Waiting
Login-Verarbeitung ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

מתודולוגיה לבדיקת סוכני בקרה וקוטלי חרקים כנגד היפותנאמוס של ברי ברי הקפה

Published: March 23, 2022 doi: 10.3791/63694
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Entomology, National Coffee Research Center

Summary

שיטה המשתמשת בפירות קפה ירוקים (GFs) פותחה כדי לבחון את הרעילות של קוטלי חרקים נגד בור פירות יער הקפה (CBB). קוטלי חרקים או חומרים רעילים יושמו על GFs מחוטאים לפני או אחרי התפשטות CBB. הוערכו תמותת חרקים, דחייה ויכולת רבייה, בנוסף לפרמטרים אחרים.

Abstract

לפני שממליצים על קוטלי חרקים לטיפול בבור פירות יער הקפה (CBB) Hypothenemus hampei, חשוב לדעת את התמותה והדחייה של קוטלי חרקים אלה נגד חרקים בוגרים או את השפעתם על תפוקת הרבייה. עם זאת, השיטות הקיימות כיום מעריכות את תמותת המבוגרים בלבד, ומגבילות את הבחירה של קוטלי חרקים חדשים עם אופן פעולה שונה. בעבודה זו נבחנו שיטות ניסיוניות שונות כדי לזהות את ההשפעות המגוונות על ה-CBB בתנאי מעבדה. לשם כך, פירות קפה ירוק (GFs) נאספו וחוטאו על ידי טבילה בתמיסת נתרן היפוכלוריט ואחריה הקרנת אור UV. במקביל, בוגרי CBB ממושבה חוטאו על ידי טבילה בתמיסת נתרן היפוכלוריט. כדי להעריך את ההגנה על פירות (טרום התפשטות), הפירות הונחו בקופסאות פלסטיק, וקוטלי החרקים יושמו. לאחר מכן, בוגרי CBB שוחררו בקצב של שני CBBs לכל GF. ה-GFs הושארו בתנאים מבוקרים כדי להעריך התפשטות והישרדות של CBB לאחר 1, 7, 15 ו-21 יום. כדי להעריך את יעילות קוטל החרקים לאחר התפשטות CBB (לאחר התפשטות), בוגרי CBB שוחררו ל- GFs ביחס של 2:1 למשך 3 שעות בטמפרטורה של 21 מעלות צלזיוס. פירות שורצי פירות שהראו בוגרי CBB עם בטן חשופה חלקית נבחרו והונחו במדפים של 96 בארות, וה-CBBs המשעממים את הפירות טופלו ישירות. לאחר 20 יום נותחו הפירות, ותועדו השלבים הביולוגיים של CBB בתוך כל פרי. ה-GFs שימשו כמצעים המחקים תנאים טבעיים להערכת קוטלי חרקים רעילים, כימיים וביולוגיים כנגד ה-CBB.

Introduction

בור פירות היער של הקפה (CBB), Hypothenemus hampei, זוהה לראשונה בשנת 1988 בקולומביה ומאז הפך למין המזיק החשוב ביותר בגידול הקפה. נקבות CBB משאירות את פרי הלידה כבר מופרה, ומחפשות פירות חדשים המונחים על ידי הכימיקלים הנדיפים שהם פולטים 1,2. מחזור שלם מתקיים תוך 23 ימים3 בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס. המחזור מתחיל כאשר הנקבה המייסדת חודרת לזרע ומטילה ביצים באנדוספרם הפרי. הזחלים הסגורים אוכלים את הזרע. אם הפירות ינותחו בשלב זה, ניתן יהיה להתבונן הן בנקבה המייסדת והן בצאצאיה. לאחר 14 יום, הזחלים הופכים לגלמים - בדרך כלל, שלב הגלמים נמשך 5 ימים. בשלב הבוגר, הנקבות מתקוטטות עם אחיהן, והנקבות שזה עתה הופרו עפות הרחק מהפירות הפגועים ומחפשות פירות קפה חדשים כדי להתחיל מחזור חדש4.

הן תהליך החדירה והן התוצאה של האכלת הזחל פוגעים בזרעי הקפה, מפחיתים את איכות משקה הקפה ומפחיתים משמעותית את ההכנסות; התפשטות גדולה מ-5% במטעי קפה נחשבת בדרך כלל לסף הכלכלי.

הדברת CBB מבוססת על אסטרטגיית ניהול מזיקים משולבת (IPM), הכוללת הדברה תרבותית ושיטות אגרונומיות, חומרים ביולוגיים טבעיים ושימוש בקוטלי חרקים כימיים, הדורשים תנאי בטיחות ויישום בזמן4.

