Summary
Denne artikkelen introduserer en enkel metode for rask produksjon av gigantiske unilamellar vesikler med innkapslede cytoskeletale proteiner. Metoden viser seg å være nyttig for nedenfra-og-opp-rekonstituering av cytoskeletale strukturer i innesperring og cytoskjelettmembraninteraksjoner.
Abstract
Giant unilamellar vesicles (GUVs) brukes ofte som modeller av biologiske membraner og er dermed et flott verktøy for å studere membranrelaterte cellulære prosesser in vitro. De siste årene har innkapsling innen GUVs vist seg å være en nyttig tilnærming for rekonstitueringsforsøk i cellebiologi og relaterte felt. Det etterligner bedre innesperringsforhold inne i levende celler, i motsetning til konvensjonell biokjemisk rekonstituering. Metoder for innkapsling i GUVer er ofte ikke enkle å implementere, og suksessrater kan variere betydelig fra lab til lab. En teknikk som har vist seg å være vellykket for å innkapsle mer komplekse proteinsystemer kalles kontinuerlig dråpegrensesnitt kryssing innkapsling (cDICE). Her presenteres en cDICE-basert metode for raskt innkapsling av cytoskeletale proteiner i GUVer med høy innkapslingseffektivitet. I denne metoden genereres først lipidmonolayerdråper ved å emulgere en proteinløsning av interesse for en lipid / oljeblanding. Etter å ha blitt lagt inn i et roterende 3D-trykt kammer, passerer disse lipid-monolagede dråpene deretter gjennom et annet lipidmonolayer ved et vann / oljegrensesnitt inne i kammeret for å danne GUVer som inneholder proteinsystemet. Denne metoden forenkler den generelle prosedyren for innkapsling i GUVer og fremskynder prosessen, og lar oss dermed begrense og observere den dynamiske utviklingen av nettverksmontering inne i lipidbilayer vesikler. Denne plattformen er nyttig for å studere mekanikken til cytoskjelettmembraninteraksjoner i innesperring.
Introduction
Lipid bilayer-rom brukes som modellsyntetiske celler for å studere lukkede organiske reaksjoner og membranbaserte prosesser eller som bæremoduler i legemiddelleveringsapplikasjoner 1,2. Bunn-opp biologi med rensede komponenter krever minimale eksperimentelle systemer for å utforske egenskaper og interaksjoner mellom biomolekyler, som proteiner og lipider 3,4. Men med utviklingen av feltet er det et økt behov for mer komplekse eksperimentelle systemer som bedre etterligner forholdene i biologiske celler. Innkapsling i GUVs er en praktisk tilnærming som kan tilby noen av disse cellelignende egenskapene ved å gi en deformerbar og selektivt gjennomtrengelig lipidbilayer og et begrenset reaksjonsrom. Spesielt kan in vitro rekonstituering av cytoskeletalsystemer, som modeller av syntetiske celler, dra nytte av innkapsling i membranrom5. Mange cytoskeletale proteiner binder og samhandler med cellemembranen. Ettersom de fleste cytoskeletale samlinger danner strukturer som spenner over hele cellen, bestemmes formen naturlig av cellestørrelsessperre6.
