Summary
Bu makalede, kapsüllenmiş sitoiskelet proteinleri ile dev unilamellar veziküllerin hızlı üretimi için basit bir yöntem tanıtılmaktadır. Yöntemin, hapsetmede ve sitoiskelet-membran etkileşimlerinde sitoiskelet yapılarının aşağıdan yukarıya doğru resulaştırılmasında yararlı olduğu kanıtlanmıştır.
Abstract
Dev unilamellar veziküller (GUV'ler) sıklıkla biyolojik membran modelleri olarak kullanılır ve bu nedenle membranla ilişkili hücresel süreçleri in vitro olarak incelemek için harika bir araçtır. Son yıllarda, GUV'lar içindeki kapsüllemenin, hücre biyolojisi ve ilgili alanlarda sulandırma deneyleri için yararlı bir yaklaşım olduğu kanıtlanmıştır. Geleneksel biyokimyasal sulandırmanın aksine, canlı hücrelerin içindeki hapsedilme koşullarını daha iyi taklit eder. GUV'lar içinde kapsülleme yöntemlerinin uygulanması genellikle kolay değildir ve başarı oranları laboratuvardan laboratuvara önemli ölçüde farklılık gösterebilir. Daha karmaşık protein sistemlerini kapsüllemek için başarılı olduğu kanıtlanmış bir teknik, sürekli damlacık arayüzü çapraz kapsüllemesi (cDICE) olarak adlandırılır. Burada, GUV'larda sitoiskelet proteinlerinin yüksek kapsülleme verimliliğine sahip hızlı bir şekilde kapsüllenmesi için cDICE tabanlı bir yöntem sunulmaktadır. Bu yöntemde, ilk olarak, bir lipit / yağ karışımında ilgilenilen bir protein çözeltisinin emülsifiye edilmesiyle lipit-tek katmanlı damlacıklar üretilir. Dönen bir 3D baskılı odaya eklendikten sonra, bu lipit tek katmanlı damlacıklar daha sonra protein sistemini içeren GUV'lar oluşturmak için odanın içindeki bir su / yağ arayüzünde ikinci bir lipit tek katmanından geçer. Bu yöntem, GUV'lar içindeki genel kapsülleme prosedürünü basitleştirir ve süreci hızlandırır ve böylece lipit çift katmanlı veziküller içindeki ağ montajının dinamik evrimini sınırlamamıza ve gözlemlememize olanak tanır. Bu platform, hapsedilmede sitoiskelet-membran etkileşimlerinin mekaniğini incelemek için kullanışlıdır.
Introduction
Lipid çift katmanlı bölmeler, kapalı organik reaksiyonları ve membran bazlı süreçleri incelemek için model sentetik hücreler olarak veya ilaç dağıtım uygulamalarında taşıyıcı modüller olarak kullanılır 1,2. Saflaştırılmış bileşenlere sahip aşağıdan yukarıya biyoloji, proteinler ve lipitler gibi biyomoleküller arasındaki özellikleri ve etkileşimleri araştırmak için minimum deneysel sistemler gerektirir 3,4. Bununla birlikte, alanın ilerlemesiyle birlikte, biyolojik hücrelerdeki koşulları daha iyi taklit eden daha karmaşık deneysel sistemlere olan ihtiyaç artmaktadır. GUV'larda kapsülleme, deforme edilebilir ve seçici olarak geçirgen bir lipit çift katmanı ve sınırlı bir reaksiyon alanı sağlayarak bu hücre benzeri özelliklerin bazılarını sunabilen pratik bir yaklaşımdır. Özellikle, sentetik hücrelerin modelleri olarak sitoiskelet sistemlerinin in vitro resusyonu, membran bölmelerinde kapsüllemeden yararlanabilir5. Birçok sitoiskelet proteini hücre zarına bağlanır ve etkileşime girer. Çoğu sitoiskelet düzeneği, hücrenin tamamını kapsayan yapılar oluşturduğundan, şekilleri doğal olarak hücre büyüklüğünde hapsetme6 ile belirlenir.
