Summary
Dit artikel introduceert een eenvoudige methode voor snelle productie van gigantische unilamellaire blaasjes met ingekapselde cytoskeletale eiwitten. De methode blijkt nuttig te zijn voor bottom-up reconstitutie van cytoskeletstructuren in opsluiting en cytoskelet-membraaninteracties.
Abstract
Gigantische unilamellaire blaasjes (GUVs) worden vaak gebruikt als modellen van biologische membranen en zijn dus een geweldig hulpmiddel om membraangerelateerde cellulaire processen in vitro te bestuderen. In de afgelopen jaren is inkapseling binnen GUV's een nuttige benadering gebleken voor reconstitutie-experimenten in celbiologie en aanverwante gebieden. Het bootst beter de opsluitingsomstandigheden in levende cellen na, in tegenstelling tot conventionele biochemische reconstitutie. Methoden voor inkapseling in GUVs zijn vaak niet eenvoudig te implementeren en slagingspercentages kunnen aanzienlijk verschillen van laboratorium tot laboratorium. Een techniek die succesvol is gebleken voor het inkapselen van complexere eiwitsystemen wordt continuous droplet interface crossing encapsulation (cDICE) genoemd. Hier wordt een op cDICE gebaseerde methode gepresenteerd voor het snel inkapselen van cytoskeletale eiwitten in GUVs met een hoge inkapselingsefficiëntie. In deze methode worden eerst lipide-monolaagdruppels gegenereerd door een eiwitoplossing te emulgeren die van belang is in een lipide / oliemengsel. Nadat ze zijn toegevoegd aan een roterende 3D-geprinte kamer, gaan deze lipide-monolagige druppels vervolgens door een tweede lipide monolaag op een water / olie-interface in de kamer om GUVs te vormen die het eiwitsysteem bevatten. Deze methode vereenvoudigt de algemene procedure van inkapseling binnen GUV's en versnelt het proces, en stelt ons dus in staat om de dynamische evolutie van netwerkassemblage in lipide bilayer blaasjes te beperken en te observeren. Dit platform is handig voor het bestuderen van de mechanica van cytoskelet-membraaninteracties in opsluiting.
Introduction
Lipide dubbellaagse compartimenten worden gebruikt als model synthetische cellen voor het bestuderen van ingesloten organische reacties en op membraan gebaseerde processen of als dragermodules in toepassingen voor medicijnafgifte 1,2. Bottom-up biologie met gezuiverde componenten vereist minimale experimentele systemen om eigenschappen en interacties tussen biomoleculen, zoals eiwitten en lipiden, te onderzoeken 3,4. Met de vooruitgang van het veld is er echter een toegenomen behoefte aan complexere experimentele systemen die de omstandigheden in biologische cellen beter imiteren. Inkapseling in GUVs is een praktische benadering die een aantal van deze celachtige eigenschappen kan bieden door een vervormbare en selectief doorlatende lipide bilayer en een beperkte reactieruimte te bieden. Met name in vitro reconstitutie van cytoskeletsystemen, als modellen van synthetische cellen, kan baat hebben bij inkapseling in membraancompartimenten5. Veel cytoskeletale eiwitten binden en interageren met het celmembraan. Aangezien de meeste cytoskeletale assemblages structuren vormen die het geheel van de cel overspannen, wordt hun vorm natuurlijk bepaald door celgrote opsluiting6.