Ulike metoder brukes til å generere GUVs, for eksempel hevelse 7,8, liten vesicle fusion 9,10, emulsjon overføring11,12, pulsert jetting13, og andre mikrofluidiske tilnærminger14,15. Selv om disse metodene fortsatt brukes, har hver sine begrensninger. Dermed er en robust og grei tilnærming med høyt utbytte av GUV-innkapsling svært ønskelig. Selv om teknikker som spontan hevelse og elektroswelling er allment vedtatt for dannelsen av GUVer, er disse metodene først og fremst kompatible med spesifikke lipidsammensetninger16, lave saltkonsentrasjonsbuffere17, mindre innkapslet molekylær størrelse18, og krever et høyt volum av innkapslingen. Fusing flere små vesicles inn i en GUV er iboende energisk ugunstig, og krever dermed spesifisitet i ladede lipidsammensetninger9 og / eller eksterne fusjonsinduserende midler, for eksempel peptider19 eller andre kjemikalier. Emulsjonsoverføring og mikrofluidiske metoder kan derimot kreve dråpestabilisering gjennom overflateaktiv og fjerning av løsningsmiddel etter bilayerdannelse, henholdsvis18,20. Kompleksiteten i eksperimentelt oppsett og enhet i mikrofluidiske teknikker som pulserende jetting pålegger en ekstra utfordring21. cDICE er en emulsjonsbasert metode avledet fra lignende prinsipper som regulerer emulsjonsoverføring22,23. En vandig løsning (ytre løsning) og en lipidoljeblanding stratifiseres av sentrifugalkrefter i et roterende sylindrisk kammer (cDICE-kammer) som danner et lipidmettet grensesnitt. Shuttling lipid monolayered vandige dråper inn i roterende cDICE kammeret resulterer i zipping av en bilayer som dråper krysse lipid-mettet grensesnitt inn i den ytre vandig løsning22,24. CDICE-tilnærmingen er en robust teknikk for GUV-innkapsling. Med den presenterte modifiserte metoden oppnås ikke bare det høye vesicleutbyttet som er typisk for cDICE med en betydelig kortere innkapslingstid (noen få sekunder), men GUV-generasjonstid som tillater observasjon av tidsavhengige prosesser (f.eks. aktin cytoskeletal nettverksdannelse) reduseres betydelig. Protokollen tar omtrent 15-20 minutter fra starten til GUV-innsamling og avbildning. Her er GUV-generasjonen beskrevet ved hjelp av den modifiserte cDICE-metoden for å innkapsle aktin- og aktinbindende proteiner (ABPer). Den presenterte teknikken gjelder imidlertid for å innkapsle et bredt spekter av biologiske reaksjoner og membraninteraksjoner, fra montering av biopolymerer til cellefritt proteinuttrykk til membranfusjonsbasert lastoverføring.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fremstilling av olje-lipidblanding
MERK: Trinnet må utføres i en avtrekkshette etter alle sikkerhetsretningslinjene for håndtering av kloroform.
- Ta 0,5 ml kloroform i et 15 ml hetteglass med glass. Tilsett 88 μL 25 mg/ml dioleoyl-fosfokolin (DOPC), 9,3 μL 50 mg/ml kolesterol og 5 μL 1 mg/ml dioleoyl-fosfoetanolamin-lissamin rhodamin B (rhodamin PE) (se Materialtabellen) i hetteglasset med 15 ml glass.
MERK: De endelige molefraksjonene av DOPC og kolesterol i silikonolje / mineralolje er henholdsvis 69,9% og 30%. Det ble fastslått at 20-30 mol% kolesterol er en optimalisert konsentrasjon for membranfluiditet og stabilitet av GUVer generert ved hjelp av den presenterte teknikken25,26. Fysiologisk er disse verdiene godt innenfor kolesterolkonsentrasjonsområdet som finnes i pattedyrcelleplasmamembraner6. Lipidbestandene er anskaffet som løsninger i kloroform og lagres ved -20 °C. Lipid lager hetteglass bør akklimatiseres til romtemperatur før de åpnes. - Pipette 7,2 ml silikonolje og 1,8 ml mineralolje i et annet 15 ml hetteglass (se Materialfortegnelse). Generelt må dette gjøres i en lavfuktighetshanskeboks, hovedsakelig hvis mineraloljen gjenbrukes.
- Bland oljene ved å virvelere med maksimal rotasjonshastighet (3200 rpm) i 10 s, tilsett blandingen til hetteglasset som inneholder lipid-i-kloroformblandingen og legg den umiddelbart på virvelblanderen. Virvel for 10-15 s ved maksimal rotasjonshastighet (3200 rpm). Den resulterende lipid-i-olje-blandingen skal være litt overskyet, da lipidene ikke er helt oppløst i oljen, men heller spredt som små aggregater24.
- Sett lipid-i-olje-dispersjonen i en badesoniker (se Materialtabell) med ultralydskraft på 80 W og driftsfrekvens på 40 kHz ved romtemperatur i 30 minutter. Bruk blandingen umiddelbart eller oppbevar den ved 4 °C i maksimalt 24 timer.
2. Vesicle generasjon
- Monter den 3D-trykte akselen (tilleggsfil 1) laget av svart harpiks (se Materialbord) på røreplaten på benken og sett rotasjonshastigheten til 1200 o/min.
- Monter det 3D-trykte cDICE-kammeret (tilleggsfil 2) laget av klar harpiks (se Materialbord) på akselen (figur 1A,B).