כדי להעריך קוטלי חרקים חדשים להדברת ה- CBB, יש צורך במתודולוגיות בעלות נמוכה המאפשרות להשיג תוצאות מהירות. הן במעבדה והן בהליכי שדה נמצאים כיום בשימוש, כולל דיאטות מלאכותיות המכילות קפה שבו משולבים קוטלי החרקים 5,6, או ריסוס קוטלי החרקים על קפה קלף יבש 7,8,9. בנוסף, דווח על ניסויים שבוצעו בשטח באמצעות ענפי עץ קפה המכוסים בשרוולים אנטומולוגיים10,11; עם זאת, שיטות אלה דורשות עבודה אינטנסיבית ותקופות הערכה ארוכות.

מצב הדומה לתנאי שדה טבעיים, שהוא גם מהיר וזול, הוא שימוש בפירות קפה ירוקים או בשלים. עם זאת, פירות אלה חייבים להישמר בתנאים המתאימים לפיתוח CBB, הימנעות משינויים ומזהמים על ידי מיקרואורגניזמים כדי לשמור על איכותם ותכונותיהם. לשם כך נעשה שימוש בחומרי חיטוי שונים, כמו גם בהליכים הכוללים חום וקרינה 7,9,12,13,14,15,16.

בנוסף, השיטות להערכת קוטל חרקים נגד ה-CBB דורשות סימולציות של נקבות בוגרות שעפות בחיפוש אחר פירות או חודרות לפירות אלה 17,18. לשם כך, התפשטות פירות מלאכותיים בוצעו בשטח 8,11,19, אם כי תהליך זה הוא עתיר עבודה ותלוי בתנאי הסביבה.

כאן אנו מתארים מתודולוגיה סטנדרטית להערכת מוצרים שיכולים להיות להם השפעות שונות על ה- CBB בתנאים סביבתיים מבוקרים הדומים לתנאי שדה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הערה: פרוטוקול זה מתייחס לשיטות שונות לזיהוי השפעות שונות על CBB בתנאי מעבדה.

1. אוסף פירות

  1. לקטוף GFs עם גיל התפתחותי של ~ 120-150 ימים לאחר פריחה מעצים במטע קפה מוקדם בבוקר.

2. חיטוי פירות20

  1. הביאו למעבדה כ-300 GFs. בחר GFs בגודל אחיד ובריא ולמשוך את peduncles.
  2. טובלים את ה-GFs בתמיסת סבון (2 מ"ל של סבון לשטיפת כלים נוזלית ב-998 מ"ל של מי ברז), ולאחר מכן שפשוף כדי לשטוף את ה-GFs. לאחר מכן, לשטוף את הפירות עם מים, שינוי המים שלוש פעמים.
  3. טבלו GFs בתמיסת 0.5% נתרן היפוכלוריט (100 מ"ל ב-900 מ"ל של מי ברז) וערבבו פנימה שייקר ב-110 סל"ד למשך 15 דקות. לאחר מכן, שטפו את ה-GFs במים על ידי ערבוב בשייקר והחלפת המים שלוש פעמים, כל 10 דקות.
  4. מייבשים את ה-GFs במגבות נייר סטריליות.
  5. מניחים את ה-GFs במגשים (33 ס"מ x 25 ס"מ x 2 ס"מ) ומקינים אותם למשך 15 דקות, ומניחים את ה-GFs במרחק של 55 ס"מ ממקור ה-UV בתוך תחנת זרימה למינרית אופקית התומכת ב-UV.
  6. במהלך 15 הדקות, כל 5 דקות, הזיזו את ה-GFs כדי להבטיח הקרנה של כל הפרי.

3. חיטוי חרקים21

  1. השתמש בחרקי CBB חדשים (באותו יום) כדי להגדיר את הבדיקות הביולוגיות.
  2. טבלו את ה-CBBs בתמיסת 0.5% נתרן היפוכלוריט, והתסיסו אותם באיטיות עם מברשת למשך 10 דקות.
  3. מסננים את ה-CBBs דרך מטלית מוסלין ושוטפים אותם שלוש פעמים במים מזוקקים סטריליים.
  4. מוציאים עודפי מים עם מגבות נייר סטריליות.

