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Summary

Dieser Artikel stellt eine einfache Methode zur schnellen Herstellung von riesigen unilamellären Vesikeln mit verkapselten zytoskelettalen Proteinen vor. Die Methode erweist sich als nützlich für die Bottom-up-Rekonstitution von Zytoskelettstrukturen in Enstrikt- und Zytoskelett-Membran-Interaktionen.

Abstract

Riesige unilamellare Vesikel (GUVs) werden häufig als Modelle biologischer Membranen verwendet und sind daher ein großartiges Werkzeug, um membranbezogene zelluläre Prozesse in vitro zu untersuchen. In den letzten Jahren hat sich die Verkapselung in GUVs als hilfreicher Ansatz für Rekonstitutionsexperimente in der Zellbiologie und verwandten Bereichen erwiesen. Es ahmt die Einschlussbedingungen in lebenden Zellen besser nach, im Gegensatz zur herkömmlichen biochemischen Rekonstitution. Methoden zur Verkapselung in GUVs sind oft nicht einfach zu implementieren, und die Erfolgsraten können sich von Labor zu Labor erheblich unterscheiden. Eine Technik, die sich bei der Verkapselung komplexerer Proteinsysteme als erfolgreich erwiesen hat, wird als kontinuierliche Tröpfchengrenzflächenkreuzung (cDICE) bezeichnet. Hier wird eine cDICE-basierte Methode zur schnellen Verkapselung von Zytoskelettproteinen in GUVs mit hoher Verkapselungseffizienz vorgestellt. Bei dieser Methode werden zunächst Lipid-Monolayer-Tröpfchen erzeugt, indem eine Proteinlösung von Interesse in einem Lipid/Öl-Gemisch emulgiert wird. Nach der Zugabe in eine rotierende 3D-gedruckte Kammer passieren diese lipidmonolagigen Tröpfchen dann eine zweite Lipid-Monoschicht an einer Wasser/Öl-Grenzfläche innerhalb der Kammer, um GUVs zu bilden, die das Proteinsystem enthalten. Diese Methode vereinfacht das Gesamtverfahren der Verkapselung in GUVs und beschleunigt den Prozess und ermöglicht es uns somit, die dynamische Entwicklung der Netzwerkmontage in Lipiddoppelschichtvesikeln einzugrenzen und zu beobachten. Diese Plattform ist praktisch, um die Mechanik von Zytoskelett-Membran-Interaktionen im Gefangenenverkehr zu untersuchen.

Introduction

Lipid-Doppelschichtkompartimente werden als synthetische Modellzellen zur Untersuchung geschlossener organischer Reaktionen und membranbasierter Prozesse oder als Trägermodule in Drug-Delivery-Anwendungen^{verwendet 1,2}. Die Bottom-up-Biologie mit gereinigten Komponenten erfordert minimale experimentelle Systeme, um Eigenschaften und Wechselwirkungen zwischen Biomolekülen wie Proteinen und Lipiden zu untersuchen ^3,4. Mit dem Fortschritt des Feldes besteht jedoch ein erhöhter Bedarf an komplexeren experimentellen Systemen, die die Bedingungen in biologischen Zellen besser imitieren. Die Verkapselung in GUVs ist ein praktischer Ansatz, der einige dieser zellähnlichen Eigenschaften bieten kann, indem er eine verformbare und selektiv durchlässige Lipiddoppelschicht und einen begrenzten Reaktionsraum bereitstellt. Insbesondere die In-vitro-Rekonstitution von Zytoskelettsystemen als Modelle synthetischer Zellen kann von der Verkapselung in Membrankompartimenten^{profitieren 5}. Viele Zytoskelettproteine binden und interagieren mit der Zellmembran. Da die meisten Zytoskelettbaugruppen Strukturen bilden, die sich über die gesamte Zelle erstrecken, wird ihre Form natürlich durch zellgroße Einschließung^{bestimmt 6}.