- Forbered aktin- og aktinbindende proteiner (ABP) oppløsninger separat i et totalt volum på 20 μL.
- Klargjør 1-10 μM aktin i kuleformet aktinbuffer (G-buffer), inkludert 10 % ATTO 488 aktin (se Materialfortegnelse).
MERK: 1x G-buffer består av 5 mM Tris-HCl, pH 8,0 og 0,2 mM CaCl2. - Tilsett filamentøs aktinpolymerisasjonsbuffer (F-buffer) for å begynne aktinpolymerisering på is. Hold løsningene på is for å bremse aktinpolymerisering før tilsetning av en krysskobling.
MERK: 1x F-bufferen inneholder 50 mM KCl, 2 mM MgCl2 og 3 mM ATP i 10 mM Tris, pH 7,5. - Vent i 15 min for å tillate initiering av aktinpolymerisering på is før du legger til krysskoblinger av interesse ved ønsket molarforhold. Hold oppløsningen på is til innkapsling.
- Forbered aktinbindende proteiner (ABPer) separat i et mikrorør (figur 1C).
MERK: Dette trinnet utføres når en kombinasjon av ABPer (f.eks. myosin, α-aktinin, fascin, Arp2/3 kompleks) innkapsler med aktin 25,26,27. I slike tilfeller trekkes ønsket mengde av hver ABP fra aksjen og legges til mikrotuben som er utpekt for ABPer. Siden den totale løsningen skal være 20 μL, må lager aliquots av ABPer fremstilles slik at ønsket mengde av den totale ABP-blandingen ikke overstiger 5-6 μL. Den eneste ABP som brukes i de representative resultatene her er fascin, hvis forberedelse er nevnt nedenfor.- Aliquot 1,57 μL fascin fra en 1,75 mg/ml fascinbestand (se Materialtabell), og legg direkte til aktinløsningen i trinn 2.7. Dette tilsvarer 2,5 μM fascin i løsningen.
- Klargjør 1-10 μM aktin i kuleformet aktinbuffer (G-buffer), inkludert 10 % ATTO 488 aktin (se Materialfortegnelse).
- Tilsett 7,5 % av tetthetsgradientmediet (se Materialtabell) i aktinløsningen for å skape en tetthetsgradient mellom den ytre og den indre vandige fasen for å lette GUV-sedimenteringen.
- Dispenser 700 μL av den ytre løsningen på 200 mM glukose i kammeret (figur 1D, venstre).
MERK: Osmolariteten til den indre løsningen bestemmer konsentrasjonen av glukose. For disse forsøkene er osmolariteten til den indre løsningen ~ 200 mOsm, så en 200 mM glukoseløsning brukes som den ytre løsningen. - Tilsett tilstrekkelig mengde lipidoljeblanding (>3 ml basert på kammerstørrelsen) i kammeret til 60% -80% av kammeret er fylt (figur 1D, høyre). Et grensesnitt vil bli dannet mellom lipidoljeblandingen og den ytre løsningen.
- Overfør ABPer (utarbeidet i trinn 2.3.4) til aktinløsningen. Bruk en vanlig 100-1000 μL pipette, overfør umiddelbart 700 μL lipidoljeblandingen til aktin-ABP-blandingen (figur 1E, venstre). Pipette opp og ned 8 ganger for å generere lipidmonolayerdråper i cellestørrelse med en diameter på 7-100 μm (figur 1E, midten).
MERK: Trinn 2.7 må fullføres om noen sekunder for å unngå aktinnettverkssamling før innkapsling. Før du utfører trinnet, må du derfor sørge for at pipettespissene allerede er satt inn i pipettene og klar til å overføre blandingene. - Bruk samme 100-1000 μL pipette, dispenser straks hele emulsjonen inn i det roterende kammeret. Dråper vil skaffe seg et nytt brosjyre med lipider ved å krysse lipidmonolayeren ved det oljeut ytre løsningsgrensesnittet, og dermed danne GUVer (figur 1E, høyre).
- Fjern kammeret fra røreplaten og kast mesteparten av lipidoljeblandingen ved å vippe kammeret i avfallsbeholderen slik at en stor del av lipidoljeblandingen dreneres fra den store åpningen i midten av kammeret.