4. הערכה של מוצר בעל השפעה מגנה על הפירות (טרום התפשטות) (איור 1)

  1. השתמש בקבוצה של GFs לכל יחידת ניסוי. בדרך כלל, קבוצה של 30 GFs משמשים לכל יחידת ניסוי.
  2. מקם את ה- GFs בקופסאות פלסטיק (יחידת ניסוי).
  3. יש ליישם את מוצר הבדיקה בריכוזים השונים להערכה. בצע את היישום עם יחידת מרסס ניידת. כאן נבדקה תחליב אלקלואידי ב-5% ו-6%.
  4. כבקרה, לרסס קבוצה של GFs עם מים.
  5. השתמשו לפחות בשלוש חזרות (יחידת ניסוי) בכל טיפול, תוך ריסוס אחת אחרי השנייה.
  6. במכסה מנוע סטרילי, שחררו שני בוגרי CBB לכל GFs (בסך הכל 60 CBBs מוכנסים לקופסאות הפלסטיק). לאחר 30 דקות, מכסים את הקופסאות.
  7. השאירו את קופסאות הפלסטיק עם ה-GFs שורצים בחדר או באינקובטור בתנאים מבוקרים (חשוך, 25 ± 2 מעלות צלזיוס, ולחות יחסית 71% ± 5%).
  8. לאחר 1, 7, 15 ו-21 ימים, ספרו את מספר פירות הבור וחרקים חיים ומתים מחוץ לפירות בכל קופסה.
  9. לאחר 20 יום לאחר ההדבקה, נתחו כל GF תחת סטריאומיקרוסקופ, הגדלה פי 10.
  10. ספרו את מספר הזרעים או הזרעים הבריאים שניזוקו על ידי החרקים בכל פרי.
  11. ספרו את השלבים הביולוגיים השונים של CBB22 שנצפו וספרו את מספר החרקים המתים בכל זרע כדי לקבוע את תמותת החרקים ליחידת ניסוי.

5. הערכת ההשפעה של מוצר לאחר התפשטות CBB (לאחר התפשטות) (איור 3)

  1. יש להשתמש בקבוצות של 200 פירות לכל טיפול.
  2. במכסה המנוע של כוכבית, שחררו את בוגרי CBB (יחס של 2:1 בין בוגרי CBB ל-GFs) ל-GFs שחוטאו בעבר, מה שמאפשר להתפשטות להמשיך במשך 3 שעות ב-21 מעלות צלזיוס.
  3. בחן את ה- GFs. לאחר 3 שעות, רובם צריכים להיות שורצי, כאשר הבטן של ה-CBBs עדיין חשופה (מיקום A20), כפי שמוצג באיור 2.
  4. בחרו 46 GFs שורצי גלים (מיקום A) והניחו אותם במדפי פלסטיק בעלי 96 בארות (יחידת ניסוי). הפירות צריכים להישאר במצב זה, כך שניתן יהיה לרסס את הטיפול ישירות על CBB המנקב את הפרי.
  5. יש לרסס לפחות שלוש פעמים (שלושה מדפים) לכל טיפול, בזה אחר זה, המכסה את המדפים לאחר 30 דקות.
  6. השאירו את המדפים עם ה-GFs שורצים בחדר או באינקובטור בתנאים מבוקרים (חשוך, 25 ± 2 מעלות צלזיוס, ולחות יחסית 71% ± 5%).
  7. לאחר 20 יום, נתחו את ה-GFs תחת סטריאומיקרוסקופ בהגדלה של פי 10.
  8. ספרו את מספר הזרעים או הזרעים הבריאים שניזוקו על ידי החרקים בכל פרי.
  9. ספרו את השלבים הביולוגיים השונים של CBB22 ואת מספר החרקים המתים בכל זרע כדי לקבוע את תמותת החרקים ליחידת ניסוי.

6. הערכת מוצר בעל השפעה מרתיעה על ה-CBB

  1. בצע את השלבים 4.1-4.6 המתוארים להערכת מוצר עם השפעה מגנה על הפירות.
  2. לאחר שחרור בוגרי ה-CBB לתוך קופסאות הפלסטיק, ספרו את מספר ה-CBBs שעפים הרחק מהקופסאות ואת המספר שורצים את ה-GFs. לאחר מכן, בצע את השלבים 4.7-4.11.
  3. בצע את השלבים 5.1-5.5 המתוארים להערכת המוצר לאחר התפשטות CBB.
  4. לאחר ריסוס כל טיפול על החרקים במצב A, ספרו את מספר ה-CBBs שיצאו מה-GF ו/או עפו הרחק מה-GF. לאחר מכן, בצע את השלבים 5.6-5.9.

7. ניתוח סטטיסטי

הערה: משתני התגובה הם אחוזי תמותה לאורך זמן ואחוז זרעי הקפה הבריאים שאינם שורצים.

  1. הערך את הממוצע וסטיית התקן של כל משתנה תגובה עבור כל טיפול.
  2. בצע ניתוח של שונות עבור כל משתנה תגובה עם מודל לתכנון אקראי לחלוטין.
    הערה: בדיקת ההשוואה של Dunnett של 5% מבוצעת כדי להשוות את הטיפולים מול הבקרה המוחלטת (בקרת מים).
  3. כאשר הטיפולים שונים באופן משמעותי מהבקרה המוחלטת, השתמש בבדיקת הבדל של 5% פחות משמעותי (LSD) כדי להשוות בין הטיפולים.
  4. להעריך את כוחו של המבחן; אם יותר מ-85%, מתקיימות ההנחות של נורמליות והומוגניות של השונות.