Verschiedene Methoden werden verwendet, um GUVs zu erzeugen, wie z.B. die Quellung ^7,8, die kleine Vesikelfusion^9,10, der Emulsionstransfer 11,12, das gepulste Jetting 13 und andere mikrofluidische Ansätze^14,15. Obwohl diese Methoden immer noch verwendet werden, hat jede ihre Grenzen. Daher ist ein robuster und unkomplizierter Ansatz mit einer hohen Ausbeute an GUV-Verkapselung sehr wünschenswert. Obwohl Techniken wie spontane Quellung und Elektroschwellung für die Bildung von GUVs weit verbreitet sind, sind diese Methoden in erster Linie mit spezifischen Lipidzusammensetzungen 16, niedrigen Salzkonzentrationspuffern¹⁷, kleineren Verkapselungsmolekülgrößen¹⁸ kompatibel und erfordern ein hohes Volumen des Verkapselungsmittels. Die Verschmelzung mehrerer kleiner Vesikel zu einem GUV ist von Natur aus energetisch ungünstig und erfordert daher Spezifität in geladenen Lipidzusammensetzungen⁹ und / oder externen fusionsinduzierenden Mitteln wie Peptiden¹⁹ oder anderen Chemikalien. Emulsionstransfer- und mikrofluidische Verfahren hingegen können eine Tröpfchenstabilisierung durch Tensid- und Lösungsmittelentfernung nach Doppelschichtbildung^{bzw. 18,20} erfordern. Die Komplexität des Versuchsaufbaus und der Vorrichtung in mikrofluidischen Techniken wie dem gepulsten Jetting stellt eine zusätzliche Herausforderung^{dar 21}. cDICE ist eine emulsionsbasierte Methode, die von ähnlichen Prinzipien für den Emulsionstransfer abgeleitet ist^22,23. Eine wässrige Lösung (äußere Lösung) und ein Lipid-Öl-Gemisch werden durch Zentrifugalkräfte in einer rotierenden zylindrischen Kammer (cDICE-Kammer) geschichtet, die eine lipidgesättigte Grenzfläche bildet. Das Einschichten von einschichtigen wässrigen Lipidtröpfchen in die rotierende cDICE-Kammer führt zu einem Reißverschluss einer Doppelschicht, wenn Tröpfchen die lipidgesättigte Grenzfläche in die äußere wässrige Lösung^22,24 überqueren. Der cDICE-Ansatz ist eine robuste Technik zur GUV-Verkapselung. Mit der vorgestellten modifizierten Methode wird nicht nur die für cDICE typische hohe Vesikelausbeute mit einer deutlich kürzeren Verkapselungszeit (wenige Sekunden) erreicht, sondern auch die GUV-Erzeugungszeit, die die Beobachtung zeitabhängiger Prozesse (z.B. Aktin-Zytoskelett-Netzwerkbildung) ermöglicht, signifikant reduziert. Das Protokoll dauert ca. 15-20 Minuten vom Start bis zur GUV-Sammlung und Bildgebung. Hier wird die GUV-Erzeugung mit der modifizierten cDICE-Methode zur Verkapselung von Aktin- und Aktin-bindenden Proteinen (ABPs) beschrieben. Die vorgestellte Technik ist jedoch anwendbar für die Verkapselung einer Vielzahl von biologischen Reaktionen und Membranwechselwirkungen, von der Montage von Biopolymeren über die zellfreie Proteinexpression bis hin zum auf Membranfusion basierenden Frachttransfer.