MERK: På denne måten trekkes lipidoljeblandingen av kammeret, og unngår blanding av lipidoljeblanding med den ytre løsningen i neste trinn. - Hold kammeret med lokket vendt mot brukeren. Åpne kammerlokket og vipp kammeret litt mot brukeren. Grensesnittet mellom den ytre løsningen som inneholder GUVer og lipidoljeblandingen er synlig fra kammeråpningen (hvor lokket er plassert).
- Bruk en pipette til å samle nok ytre oppløsning som inneholder GUVer, og dispenser 50-300 μL av den ytre løsningen i en 96-brønnsplate for å oppnå en passende tetthet av GUVer.
MERK: Etter denne protokollen frigjøres totalt ca. 2 x 105 GUVer i den ytre løsningen inne i kammeret. GUV-dispersjonen ble ikke kvantifisert; Diameteren på ca 90% av GUVs er imidlertid i området 12-30 μm. GUVer med en hvilken som helst diameter i området 7-50 μm finnes i befolkningen. Avhengig av innkapslet tetthetsgradientmedium, GUV-størrelse og løsningsdybde i brønnplaten, tar det 2-15 min for GUVer å slå seg ned på overflaten. Utbyttet av GUVer med rekonstituerte aktinbunter er ca. 90%.
3. Avbildning og 3D-bilderekonstruksjon
- Sett opp 96-brønnplaten på scenen til et invertert mikroskop utstyrt med en roterende disk (eller laserskanning) konfokal enhet, en EMCCD- eller et SCMOS-kamera og et objektivt objektiv for olje nedsenking (se Materialfortegnelse).
- Fokuser på et hvilket som helst interesseområde (ROI) og ta en z-stack bildesekvens fra avkastningen med et z-trinns intervall på 0,5 μm.
MERK: Fordi GUVer kan være litt forskjøvet på overflaten over tid, anbefales det å ta et multibølgelengdesett med bilder på hvert z-plan hvis flere fluoroforer blir avbildet, det vil si ta en gruppe på 561 nm og 488 nm bilder på hver z-bane om gangen for å fange ATTO 488 aktin- og Rhod PE-bilder. - Lagre hver z-stack-bildesekvens i .tiff-format.
- Åpne en bildesekvens av interesse for en bildebehandlingsprogramvare (ImageJ/Fiji). Identifiser bildet med høyest intensitet. Hold inne "ctrl + skift + c" for å åpne Lysstyrke &kontrast-vinduet og klikk på Tilbakestill.
- Gå til Analyser > Angi skala på ImageJ/Fiji-menyen, og angi den kjente fysiske avstanden og enheten for hver bildepiksel.
- Gå til Image > Stacks > 3D-prosjekt på ImageJ /Fiji-menyen for å rekonstruere et 3D-bilde fra z-stakken. Angi "Projeksjonsmetode" som Lysstyrkepunkt, "Stykkeavstand (μm)" som 0,5, og merk interpolering. Standardalternativene kan brukes for resten av innstillingene.
MERK: z-intervaller i enkelte mikroskoper er kanskje ikke kalibrert, og den faktiske bevegelsen i z-retning kan avvike noe fra det angitte z-intervallet (dvs. 0,5 μm). I slike tilfeller kan en 3D-kalibreringsprøve som fluorescerende mikrosfærer med kjent diameter brukes til å oppnå det faktiske z-intervallet. Denne verdien vil dermed bli brukt som "Stykkeavstand (μm)" for 3D-projeksjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For å demonstrere den vellykkede generasjonen av cytoskeletale GUVer ved hjelp av den nåværende protokollen, ble fascin-actinbuntstrukturer i GUVer rekonstituert. Fascin er en kort krysskobling av aktinfilamenter som danner stive parallelljusterte aktinbunter og renses fra E. coli som Glutathione-S-Transferase (GST) fusjonsprotein26. 5 μM aktin ble først rekonstituert, inkludert 0,53 μM ATTO488 aktin i aktinpolymerisasjonsbufferen og 7,5% av tetthetsgradientmediet. Ved tilsetning av fascin i en konsentrasjon på 2,5 μM og innkapsling av fascin-aktinblandingen, ble aktinbuntstrukturer dannet i GUVer. Z-stack konfokale bildesekvenser av de innkapslede aktinbuntstrukturene i de rhodamin PE-merkede GUVene ble fanget opp 1 t etter innkapsling (figur 2A). Ved hjelp av denne protokollen ble iboende konkurranse og sortering av de innkapslede actin crosslinkers, α-actinin og fascin, som sammen danner forskjellige aktinbuntmønstre på en GUV-størrelsesavhengig måte, tidligere demonstrert26.