Şişlik7,8, küçük vezikül füzyonu9,10, emülsiyon transferi 11,12, darbeli püskürtme 13 ve diğer mikroakışkan yaklaşımlar 14,15 gibi GUV'ları üretmek için farklı yöntemler kullanılır. Bu yöntemler hala kullanılsa da, her birinin sınırlamaları vardır. Bu nedenle, yüksek GUV kapsülleme verimine sahip sağlam ve basit bir yaklaşım oldukça arzu edilir. GUV'ların oluşumu için spontan şişlik ve elektroşişme gibi teknikler yaygın olarak benimsenmesine rağmen, bu yöntemler öncelikle spesifik lipit bileşimleri16, düşük tuz konsantrasyonlu tamponlar 17, daha küçük kapsülleyici moleküler boyut18 ile uyumludur ve yüksek miktarda kapsülleyici gerektirir. Birden fazla küçük vezikülün bir GUV'ye kaynaştırılması doğal olarak enerjisel olarak elverişsizdir, bu nedenle yüklü lipit bileşimleri9 ve / veya peptidler19 veya diğer kimyasallar gibi harici füzyon indükleyici ajanlarda özgüllük gerektirir. Emülsiyon transferi ve mikroakışkan yöntemler ise çift katmanlı oluşumdan sonra yüzey aktif madde ve çözücü giderimi yoluyla damlacık stabilizasyonu gerektirebilir, sırasıyla18,20. Darbeli püskürtme gibi mikroakışkan tekniklerdeki deneysel düzeneğin ve cihazın karmaşıklığı ek bir zorluk getirmektedir21. cDICE, emülsiyon transferi22,23'ü yöneten benzer ilkelerden türetilen emülsiyon bazlı bir yöntemdir. Sulu bir çözelti (dış çözelti) ve bir lipit-yağ karışımı, lipit doymuş bir arayüz oluşturan dönen silindirik bir odada (cDICE odası) santrifüj kuvvetleri ile tabakalandırılır. Lipid tek katmanlı sulu damlacıkların dönen cDICE odasına sokulması, damlacıklar lipit doymuş arayüzü geçerek dış sulu çözelti 22,24'e geçerken bir çift katmanın sıkıştırılmasına neden olur. cDICE yaklaşımı, GUV kapsüllemesi için sağlam bir tekniktir. Sunulan modifiye yöntemle, sadece önemli ölçüde daha kısa bir kapsülleme süresine (birkaç saniye) sahip cDICE için tipik olan yüksek vezikül verimi elde edilmekle kalmaz, aynı zamanda zamana bağlı süreçlerin (örneğin, aktin sitoiskelet ağı oluşumu) gözlemlenmesine izin veren GUV üretim süresi de önemli ölçüde azalır. Protokol başlangıçtan GUV toplama ve görüntülemeye kadar yaklaşık 15-20 dakika sürer. Burada, GUV üretimi, aktin ve aktin bağlayıcı proteinleri (ABP'ler) kapsüllemek için modifiye cDICE yöntemi kullanılarak tanımlanmıştır. Bununla birlikte, sunulan teknik, biyopolimerlerin montajından hücresiz protein ekspresyonuna, membran füzyon bazlı kargo transferine kadar çok çeşitli biyolojik reaksiyonları ve membran etkileşimlerini kapsüllemek için uygulanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Yağ-lipit-karışımının hazırlanması
NOT: Adımın, kloroformun taşınması için tüm güvenlik kurallarına uygun olarak bir duman davlumbazında gerçekleştirilmesi gerekir.
- 15 mL'lik bir cam şişede 0,5 mL kloroform alın. 15 ml'lik cam şişeye 88 μL 25 mg/mL dioleoyl-fosfokolin (DOPC), 9.3 μL 50 mg/mL kolesterol ve 5 μL 1 mg/mL dioleoyl-phosphoethanolamine-lissamine rhodamine B ( rodamin PE) ekleyin (bkz.
NOT: Silikon yağı / mineral yağdaki DOPC ve kolesterolün son mol fraksiyonları sırasıyla% 69.9 ve% 30'dur. % 20-30 mol kolesterolün, sunulan teknik25,26 kullanılarak üretilen GUV'ların membran akışkanlığı ve stabilitesi için optimize edilmiş bir konsantrasyon olduğu tespit edilmiştir. Fizyolojik olarak, bu değerler memeli hücre plazma membranlarında bulunan kolesterol konsantrasyon aralığındadır6. Lipid stokları kloroformda çözeltiler halinde elde edilir ve -20 °C'de depolanır. Lipid stok şişeleri açılmadan önce oda sıcaklığına alıştırılmalıdır. - Pipet, ikinci bir 15 mL şişede 7,2 mL silikon yağı ve 1,8 mL mineral yağ (bkz. Genel olarak, bunun düşük nemli bir torpido gözünde, özellikle mineral yağ yeniden kullanılıyorsa yapılması gerekir.
- Yağları 10 s boyunca maksimum dönme hızında (3200 rpm) vorteks yaparak karıştırın, karışımı kloroform içindeki lipit karışımını içeren şişeye ekleyin ve hemen vorteks karıştırıcısına yerleştirin. Maksimum dönme hızında (3200 rpm) 10-15 s için vorteks. Elde edilen lipitler yağ içinde karışım hafif bulutlu olmalıdır, çünkü lipitler yağda tamamen çözünmez, bunun yerine küçük agregalar olarak dağılır24.
- Lipid-in-oil dispersiyonunu 80 W ultrasonik güce ve 30 dakika boyunca oda sıcaklığında 40 kHz çalışma frekansına sahip bir banyo sonikatörüne ( Malzeme Tablosuna bakınız) koyun. Karışımı hemen kullanın veya maksimum 24 saat boyunca 4 ° C'de saklayın.
2. Vezikül oluşumu
- Siyah reçineden yapılmış 3D baskılı şaftı (Ek Dosya 1) tezgah üstü karıştırma plakasına monte edin ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve dönme hızını 1200 rpm'ye ayarlayın.