Protocol

1. Herstellung eines Öl-Lipid-Gemisches HINWEIS: Der Schritt muss in einem Abzug unter Einhaltung aller Sicherheitsrichtlinien für den Umgang mit Chloroform durchgeführt werden. Nehmen Sie 0,5 ml Chloroform in eine 15 ml Durchstechflasche aus Glas. 88 μL 25 mg/ml Dioleoyl-Phosphocholin (DOPC), 9,3 μL 50 mg/ml Cholesterin und 5 μL 1 mg/ml Dioleoyl-phosphoethanolamin-Lissamin-Rhodamin B (Rhodamin PE) (siehe Materialtabelle) in die 15-ml-Durchstechflasche aus Glas geben.HINWEIS: Die endgültigen Molfraktionen von DOPC und Cholesterin in Silikonöl / Mineralöl betragen 69,9% bzw. 30%. Es wurde festgestellt, dass 20-30 Mol% Cholesterin eine optimierte Konzentration für die Membranfluidität und Stabilität von GUVs ist, die mit der vorgestellten Technik erzeugtwerden 25,26. Physiologisch liegen diese Werte weit innerhalb des Cholesterinkonzentrationsbereichs in Plasmamembranen von Säugetierzellen6. Lipidvorräte werden als Lösungen in Chloroform aufgenommen und bei -20 °C gelagert. Lipidbrühflaschen sollten vor dem Öffnen an Raumtemperatur gewöhnt werden. Pipette 7,2 ml Silikonöl und 1,8 ml Mineralöl in einer zweiten 15 ml Durchstechflasche (siehe Materialtabelle). Im Allgemeinen muss dies in einem Handschuhfach mit niedriger Luftfeuchtigkeit erfolgen, hauptsächlich wenn das Mineralöl wiederverwendet wird. Mischen Sie die Öle, indem Sie mit der maximalen Drehzahl (3200 U / min) für 10 s vorwirbeln, fügen Sie die Mischung zu der Durchstechflasche hinzu, die die Lipid-in-Chloroform-Mischung enthält, und legen Sie sie sofort auf den Wirbelmischer. Wirbel für 10-15 s bei maximaler Drehzahl (3200 U/min). Die resultierende Lipid-in-Öl-Mischung sollte leicht trüb sein, da die Lipide nicht vollständig im Öl gelöst sind, sondern als kleine Aggregate verteiltwerden 24. Legen Sie die Lipid-in-Öl-Dispersion in einen Badbeschaller (siehe Materialtabelle) mit Ultraschallleistung von 80 W und Betriebsfrequenz von 40 kHz bei Raumtemperatur für 30 min. Verwenden Sie die Mischung sofort oder lagern Sie sie bei 4 °C für maximal 24 h. 2. Vesikelbildung Montieren Sie die 3D-gedruckte Welle (Zusatzdatei 1) aus schwarzem Harz (siehe Materialtabelle) auf die Tischrührplatte und stellen Sie die Drehzahl auf 1200 U / min ein. Montieren Sie die 3D-gedruckte cDICE-Kammer (Zusatzdatei 2) aus klarem Harz (siehe Materialtabelle) auf der Welle (Abbildung 1A,B). Stellt Aktin und Aktin-bindende Proteine (ABP)-Lösungen separat in einem Gesamtvolumen von 20 μL her. Bereiten Sie 1-10 μM Aktin im globulären Aktinpuffer (G-Puffer) vor, einschließlich 10% ATTO 488 Aktin (siehe Materialtabelle).HINWEIS: 1x G-Puffer umfasst 5 mM Tris-HCl, pH 8,0 und 0,2 mM CaCl2. Fügen Sie filamentösen Aktinpolymerisationspuffer (F-Puffer) hinzu, um mit der Aktinpolymerisation auf Eis zu beginnen. Halten Sie die Lösungen auf Eis, um die Aktinpolymerisation vor der Zugabe eines Vernetzers zu verlangsamen.HINWEIS: Der 1x F-Puffer enthält 50 mM KCl, 2 mM MgCl2 und 3 mM ATP in 10 mM Tris, pH 7,5. Warten Sie 15 Minuten, um die Aktinpolymerisation auf Eis einzuleiten, bevor Sie interessante Vernetzer im gewünschten Molverhältnis hinzufügen. Halten Sie die Lösung bis zur Verkapselung auf Eis. Aktin-bindende Proteine (ABPs) werden separat in einem Mikroröhrchen hergestellt (Abbildung 1C).HINWEIS: Dieser Schritt wird durchgeführt, wenn eine Kombination von ABPs (z. B. Myosin, α-Actinin, Fascin, Arp2/3-Komplex) mit Actin25,26,27 verkapselt wird. In solchen Fällen wird die gewünschte Menge jedes TNP aus seinem Bestand entnommen und in das für TNPs bestimmte Mikroröhrchen gegeben. Da die Gesamtlösung 20 μL betragen soll, müssen die Bestandsaliquoten von ABP so hergestellt werden, dass die gewünschte Menge des gesamten ABP-Gemisches 5-6 μL nicht überschreitet. Das einzige ABP, das in den repräsentativen Ergebnissen hier verwendet wird, ist Fascin, dessen Vorbereitung unten erwähnt wird. Aliquot 1,57 μL Faszin aus einem 1,75 mg/ml Faszinbestand (siehe Materialverzeichnis) und direkt in Schritt 2.7 zur Aktinlösung geben. Dies entspricht 2,5 μM Faszin in der Lösung. 7,5% des Dichtegradientenmediums (siehe Materialtabelle) in die Aktinlösung geben, um einen Dichtegradienten zwischen der äußeren und der inneren wässrigen Phase zu erzeugen, um die GUV-Sedimentation zu erleichtern. Geben Sie 700 μL der äußeren Lösung von 200 mM Glucose in die Kammer (Abbildung 1D, links).HINWEIS: Die Osmolarität der inneren Lösung bestimmt die Konzentration der Glukose. Für diese Experimente beträgt die Osmolarität der inneren Lösung ~ 200 mOsm, so dass eine 200 mM Glukoselösung als äußere Lösung verwendet wird. Geben Sie eine ausreichende Menge an Lipid-Öl-Gemisch (>3 ml basierend auf der Kammergröße) in die Kammer, bis 60% -80% der Kammer gefüllt sind (Abbildung 1D, rechts). Zwischen dem Lipid-Öl-Gemisch und der äußeren Lösung wird eine Grenzfläche gebildet. Übertragen Sie ABPs (vorbereitet in Schritt 2.3.4) in die Aktinlösung. Mit einer normalen 100-1000 μL Pipette sofort die 700 μL des Lipid-Öl-Gemisches in das Aktin-ABP-Gemisch überführen (Abbildung 1E, links). Pipette auf und ab 8-mal, um zellgroße Lipid-Monolayer-Tröpfchen mit einem Durchmesser im Bereich von 7-100 μm zu erzeugen (Abbildung 1E, Mitte).HINWEIS: Schritt 2.7 muss in wenigen Sekunden abgeschlossen sein, um eine Aktin-Netzwerkbaugruppe vor der Kapselung zu vermeiden. Stellen Sie daher vor dem Ausführen des Schritts sicher, dass die Pipettenspitzen bereits in die Pipetten eingeführt wurden und bereit sind, die Mischungen zu übertragen. Mit der gleichen 100-1000 μL Pipette sofort die gesamte Emulsion in die rotierende Kammer dosieren. Tröpfchen erhalten ein zweites Blatt mit Lipiden, indem sie die Lipidmonoschicht an der Öl-Außenlösungs-Grenzfläche kreuzen und dadurch GUVs bilden (Abbildung 1E, rechts). Entfernen Sie die Kammer von der Rührplatte und entsorgen Sie den größten Teil der Lipid-Öl-Mischung, indem Sie die Kammer im Abfallbehälter kippen, so dass ein großer Teil des Lipid-Öl-Gemisches aus der großen Öffnung in der Mitte der Kammer abgelassen wird.HINWEIS: Auf diese Weise wird das Lipid-Öl-Gemisch aus der Kammer gezogen, wodurch im nächsten Schritt eine Vermischung des Lipid-Öl-Gemisches mit der äußeren Lösung vermieden wird. Halten Sie die Kammer mit dem Deckel zum Benutzer hin. Öffnen Sie den Kammerdeckel und neigen Sie die Kammer leicht zum Benutzer. Die Grenzfläche zwischen der äußeren Lösung, die GUVs enthält, und dem Lipid-Öl-Gemisch ist von der Kammeröffnung (wo sich der Deckel befindet) sichtbar. Sammeln Sie mit einer Pipette genügend äußere Lösung, die GUVs enthält, und dosieren Sie 50-300 μL der äußeren Lösung in eine 96-Well-Platte, um eine angemessene Dichte an GUVs zu erhalten.HINWEIS: Nach diesem Protokoll werden insgesamt etwa 2 x 105 GUVs in der äußeren Lösung innerhalb der Kammer freigesetzt. Die GUV-Dispersion wurde nicht quantifiziert; Der Durchmesser von etwa 90% der GUVs liegt jedoch im Bereich von 12-30 μm. GUVs mit einem beliebigen Durchmesser im Bereich von 7-50 μm können in der Bevölkerung gefunden werden. Abhängig vom gekapselten Dichtegradientenmedium, der GUV-Größe und der Lösungstiefe in der Bohrlochplatte dauert es 2-15 Minuten, bis sich GUVs auf der Oberfläche absetzen. Die Ausbeute von GUVs mit rekonstituierten Aktinbündeln beträgt etwa 90%. 3. Bildgebung und 3D-Bildrekonstruktion Stellen Sie die 96-Well-Platte auf dem Tisch eines inversen Mikroskops auf, das mit einer konfokalen Einheit mit rotierender Scheibe (oder Laserscanning), einer EMCCD- oder sCMOS-Kamera und einem 60-fachen Objektiv zum Eintauchen in Öl ausgestattet ist (siehe Materialtabelle). Konzentrieren Sie sich auf eine beliebige Region von Interesse (ROI) und nehmen Sie eine Z-Stack-Bildsequenz aus dem ROI mit einem Z-Step-Intervall von 0,5 μm.HINWEIS: Da GUVs im Laufe der Zeit leicht auf der Oberfläche verschoben werden können, wird empfohlen, an jeder Z-Ebene einen Satz von Bildern mit mehreren Wellenlängen aufzunehmen, wenn mehrere Fluorophore abgebildet werden, d. H. Nehmen Sie eine Gruppe von 561 nm und 488 nm Bildern an jeder Z-Lane gleichzeitig auf, um ATTO 488 Actin- und Rhod PE-Bilder aufzunehmen. Speichern Sie jede Z-Stack-Bildsequenz in .tiff Format. Öffnen Sie eine Bildsequenz von Interesse in einer Bildverarbeitungssoftware (ImageJ/Fidschi). Identifizieren Sie das Bild mit der höchsten Intensität. Halten Sie “Strg + Umschalt + C” gedrückt, um das Fenster Helligkeit und Kontrast zu öffnen, und klicken Sie auf Zurücksetzen. Gehen Sie im Menü ImageJ/Fiji zu Analyze > Set Scale und geben Sie den bekannten physischen Abstand und seine Einheit für jedes Bildpixel ein. Gehen Sie im ImageJ/Fiji-Menü zu Image > Stacks > 3D-Projekt , um ein 3D-Bild aus dem Z-Stack zu rekonstruieren. Legen Sie “Projektionsmethode” als Helligkeitspunkt, “Slice Spacecing (μm)” als 0,5 fest und aktivieren Sie das Häkchen Interpolate. Die Standardoptionen können für den Rest der Einstellungen verwendet werden.HINWEIS: Z-Intervalle in einigen Mikroskopen sind möglicherweise nicht kalibriert, und die tatsächliche Bewegung in z-Richtung kann geringfügig vom eingegebenen z-Intervall abweichen (d. h. 0,5 μm). In solchen Fällen kann eine 3D-Kalibrierprobe wie fluoreszierende Mikrokugeln mit einem bekannten Durchmesser verwendet werden, um das tatsächliche z-Intervall zu erhalten. Dieser Wert wird somit als “Slice Spacing (μm)” für die 3D-Projektion verwendet.