Som den modifiserte inverterte emulsjonsmetoden som presenteres her, genererer den tradisjonelle cDICE-prosessen cytoskeletal GUVs med høyt utbytte, men krever likevel en sprøytepumpe og røroppsett for kontrollert injeksjon av proteinoppløsning i det roterende kammeret ved lave strømningshastigheter i størrelsesorden nanoliter per sekund22,28. I denne tilnærmingen genereres emulsjonen direkte i det roterende cDICE-kammeret; en tynn kapillær settes inn i oljefasen. Proteinoppløsningen injiseres gjennom en sprøytepumpe. Dråper dannes og skjæres av på kapillærspissen før de beveger seg mot den vandige ytre fasen, hvor de blir til GUVs, som ligner metoden beskrevet ovenfor. Figur 2B viser vesikler som innkapsler en reaksjonsblanding ved hjelp av denne tilnærmingen. Reaksjonsblandingen inneholder 6 μM aktin som er buntet med 0,9 μM fascin. Her sammenlignes ikke de to metodene og resultatene deres, men bemerker at de begge genererer et høyt utbytte av GUVer.
Figur 1: Eksperimentelt oppsett for generering av GUVer. (A) Ovenfra og sidedelvisning av cDICE-kammeret. (B) Bilder av oppsettet for det roterende kammeret. (C-E) Skjematiske illustrasjoner av trinnvise prosedyrer for generering av GUVer. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Innkapsling av aktinbuntstrukturer. (A) Bildene viser representative fluorescensfokale skiver av GUVer (venstre) og maksimale projeksjoner av en konfokal z-stabel med aktin- og lipidkanaler (høyre). Fascin, 2,5 μM; 5 μM (inkludert 10 % ATTO 488 aktin). Skalastang = 10 μm. (B) Innkapsling av aktinbuntstrukturer ved hjelp av konvensjonell cDICE. Bildet viser en representativ maksimal projeksjon av konfokale fluorescensbilder av innkapslede aktinbunter dannet i nærvær av fascin. Fascin, 0,9 μM; Actin, 6 μM. Skalastang = 10 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tilleggsfil 1: 3D-trykt akseldesign. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfil 2: Design for det 3D-trykte cDICE-kammeret. Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ulike metoder for å generere GUVs har blitt utforsket for etablering av syntetiske celler Men kompleksiteten i prosedyrene, utvidet tid til å oppnå innkapsling, begrensning av lipidtyper og molekylær sammensetning av innkapslingen, behovet for ikke-fysiologiske kjemikalier for å lette innkapsling, lavt GUV-utbytte og inkonsekvenser i innkapslingseffektivitet har fortsatt å utfordre forskere på dette feltet. Tatt i betraktning det brede spekteret av potensielle studier som kan tas i gang i bunn-opp syntetisk biologi, en sømløs høy gjennomstrømning GUV innkapsling tilnærming som er kompatibel med ulike lipid komposisjoner og kan innkapsle noen molekyler uavhengig av størrelse kan anspore nye muligheter til å studere komplekse biomimicking syntetiske systemer. CDICE-metoden har eliminert de fleste utfordringer og begrensninger knyttet til tidligere GUV-generasjonsmetoder.