Verschillende methoden worden gebruikt om GUVs te genereren, zoals de zwelling 7,8, kleine blaasjesfusie 9,10, emulsieoverdracht11,12, gepulseerde jetting13 en andere microfluïdische benaderingen14,15. Hoewel deze methoden nog steeds worden gebruikt, heeft elk zijn beperkingen. Daarom is een robuuste en eenvoudige aanpak met een hoog rendement van GUV-inkapseling zeer wenselijk. Hoewel technieken zoals spontane zwelling en elektroswelling op grote schaal worden toegepast voor de vorming van GUVs, zijn deze methoden voornamelijk compatibel met specifieke lipidesamenstellingen16, buffers met lage zoutconcentraties17, kleinere encapsulant moleculaire grootte18 en vereisen ze een groot volume van het inkapselingsmiddel. Het fuseren van meerdere kleine blaasjes tot een GUV is inherent energetisch ongunstig, waardoor specificiteit vereist is in geladen lipidesamenstellingen9 en / of externe fusie-inducerende middelen, zoals peptiden19 of andere chemicaliën. Emulsieoverdracht en microfluïdische methoden kunnen daarentegen druppelstabilisatie vereisen door verwijdering van oppervlakteactieve stoffen en oplosmiddelen na dubbellaagse vorming, respectievelijk18,20. De complexiteit van experimentele opstelling en apparaat in microfluïdische technieken zoals gepulseerde jetting vormen een extra uitdaging21. cDICE is een op emulsie gebaseerde methode die is afgeleid van vergelijkbare principes voor emulsieoverdracht22,23. Een waterige oplossing (buitenoplossing) en een lipide-oliemengsel worden gestratificeerd door centrifugale krachten in een roterende cilindrische kamer (cDICE-kamer) die een lipide verzadigd interface vormen. Het dichtknijpen van lipide monolaged waterige druppels in de roterende cDICE-kamer resulteert in het ritsen van een dubbellaag terwijl druppels de lipide-verzadigde interface doorkruisen naar de buitenste waterige oplossing22,24. De cDICE-aanpak is een robuuste techniek voor GUV-inkapseling. Met de gepresenteerde gemodificeerde methode wordt niet alleen de hoge blaasjesopbrengst bereikt die typisch is voor cDICE met een aanzienlijk kortere inkapselingstijd (enkele seconden), maar wordt ook de GUV-generatietijd bereikt die de observatie van tijdsafhankelijke processen mogelijk maakt (bijv. Actine cytoskeletale netwerkvorming) aanzienlijk verminderd. Het protocol duurt ongeveer 15-20 minuten vanaf het begin tot GUV-verzameling en beeldvorming. Hier wordt GUV-generatie beschreven met behulp van de gemodificeerde cDICE-methode voor het inkapselen van actine en actine-bindende eiwitten (ABPs). De gepresenteerde techniek is echter toepasbaar voor het inkapselen van een breed scala aan biologische reacties en membraaninteracties, van de assemblage van biopolymeren tot celvrije eiwitexpressie tot op membraanfusie gebaseerde ladingoverdracht.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bereiding van olie-lipidenmengsel
OPMERKING: De stap moet worden uitgevoerd in een zuurkast volgens alle veiligheidsrichtlijnen voor het hanteren van chloroform.
- Neem 0,5 ml chloroform in een glazen injectieflacon van 15 ml. Voeg 88 μL 25 mg/ml dioleoylfosfocholine (DOPC), 9,3 μL 50 mg/ml cholesterol en 5 μL 1 mg/ml dioleoyl-fosfoethanolamine-lissamine rhodamine B (rhodamine PE) (zie Materiaaltabel) toe aan de glazen injectieflacon van 15 ml.
OPMERKING: De uiteindelijke molfracties van DOPC en cholesterol in siliconenolie / minerale olie zijn respectievelijk 69,9% en 30%. Er werd vastgesteld dat 20-30 mol% cholesterol een geoptimaliseerde concentratie is voor membraanfluïditeit en stabiliteit van GUVs gegenereerd met behulp van de gepresenteerde techniek25,26. Fysiologisch liggen deze waarden ruim binnen het cholesterolconcentratiebereik dat wordt aangetroffen in plasmamembranen van zoogdiercellen6. Lipidenvoorraden worden verworven als oplossingen in chloroform en opgeslagen bij -20 °C. Injectieflacons met lipidenbouillon moeten aan kamertemperatuur worden aangepast voordat ze worden geopend. - Pipetteer 7,2 ml siliconenolie en 1,8 ml minerale olie in een tweede injectieflacon van 15 ml (zie Materiaaltabel). Over het algemeen moet dit worden gedaan in een handschoenenkastje met een lage luchtvochtigheid, vooral als de minerale olie wordt hergebruikt.
- Meng de oliën door vortexing met de maximale rotatiesnelheid (3200 rpm) gedurende 10 s, voeg het mengsel toe aan de injectieflacon met het lipide-in-chloroformmengsel en plaats het onmiddellijk op de vortexmenger. Vortex voor 10-15 s bij het maximale toerental (3200 rpm). De resulterende lipiden-in-oliemix moet enigszins troebel zijn, omdat de lipiden niet volledig in de olie zijn opgelost, maar eerder als kleine aggregaten worden gedispergeerd24.
- Plaats de lipide-in-oliedispersie in een badsonicator (zie materiaaltabel) met een ultrasoon vermogen van 80 W en een werkfrequentie van 40 kHz bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten. Gebruik het mengsel onmiddellijk of bewaar het maximaal 24 uur bij 4 °C.
2. Blaasjes generatie
- Monteer de 3D-geprinte as (aanvullend bestand 1) gemaakt van zwart hars (zie materiaaltabel) op de roerplaat op de tafel en stel de rotatiesnelheid in op 1200 tpm.