Figure 1
איור 1: נוהל להערכת ההשפעות המוקדמות של קוטלי חרקים על ה-CBB. שלבים להערכת ההשפעות המוקדמות של קוטלי חרקים על היפותנאמוס האמפיי (CBB) באמצעות פירות ירוקים (GFs). (א) בחירת פירות. (B) ריסוס קוטלי החרקים על פירות הקפה. (C) התפשטות CBB של פירות קפה ביחס של 2:1 CBB לכל GF. (ד) פירות שורצים. (ה) הדגירה של הפירות בתנאים מבוקרים. (ו) כריתת פירות. (ז) ספירת אוכלוסיית ה-CBB בתוך הזרעים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 2
איור 2: עיבוד התפשטות CBB של פירות קפה. הפירות השורציים מכילים בוגרי CBB עם בטן חשופה חלקית (עמדה A). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 3
איור 3: הליך להערכת ההשפעות של קוטלי חרקים על ה-CBB. שלבים להערכת ההשפעות שלאחר ההדבקה של קוטלי חרקים על ה-CBB באמצעות GFs. (A) בחירת פירות. (B) התפשטות של הפירות עם CBB ביחס של 2:1 CBB לכל GF. (ג) מבחר פירות שורצי עצים. (ד) ריסוס קוטל החרקים על הפירות. (ה) דגירה של הפירות. (ו) כריתת פירות. (ז) ספירת אוכלוסיית ה-CBB. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

התוצאות הראו כי נקבות ה- CBB זיהו את הפירות, ובהתאם למאפייני פני השטח של הפרי והריחות הנפלטים, נקבות ה- CBB החלו לחדור או לשאת את הפירות תוך 3 שעות בטמפרטורה של 21 מעלות צלזיוס.

ההשפעה של קוטל חרקים על ה-CBB כאשר הוא מיושם על פירות הקפה (הליך טרום ההדבקה) לאחר 24 שעות ולאורך זמן מוצגת באיור 4. שני קוטלי החרקים (תחליב אלקלואידים ב-5% ו-6%) גרמו לתמותת חרקים גבוהה ביום 20 (טבלה 1) והראו הבדלים משמעותיים בהשוואה לבקרה המוחלטת במים (P < 0.001), על פי בדיקת האל-אס-די. לגבי אחוזי הזרעים הבריאים שאינם שורצים (טבלה 1), היו גם הבדלים בין קבוצות הקוטלי הדברה וקוטלי החרקים על פי הבדיקה של דאנט בשיעור של 5% (P < 0.001). בקבוצת הביקורת, 37% מהזרעים לא היו שורצים, בעוד שיישום קוטלי חרקים הגן על הזרעים, כאשר 94% מהזרעים נשארו בריאים בעת שימוש בקוטלי חרקים 2 ו-89% עם קוטל חרקים 1.

Figure 4
איור 4: השפעות טרום-התפשטות של קוטלי חרקים בהדברה לעומת שתי קבוצות של קוטלי חרקים. השפעות טרום התפשטות של קוטלי החרקים. אחוזי התמותהשל H. hampei הבוגרים הוערכו בימים 1, 7, 15 ו-21 לאחר התפשטות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

טיפול יחידה ניסיונית תמותה (%) זרעים בריאים (%)
ממוצע Sd ממוצע Sd
בקרה (מים) 5 12.4 8.3 37 6.3
קוטל חרקים 1 5 83.9 *ב 3.9 89 *ב 6
קוטל חרקים 2 5 94.2 *א 3.2 94.2 *א 3.7
* עבור כל משתנה, הבדלים ביחס לבקרה (מים) על פי הבדיקה של דאנט ב 5%.

טבלה 1: השפעת הטיפול לפני ההדבקה על ה-CBB. אחוזי תמותה וזרעים בריאים באחוזים לאחר 20 יום. * עבור כל משתנה, הבדלים ביחס לבקרה (מים) על פי הבדיקה של דאנט ב 5%.