Tilnærmingen og styrende prinsipper for å generere GUVer ved hjelp av cDICE-metoden predates plattformen og har blitt implementert i tidligere teknikker som omvendt emulsjon overføring12. Imidlertid har den omvendte emulsjonsoverføringsmetoden begrensninger som lavt vesicleutbytte og heterogenitet av vesikler. For cDICE-metoden som presenteres her, spres lipider i olje i form av aggregater av titalls nanometer (størrelsen på lipidaggregatet er avhengig av den totale konsentrasjonen av lipider)24. Dispersjon av lipider er i to blandbare oljer, hvor en (mineralolje) kan oppløse lipider og en annen olje (silisiumolje) som ikke er blandbar med lipider. Dette skaper lipidaggregat coacervates ved hjelp av løsningsmiddelskiftende29. Denne spesielle dispersjonsmetoden letter øyeblikkelig monolayermetning av vandige dråper og raskere fornyelse av lipider ved det olje-vandige grensesnittet som vandige dråper krysser kontinuerlig det lipidmettede olje-vandige grensesnittet. Dette forbedrer også senere bilayer zipping for å danne GUVs og øker GUV-gjennomstrømningen. Sentrifugalkreftene som genereres av det roterende kammeret, er optimale for å lukke polydisperserte dråper over det lipidmettede grensesnittet. Den opprinnelige versjonen av cDICE-metoden benytter en mikrokapillær dyse for å injisere den indre løsningen i oljelipidblandingen. I denne tilnærmingen genererer skjærekrefter skapt av den roterende oljelipidblandingen vandige dråper, og forvandles til slutt til GUVer som beskrevet. Men med den hensikt å redusere tiden det tar å forberede injeksjonsplattformen, spesielt kritisk for raske reaksjoner, for eksempel aktinnettverksmontering og potensiell tilstopping av mikrokapselen, genereres vandige dråper med lipidmonolayers nå ved å legge olje-lipidblandingen direkte til den indre løsningen og pipettering opp og ned. Denne tilnærmingen eliminerer tidsforsinkelsen i GUV-innkapsling for et raskt reaksjonseksperiment.
Blant utfordringene forårsaket av tidligere GUV-generasjonsmetoder er begrensningen av lipidtyper (ladning av lipid og fase av lipid) avhengig av teknikken for GUV-generasjon. Flere lipidtyper, inkludert DOPC, dioleoyl-glysero-hosfoserin (DOPS), dioleoyl-glysero-succinat (DGS), dimyristoyl-glysero-fosfocholin (DMPC), og kombinasjoner av forskjellige lipider og kolesterol ved varierende konsentrasjoner ble testet. For alle forhold er cDICE-metoden vist å danne GUVer med høy innkapslingseffektivitet med et konsekvent høyt GUV-utbytte. Videre har cDICE-metoden også vist seg å effektivt innkapsle forskjellige cellulære komponenter, inkludert cytoskeletale proteiner, cellefrie uttrykksreaksjoner, trengselsmidler, fargestoffer og andre cellulære molekyler av forskjellige størrelser uten tap av innkapslingseffektivitet eller redusert gjennomstrømning. Videre, som normale inverterte emulsjonsoverføringsmetoder30, kan den modifiserte cDICE potensielt tillate generering av asymmetriske GUVer for fremtidig arbeid. Ulike lipidsammensetninger kan brukes til det indre pakningsvedlegget og det ytre pakningsvedlegget siden monolayerdråper dannes separat (inne i et mikrorør ved å pipettere opp og ned) før du zipper bilayeren inne i cDICE-kammeret. Sedimentering av lipider observeres når lipidoljeblandingen holdes lenge; Imidlertid kan man ganske enkelt virvel lipidoljeblandingen før innkapsling for å re-spre lipidaggregater. Det er viktig å merke seg at innkapslingskvaliteten kan bli kompromittert når lipidoljeblandingene holdes lengre, som indikert av mer signifikante enn vanlige lipidaggregater i lipidoljeblandingen. Selv om de ikke er testet, kan disse aggregatene potensielt føre til ufullkommenhet i bilayerglidelås, og aggregatene kan også ende opp med å bli innkapslet med indre løsning som kompromitterer ønsket kjemisk miljø.
Begrensningen av den presenterte modifiserte tilnærmingen til å danne vandige dråper er å generere ensartethet i størrelsen på dråper. Selv om dette kan forbedres ved å bruke mikrokapillær injeksjon av indre oppløsning med forskjellige strømningshastigheter for å regulere GUV-størrelser, er det mindre ønskelig å overvåke raske reaksjoner som aktinmontering i innkapslede GUVer. Ved å lage dråper ved å pipettere opp og ned som resulterer i forskjellige GUV-størrelser, kan man analysere populasjoner av lignende størrelse vesicles. Bekymringer om mulig oljeretensjon hos bilayers hindrer vedtakelsen av de fleste GUV-generasjonsteknikker, inkludert emulsjonsbaserte GUV-generasjonsteknikker som cDICE21. Imidlertid kan mengden olje som er igjen i membranen reduseres ved å bruke organiske midler som 1-oktanol, som kan fjernes etter å ha generert vesiklene31,32. Fremtidige modifikasjoner på metoden, muligens ved å endre løsningsmiddelsammensetning, må undersøkes.