- Monteer de 3D-geprinte cDICE-kamer (aanvullend dossier 2) gemaakt van heldere hars (zie materiaaltabel) op de schacht (figuur 1A,B).
- Bereid actine- en actinebindende eiwitten (ABP)-oplossingen afzonderlijk voor in een totaal volume van 20 μL.
- Bereid 1-10 μM actine in bolvormige actinebuffer (G-buffer), inclusief 10% ATTO 488 actine (zie materialentabel).
OPMERKING: 1x G-buffer bestaat uit 5 mM Tris-HCl, pH 8,0 en 0,2 mM CaCl2. - Voeg filamenteuze actinepolymerisatiebuffer (F-buffer) toe om te beginnen met actinepolymerisatie op ijs. Houd de oplossingen op ijs om de actinepolymerisatie te vertragen voordat een crosslinker wordt toegevoegd.
OPMERKING: De 1x F-buffer bevat 50 mM KCl, 2 mM MgCl2 en 3 mM ATP in 10 mM Tris, pH 7,5. - Wacht 15 minuten om actinepolymerisatie op ijs te kunnen starten voordat u crosslinkers van belang toevoegt met de gewenste molaire verhouding. Houd de oplossing op ijs tot de inkapseling.
- Bereid actinebindende eiwitten (ABPs) afzonderlijk in een microbuisje (figuur 1C).
OPMERKING: Deze stap wordt uitgevoerd wanneer een combinatie van ABPs (bijv. myosine, α-actinine, fascin, Arp2/3-complex) inkapselt met actine 25,26,27. In dergelijke gevallen wordt het gewenste bedrag van elk ABP uit zijn voorraad gehaald en toegevoegd aan de microbuis die is aangewezen voor ABPs. Aangezien de totaaloplossing 20 μL moet bedragen, moeten voorraad aliquots van ABPs zo worden bereid dat de gewenste hoeveelheid van het totale ABP-mengsel niet meer dan 5-6 μL bedraagt. Het enige ABP dat in de representatieve resultaten hier wordt gebruikt, is fascin, waarvan de bereiding hieronder wordt vermeld.- Aliquot 1,57 μL fascin uit een fascinvoorraad van 1,75 mg/ml (zie materiaaltabel) en direct toevoegen aan de actine-oplossing in stap 2.7. Dit komt overeen met 2,5 μM fascin in de oplossing.
- Bereid 1-10 μM actine in bolvormige actinebuffer (G-buffer), inclusief 10% ATTO 488 actine (zie materialentabel).
- Voeg 7,5% van het dichtheidsgradiëntmedium (zie tabel met materialen) toe aan de actine-oplossing om een dichtheidsgradiënt te creëren tussen de buitenste en de binnenste waterige fase om GUV-sedimentatie te vergemakkelijken.
- Doseer 700 μL van de buitenoplossing van 200 mM glucose in de kamer (figuur 1D, links).
OPMERKING: De osmolariteit van de binnenoplossing bepaalt de glucoseconcentratie. Voor deze experimenten is de osmolariteit van de binnenoplossing ~ 200 mOsm, dus een glucose-oplossing van 200 mM wordt gebruikt als de buitenste oplossing. - Voeg een voldoende hoeveelheid lipide-oliemengsel (>3 ml op basis van de kamergrootte) toe aan de kamer totdat 60% -80% van de kamer is gevuld (figuur 1D, rechts). Er zal een interface worden gevormd tussen het lipide-oliemengsel en de buitenoplossing.
- Breng ABPs (bereid in stap 2.3.4) over in de actine-oplossing. Breng met een gewone pipet van 100-1000 μL onmiddellijk de 700 μL van het lipide-oliemengsel over in het actine-ABP-mengsel (figuur 1E, links). Pipetteer 8 keer op en neer om celgrote lipide-monolaagdruppels te genereren met een diameter in het bereik van 7-100 μm (figuur 1E, midden).
OPMERKING: Stap 2.7 moet binnen enkele seconden worden voltooid om te voorkomen dat actinenetwerkassemblage vóór inkapseling plaatsvindt. Zorg er dus voordat u de stap uitvoert voor dat pipetpunten al in de pipetten zijn geplaatst en klaar zijn om de mengsels over te brengen. - Gebruik dezelfde pipet van 100-1000 μL om onmiddellijk de volledige emulsie in de roterende kamer te doseren. Druppels krijgen een tweede deel van lipiden door de lipide monolaag op het olie-buitenste oplossingsinterface te kruisen, waardoor GUVs worden gevormd (figuur 1E, rechts).