Representative Results

Um die erfolgreiche Erzeugung von zytoskelettalen GUVs unter Verwendung des aktuellen Protokolls zu demonstrieren, wurden Fascin-Aktin-Bündelstrukturen in GUVs rekonstituiert. Fascin ist ein kurzer Vernetzer von Aktinfilamenten, der steife parallel ausgerichtete Aktinbündel bildet und als Glutathion-S-Transferase (GST) Fusionsprotein26 aus E. coli gereinigt wird. Zunächst wurden 5 μM Aktin rekonstituiert, darunter 0,53 μM ATTO488-Aktin im Aktinpolymerisationspuffer und 7,5 % des Dich…

Discussion

Verschiedene Methoden zur Erzeugung von GUVs wurden für die Erzeugung synthetischer Zellen erforscht Die Komplexität der Verfahren, die verlängerte Zeit bis zur Verkapselung, die Einschränkung der Lipidtypen und die molekulare Zusammensetzung des Verkapselungsmittels, der Bedarf an nichtphysiologischen Chemikalien zur Erleichterung der Verkapselung, die geringe GUV-Ausbeute und die Inkonsistenzen bei der Verkapselungseffizienz haben die Forscher auf diesem Gebiet weiterhin herausgefordert. In Anbetracht der breiten P…

Materials

18:1 Liss Rhod PE lipid in chloroform	Avanti Polar Lipids	810150C
96 Well Optical Btm Pit PolymerBase	ThermoFisher Scientific	165305
Actin from rabbit skeletal muscle	Cytoskeleton	AKL99-A
ATTO 488-actin from rabbit skeletal muscle	Hypermol	8153-01
Axygen microtubes (200 µL)	Fisher Scientific	14-222-262	for handling ABPs
Black resin	Formlabs	RS-F2-GPBK-04
Cholesterol (powder)	Avanti Polar Lipids	700100P
Choloroform	Sigma Aldrich	67-66-3
Clear resin	Formlabs	RS-F2-GPCL-04
CSU-X1 Confocal Scanner Unit	YOKOGAWA	CSU-X1
Density gradient medium (Optiprep)	Sigma-Aldrich	D1556
DOPC lipid in chloroform	Avanti Polar Lipids	850375C
Fascin	homemade	N/A
F-buffer	homemade	N/A
Fisherbrand microtubes (1.5 mL)	Fisher Scientific	05-408-129
FS02 Sonicator	Fischer Scientific	FS20
G-buffer	homemade	N/A
Glucose	Sigma-Aldrich	158968
iXon X3 camera	Andor	DU-897E-CS0
Mineral oil	Acros Organics	8042-47-5
Olympus IX81 Inverted Microscope	Olympus	IX21
Olympus PlanApo N 60x Oil Microscope Objective	Olumpus	1-U2B933
Silicone oil	Sigma-Aldrich	317667