Det er mange områder i bunn-opp syntetisk biologi som ennå ikke er undersøkt og kanskje krever celle-etterligning innesperring av GUVs. Slike eksperimentelle bestrebelser krever GUV-generasjonsplattformer som cDICE for å generere GUVer robust mens de effektivt innkapsler ulike molekyler av interesse. Mange cellulære prosesser forekommer raskere enn tiden det tar å innkapsle molekyler ved hjelp av tidligere GUV-generasjonsteknikker. Som beskrevet her, er aktinløsninger innkapslet raskt nok til å observere vesicle deformasjon som følge av aktin nettverksmontering. Slike syntetiske celler med rekonstituert aktin cytoskeleton har avslørt funksjoner i actin nettverksorganisasjon i nærvær av forskjellige krysskoblinger 5,25,33 og membran ombygging 25,27,28. De vil inspirere til fremtidig arbeid for å skape mer sofistikerte syntetiske celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
APL anerkjenner støtte fra humboldtstipend for erfarne forskere og fra National Science Foundation (1939310 og 1817909) og National Institutes of Health (R01 EB030031).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 18:1 Liss Rhod PE lipid in chloroform | Avanti Polar Lipids | 810150C | |
| 96 Well Optical Btm Pit PolymerBase | ThermoFisher Scientific | 165305 | |
| Actin from rabbit skeletal muscle | Cytoskeleton | AKL99-A | |
| ATTO 488-actin from rabbit skeletal muscle | Hypermol | 8153-01 | |
| Axygen microtubes (200 µL) | Fisher Scientific | 14-222-262 | for handling ABPs |
| Black resin | Formlabs | RS-F2-GPBK-04 | |
| Cholesterol (powder) | Avanti Polar Lipids | 700100P | |
| Choloroform | Sigma Aldrich | 67-66-3 | |
| Clear resin | Formlabs | RS-F2-GPCL-04 | |
| CSU-X1 Confocal Scanner Unit | YOKOGAWA | CSU-X1 | |
| Density gradient medium (Optiprep) | Sigma-Aldrich | D1556 | |
| DOPC lipid in chloroform | Avanti Polar Lipids | 850375C | |
| Fascin | homemade | N/A | |
| F-buffer | homemade | N/A | |
| Fisherbrand microtubes (1.5 mL) | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| FS02 Sonicator | Fischer Scientific | FS20 | |
| G-buffer | homemade | N/A | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | 158968 | |
| iXon X3 camera | Andor | DU-897E-CS0 | |
| Mineral oil | Acros Organics | 8042-47-5 | |
| Olympus IX81 Inverted Microscope | Olympus | IX21 | |
| Olympus PlanApo N 60x Oil Microscope Objective | Olumpus | 1-U2B933 | |
| Silicone oil | Sigma-Aldrich | 317667 |
References
- Groaz, A., et al. Engineering spatiotemporal organization and dynamics in synthetic cells. Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology. 13 (3), 1685 (2021).
- Diltemiz, S. E., et al. Use of artificial cells as drug carriers. Materials Chemistry Frontiers. 5, 6672-6692 (2021).
- Liu, A. P., Fletcher, D. A. Biology under construction: In vitro reconstitution of cellular function. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (9), 644-650 (2009).
- Ganzinger, K. A., Schwille, P. More from less - bottom-up reconstitution of cell biology. Journal of Cell Science. 132 (4), 227488 (2019).
- Bashirzadeh, Y., Liu, A. P. Encapsulation of the cytoskeleton: Towards mimicking the mechanics of a cell. Soft Matter. 15 (42), 8425-8436 (2019).
- Blanchoin, L., Boujemaa-Paterski, R., Sykes, C., Plastino, J. Actin dynamics, architecture, and mechanics in cell motility. Physiol reviews. 94 (1), 235-263 (2014).
- Angelova, M. I., Dimitrov, D. S.
- Tsumoto, K., Matsuo, H., Tomita, M., Yoshimura, T. Efficient formation of giant liposomes through the gentle hydration of phosphatidylcholine films doped with sugar. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 68 (1), 98-105 (2009).
- Bailey, A. L., Cullis, P. R. Membrane fusion with cationic liposomes: Effects of target membrane lipid composition. Biochemistry. 36 (7), 1628-1634 (1997).
- Haluska, C. K., Riske, K. A., Marchi-Artzner, V., Lehn, J. M., Lipowsky, R., Dimova, R. Time scales of membrane fusion revealed by direct imaging of vesicle fusion with high temporal resolution. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (43), 15841-15846 (2006).