- Verwijder de kamer van de roerplaat en gooi het grootste deel van het lipide-oliemengsel weg door de kamer in de afvalcontainer te kantelen, zodat een groot deel van het lipide-oliemengsel uit de grote opening in het midden van de kamer wordt afgevoerd.
OPMERKING: Op deze manier wordt het lipide-oliemengsel uit de kamer getrokken, waardoor vermenging van lipide-oliemengsel met de buitenoplossing in de volgende stap wordt vermeden. - Houd de kamer met het deksel naar de gebruiker gericht. Open het deksel van de kamer en kantel de kamer iets naar de gebruiker. Het raakvlak tussen de buitenoplossing met GUVs en het lipide-oliemengsel is zichtbaar vanuit de kameropening (waar het deksel zich bevindt).
- Verzamel met behulp van een pipet voldoende buitenoplossing met GUVs en doseer 50-300 μL van de buitenoplossing in een 96-putplaat om een geschikte dichtheid van GUVs te verkrijgen.
OPMERKING: Volgens dit protocol worden in totaal ongeveer 2 x 105 GUVs vrijgegeven in de buitenoplossing in de kamer. De GUV-dispersiteit werd niet gekwantificeerd; de diameter van ongeveer 90% van de GUVs ligt echter in het bereik van 12-30 μm. GUVs met elke diameter in het bereik van 7-50 μm zijn te vinden in de populatie. Afhankelijk van de ingekapselde dichtheidsgradiënt medium, GUV-grootte en oplossingsdiepte in de putplaat, duurt het 2-15 minuten voordat GUVs zich op het oppervlak vestigen. Het rendement van GUV's met gereconstitueerde actinebundels is ongeveer 90%.
3. Beeldvorming en 3D-beeldreconstructie
- Plaats de 96-putplaat op het podium van een omgekeerde microscoop die is uitgerust met een confocale eenheid van een draaiende schijf (of laserscanning), een EMCCD- of een sCMOS-camera en een olie-onderdompelingslens van 60x objectief (zie Materiaaltabel).
- Focus op elke interesseregio (ROI) en neem een z-stack-afbeeldingsreeks van de ROI met een z-stapinterval van 0,5 μm.
OPMERKING: Omdat GUVs in de loop van de tijd enigszins op het oppervlak kunnen worden verplaatst, wordt het aanbevolen om een reeks afbeeldingen met meerdere golflengten op elk z-vlak vast te leggen als meerdere fluoroforen worden afgebeeld, d.w.z. een groep van 561 nm- en 488 nm-afbeeldingen op elke z-lane tegelijk te maken om ATTO 488 actine- en Rhod PE-beelden vast te leggen. - Sla elke z-stack-afbeeldingsreeks op in .tiff indeling.
- Open een interessante afbeeldingsreeks in een beeldverwerkingssoftware (ImageJ/Fiji). Identificeer de afbeelding met de hoogste intensiteit. Houd "ctrl + shift + c" ingedrukt om het venster Helderheid en contrast te openen en klik op Reset.
- Ga in het menu ImageJ/Fiji naar > instellen en voer de bekende fysieke afstand en de bijbehorende eenheid in voor elke afbeeldingspixel.
- Ga in het menu ImageJ/Fiji naar Image > Stacks > 3D-project om een 3D-afbeelding uit de z-stack te reconstrueren. Stel 'Projectiemethode' in als Helderheidspunt, 'Segmentafstand (μm)' als 0,5 en vink Interpoleren aan. De standaardopties kunnen worden gebruikt voor de rest van de instellingen.
OPMERKING: z-intervallen in sommige microscopen zijn mogelijk niet gekalibreerd en de werkelijke beweging in z-richting kan enigszins afwijken van het ingevoerde z-interval (d.w.z. 0,5 μm). In dergelijke gevallen kan een 3D-kalibratiemonster zoals fluorescerende microsferen met een bekende diameter worden gebruikt om het werkelijke z-interval te verkrijgen. Deze waarde zal dus gebruikt worden als "Slice Spacing (μm)" voor 3D projectie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Om de succesvolle generatie van cytoskeletale GUVs met behulp van het huidige protocol aan te tonen, werden fascin-actinebundelstructuren in GUV's gereconstitueerd. Fascin is een korte crosslinker van actinefilamenten die stijve parallel uitgelijnde actinebundels vormt en wordt gezuiverd van E. coli als glutathion-S-Transferase (GST) fusie-eiwit26. 5 μM actine werd voor het eerst gereconstitueerd, inclusief 0,53 μM ATTO488 actine in de actinepolymerisatiebuffer en 7,5% van het dichtheidsgradiëntmedium. Na toevoeging van fascin in een concentratie van 2,5 μM en inkapseling van het fascin-actinemengsel, werden actinebundelstructuren gevormd in GUV's. Z-stack confocale beeldsequenties van de ingekapselde actinebundelstructuren in de rhodamine PE-gelabelde GUVs werden 1 uur na inkapseling vastgelegd (figuur 2A). Met behulp van dit protocol werd eerder aangetoond dat inherente concurrentie en sortering van de ingekapselde actine-crosslinkers, α-actinine en fascin, die samen verschillende actinebundelpatronen vormen op een GUV-grootteafhankelijke manier.
Net als de hier gepresenteerde gemodificeerde omgekeerde emulsiebenadering genereert het traditionele cDICE-proces cytoskeletale GUV's met een hoge opbrengst, maar vereist het een spuitpomp en slangopstelling voor gecontroleerde injectie van eiwitoplossing in de roterende kamer bij lage stroomsnelheden in de orde van nanoliter per seconde22,28. Bij deze benadering wordt de emulsie direct gegenereerd in de roterende cDICE-kamer; een dun capillair wordt ingebracht in de oliefase. De eiwitoplossing wordt geïnjecteerd via een spuitpomp. Druppels vormen zich en worden afgeschoren aan de capillaire punt voordat ze naar de waterige buitenste fase reizen, waar ze veranderen in GUVs, vergelijkbaar met de hierboven beschreven methode. Figuur 2B toont blaasjes die met deze benadering een reactiemengsel inkapselen. De reactiemix bevat 6 μM actine dat wordt gebundeld met 0,9 μM fascin. Hier worden de twee methoden en hun resultaten niet vergeleken, maar merk op dat ze beide een hoog rendement van GUVs genereren.
Figuur 1: Experimentele opstelling voor het genereren van GUVs. (A) Bovenaanzicht en zijaanzicht van de cDICE-kamer. (B) Foto's van de opstelling voor de spinkamer. (C-E) Schematische illustraties van stapsgewijze procedures voor het genereren van GUVs. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Inkapseling van actinebundelstructuren. (A) De afbeeldingen tonen representatieve fluorescentie confocale plakjes GUVs (links) en maximale projecties van een confocale z-stapel actine- en lipidekanalen (rechts). Fascin, 2,5 μM; actine, 5 μM (inclusief 10% ATTO 488 actine). Schaalbalk = 10 μm. (B) Inkapseling van actinebundelstructuren met behulp van conventionele cDICE. De afbeelding toont een representatieve maximale projectie van confocale fluorescentiebeelden van ingekapselde actinebundels gevormd in aanwezigheid van fascin. Fascin, 0,9 μM; Actine, 6 μM. Schaalbalk = 10 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullend dossier 1: 3D-geprint asontwerp. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullend dossier 2: Ontwerp voor de 3D-geprinte cDICE-kamer. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Verschillende methoden voor het genereren van GUVs zijn onderzocht voor de creatie van synthetische cellen De complexiteit van de procedures, de langere tijd om inkapseling te bereiken, beperking van lipidetypen en moleculaire samenstelling van het inkapselingsmiddel, behoefte aan niet-fysiologische chemicaliën om inkapseling te vergemakkelijken, lage GUV-opbrengst en inconsistenties in inkapselingsefficiëntie blijven onderzoekers op dit gebied uitdagen. Gezien het brede scala aan potentiële studies die kunnen worden gestart in bottom-up synthetische biologie, kan een naadloze GUV-inkapselingsbenadering met hoge doorvoer die compatibel is met verschillende lipidesamenstellingen en alle moleculen kan inkapselen, ongeacht de grootte, nieuwe kansen bieden om complexe biomimicking synthetische systemen te bestuderen. De cDICE-methode heeft de meeste uitdagingen en beperkingen geëlimineerd die inherent zijn aan eerdere GUV-generatiemethoden.