התוצאות לפני ההדבקה לאחר 21 יום מוצגות בטבלה 1, והתוצאות לאורך זמן תואמות לאיור 4. במקרה זה, פירות הקפה כוסו בחומר רעיל הגורם לתמותת חרקים. החרקים הופכים ספוגים כשהם הולכים על הפירות, טועמים את הפירות עם המישושים שלהם, או מתחילים ללעוס את האפידרמיס של הפירות. בנוסף, החומרים הנמרחים על פני הפרי יכולים לשנות או לשנות את הריח הטבעי של הפרי, כך שאנשי CBB עשויים לעצור את תהליך ההדבקה, או לעוף משם או להעדיף להיות מופרדים מהפרי מבלי לגעת בו או לשורץ אותו. בהתאם לזמן הפעולה של המוצר, תמותת חרקים או הימנעות מהתנהגות התפשטות יכולים להימשך 24 שעות או יותר.

מצד שני, אם המוצרים נמרחים לאחר שהחרקים מתחילים לשאת את הפירות (לאחר ההדבקה), המוצרים יכולים לחדור את קוטיקולת החרקים ולגרום לתמותת חרקים (טבלה 2 ואיור 5). התמותה הגבוהה ביותר התרחשה עם קוטל חרקים 2 (P < 0.01). אם התמותה מתרחשת במהירות, החרק ימות לפני שהוא נכנס לזרע, ולא יימצאו ביצים או אוכלוסיית חרקים בתוך הזרעים.

Figure 5
איור 5: השפעות לאחר התפשטות של קוטלי חרקים. אחוזי התמותה של H. hampei הבוגרים הוערכו בימים 1, 7, 15 ו-21 לאחר התפשטות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

טיפול יחידה ניסיונית תמותה (%) זרעים בריאים (%)
ממוצע Sd ממוצע Sd
בקרה (מים) 5 11.1 3.0 57.3 3. 9
קוטל חרקים 1 5 46.8 *ב 6.6 79.2 *ב 8.6
קוטל חרקים 2 5 77.8 *א 3.7 90.0 *א 2.9
* עבור כל משתנה, הבדלים ביחס לבקרה (מים) על פי הבדיקה של דאנט ב 5%.

טבלה 2: השפעות הטיפול לאחר ההדבקה על ה-CBB. אחוזי תמותה ואחוז זרעים בריאים לאחר 20 יום. * עבור כל משתנה, הבדלים ביחס לבקרה (מים) על פי הבדיקה של דאנט ב 5%. עבור כל משתנה, אותיות שונות מציינות הבדלים לפי אל-אס-די 5%.

ההשפעות של קוטלי החרקים משתקפות כאחוז הזרעים הבריאים שאינם נגועים ביום 20 להערכה (טבלה 2). בשל תמותת חרקים גבוהה, החרק לא חדר לזרעי הקפה ופגע בהם. יישום המוצרים הגן על בין 79%-90% מזרעי הקפה, מה שמראה הבדלים ביחס לבקרה, שבה 57% מהזרעים נמצאו בריאים (P < 0.01). כמו כן נצפו הבדלים משמעותיים בין שני קוטלי החרקים (P < 0.01).

במקרים מסוימים, החרקים מתו מהר מאוד, עוד לפני שגרמו נזק לזרע. עם זאת, אם מותו של החרק ארך זמן רב יותר, החרק יכול היה להגיע לזרע ולהטיל כמה ביצים, ומאוחר יותר, הבוגר ימות. במקרה זה, אוכלוסיית חרקים מופחתת נמצאה בתוך זרעי הקפה בהשוואה לאוכלוסיית החרקים שנמצאה בקבוצת הביקורת המרוססת במים (טבלה 3).

טיפולים סה"כ אוכלוסיית חרקים ממוצעת/ זרעים * קיבוץ דאנקן (אלפא= 00.05)
לשלוט 5 a
אנטומופתוגן 2.5 b
חומר דוחה 3.27 b
אנטומופתוגן + דוחה 1.5 c
עבור כל משתנה, אותיות שונות מציינות הבדלים לפי אל-אס-די 5%.

טבלה 3: השפעות לאחר התפשטות לאחר טיפול בפטריית אנטומופתוגן וחומר דוחה. אוכלוסיית החרקים בתוך הזרעים. GFs נותחו לאחר 15 יום. * עבור כל משתנה, הבדלים ביחס לבקרה (מים) על פי הבדיקה של דאנט ב 5%. עבור כל משתנה, אותיות שונות מציינות הבדלים לפי אל-אס-די 5%.

איור 6 מראה את ההשפעה של מוצר עם השפעות לאחר התפשטות, אנטומופתוגן, ושל חומר דוחה, כמו גם את הפעולה המשולבת שלהם.