- Nishimura, K., Suzuki, H., Toyota, T., Yomo, T. Size control of giant unilamellar vesicles prepared from inverted emulsion droplets. Journal of Colloid and Interface Science. 376 (1), 119-125 (2012).
- Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A. Production of unilamellar vesicles using an inverted emulsion. Langmuir. 19 (7), 2870-2879 (2003).
- Stachowiak, J. C., Richmond, D. L., Li, T. H., Liu, A. P., Parekh, S. H., Fletcher, D. A. Unilamellar vesicle formation and encapsulation by microfluidic jetting. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (12), 4697-4702 (2008).
- Noireaux, V., Liu, A. P. The new age of cell-free biology. Annual Review of Biomedical Engineering. 22, 51-77 (2020).
- Ho, K. K. Y., Murray, V. L., Liu, A. P. Engineering artificial cells by combining HeLa-based cell-free expression and ultrathin double emulsion template. Methods in Cell Biology. , 303-318 (2015).
- Akashi, K., Miyata, H., Itoh, H., Kinosita, K. Preparation of giant liposomes in physiological conditions and their characterization under an optical microscope. Biophysical Journal. 71 (6), 3242-3250 (1996).
- Méléard, P., Bagatolli, L. A., Pott, T. Giant unilamellar vesicle electroformation: From lipid mixtures to native membranes under physiological conditions. Methods in Enzymology. 465, 161-176 (2009).
- Walde, P., Cosentino, K., Engel, H., Stano, P. Giant vesicles: Preparations and applications. ChemBioChem. 11 (7), 848-865 (2010).
- Pécheur, E. I., Martin, I., Ruysschaert, J. M., Bienvenüe, A., Hoekstra, D. Membrane fusion induced by 11-mer anionic and cationic peptides: A structure− function study. Biochemistry. 37 (8), 2361-2371 (1998).
- Morigaki, K., Walde, P. Giant vesicle formation from oleic acid/sodium oleate on glass surfaces induced by adsorbed hydrocarbon molecules. Langmuir. 18 (26), 10509-10511 (2002).
- Majumder, S., Wubshet, N., Liu, A. P. Encapsulation of complex solutions using droplet microfluidics towards the synthesis of artificial cells. Journal of Micromechanics and Microengineering. 29 (8), 83001 (2019).
- Abkarian, M., Loiseau, E., Massiera, G. Continuous droplet interface crossing encapsulation (cDICE) for high throughput monodisperse vesicle design. Soft Matter. 7 (10), 4610-4614 (2011).
- Van de Cauter, L., et al. Optimized cDICE for efficient reconstitution of biological systems in giant unilamellar vesicles. ACS Synthetic Biology. 10 (7), 1690-1702 (2021).
- Claudet, C., In, M., Massiera, G. Method to disperse lipids as aggregates in oil for bilayers production. The European Physical Journal E. 39 (1), 1-6 (2016).
- Bashirzadeh, Y., Wubshet, N. H., Liu, A. P. Confinement Geometry tunes fascin-actin bundle structures and consequently the shape of a lipid bilayer vesicle. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 610277 (2020).
- Bashirzadeh, Y., et al. Actin crosslinker competition and sorting drive emergent GUV size-dependent actin network architecture. Communications Biology. 4, 1136 (2021).
- Bashirzadeh, Y., Moghimianavval, H., Liu, A. P. Encapsulated actomyosin patterns drive cell-like membrane shape changes. bioRxiv. , (2021).
- Litschel, T., et al.
- Vitale, S. A., Katz, J. L. Liquid droplet dispersions formed by homogeneous liquid− liquid nucleation:"The Ouzo effect.". Langmuir. 19 (10), 4105-4110 (2003).
- Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A.
- Deshpande, S., Dekker, C. On-chip microfluidic production of cell-sized liposomes. Nature Protocols. 13 (5), 856-874 (2018).
- Deshpande, S., Caspi, Y., Meijering, A. E. C., Dekker, C. Octanol-assisted liposome assembly on chip. Nature Communications. 7, 10447 (2016).
- Wubshet, N. H., Bashirzadeh, Y., Liu, A. P. Fascin-induced actin protrusions are suppressed by dendritic networks in GUVs. Molecular Biology of the Cell. 32 (18), 1634-1640 (2021).