De aanpak en heersende principes om GUVs te genereren met behulp van de cDICE-methode dateert van vóór het platform en zijn geïmplementeerd in eerdere technieken zoals de omgekeerde emulsieoverdracht12. De omgekeerde emulsietransfermethode heeft echter beperkingen zoals een lage blaasjesopbrengst en heterogeniteit van blaasjes. Voor de hier gepresenteerde cDICE-methode worden lipiden in olie gedispergeerd in de vorm van aggregaten van tientallen nanometers (de grootte van het lipidenaggregaat is afhankelijk van de totale concentratie lipiden)24. Dispersie van lipiden is in twee mengbare oliën, waarbij één (minerale olie) lipiden kan oplossen en een tweede olie (siliciumolie) die niet mengbaar is met lipiden. Dit creëert lipide aggregaat coacervaten door middel van solvent-shifting29. Deze specifieke dispersiebenadering vergemakkelijkt onmiddellijke monolaagverzadiging van waterige druppels en snellere vernieuwing van lipiden op het olie-waterige grensvlak, aangezien waterige druppels continu de lipide-verzadigde olie-waterige interface passeren. Dit verbetert vervolgens ook het dubbellaags ritsen om GUV's te vormen en verhoogt de GUV-doorvoer. De centrifugale krachten die door de roterende kamer worden gegenereerd, zijn optimaal voor het sluiten van polydispersed druppels over de lipide-verzadigde interface. De originele versie van de cDICE-methode maakt gebruik van een microcapillair mondstuk om de binnenoplossing in het olie-lipidenmengsel te injecteren. In deze benadering genereren schuifkrachten gecreëerd door het roterende olie-lipidenmengsel waterige druppels, die uiteindelijk transformeren in GUV's zoals beschreven. Echter, met de bedoeling om de tijd die nodig is om het injectieplatform te bereiden te verkorten, vooral kritisch voor snelle reacties, zoals actinenetwerkassemblage en mogelijke verstopping van het microcapillair, worden waterige druppels met lipide monolagen nu gegenereerd door het olie-lipidenmengsel rechtstreeks aan de binnenoplossing toe te voegen en op en neer te pipetteren. Deze aanpak elimineert de vertraging in GUV-inkapseling voor een snelle reactie-experiment.
Een van de uitdagingen veroorzaakt door eerdere GUV-generatiemethoden is de beperking van lipidetypen (lading van lipide en fase van lipide) afhankelijk van de techniek van GUV-generatie. Meerdere lipidetypen, waaronder DOPC, dioleoyl-glycero-hosphoserine (DOPS), dioleoyl-glycero-succinaat (DGS), dimyristoyl-glycero-fosfocholine (DMPC) en combinaties van verschillende lipiden en cholesterol in verschillende concentraties werden getest. Voor alle omstandigheden is aangetoond dat de cDICE-methode GUV's vormt met een hoge inkapselingsefficiëntie bij een consistent hoge GUV-opbrengst. Bovendien is ook aangetoond dat de cDICE-methode effectief verschillende cellulaire componenten inkapselt, waaronder cytoskeletale eiwitten, celvrije expressiereacties, verdringingsmiddelen, kleurstoffen en andere cellulaire moleculen van verschillende grootte zonder verlies van inkapselingsefficiëntie of verminderde doorvoer. Bovendien kan de gemodificeerde cDICE, net als normale omgekeerde emulsieoverdrachtsmethoden30, mogelijk het genereren van asymmetrische GUV's voor toekomstig werk mogelijk maken. Verschillende lipidesamenstellingen kunnen worden gebruikt voor de binnenste folder en de buitenste folder, omdat monolaagdruppels afzonderlijk worden gevormd (in een microbuis door op en neer te pipetteren) voordat de dubbellaag in de cDICE-kamer wordt geritst. Sedimentatie van lipiden wordt waargenomen wanneer het lipide-oliemengsel lang wordt bewaard; men kan echter eenvoudig het lipide-oliemengsel vortexen voordat het wordt ingekapseld om lipideaggregaten opnieuw te dispergeren. Het is belangrijk op te merken dat de inkapselingskwaliteit kan worden aangetast wanneer de lipide-oliemengsels langer worden bewaard, zoals aangegeven door meer significante dan gebruikelijke lipideaggregaten in het lipide-oliemengsel. Hoewel niet getest, kunnen deze aggregaten mogelijk leiden tot onvolkomenheid bij het ritsen van twee lagen, en de aggregaten kunnen ook worden ingekapseld met een binnenoplossing die de gewenste chemische omgeving in gevaar brengt.
De beperking van de gepresenteerde aangepaste benadering om waterige druppels te vormen, ligt in het genereren van uniformiteit in de grootte van druppels. Hoewel dit kan worden verbeterd door microcapillaire injectie van de binnenoplossing bij verschillende stroomsnelheden te gebruiken om GUV-maten te regelen, is het minder wenselijk om snelle reacties zoals actineassemblage in ingekapselde GUVs te controleren. Door druppels te maken door op en neer te pipetteren wat resulteert in verschillende GUV-maten, kan men populaties van blaasjes van vergelijkbare grootte analyseren. Bezorgdheid over mogelijke olieretentie in twee lagen belemmert de toepassing van de meeste GUV-generatietechnieken, waaronder op emulsie gebaseerde GUV-generatietechnieken zoals cDICE21. De hoeveelheid olie die in het membraan achterblijft, kan echter worden verminderd door organische middelen zoals 1-octanol te gebruiken, die kan worden verwijderd na het genereren van de blaasjes31,32. Toekomstige wijzigingen in de methode, mogelijk door verandering van oplosmiddelsamenstelling, moeten worden onderzocht.
Er zijn veel gebieden in de bottom-up synthetische biologie die nog moeten worden onderzocht en misschien cel-nabootsende opsluitingen van GUVs vereisen. Dergelijke experimentele inspanningen vereisen GUV-generatieplatforms zoals cDICE om GUV's robuust te genereren en tegelijkertijd efficiënt verschillende interessante moleculen in te kapselen. Veel cellulaire processen vinden sneller plaats dan de tijd die nodig is om moleculen in te kapselen met behulp van eerdere GUV-generatietechnieken. Zoals hier beschreven, worden actineoplossingen snel genoeg ingekapseld om vesikelvervorming als gevolg van actinenetwerkassemblage te observeren. Dergelijke synthetische cellen met gereconstitueerd actinecytoskelet hebben kenmerken van actinenetwerkorganisatie onthuld in de aanwezigheid van verschillende crosslinkers 5,25,33 en membraanremodellering 25,27,28. Ze zullen toekomstig werk inspireren om meer geavanceerde synthetische cellen te creëren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen belangenconflicten te hebben.
Acknowledgments
APL erkent steun van een Humboldt Research Fellowship for Experienced Researchers en van de National Science Foundation (1939310 and 1817909) en National Institutes of Health (R01 EB030031).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 18:1 Liss Rhod PE lipid in chloroform | Avanti Polar Lipids | 810150C | |
| 96 Well Optical Btm Pit PolymerBase | ThermoFisher Scientific | 165305 | |
| Actin from rabbit skeletal muscle | Cytoskeleton | AKL99-A | |
| ATTO 488-actin from rabbit skeletal muscle | Hypermol | 8153-01 | |
| Axygen microtubes (200 µL) | Fisher Scientific | 14-222-262 | for handling ABPs |
| Black resin | Formlabs | RS-F2-GPBK-04 | |
| Cholesterol (powder) | Avanti Polar Lipids | 700100P | |
| Choloroform | Sigma Aldrich | 67-66-3 | |
| Clear resin | Formlabs | RS-F2-GPCL-04 | |
| CSU-X1 Confocal Scanner Unit | YOKOGAWA | CSU-X1 | |
| Density gradient medium (Optiprep) | Sigma-Aldrich | D1556 | |
| DOPC lipid in chloroform | Avanti Polar Lipids | 850375C | |
| Fascin | homemade | N/A | |
| F-buffer | homemade | N/A | |
| Fisherbrand microtubes (1.5 mL) | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| FS02 Sonicator | Fischer Scientific | FS20 | |
| G-buffer | homemade | N/A | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | 158968 | |
| iXon X3 camera | Andor | DU-897E-CS0 | |
| Mineral oil | Acros Organics | 8042-47-5 | |
| Olympus IX81 Inverted Microscope | Olympus | IX21 | |
| Olympus PlanApo N 60x Oil Microscope Objective | Olumpus | 1-U2B933 | |
| Silicone oil | Sigma-Aldrich | 317667 |
References
- Groaz, A., et al. Engineering spatiotemporal organization and dynamics in synthetic cells. Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology. 13 (3), 1685 (2021).
- Diltemiz, S. E., et al. Use of artificial cells as drug carriers. Materials Chemistry Frontiers. 5, 6672-6692 (2021).
- Liu, A. P., Fletcher, D. A. Biology under construction: In vitro reconstitution of cellular function. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (9), 644-650 (2009).
- Ganzinger, K. A., Schwille, P. More from less - bottom-up reconstitution of cell biology. Journal of Cell Science. 132 (4), 227488 (2019).
- Bashirzadeh, Y., Liu, A. P. Encapsulation of the cytoskeleton: Towards mimicking the mechanics of a cell. Soft Matter. 15 (42), 8425-8436 (2019).
- Blanchoin, L., Boujemaa-Paterski, R., Sykes, C., Plastino, J. Actin dynamics, architecture, and mechanics in cell motility. Physiol reviews. 94 (1), 235-263 (2014).
- Angelova, M. I., Dimitrov, D. S.
- Tsumoto, K., Matsuo, H., Tomita, M., Yoshimura, T. Efficient formation of giant liposomes through the gentle hydration of phosphatidylcholine films doped with sugar. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 68 (1), 98-105 (2009).
- Bailey, A. L., Cullis, P. R. Membrane fusion with cationic liposomes: Effects of target membrane lipid composition. Biochemistry. 36 (7), 1628-1634 (1997).
