Summary
コーヒー果実(GF)を用いた方法が開発され、コーヒーベリーボーラー(CBB)に対する殺虫剤の毒性を試験した。殺虫剤または有毒物質を、CBBの蔓延の前後に消毒されたGFに適用した。昆虫の死亡率、忌避性、および生殖能力は、他のパラメータに加えて、評価された。
Abstract
コーヒーベリーボーラー(CBB) Hypothenemus hampeiを治療するために殺虫剤を推奨する前に、成虫の昆虫に対するこれらの殺虫剤の死亡率および忌避性、または生殖出力への影響を知ることは貴重である。しかし、現在利用可能な方法は、成人の死亡率のみを評価し、異なる作用機序を有する新規殺虫剤の選択を制限する。この研究では、実験室条件下でのCBBに対する多様な影響を特定するために、さまざまな実験方法を検討した。このために、グリーンコーヒー果実(GFs)を回収し、次亜塩素酸ナトリウム溶液に浸漬し、続いてUV光照射することにより消毒した。並行して、コロニーからのCBB成虫を次亜塩素酸ナトリウム溶液に浸漬することによって消毒した。果実の保護(前科)を評価するために、果実をプラスチック製の箱に入れ、殺虫剤を塗布した。その後、CBB成人はGFあたり2つのCBBの割合で放出された。GFsを制御された条件下で放置し、1、7、15、および21日後のCBBの侵入および生存を評価した。CBBの侵入(侵入後)後の殺虫剤の有効性を評価するために、CBB成虫を21°Cで3時間、2:1の比率でGFsに放出した。 腹部が部分的に露出したCBB成虫を示す寄生果実を選別し、96ウェルラックに入れ、果実に穴を開けたCBBを直接処理した。20日後、果実を解剖し、各果実内のCBB生物学的段階を記録した。GFは、CBBに対する毒性、化学的、生物学的殺虫剤を評価するために、自然条件を模倣する基質として役立った。
Introduction
コーヒーベリーボーラー(CBB)、Hypothenemus hampeiは、コロンビアで1988年に最初に検出され、それ以来、コーヒー作物の最も重要な害虫種となっています。CBBの雌は、出生時の果実をすでに受精させたままにし、彼らが放出する揮発性化学物質によって導かれる新しい果実を探します1,2。完全なサイクルは、25°C (78 °F) の温度で23日以内に3で満たされる。 サイクルは、創始者の女性が種子に浸透し、果実の胚乳に卵を産むことから始まります。閉じた幼虫は種子を食べる。この時点で果実を解剖すると、創設者の女性とその子孫の両方を観察することができます。14日後、幼虫は一般的に蛹になり、蛹期は5日間続きます。成人の段階では、雌は兄弟と交尾し、新しく受精した雌は損傷した果実から飛び立ち、新しいコーヒー果実を探して新しいサイクル4を開始する。
浸透プロセスと幼虫の摂食の結果の両方がコーヒー種子に損傷を与え、コーヒー飲料の品質を低下させ、収益を大幅に減少させる。コーヒー農園での5%を超える侵入は、一般的に経済的閾値と考えられています。
CBB防除は、文化的防除と農業慣行、天然の生物学的薬剤、および安全条件とタイムリーな適用を必要とする化学殺虫剤の使用を含む、統合された害虫管理(IPM)戦略に基づいています4。
CBBの防除のための新しい殺虫剤を評価するには、迅速な結果が得られる低コストの方法論が必要である。殺虫剤が組み込まれたコーヒーを含む人工飼料5,6、または乾燥羊皮紙コーヒー7,8,9に殺虫剤を噴霧することを含む、実験室および現場の両方の手順が現在使用されている。さらに、昆虫学的スリーブで覆われたコーヒーの木の枝を用いて現場で行われた実験が報告されている10,11;しかし、これらの方法は、激しい労力と長い評価期間を必要とします。
自然の畑の状態に似た条件、つまり速くて安価な条件は、緑色または熟したコーヒーフルーツの使用です。しかし、これらの果実は、その品質および特性を維持するために微生物による変質および汚染物質を避けて、CBBを発達させるのに適した条件下で維持されなければならない。この目的のために、異なる消毒剤、ならびに熱および放射線を伴う手順が使用されてきた7、9、12、13、14、15、16。
さらに、CBBに対する殺虫剤評価の方法は、果実を求めて飛行するか、またはそれらの果実に浸透する成虫雌のシミュレーションを必要とする17,18。このために、人工果実の蔓延が現場8、11、19で行われているが、このプロセスは労働集約的であり、環境条件に依存する。
ここでは、フィールド条件に似た制御された環境条件下でCBBに異なる影響を与える可能性のある製品の評価のための標準化された方法論について説明します。
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Protocol
注:このプロトコルは、実験室条件下でCBBに対するさまざまな影響を識別するためのさまざまな方法に対応しています。
1. フルーツコレクション
- 早朝にコーヒー農園の木から開花してから約120〜150日の発生年齢のGFを選びます。