Figure 6
איור 6: השפעות לאחר ההדבקה של פטריית אנטומופתוגן וחומר דוחה. אחוזי תמותה של ה. האמפי בוגר ונזק לזרעים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

מתודולוגיות אלה מאפשרות קביעה מהירה של השפעות שונות של מוצרים רעילים על CBB.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

בפרוטוקול זה, חיטוי של הפירות כמו גם של החרקים הם צעדים קריטיים. כאשר פירות מהשדה משמשים במעבדה, הם מראים לעתים קרובות זיהום גבוה והתייבשות שכן מיקרואורגניזמים וקרדית נמצאים באפידרמיס 7,15,16. לכן, שימוש בפירות או חרקים שאינם מחוטאים יגרום למוות של חרקים עקב זיהום הנגרם על ידי מיקרואורגניזמים, כגון חיידקים או פטריות, ובכך יפריע לתוצאות הבדיקה הביולוגית. בעבר, Tapias et al.20 העריכו חומרים אנטי-מיקרוביאליים אחרים לחיטוי פירות, כגון קרבנדאזים ובנזלקוניום כלוריד; עם זאת, למרות שחיטוי פירות היה טוב, תרכובות אלה היו רעילות מאוד ל- CBB או לסביבה.

השימוש ב-0.5% נתרן היפוכלוריט הוערך על ידי טבילת הפירות בתמיסה במשך 30 דקות ו-15 דקות. לאחר שני אורכי הפעמים, מיקרואורגניזמים הושפעו, אך ה- CBB הושפעו גם לאחר 30 דקות של טבילה בשל כוח החמצון של התמיסה23. אור UV גורם נזק לדנ"א24 של מיקרואורגניזמים, ומפחית את הזיהום. עם זאת, במינונים גבוהים יותר (זמן חשיפה ארוך יותר), מתרחש נזקי פירות, הגורמים לנמק והתייבשות זרעים. חיטוי עם 0.5% נתרן היפוכלוריט במשך 15 דקות ולאחר מכן חשיפה לאור UV במשך 15 דקות נמצא להיות אופטימלי בהליך זה.

השיקול השני הוא איכות החרקים. לצורך מחקר זה, החרקים סופקו על ידי יחידת גידול חרקים בשם BIOCAFE25 (http://avispitas.blogspot.com/p/biocafe.html). חרקים חלשים או גזעיים ממושבות חרקים עניות יעריכו יתר על המידה את התוצאות של מוצר רעיל. יתר על כן, התנהגות המעבדה, במקרה זה, לא תתאים לתצפיות השדה של חרקים מסוג בר עם כושר גבוה. בנוסף, חרקים כאלה יכולים להכיל מספר רב של מיקרואורגניזמים שעלולים להפריע לבדיקה הביולוגית. לפיכך, חיטוי21 הוא צעד חשוב כדי להבטיח את הצלחת המתודולוגיה.

לגבי התפשטות (שני חרקים לפרי אחד), נקבע בעבר כי שימוש בכמות גדולה יותר של חרקים יגדיל את מספר פירות הקפה עם יותר מנקב חרקים אחד, מה שהופך את הניתוח לקשה יותר20. בנוסף, הטמפרטורה שבה נערכים הניסויים חשובה להשגת פירות עם חרקים במצב A או להשגת חדירת חרקים רגילה בעת ריסוס הפירות. שימוש בטמפרטורה של 21 מעלות צלזיוס למשך 3 שעות איפשר ליותר מ-70% מהפירות להיות שורצי. כאשר הטמפרטורה עלתה ל-25-27 מעלות צלזיוס, רוב החרקים הגיעו למצב B בפרק זמן קצר יותר מאשר ב-21 מעלות צלזיוס. החדירה המהירה יותר של ה-CBB לתוך הפרי היא תוצאה של פעילות גדולה יותר של החרק עקב עליית הטמפרטורה26. לפיכך, אי הנוחות של שימוש בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס למשך פרק זמן ארוך יותר היא שפירות רבים נמצאים עם יותר מניקוב אחד, ועם חרקים במיקומים A ו- B כאחד.

לפני התפתחותה של שיטה זו, דיאטות חרקים מלאכותיות עם קפה טחון שימשו להערכת ההשפעות של חומרים רעילים על ידי שילוב החומר לתוך או מעל הדיאטה 5,6; עם זאת, דיאטות אלה יקרות בשל המרכיבים המיוחדים שלהם 27,28. קפה קלף שימש גם להערכת קוטל חרקים, שבו פולי הקפה מפוזרים או טבולים בחומר שיש להעריך. מכיוון שהמבנה וההרכב של הקלף שונים מאלה של הפריקרפ של הפרי, ניתן היה לצפות כי האינטראקציה בין קוטל החרקים לקפה שונה. עם קפה קלף, מולקולת קוטל החרקים יכולה להיספג בקלות, ובכך ליצור תמותה גדולה יותר מזו שנצפתה בתנאים טבעיים. בנוסף, קפה קלף הוא יקר יותר באופן יחסי שכן יש להסיר אותו מן עיסת הפרי ולאחר מכן לייבש. יתר על כן, זה לא המצע הטבעי לצמיחת חרקים.