- Haluska, C. K., Riske, K. A., Marchi-Artzner, V., Lehn, J. M., Lipowsky, R., Dimova, R. Time scales of membrane fusion revealed by direct imaging of vesicle fusion with high temporal resolution. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (43), 15841-15846 (2006).
- Nishimura, K., Suzuki, H., Toyota, T., Yomo, T. Size control of giant unilamellar vesicles prepared from inverted emulsion droplets. Journal of Colloid and Interface Science. 376 (1), 119-125 (2012).
- Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A. Production of unilamellar vesicles using an inverted emulsion. Langmuir. 19 (7), 2870-2879 (2003).
- Stachowiak, J. C., Richmond, D. L., Li, T. H., Liu, A. P., Parekh, S. H., Fletcher, D. A. Unilamellar vesicle formation and encapsulation by microfluidic jetting. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (12), 4697-4702 (2008).
- Noireaux, V., Liu, A. P. The new age of cell-free biology. Annual Review of Biomedical Engineering. 22, 51-77 (2020).
- Ho, K. K. Y., Murray, V. L., Liu, A. P. Engineering artificial cells by combining HeLa-based cell-free expression and ultrathin double emulsion template. Methods in Cell Biology. , 303-318 (2015).
- Akashi, K., Miyata, H., Itoh, H., Kinosita, K. Preparation of giant liposomes in physiological conditions and their characterization under an optical microscope. Biophysical Journal. 71 (6), 3242-3250 (1996).
- Méléard, P., Bagatolli, L. A., Pott, T. Giant unilamellar vesicle electroformation: From lipid mixtures to native membranes under physiological conditions. Methods in Enzymology. 465, 161-176 (2009).
- Walde, P., Cosentino, K., Engel, H., Stano, P. Giant vesicles: Preparations and applications. ChemBioChem. 11 (7), 848-865 (2010).
- Pécheur, E. I., Martin, I., Ruysschaert, J. M., Bienvenüe, A., Hoekstra, D. Membrane fusion induced by 11-mer anionic and cationic peptides: A structure− function study. Biochemistry. 37 (8), 2361-2371 (1998).
- Morigaki, K., Walde, P. Giant vesicle formation from oleic acid/sodium oleate on glass surfaces induced by adsorbed hydrocarbon molecules. Langmuir. 18 (26), 10509-10511 (2002).
- Majumder, S., Wubshet, N., Liu, A. P. Encapsulation of complex solutions using droplet microfluidics towards the synthesis of artificial cells. Journal of Micromechanics and Microengineering. 29 (8), 83001 (2019).
- Abkarian, M., Loiseau, E., Massiera, G. Continuous droplet interface crossing encapsulation (cDICE) for high throughput monodisperse vesicle design. Soft Matter. 7 (10), 4610-4614 (2011).
- Van de Cauter, L., et al. Optimized cDICE for efficient reconstitution of biological systems in giant unilamellar vesicles. ACS Synthetic Biology. 10 (7), 1690-1702 (2021).
- Claudet, C., In, M., Massiera, G. Method to disperse lipids as aggregates in oil for bilayers production. The European Physical Journal E. 39 (1), 1-6 (2016).
- Bashirzadeh, Y., Wubshet, N. H., Liu, A. P. Confinement Geometry tunes fascin-actin bundle structures and consequently the shape of a lipid bilayer vesicle. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 610277 (2020).
- Bashirzadeh, Y., et al. Actin crosslinker competition and sorting drive emergent GUV size-dependent actin network architecture. Communications Biology. 4, 1136 (2021).
- Bashirzadeh, Y., Moghimianavval, H., Liu, A. P. Encapsulated actomyosin patterns drive cell-like membrane shape changes. bioRxiv. , (2021).
- Litschel, T., et al.
- Vitale, S. A., Katz, J. L. Liquid droplet dispersions formed by homogeneous liquid− liquid nucleation:"The Ouzo effect.". Langmuir. 19 (10), 4105-4110 (2003).
- Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A.
- Deshpande, S., Dekker, C. On-chip microfluidic production of cell-sized liposomes. Nature Protocols. 13 (5), 856-874 (2018).
- Deshpande, S., Caspi, Y., Meijering, A. E. C., Dekker, C. Octanol-assisted liposome assembly on chip. Nature Communications. 7, 10447 (2016).
- Wubshet, N. H., Bashirzadeh, Y., Liu, A. P. Fascin-induced actin protrusions are suppressed by dendritic networks in GUVs. Molecular Biology of the Cell. 32 (18), 1634-1640 (2021).