2. 果物の消毒20
- 約300GFを実験室に持参してください。均一な大きさで健康なGFを選択し、茎を撤回する。
- GFを石鹸溶液(998mLの水道水に2mLの液体食器洗い石鹸)に浸し、続いてGFをこすって洗浄する。その後、果物を水ですすぎ、水を3回交換します。
- GFsを0.5%次亜塩素酸ナトリウム溶液(水道水900mL中100mL)に浸し、シェーカーで110rpmで15分間攪拌する。その後、シェーカーで攪拌し、10分ごとに水を3回交換してGFsを水ですすいでください。
- GFを滅菌ペーパータオルで乾かします。
- GFをトレイ(33 cm x 25 cm x 2 cm)に入れ、15分間照射し、UV対応の水平層流ステーション内のUV源から55cmの距離にGFを配置します。
- 15分間の間、5分ごとに、GFsを動かして果実全体の照射を確実にする。
3.虫除菌21
- 新たに出現した(同日)CBB昆虫を使用してバイオアッセイを設定する。
- CBBを0.5%次亜塩素酸ナトリウム溶液に浸し、ブラシでゆっくりと10分間攪拌する。
- CBBをモスリン布でろ過し、滅菌蒸留水で3回洗浄します。
- 滅菌ペーパータオルで余分な水分を取り除きます。
4. 果実に保護効果を有する製品の評価(前科的存在)(図1)
- 実験ユニットごとにGFのグループを使用します。一般に、実験ユニットごとに30個のGFのグループが使用されます。
- GFをプラスチック製の箱(実験ユニット)に入れます。
- 評価のために異なる濃度で試験生成物を適用する。ポータブル噴霧器ユニットで塗布を行います。ここでアルカロイドエマルジョンを5%および6%で試験した。
- 対照として、GFの群に水を噴霧する。
- 1回の処理につき少なくとも3回の繰り返し(実験単位)を利用し、次々に噴霧する。
- 滅菌フード内で、GFごとに2人のCBB成人を放出する(合計60個のCBBがプラスチック箱に導入される)。30分後、箱を覆います。
- GFが付着したプラスチック製の箱を、制御された条件(暗所、25±2°C、相対湿度71%±5%)の部屋またはインキュベーターに放置します。
- 1日後、7日後、15日後、および21日後に、各箱の中の果物の外側のボーラーフルーツと生きている昆虫と死んだ昆虫の数を数えます。
- 侵入後20日目に、各GFを実体顕微鏡、倍率10倍で解剖する。
- 健康な種子または各果物の昆虫によって損傷を受けた種子の数を数えます。
- 観察された生物学的ステージ22 の異なるCBBをカウントし、各種子中の死虫の数をカウントして、実験単位ごとの昆虫死亡率を決定した。
5. CBB感染後(感染後)の製品効果の評価(図3)
- 1回のトリートメントで200個の果物のグループを使用してください。
- 無菌フード内で、CBB成人(CBB成人とGFの2:1比)を以前に消毒したGFに放出し、21°Cで3時間侵入を進行させる。
- GF を調べます。図2に示すように、3時間後、CBBの腹部がまだ露出したまま(位置A20)で、ほとんどが蔓延する必要があります。
- 46個のGF(位置A)を選択し、96ウェルのプラスチックラック(実験ユニット)に配置します。果実は、果実を穿孔するCBBに直接噴霧することができるように、この位置にとどまるべきである。
- 1回の処置につき少なくとも3回(3ラック)を1回ずつスプレーし、30分後にラックを覆う。
- GFが蔓延したラックを、制御された条件(暗所、25±2°C、相対湿度71%±5%)の部屋またはインキュベーターに放置します。
- 20日後、10倍の倍率で実体顕微鏡下でGFsを解剖する。
- 健康な種子または各果物の昆虫によって損傷を受けた種子の数を数えます。
- 異なるCBB生物学的段階22 および各種子における死んだ昆虫の数を数えて、実験単位ごとの昆虫死亡率を決定した。
6. CBBに対する抑止効果のある製品の評価
- 果物に保護効果のある製品を評価するために概説されている手順4.1-4.6に従ってください。
- CBBの成虫をプラスチックの箱に入れた後、箱から飛び去るCBBの数とGFに寄生する数を数えます。次に、手順 4.7 ~ 4.11 に従います。
- CBBの蔓延後の製品を評価するために概説されたステップ5.1-5.5に従ってください。
- 位置Aの昆虫に各処理を噴霧した後、GFから移動した、および/またはGFから離れたCBBの数を数えます。次に、手順 5.6 ~ 5.9 を実行します。
7. 統計解析
注: 応答変数は、時間の経過に伴う死亡率と、健康な未感染のコーヒー種子の割合です。
- 各処理の各応答変数の平均と標準偏差を推定します。
- 完全にランダム化された計画のモデルを使用して、各応答変数の分散分析を実行します。
注:ダネットの5%比較試験は、処理を絶対対照(水対照)と比較するために実施される。 - 治療が絶対対照と有意に異なる場合は、5%最小有意差(LSD)検定を使用して治療を比較します。
- テストのパワーを評価します;85%より大きい場合、分散の正規性と均質性の仮定が満たされます。
図1:CBBに対する殺虫剤の寄生前効果を評価するための手順。 緑色の果実(GF)を用いて 、ヒポテネムス・ハンペイ (CBB)に対する殺虫剤の寄生前効果を評価するためのステップ。(A)果物の選択。(B)コーヒー果実への殺虫剤の散布。(C)GF当たり2:1 CBBの比率でのコーヒー果実のCBBの侵入。(D) 蔓延した果実(E)制御された条件下での果実のインキュベーション。(F)果実の解剖。(G)種子内のCBB個体群を数える。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:コーヒー果実のCBB感染を処理する。 寄生した果実には、腹部が部分的に露出したCBB成虫(位置A)が含まれる。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:CBBに対する殺虫剤の寄生効果を評価するための手順。 GFsを用いてCBBに対する殺虫剤の寄生後効果を評価するためのステップ(A)果物の選択。(B)GFあたり2:1のCBBの比率でCBBを含む果実の侵入。(C)蔓延した果物の選択。(d)果実への殺虫剤の散布。(E)果実のインキュベーション。(F)果実の解剖。(G)CBB人口を数える。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Representative Results
その結果、CBB雌は果実を認識し、果実表面の特性や放出された臭いに応じて、CBB雌は21°Cで3時間以内に果実に浸透または穿孔し始めた。
24時間後および経時的にコーヒー果実に適用した場合のCBBに対する殺虫剤の効果(事前侵入手順)を 図4に示す。LSD試験によると、2つの殺虫剤(アルカロイドエマルジョン5%および6%)は、20日目に高い昆虫死亡率(表1)を引き起こし、水絶対対照(P <0.001)と比較して有意差を示した。寄生していない健康な種子の割合(表1)に関しては、ダネットの試験によれば、対照群と殺虫剤群との間にも5%の差があった(P < 0.001)。対照群では、種子の37%は寄生しなかったが、殺虫剤の施用は種子を保護し、殺虫剤2を使用した場合種子の94%は健康なままであり、殺虫剤1では89%であった。
図4:対照における殺虫剤の寄生前効果と2つの殺虫剤群 殺虫剤の事前侵入効果。成人H. hampeiの 死亡率は、感染後1日目、7日目、15日目、および21日目に評価された。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
| 処遇 | 実験ユニット | 死亡率(%) | 健康な種子(%) | ||||
| 平均 | SDの | 平均 | SDの | ||||
| コントロール(水) | 5 | 12.4 | 8.3 | 37 | 6.3 | ||
| 殺虫剤1 | 5 | 83.9 | *b | 3.9 | 89 | *b | 6 |
| 殺虫剤2 | 5 | 94.2 | *a | 3.2 | 94.2 | *a | 3.7 |
| *各変数について、ダネット検定によるコントロール(水)に対する差は5%である。 | |||||||
表1:CBBに対する寄生前処理の効果。 20日後の死亡率と健康な種子の割合。*各変数について、ダネット検定によるコントロール(水)に対する差は5%である。
21日後の寄生前結果を 表1 に示し、経時的な結果を 図4に対応する。この場合、コーヒー果実は昆虫の死亡率を引き起こす有毒物質で覆われていた。昆虫は、果物の上を歩いたり、触診で果物を味わったり、果物の表皮を噛み始めると含浸します。さらに、果実表面に適用される物質は、果実の自然な臭いを変化または変化させる可能性があるため、CBBの個体は、飛散するか、または果物に触れたり寄生したりすることなく果実から分離することを好むかのいずれかで、侵入プロセスを停止することができる。製品の作用時間に応じて、昆虫の死亡率または侵入行動の回避は24時間以上持続し得る。
一方、昆虫が果実を産み始めた後(侵入後)に製品を施用すると、製品は昆虫のキューティクルに浸透し、昆虫の死亡率を引き起こす可能性がある(表2 および 図5)。最も高い死亡率は殺虫剤2(P <0.01)で起こった。死亡率が急速に起こると、昆虫は種子に入る前に死に、種子の中に卵や昆虫の集団は見当たりません。
図5:殺虫剤の寄生後効果 成人 H. hampei の死亡率は、感染後1日目、7日目、15日目、および21日目に評価された。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
| 処遇 | 実験ユニット | 死亡率(%) | 健康な種子(%) | ||||
| 平均 | SDの | 平均 | SDの | ||||
| コントロール(水) | 5 | 11.1 | 3.0 | 57.3 | 3. 9 | ||
| 殺虫剤1 | 5 | 46.8 | *b | 6.6 | 79.2 | *b | 8.6 |
| 殺虫剤2 | 5 | 77.8 | *a | 3.7 | 90.0 | *a | 2.9 |
| *各変数について、ダネット検定によるコントロール(水)に対する差は5%である。 | |||||||
表2:CBBに対する感染後治療の効果。 20日後の死亡率と健康な種子の割合。*各変数について、ダネット検定によるコントロール(水)に対する差は5%である。変数ごとに、LSD 5%による差異を示す文字が異なります。
殺虫剤の効果は、評価の20日目における健康な未侵入種子の割合として反映される(表2)。昆虫の死亡率が高いため、昆虫はコーヒー種子に浸透せず、それらを損傷しなかった。コーヒー種子の79%〜90%の間で保護された製品の施用は、対照に関して差異を示し、種子の57%が健康であることが判明した(P <0.01)。2つの殺虫剤の間にも有意差が認められた(P <0.01)。
場合によっては、昆虫は種子に損傷を与える前であっても、非常に迅速に死亡した。しかし、昆虫の死がもっと長くかかると、昆虫は種子に到達して卵を預けることができ、その後、成虫は死ぬでしょう。この場合、水を噴霧した対照群で見つかった昆虫集団と比較して、コーヒー種子の内部に減少した昆虫集団が見出された(表3)。
| 治療 | 総平均昆虫個体数/種子 | *ダンカンのグループ化(アルファ= 00.05) |
| コントロール | 5 | ある |
| 昆虫病原体 | 2.5 | b |
| 忌避物質 | 3.27 | b |
| 昆虫病原体+忌避剤 | 1.5 | c |
| 変数ごとに、LSD 5%による差異を示す文字が異なります。 | ||
表3:昆虫病原菌と忌避物質による治療後の寄生後効果。 種子の中の昆虫の個体群。GFsは15日目に解剖された。*各変数について、ダネット検定によるコントロール(水)に対する差は5%である。変数ごとに、LSD 5%による差異を示す文字が異なります。
図6 は、寄生後作用を有する製品、昆虫病原体、忌避物質の効果、ならびにそれらの複合作用を示す。
図6:昆虫病原菌と忌避物質の寄生後効果 成人 H.ハンペイ および種子損傷の死亡率。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
これらの方法論は、CBBに対する毒性製品のさまざまな影響の迅速な決定を可能にする。
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Discussion
このプロトコルでは、果物と昆虫の消毒が重要なステップです。畑の果物を実験室で使用すると、微生物やダニが表皮に存在するため、高い汚染と脱水が頻繁に示されます7,15,16。したがって、消毒されていない果物や昆虫を使用すると、細菌や真菌などの微生物によって引き起こされる汚染による昆虫の死を引き起こし、したがってバイオアッセイの結果を妨げる。以前、Tapias et al.20は、カルベンダジムや塩化ベンザルコニウムなどの果物消毒のための他の抗菌剤を評価しました。しかし、果物の消毒は良好であったが、これらの化合物はCBBまたは環境に対して非常に有毒であった。
0.5%次亜塩素酸ナトリウムの使用は、果実を溶液に30分および15分間浸漬することによって評価した。両方の長さの時間の後、微生物は冒されたが、CBBは溶液23の酸化力のために浸漬の30分後にも影響を受けた。UV光は微生物のDNA24に損傷を与え、汚染を減少させる。しかし、より高い用量(より長い曝露時間)では、果実の損傷が起こり、壊死および種子脱水を引き起こす。0.5%次亜塩素酸ナトリウムによる消毒を15分間行い、続いてUV光を15分間曝露することが、この手順において最適であることが判明した。
2番目の考慮事項は、昆虫の品質です。この研究のために、昆虫はBIOCAFE25 (http://avispitas.blogspot.com/p/biocafe.html)と呼ばれる昆虫飼育ユニットによって提供された。貧弱な昆虫コロニーからの弱いまたは近交系の昆虫は、有毒な製品の結果を過大評価する。さらに、この場合、実験室の行動は、高い適応度を有する野生型昆虫の野外観察に対応しないであろう。さらに、そのような昆虫は、バイオアッセイを妨げる可能性のある多数の微生物を含むことができる。したがって、消毒21 は、方法論の成功を確実にするための重要なステップである。
寄生(1つの果実に2つの昆虫)に関しては、昆虫の量を多く使用すると、複数の昆虫の穿孔を伴うコーヒー果実の数が増加し、分析がより困難になることが以前に決定されていた20。さらに、実験が行われる温度は、位置Aに昆虫を有する果実を得るため、または果実を噴霧したときに正常な昆虫浸透を得るために重要である。21°Cの温度を3時間使用して、果実の70%以上が蔓延することができました。温度が25〜27°Cの間に上昇すると、ほとんどの昆虫は21°Cよりも短い時間で位置Bに到達した。 CBBの果実へのより速い浸透は、温度上昇による昆虫のより大きな活性の結果である26。したがって、25°Cの温度を長期間使用することの不便さは、多くの果実が複数の穿孔を有し、AおよびB位置の両方に昆虫が見出されることである。
この方法の開発前に、挽いたコーヒーを含む人工昆虫食は、その物質を食事に組み込むことによって、または食事の上に物質を組み込むことによって毒性物質の影響を評価するために使用されていた5,6;しかし、これらの食事療法はそれらの特別な成分のために高価です27,28。羊皮紙コーヒーは殺虫剤評価にも使用されており、コーヒー豆に評価対象物質を振りかけたり、浸漬したりしています。羊皮紙の構造や組成は果実の果皮の構造や組成が異なるため、殺虫剤とコーヒーの相互作用が異なることが予想されます。羊皮紙コーヒーでは、殺虫剤分子を容易に吸収することができ、したがって、自然条件下で観察されるものよりも大きな死亡率を生成する。さらに、羊皮紙コーヒーは、フルーツパルプから取り出してから乾燥させる必要があるため、比較的高価です。さらに、それは昆虫の成長のための天然の基質ではありません。
結論として、昆虫の成長に十分な栄養素を含む本物のグリーンコーヒーを使用することは、シミュレートされた自然条件下で昆虫に対する化合物の毒性を評価する最も適切な方法である。
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Disclosures
著者の誰一人として、宣言すべき利益相反はありません。
Acknowledgments
著者らは、コロンビアの全国コーヒー生産者連盟、昆虫学部門のアシスタント(ダイアナ・マルセラ・ヒラルド、グロリア・パトリシア・ナランホ)、実験ステーション・ナランジャル、ジョン・フェリックス・トレホスに感謝の意を表します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Beaker with spout, low form 500 mL | BRAND PP | BR87826 | |
| Benchtop Shaker | New Brunswick Scientific Innova 4000 Incubator Shaker | ||
| Dishwashing liquid soap-AXION | Colgate-Palmolive | AXION | |
| Hood; Horizontal Laminar Flow Station | Terra Universal | Powder-Coated Steel, 1930 mm W x 1118 mm D x 1619 mm H, 120 V (https://www.terrauniversal.com/hood-horizontal-laminar-flow-station-9620-64a.html) | |
| Insects CBB | BIOCAFE | (http://avispitas.blogspot.com/p/biocafe.html). | |
| Multi Fold White paper towels | Familia | 73551 | |
| Preval Spray unit | Preval Merck | Z365556-1KT | https://www.sigmaaldrich.com/CO/es/product/sigma/z365556?gclid=Cj0KCQiAweaNBhDEARIsAJ 5hwbfZOy1TWGj6huatFtRQt AzOyHe5-oBiKnOUK2T1exuuk WwJLdvxkvsaAjoYEALw_wcB |
| Reversible Racks 96-Well | heathrowscientific | HEA2345A | https://www.heathrowscientific.com/reversible-racks-96-well-i-hea2345a |
| Scalpel blades N 11 | Merck | S2771-100EA | |
| Scalpel handles N3 | Merck | S2896-1EA | |
| Sodium Hypochloride | The clorox company | Clorox | |
| Stereo Microscope | Zeiss | Stemi 508 | https://www.zeiss.com/microscopy/int/products/stereo-zoom-microscopes/stemi-508.html |
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