לסיכום, שימוש בקפה ירוק אמיתי עם חומרים מזינים המתאימים לצמיחת חרקים הוא הדרך המתאימה ביותר להעריך את הרעילות של תרכובות לחרקים בתנאים טבעיים מדומים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

לאף אחד מהמחברים אין ניגודי עניינים להצהיר עליהם.

Acknowledgments

המחברים מביעים את תודתם לפדרציה הלאומית של מגדלי הקפה בקולומביה, לעוזרות המחלקה לאנטומולוגיה (דיאנה מרסלה ג'ירלדו, גלוריה פטרישיה נרנג'ו), לתחנת הניסויים נרנג'אל ולג'ון פליקס טרז'וס.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Beaker with spout, low form 500 mL BRAND PP BR87826
Benchtop Shaker New Brunswick Scientific Innova 4000 Incubator Shaker
Dishwashing liquid soap-AXION Colgate-Palmolive AXION
Hood; Horizontal Laminar Flow Station Terra Universal  Powder-Coated Steel, 1930 mm W x 1118 mm D x 1619 mm H, 120 V (https://www.terrauniversal.com/hood-horizontal-laminar-flow-station-9620-64a.html)
Insects CBB BIOCAFE (http://avispitas.blogspot.com/p/biocafe.html).
Multi Fold White paper towels Familia 73551
Preval Spray unit  Preval Merck Z365556-1KT https://www.sigmaaldrich.com/CO/es/product/sigma/z365556?gclid=Cj0KCQiAweaNBhDEARIsAJ
5hwbfZOy1TWGj6huatFtRQt
AzOyHe5-oBiKnOUK2T1exuuk
WwJLdvxkvsaAjoYEALw_wcB
Reversible Racks 96-Well heathrowscientific HEA2345A https://www.heathrowscientific.com/reversible-racks-96-well-i-hea2345a
Scalpel blades N 11 Merck S2771-100EA
Scalpel handles N3 Merck S2896-1EA
Sodium Hypochloride The clorox company Clorox
Stereo Microscope Zeiss Stemi 508 https://www.zeiss.com/microscopy/int/products/stereo-zoom-microscopes/stemi-508.html