- Şeffaf reçineden yapılmış 3D baskılı cDICE odasını (Ek Dosya 2) şaft üzerine monte edin ( Malzeme Tablosuna bakınız) (Şekil 1A, B).
- Aktin ve aktin bağlayıcı proteinler (ABP) çözeltilerini ayrı ayrı toplam 20 μL hacimde hazırlayın.
- Küresel aktin tamponunda (G-tamponu) %10 ATTO 488 aktin dahil olmak üzere 1-10 μM aktin hazırlayın (bkz.
NOT: 1x G-tamponu 5 mM Tris-HCl, pH 8.0 ve 0.2 mM CaCl2'den oluşur. - Buz üzerinde aktin polimerizasyonuna başlamak için filamentli aktin polimerizasyon tamponu (F-tamponu) ekleyin. Bir çapraz bağlayıcı eklemeden önce aktin polimerizasyonunu yavaşlatmak için çözeltileri buz üzerinde tutun.
NOT: 1x F-tamponu, 10 mM Tris, pH 7,5'te 50 mM KCl, 2 mM MgCl2 ve 3 mM ATP içerir. - İstenilen molar oranda ilgilenilen çapraz bağlayıcıları eklemeden önce buz üzerinde aktin polimerizasyonunun başlatılmasına izin vermek için 15 dakika bekleyin. Kapsüllenene kadar çözeltiyi buz üzerinde tutun.
- Aktin bağlayıcı proteinleri (ABP'ler) bir mikrotüp içinde ayrı ayrı hazırlayın (Şekil 1C).
NOT: Bu adım, ABP'lerin bir kombinasyonu (örneğin, miyosin, α-aktinin, fasist, Arp2/3 kompleksi) aktin25,26,27 ile kapsüllendiğinde gerçekleştirilir. Bu gibi durumlarda, her ABP'nin istenen miktarı stoklarından çekilir ve ABP'ler için belirlenen mikrotüpe eklenir. Toplam çözelti 20 μL olacağından, ABP'lerin stok alikotları, toplam ABP karışımının istenen miktarı 5-6 μL'yi geçmeyecek şekilde hazırlanmalıdır. Buradaki temsili sonuçlarda kullanılan tek ABP, hazırlanması aşağıda belirtilen büyüleyicidir.- 1.75 mg/mL'lik bir fasin stoğundan 1.57 μL fasin (bakınız Malzeme Tablosu) ve adım 2.7'de doğrudan aktin çözeltisine eklenir. Bu, çözeltideki 2.5 μM büyüsüne karşılık gelir.
- Küresel aktin tamponunda (G-tamponu) %10 ATTO 488 aktin dahil olmak üzere 1-10 μM aktin hazırlayın (bkz.
- GUV çökelmesini kolaylaştırmak için dış ve iç sulu faz arasında bir yoğunluk gradyanı oluşturmak için aktin çözeltisine yoğunluk gradyanı ortamının% 7,5'ini ekleyin ( Malzeme Tablosuna bakınız).
- 200 mM glikozun dış çözeltisinin 700 μL'sini odaya dağıtın (Şekil 1D, solda).
NOT: İç çözeltinin ozmolaritesi, glikoz konsantrasyonunu belirler. Bu deneyler için, iç çözeltinin ozmolaritesi ~ 200 mOsm'dur, bu nedenle dış çözelti olarak 200 mM'lik bir glikoz çözeltisi kullanılır. - Odanın% 60-80'i dolana kadar odaya yeterli miktarda lipit-yağ karışımı (oda boyutuna göre >3 mL) ekleyin (Şekil 1D, sağ). Lipit-yağ karışımı ile dış çözelti arasında bir arayüz oluşturulacaktır.
- ABP'leri (adım 2.3.4'te hazırlanan) aktin çözeltisine aktarın. Normal bir 100-1000 μL pipet kullanarak, lipit-yağ karışımının 700 μL'sini derhal aktin-ABP karışımına aktarın (Şekil 1E, sol). Çapı 7-100 μm aralığında olan hücre boyutunda lipid tek katmanlı damlacıklar oluşturmak için 8 kez yukarı ve aşağı pipet alın (Şekil 1E, orta).
NOT: Kapsüllemeden önce herhangi bir aktin ağ montajını önlemek için Adım 2.7'nin birkaç saniye içinde tamamlanması gerekir. Bu nedenle, adımı gerçekleştirmeden önce, pipet uçlarının pipetlere zaten takılı olduğundan ve karışımları aktarmaya hazır olduğundan emin olun. - Aynı 100-1000 μL pipeti kullanarak, tüm emülsiyonu derhal dönen odaya dağıtın. Damlacıklar, lipit tek tabakasını yağ-dış çözelti arayüzünde geçerek ikinci bir lipit broşürü elde edecek ve böylece GUV'lar oluşturacaktır (Şekil 1E, sağda).
- Odayı karıştırma plakasından çıkarın ve odayı atık kabına eğerek lipit-yağ karışımının çoğunu atın, böylece lipit-yağ karışımının büyük bir kısmı odanın ortasındaki büyük açıklıktan boşaltılır.
NOT: Bu şekilde, lipit-yağ karışımı haznenin dışına çekilir ve bir sonraki adımda lipit-yağ karışımının dış çözelti ile karıştırılmasını önler. - Odayı, kapağı kullanıcıya bakacak şekilde tutun. Oda kapağını açın ve odayı kullanıcıya doğru hafifçe eğin. GUV'ları içeren dış çözelti ile lipit-yağ karışımı arasındaki arayüz, hazne açıklığından (kapağın bulunduğu yerden) görülebilir.
- Bir pipet kullanarak, GUV'ler içeren yeterli dış çözeltiyi toplayın ve uygun bir GUV yoğunluğu elde etmek için dış çözeltinin 50-300 μL'sini 96 delikli bir plakaya dağıtın.
NOT: Bu protokolü takiben, hazne içindeki dış çözeltide toplam yaklaşık 2 x 105 GUV'ler serbest bırakılır. GUV dağılımı ölçülmedi; Bununla birlikte, GUV'ların yaklaşık% 90'ının çapı 12-30 μm aralığındadır. popülasyonda 7-50 μm aralığında herhangi bir çapa sahip GUV'lar bulunabilir. Kapsüllenmiş yoğunluk gradyanı ortamına, GUV boyutuna ve kuyu plakasındaki çözelti derinliğine bağlı olarak, GUV'ların yüzeye yerleşmesi 2-15 dakika sürer. Yeniden yapılandırılmış aktin demetlerine sahip GUV'ların verimi yaklaşık% 90'dır.
3. Görüntüleme ve 3D görüntü rekonstrüksiyonu
- 96 kuyu plakasını, dönen disk (veya lazer tarama) konfokal ünitesi, bir EMCCD veya bir sCMOS kamera ve bir yağ daldırma 60x objektif lens ile donatılmış ters çevrilmiş bir mikroskop sahnesine yerleştirin (bkz.
- Herhangi bir ilgi alanına (ROI) odaklanın ve 0,5 μm z-adım aralığıyla ROI'den bir z-stack görüntü dizisi alın.
NOT: GUV'ler zaman içinde yüzeyde hafifçe yer değiştirebildiğinden, birden fazla florofor görüntüleniyorsa, her z-düzleminde çok dalga boyunda bir görüntü kümesi yakalamanız önerilir, yani ATTO 488 aktin ve Rhod PE görüntülerini yakalamak için her bir z-şeridinde bir seferde 561 nm ve 488 nm görüntü grubu alın. - Her z-stack görüntü dizisini .tiff formatında kaydedin.
- Bir görüntü işleme yazılımında (ImageJ/Fiji) ilgilendiğiniz bir görüntü dizisini açın. Görüntüyü en yüksek yoğunlukta tanımlayın. Parlaklık ve Kontrast penceresini açmak için "ctrl + shift + c" tuşlarını basılı tutun ve Sıfırla'ya tıklayın.
- ImageJ/Fiji menüsünden, Analiz > Ölçek Ayarla'ya gidin ve her görüntü pikseli için bilinen fiziksel mesafeyi ve birimini girin.
- ImageJ/Fiji menüsünden, z-yığınından bir 3B görüntüyü yeniden oluşturmak için Görüntü > Yığınları > 3B projesine gidin. "Projeksiyon yöntemi"ni Parlaklık Noktası, "Dilim Aralığı (μm)" değerini 0,5 olarak ayarlayın ve İnterpolat onay işaretini işaretleyin. Varsayılan seçenekler, ayarların geri kalanı için kullanılabilir.
NOT: Bazı mikroskoplardaki z-aralıkları kalibre edilemeyebilir ve z-yönündeki gerçek hareket girilen z-aralığından (yani 0,5 μm) biraz farklı olabilir. Bu gibi durumlarda, gerçek z-aralığını elde etmek için bilinen bir çapa sahip floresan mikrosferler gibi bir 3D kalibrasyon örneği kullanılabilir. Bu nedenle bu değer, 3B projeksiyon için "Dilim Aralığı (μm)" olarak kullanılacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mevcut protokol kullanılarak sitoiskelet GUV'larının başarılı bir şekilde üretildiğini göstermek için, GUV'lardaki fasin-aktin demet yapıları yeniden oluşturulmuştur. Fascin, sert paralel hizalanmış aktin demetleri oluşturan ve E. coli'den Glutatyon-S-Transferaz (GST) füzyon proteini26 olarak saflaştırılan aktin filamentlerinin kısa bir çapraz bağlayıcısıdır. Aktin polimerizasyon tamponunda 0.53 μM ATTO488 aktin ve yoğunluk gradyan ortamının% 7.5'i dahil olmak üzere 5 μM aktin ilk olarak yeniden yapılandırıldı. 2.5 μM'lik bir konsantrasyonda büyüleyici eklendikten ve fasin-aktin karışımını kapsülledikten sonra, GUV'larda aktin demeti yapıları oluşturuldu. Rodamin PE etiketli GUV'lardaki kapsüllenmiş aktin demet yapılarının Z-yığını konfokal görüntü dizileri, kapsüllemeden 1 saat sonra yakalandı (Şekil 2A). Bu protokolü kullanarak, kapsüllenmiş aktin çapraz bağlayıcılarının, α-aktininin ve birlikte GUV boyutuna bağlı bir şekilde farklı aktin demet desenleri oluşturan büyüleyicilerin doğal rekabeti ve sıralanması daha önce gösterilmiştir26.
Burada sunulan modifiye ters çevrilmiş emülsiyon yaklaşımı gibi, geleneksel cDICE işlemi de yüksek verime sahip sitoiskelet GUV'ları üretir,ancak protein çözeltisinin döner odaya kontrollü enjeksiyonu için bir şırınga pompası ve boru kurulumu gerektirir. Bu yaklaşımda, emülsiyon doğrudan dönen cDICE odasında üretilir; yağ fazına ince bir kılcal damar yerleştirilir. Protein çözeltisi bir şırınga pompasından enjekte edilir. Damlacıklar oluşur ve yukarıda açıklanan yönteme benzer şekilde GUV'lara dönüştükleri sulu dış faza doğru ilerlemeden önce kılcal uçta kesilir. Şekil 2B, bu yaklaşımı kullanarak bir reaksiyon karışımını kapsülleyen vezikülleri göstermektedir. Reaksiyon karışımı, 0.9 μM fasin ile paketlenmiş 6 μM aktin içerir. Burada, iki yöntem ve sonuçları karşılaştırılmamaktadır, ancak her ikisinin de yüksek miktarda GOV ürettiğini unutmayın.
Resim 1: GUV'lerin oluşturulması için deneysel kurulum . (A) cDICE odasının üstten görünümü ve yan kesit görünümü. (B) İplik eğirme odası kurulumunun fotoğrafları. (C-E) GUV'lerin oluşturulması için aşamalı prosedürlerin şematik çizimleri. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Resim 2: Aktin demet yapılarının kapsüllenmesi. (A) Görüntüler, GUV'ların temsili floresan konfokal dilimlerini (solda) ve aktin ve lipit kanallarının konfokal z-yığınının (sağda) maksimum projeksiyonlarını göstermektedir. Büyüleyici, 2,5 μM; aktin, 5 μM (%10 ATTO 488 aktin dahil). Ölçek çubuğu = 10 μm. (B) Geleneksel cDICE kullanılarak aktin demet yapılarının kapsüllenmesi. Görüntü, büyüleyici varlığında oluşan kapsüllenmiş aktin demetlerinin konfokal floresan görüntülerinin temsili bir maksimum projeksiyonunu göstermektedir. Büyüleyici, 0.9 μM; Aktin, 6 μM. Ölçek çubuğu = 10 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Dosya 1: 3D baskılı şaft tasarımı. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Dosya 2: 3D baskılı cDICE odası için tasarım. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bununla birlikte, sentetik hücrelerin oluşturulması için GUV'ler üretmenin farklı yöntemleri araştırılmıştır Bununla birlikte, prosedürlerin karmaşıklığı, kapsüllemeye ulaşmak için uzatılmış süre, kapsüllemenin lipit tiplerinin ve kapsülleyicinin moleküler bileşiminin kısıtlanması, kapsüllemeyi kolaylaştırmak için fizyolojik olmayan kimyasallara duyulan ihtiyaç, düşük GUV verimi ve kapsülleme verimliliğindeki tutarsızlıklar bu alandaki araştırmacıları zorlamaya devam etmiştir. Aşağıdan yukarıya sentetik biyolojide başlatılabilecek çok çeşitli potansiyel çalışmalar göz önüne alındığında, farklı lipit bileşimleriyle uyumlu olan ve boyuttan bağımsız olarak herhangi bir molekülü kapsülleyebilen kesintisiz bir yüksek verimli GUV kapsülleme yaklaşımı, karmaşık biyomimiking sentetik sistemleri incelemek için yeni fırsatları teşvik edebilir. cDICE yöntemi, önceki GUV üretim yöntemlerine özgü çoğu zorluğu ve sınırlamayı ortadan kaldırmıştır.
cDICE yöntemini kullanarak GUV'lar üretmek için yaklaşım ve yönetim ilkeleri platformdan öncesine dayanır ve ters emülsiyon transferi12 gibi daha önceki tekniklerde uygulanmıştır. Bununla birlikte, ters emülsiyon transfer yönteminin düşük vezikül verimi ve veziküllerin heterojenliği gibi sınırlamaları vardır. Burada sunulan cDICE yöntemi için, lipitler onlarca nanometre agrega şeklinde yağda dağılır (lipit agregasının büyüklüğü lipitlerin genel konsantrasyonuna bağlıdır)24. Lipitlerin dağılımı, birinin (mineral yağ) lipitleri çözebildiği ve lipitlerle karışamayan ikinci bir yağın (silikon yağı) bulunduğu iki karışabilir yağdadır. Bu, solvent kayması yoluyla lipit agrega koakervatları oluşturur29. Bu özel dağılım yaklaşımı, sulu damlacıkların anında tek katmanlı doygunluğunu ve sulu damlacıklar lipit-doymuş yağ-sulu arayüzü sürekli olarak geçtikçe yağ-sulu arayüzde lipitlerin daha hızlı yenilenmesini kolaylaştırır. Bu aynı zamanda daha sonra GUV'lar oluşturmak için çift katmanlı sıkıştırmayı iyileştirir ve GUV verimini arttırır. Dönen oda tarafından üretilen santrifüj kuvvetleri, lipit doymuş arayüz boyunca çok dağınık damlacıkları susturmak için idealdir. cDICE yönteminin orijinal versiyonu, iç çözeltiyi yağ-lipit karışımına enjekte etmek için bir mikrokapiler nozul kullanır. Bu yaklaşımda, dönen yağ-lipit karışımı tarafından oluşturulan kesme kuvvetleri, sulu damlacıklar üretir ve sonunda tarif edildiği gibi GUV'lara dönüşür. Bununla birlikte, özellikle aktin ağ montajı ve mikrokılcal damarın potansiyel tıkanması gibi hızlı reaksiyonlar için kritik olan enjeksiyon platformunu hazırlamak için harcanan süreyi azaltmak amacıyla, artık yağ-lipit karışımının doğrudan iç çözeltiye eklenmesi ve yukarı ve aşağı pipetlenmesiyle lipit tek katmanlı sulu damlacıklar üretilmektedir. Bu yaklaşım, hızlı reaksiyon deneyi için GUV kapsüllemesindeki zaman gecikmesini ortadan kaldırır.
Daha önceki GUV üretim yöntemlerinin neden olduğu zorluklar arasında, GUV üretim tekniğine bağlı olarak lipit tiplerinin (lipid yükü ve lipid fazı) kısıtlanması yer almaktadır. DOPC, dioleoyl-glycero-hosphoserine (DOPS), dioleoyl-glycero-süksinat (DGS), dimiristoyl-glycero-phosphocholine (DMPC) dahil olmak üzere çoklu lipid tipleri ve farklı konsantrasyonlarda farklı lipit ve kolesterol kombinasyonları test edildi. Tüm koşullar için, cDICE yönteminin sürekli olarak yüksek GUV veriminde yüksek kapsülleme verimliliğine sahip GUV'lar oluşturduğu gösterilmiştir. Ayrıca, cDICE yönteminin, sitoiskelet proteinleri, hücresiz ekspresyon reaksiyonları, kalabalıklaşma ajanları, boyalar ve farklı boyutlardaki diğer hücresel moleküller de dahil olmak üzere farklı hücresel bileşenleri, kapsülleme verimliliği kaybı veya verim azalması olmadan etkili bir şekilde kapsüllediği gösterilmiştir. Ayrıca, normal ters çevrilmiş emülsiyon transfer yöntemleri30 gibi, modifiye cDICE gelecekteki çalışmalar için asimetrik GUV'lerin üretilmesine potansiyel olarak izin verebilir. İç broşür ve dış broşür için farklı lipit bileşimleri kullanılabilir, çünkü tek katmanlı damlacıklar, cDICE odasının içindeki çift katmanı sıkıştırmadan önce ayrı ayrı (yukarı ve aşağı pipetleme yoluyla bir mikrotüp içinde) oluşturulur. Lipit-yağ karışımı uzun süre tutulduğunda lipitlerin çökelmesi gözlenir; Bununla birlikte, lipit agregalarını yeniden dağıtmak için kapsüllemeden önce lipit-yağ karışımını basitçe vortekse edebilirsiniz. Lipid-yağ karışımları, lipit-yağ karışımındaki normalden daha önemli lipit agregaları ile gösterildiği gibi, daha uzun süre tutulduğunda kapsülleme kalitesinin tehlikeye girebileceğini belirtmek önemlidir. Test edilmemiş olsa da, bu agregalar potansiyel olarak çift katmanlı fermuarlamada kusurluluğa neden olabilir ve agregalar ayrıca istenen kimyasal ortamı tehlikeye atan iç çözelti ile kapsüllenebilir.
Sulu damlacıklar oluşturmak için sunulan modifiye yaklaşımın sınırlaması, damlacıkların boyutunda homojenlik yaratmaktır. Bu, GUV boyutlarını düzenlemek için farklı akış hızlarında iç çözeltinin mikrokapiler enjeksiyonu kullanılarak geliştirilebilse de, kapsüllenmiş GUV'larda aktin montajı gibi hızlı reaksiyonların izlenmesi daha az arzu edilir. Farklı GUV boyutlarıyla sonuçlanan yukarı ve aşağı pipetleme yaparak damlacıklar yaparak, benzer büyüklükteki veziküllerin popülasyonları analiz edilebilir. Çift katmanlarda olası yağ tutma ile ilgili endişeler, cDICE21 gibi emülsiyon bazlı GUV üretim teknikleri de dahil olmak üzere çoğu GUV üretim tekniğinin benimsenmesini engellemektedir. Bununla birlikte, membranda kalan yağ miktarı,veziküller 31,32 üretildikten sonra çıkarılabilen 1-oktanol gibi organik ajanlar kullanılarak azaltılabilir. Yöntemde gelecekteki değişiklikler, muhtemelen çözücü bileşimini değiştirerek, araştırılmalıdır.
Aşağıdan yukarıya sentetik biyolojide henüz araştırılmamış ve belki de GUV'ların hücre taklit eden hapsedilmesini gerektiren birçok alan vardır. Bu tür deneysel çabalar, cDICE gibi GUV üretim platformlarının, GUV'ları sağlam bir şekilde üretmesini ve aynı zamanda ilgilenilen çeşitli molekülleri verimli bir şekilde kapsüllemesini gerektirir. Birçok hücresel süreç, önceki GUV üretim tekniklerini kullanarak molekülleri kapsüllemek için gereken süreden daha hızlı gerçekleşir. Burada açıklandığı gibi, aktin çözeltileri, aktin ağ montajından kaynaklanan vezikül deformasyonunu gözlemlemek için yeterince hızlı bir şekilde kapsüllenir. Yeniden yapılandırılmış aktin sitoiskeletine sahip bu tür sentetik hücreler, farklı çapraz bağlayıcılar 5,25,33 ve membran yeniden şekillenmesi 25,27,28 varlığında aktin ağ organizasyonunun özelliklerini ortaya koymuştur. Daha sofistike sentetik hücreler oluşturmak için gelecekteki çalışmalara ilham verecekler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.
Acknowledgments
APL, Deneyimli Araştırmacılar için Humboldt Araştırma Bursu ve Ulusal Bilim Vakfı (1939310 ve 1817909) ve Ulusal Sağlık Enstitüleri (R01 EB030031) tarafından verilen desteği kabul etmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 18:1 Liss Rhod PE lipid in chloroform | Avanti Polar Lipids | 810150C | |
| 96 Well Optical Btm Pit PolymerBase | ThermoFisher Scientific | 165305 | |
| Actin from rabbit skeletal muscle | Cytoskeleton | AKL99-A | |
| ATTO 488-actin from rabbit skeletal muscle | Hypermol | 8153-01 | |
| Axygen microtubes (200 µL) | Fisher Scientific | 14-222-262 | for handling ABPs |
| Black resin | Formlabs | RS-F2-GPBK-04 | |
| Cholesterol (powder) | Avanti Polar Lipids | 700100P | |
| Choloroform | Sigma Aldrich | 67-66-3 | |
| Clear resin | Formlabs | RS-F2-GPCL-04 | |
| CSU-X1 Confocal Scanner Unit | YOKOGAWA | CSU-X1 | |
| Density gradient medium (Optiprep) | Sigma-Aldrich | D1556 | |
| DOPC lipid in chloroform | Avanti Polar Lipids | 850375C | |
| Fascin | homemade | N/A | |
| F-buffer | homemade | N/A | |
| Fisherbrand microtubes (1.5 mL) | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| FS02 Sonicator | Fischer Scientific | FS20 | |
| G-buffer | homemade | N/A | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | 158968 | |
| iXon X3 camera | Andor | DU-897E-CS0 | |
| Mineral oil | Acros Organics | 8042-47-5 | |
| Olympus IX81 Inverted Microscope | Olympus | IX21 | |
| Olympus PlanApo N 60x Oil Microscope Objective | Olumpus | 1-U2B933 | |
| Silicone oil | Sigma-Aldrich | 317667 |
References
- Groaz, A., et al. Engineering spatiotemporal organization and dynamics in synthetic cells. Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology. 13 (3), 1685 (2021).
- Diltemiz, S. E., et al. Use of artificial cells as drug carriers. Materials Chemistry Frontiers. 5, 6672-6692 (2021).
- Liu, A. P., Fletcher, D. A. Biology under construction: In vitro reconstitution of cellular function. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (9), 644-650 (2009).
- Ganzinger, K. A., Schwille, P. More from less - bottom-up reconstitution of cell biology. Journal of Cell Science. 132 (4), 227488 (2019).
- Bashirzadeh, Y., Liu, A. P. Encapsulation of the cytoskeleton: Towards mimicking the mechanics of a cell. Soft Matter. 15 (42), 8425-8436 (2019).
- Blanchoin, L., Boujemaa-Paterski, R., Sykes, C., Plastino, J. Actin dynamics, architecture, and mechanics in cell motility. Physiol reviews. 94 (1), 235-263 (2014).
- Angelova, M. I., Dimitrov, D. S.
- Tsumoto, K., Matsuo, H., Tomita, M., Yoshimura, T. Efficient formation of giant liposomes through the gentle hydration of phosphatidylcholine films doped with sugar. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 68 (1), 98-105 (2009).
- Bailey, A. L., Cullis, P. R. Membrane fusion with cationic liposomes: Effects of target membrane lipid composition. Biochemistry. 36 (7), 1628-1634 (1997).
- Haluska, C. K., Riske, K. A., Marchi-Artzner, V., Lehn, J. M., Lipowsky, R., Dimova, R. Time scales of membrane fusion revealed by direct imaging of vesicle fusion with high temporal resolution. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (43), 15841-15846 (2006).
- Nishimura, K., Suzuki, H., Toyota, T., Yomo, T. Size control of giant unilamellar vesicles prepared from inverted emulsion droplets. Journal of Colloid and Interface Science. 376 (1), 119-125 (2012).
- Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A. Production of unilamellar vesicles using an inverted emulsion. Langmuir. 19 (7), 2870-2879 (2003).
- Stachowiak, J. C., Richmond, D. L., Li, T. H., Liu, A. P., Parekh, S. H., Fletcher, D. A. Unilamellar vesicle formation and encapsulation by microfluidic jetting. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (12), 4697-4702 (2008).
- Noireaux, V., Liu, A. P. The new age of cell-free biology. Annual Review of Biomedical Engineering. 22, 51-77 (2020).
- Ho, K. K. Y., Murray, V. L., Liu, A. P. Engineering artificial cells by combining HeLa-based cell-free expression and ultrathin double emulsion template. Methods in Cell Biology. , 303-318 (2015).
- Akashi, K., Miyata, H., Itoh, H., Kinosita, K. Preparation of giant liposomes in physiological conditions and their characterization under an optical microscope. Biophysical Journal. 71 (6), 3242-3250 (1996).
- Méléard, P., Bagatolli, L. A., Pott, T. Giant unilamellar vesicle electroformation: From lipid mixtures to native membranes under physiological conditions. Methods in Enzymology. 465, 161-176 (2009).
- Walde, P., Cosentino, K., Engel, H., Stano, P. Giant vesicles: Preparations and applications. ChemBioChem. 11 (7), 848-865 (2010).
- Pécheur, E. I., Martin, I., Ruysschaert, J. M., Bienvenüe, A., Hoekstra, D. Membrane fusion induced by 11-mer anionic and cationic peptides: A structure− function study. Biochemistry. 37 (8), 2361-2371 (1998).
- Morigaki, K., Walde, P. Giant vesicle formation from oleic acid/sodium oleate on glass surfaces induced by adsorbed hydrocarbon molecules. Langmuir. 18 (26), 10509-10511 (2002).
- Majumder, S., Wubshet, N., Liu, A. P. Encapsulation of complex solutions using droplet microfluidics towards the synthesis of artificial cells. Journal of Micromechanics and Microengineering. 29 (8), 83001 (2019).
- Abkarian, M., Loiseau, E., Massiera, G. Continuous droplet interface crossing encapsulation (cDICE) for high throughput monodisperse vesicle design. Soft Matter. 7 (10), 4610-4614 (2011).
- Van de Cauter, L., et al. Optimized cDICE for efficient reconstitution of biological systems in giant unilamellar vesicles. ACS Synthetic Biology. 10 (7), 1690-1702 (2021).
- Claudet, C., In, M., Massiera, G. Method to disperse lipids as aggregates in oil for bilayers production. The European Physical Journal E. 39 (1), 1-6 (2016).
- Bashirzadeh, Y., Wubshet, N. H., Liu, A. P. Confinement Geometry tunes fascin-actin bundle structures and consequently the shape of a lipid bilayer vesicle. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 610277 (2020).
- Bashirzadeh, Y., et al. Actin crosslinker competition and sorting drive emergent GUV size-dependent actin network architecture. Communications Biology. 4, 1136 (2021).
- Bashirzadeh, Y., Moghimianavval, H., Liu, A. P. Encapsulated actomyosin patterns drive cell-like membrane shape changes. bioRxiv. , (2021).
- Litschel, T., et al.
- Vitale, S. A., Katz, J. L. Liquid droplet dispersions formed by homogeneous liquid− liquid nucleation:"The Ouzo effect.". Langmuir. 19 (10), 4105-4110 (2003).
- Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A.
- Deshpande, S., Dekker, C. On-chip microfluidic production of cell-sized liposomes. Nature Protocols. 13 (5), 856-874 (2018).
- Deshpande, S., Caspi, Y., Meijering, A. E. C., Dekker, C. Octanol-assisted liposome assembly on chip. Nature Communications. 7, 10447 (2016).
- Wubshet, N. H., Bashirzadeh, Y., Liu, A. P. Fascin-induced actin protrusions are suppressed by dendritic networks in GUVs. Molecular Biology of the Cell. 32 (18), 1634-1640 (2021).