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mendesil, E., et al. Semiochemicals used in host location by the coffee berry borer, Hypothenemus hampei. Journal of Chemical Ecology. 35 (8), 944-950 (2009).
  2. Jaramillo, J., et al. Coffee berry borer joins bark beetles in coffee klatch. PLoS ONE. 8 (9), 74277 (2013).
  3. Giraldo-Jaramillo, M., Garcia, A. G., Parra, J. R. Biology, thermal requirements, and estimation of the number of generations of Hypothenemus hampei (Ferrari, 1867) (Coleoptera: Curculionidae) in the state of São Paulo, Brazil. Journal of Economic Entomology. 111 (5), 2192-2200 (2018).
  4. Benavides, P., Góngora, C., Bustillo, A. IPM Program to Control Coffee Berry Borer Hypothenemus hampei, with Emphasis on Highly Pathogenic Mixed Strains of Beauveria bassiana, to Overcome Insecticide Resistance in Colombia. IntechOpen. , (2012).
  5. Martínez, C. P., Echeverri, C., Florez, J. C., Gaitan, A. L., Góngora, C. E. In vitro production of two chitinolytic proteins with an inhibiting effect on the insect coffee berry borer, Hypothenemus hampei (Ferrari) (Coleoptera: Curculionidae) and the fungus Hemileia vastatrix the most limiting pests of coffee crops. AMB Express. 2, 1-11 (2012).
  6. Padilla, B. E., Acuña, Z., Velásquez, C. S., Rubio, G. J. D. Inhibitors of [alpha]-amylases from the coffee berry borer Hypothenemus hampei in different plant species. Revista Colombiana de Entomología. 32 (2), 125-130 (2006).
  7. Alvarez, J. H., Cortina, H. A., Villegas, J. F. Methods to evaluate antibiosis to Hypothenemus hampei Ferrari in coffee under controlled conditions. Cenicafé. 52 (3), 205-214 (2001).
  8. Arcila, A., Duarte, A. F., Villalba, D. A., Benavides, P. New Product in the Integrated Management of the Coffee Berry Borer in Colombia. National Coffee Research Center (Cenicafé). , Available from: https://biblioteca.cenicafe.org/handle/10778/477 (2014).
  9. Jaramillo, J., Montoya, E., Benavides, P., Góngora, C. Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae for the control of coffee brocade in fruits on the ground. Revista Colombiana de Entomología. 41, 95-104 (2015).
  10. Bastidas, A., Velásquez, E., Benavides, P., Bustillo, A., Orozco, C. Evaluation of preformulated Beauveria bassiana (Bálsam) Vuillemin, for the control of the coffee berry borer. Agronomia. 17, 44-61 (2009).
  11. Villalba-Gault, D., Bustillo, A., Chaves Cordoba, B. Evaluation of insecticides for the control of the coffee berry borer in Colombia. Cenicafe. 46, 152-163 (1995).
  12. Bustillo, A. E., Orozco, J., Benavides, P., Portilla, M. Mass production and use of parasitoids for the control of the coffee berry borer in Colombia. Cenicafe. 47 (4), 215-230 (1996).
  13. Celestino, F. N., Pratissoli, D., Machado, L. C., Santos Junior, H. J. G. D., Mardgan, L., Ribeiro, L. V. Adaptation of breeding techniques of the coffee berry borer [Hypothenemus hampei (Ferrari). Coffee Science. 11 (2), 161-168 (2016).
  14. Domínguez, L., Parzanese, M. Ultraviolet light in food preservation. Argentine Foods. 52 (2), 70-76 (2012).
  15. Jaramillo, J., Chabi-Olaye, A., Poehling, H. M., Kamonjo, C., Borgemeister, C. Development of an improved laboratory production technique for the coffee berry borer Hypothenemus hampei, using fresh coffee berries. Entomologia Experimentalis et Applicata. 130 (3), 275-281 (2009).
  16. Pérez, J., Infante, F., Vega, F. E. Does the coffee berry borer (Coleoptera: Scolytidae) have mutualistic fungi. Annals of the Entomological Society of America. 98 (4), 483-490 (2005).
  17. Benavides, P., Gil, P., Góngora, C., Arcila, A. Integrated pest management. Cenicafe. Manual of the Colombian coffee grower: Research and technology for the sustainability of coffee growing. Manizales: FNC: Cenicafé. 3, 179-214 (2013).
  18. Bustillo, P. A review of the coffee berry borer, Hypothenemus hampei (Coleoptera: Curculionidae: Scolytinae), in Colombia. Revista Colombiana de Entomología. 32 (2), 101-116 (2006).
  19. Arcila, A., Benavides, P., Mejia, J. New Chemical Control Alternative for the Integrated Management of the Coffee Berry Borer. National Coffee Research Center (Cenicafé). , Available from: https://biblioteca.cenicafe.org/handle/10778/557 (2015).
  20. Tapias, L., Martinez, C., Benavides, P., Gongora, C. Laboratory method to evaluate the effect of insecticides on the coffee berry borer. Cenicafé. 68 (2), 76-89 (2017).
  21. Bustillo, A. E., Marín, P. How to reactivate the virulence of Beauveria bassiana to control the coffee berry borer. Manejo Integrado de Plagas. 63, (2002).
  22. Constantino, L. M., et al. morphological and genetic aspects of Hypothenemus obscurus and Hypothenemus hampei (Coleoptera: Curculionidae: Scolytinae). Revista Colombiana de Entomología. 37 (2), 173-182 (2011).
  23. Estrela, C., et al. Mechanism of action of sodium hypochlorite. Brazilian Dental Journal. 13 (2), 113-117 (2002).
  24. Diffey, B. L. Solar ultraviolet radiation effects on biological systems. Physics in Medicine and Biology. 36 (3), 299-328 (1991).
  25. BIOCAFE. , Available from: http://avispitas.blogspot.com/p/biocafe.html (2022).
  26. Bustillo, A. E., et al. Integrated Management of the Coffee Berry Borer: Hypothenemus hampei Ferrari in Colombia. , Available from: https://biblioteca.cenicafe.org/hangle/10778/848 (1998).
  27. Portilla, R. Development and evaluation of an artificial diet for the rearing of Hypothenemus hampei. Cenicafé. 50, 24-38 (1999).
  28. Portilla, R. M., Streett, D. A. New techniques for automated mass production of Hypothenemus hampei on the modified Cenibroca artificial diet. Cenicafé. 57, 37-50 (2006).

Tags

מדעי הסביבה גיליון 181 קפה קוטלי חרקים תמותה דחייה שלבים התפתחותיים
מתודולוגיה לבדיקת סוכני בקרה וקוטלי חרקים כנגד <em>היפותנאמוס</em> של ברי ברי הקפה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Góngora, C. E., Tapias, J.,… More

Góngora, C. E., Tapias, J., Martínez, C. P., Benavides, P. Methodology to Test Control Agents and Insecticides Against the Coffee Berry Borer Hypothenemus hampei. J. Vis. Exp. (181), e63694, doi:10.3791/63694 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter