Summary
Hier beschreiben wir die Methode zur Erzeugung eines künstlichen Dezidualisierungsmodells mit der ovariektomierten Maus, ein klassisches Endometrium-Dezidualisierungsexperiment im Forschungsgebiet der Endometrium-Dezidualisierung.
Abstract
Die Endometriumdezidualisierung ist ein einzigartiger Differenzierungsprozess des Endometriums, der eng mit Menstruation und Schwangerschaft zusammenhängt. Eine Beeinträchtigung der Dezidualisierung führt zu verschiedenen Endometriumstörungen wie Unfruchtbarkeit, wiederholten Fehlgeburten und Frühgeburten. Die Entwicklung und Anwendung des Endometriumdezidualisierungsmodells in Reproduktionsstudien ist seit langem ein Highlight für Reproduktionsforscher. Die Maus wurde ausgiebig bei der Untersuchung der Reproduktion und Dezidualisierung eingesetzt. Es gibt drei gut etablierte Mausmodelle zur Dezidualisierung, nämlich die natürliche Schwangerschaftsdezidualisierung (NPD), die künstliche Dezidualisierung (AD) und die In-vitro-Dezidualisierung (IVD). Unter ihnen gilt AD als zuverlässiges Modell für die Dezidualisierung von Mäusen, das einfach zu implementieren und nahe an NPD ist. Diese Arbeit konzentriert sich auf eine modifizierte Methode des Generierungs- und Anwendungsprozesses des künstlichen Dezidualisierungsmodells der Maus mit Ovarektomie, um ovarielle Effekte zu vermeiden, die mit kleinen Varianzen innerhalb der Gruppe hochreproduzierbare Ergebnisse erzielen können. Diese Methode bietet ein gutes und zuverlässiges Tiermodell für die Untersuchung der Endometriumdezidualisierung.
Introduction
Mit der Entwicklung der humanassistierten Reproduktionstechnologie hat die derzeitige klinische Schwangerschaftsrate der In-vitro-Fertilisation-Embryotransfer (IVF-ET) die der natürlichen Schwangerschaft erreicht oder sogar übertroffen. Trotzdem werden viele Patientinnen in der klinischen Praxis der assistierten Reproduktion immer noch mehreren Embryotransfers unterzogen, erreichen jedoch nicht die gewünschte Schwangerschaft. Sein spezifischer molekularer Mechanismus ist jedoch noch unklar, so dass klinische Interventionen unwirksam sind, was eine der größten Herausforderungen für die Reproduktionsmedizin darstellt 1,2.
Endometriumfaktoren machen etwa zwei Drittel der Ursachen für das Versagen der IVF aus3. Die Einnistung des menschlichen Embryos ist in drei Phasen unterteilt: Positionierung, Adhäsion und Invasion 4,5,6. Das mütterliche Endometrium erfährt eine Reihe von Veränderungen, um der Ankunft des Embryos gerecht zu werden. Die Bildung einer "Fensterperiode" bietet günstige Bedingungen für die Einnistung des Embryos 7,8.
Bei den meisten Säugetieren beginnen sich die Stromazellen, die die Blastozyste umgeben, schnell zu vermehren und zu differenzieren, nachdem die Blastozyste am luminalen Epithel der Gebärmutter haftet, und der schnelle Umbau des Mesenchyms verändert seine Form und Funktion, was zur Einnistung des Embryos führt 5,9,10. Die rasche Zunahme des Stellenvolumens und des Gewichts ermöglicht es der Blastozyste, in das Uterusstroma eingebettet zu werden, ein Prozess, der als Dezidualisierungbekannt ist 11. Das endometriale Stroma differenziert und rekonstruiert sich in Vorbereitung auf die Schwangerschaft, während der Übergang der Stromazellen Raum und neue Signalverbindungen für Dezidualzellen bietet, um ihre Funktionen zu erfüllen12,13. Stromazellen wandeln sich in Dezidualzellen um und sezernieren viele ikonische Faktoren wie Prolaktin (PRL), insulinähnliches Wachstumsfaktor-bindendes Protein 1 (Igfbp1) und so weiter. Studien haben gezeigt, dass eine abnorme Dezidualisierung einer der Hauptgründe für das Versagen der Embryonenimplantation ist, aber die Ursache der abnormalen Dezidualisierung ist noch unklar und muss weiter aufgeklärt werden 1,14.
Das künstliche Dezidualisierungsmodell der Maus ist unerlässlich für die Untersuchung des physiologischen Prozesses und der molekularen Mechanismen, die der Dezidualisierung zugrunde liegen. Künstliche Dezidualisierung (AD) bezieht sich hauptsächlich auf den Prozess der Endometrium-Dezidualisierung, der durch künstliche Methoden zur Simulation einer Schwangerschaft oder des Menstruationszyklus etabliert wird. In Bezug auf die Morphologie gibt es insgesamt kaum einen Unterschied zwischen Schwangerschaftsdezidualisierung und künstlicher Dezidualisierung15,16. Die Uterusdrüsen existieren im Endometrium, bevor sich Decidua bilden und verschwinden nach der Dezidualisierung. In Bezug auf die Genexpression wird nur ein geringer Unterschied zwischen der natürlichen Schwangerschaftsdezidualisierung (NPD) und AD15 festgestellt. Folglich kann das künstliche Dezidualisierungsmodell in Mäusen die Dezidualisierung der Schwangerschaft simulieren, um die unbekannte Pathogenese und neue Behandlung menschlicher Fortpflanzungskrankheiten zu erforschen.
NPD, AD und In-vitro-Dezidualisierung (IVD) sind drei Methoden, um eine Maus-Dezidualisierung zu erreichen. Das NPD-Modell hängt von der natürlichen Schwangerschaft ab und kommt dem physiologischen Zustand der Mutter, einschließlich der Auswirkungen von Embryonen, am nächsten. Der Vergleich der Unterschiede zwischen Implantations- und Nicht-Implantationsstellen ist ein physiologischerer und bequemerer Ansatz zur Untersuchung der Dezidualisierung. Das AD-Modell wurde entwickelt, indem eine intrauterine Injektion von Sesamöl als Stimulans verwendet wurde, um eine Dezidualisierung bei einer pseudoschwangeren weiblichen Maus zu induzieren, die mit vasektomierten Männchen gepaart war, um die Auswirkungen von Embryonen zu vermeiden. Sowohl NPD- als auch AD-Modelle spielen eine wesentliche Rolle bei verschiedenen Forschungszwecken, aber sie können Paarungsfehler und Unterschiede innerhalb der Gruppe, die durch die unterschiedlichen Aktivitäten des mütterlichen Hormonstoffwechsels verursacht werden, nicht vermeiden. IVD ist eine Methode, die von der Behandlung von kombiniertem Östrogen und Progesteron auf zellulärer Ebene abhängt und strengere experimentelle Bedingungen und Operationsfähigkeiten erfordert. Das In-vitro-Modell kann die Dezidualantwort jedoch unter physiologischen Bedingungen nicht vollständig simulieren15. Daher schlagen wir eine einfache und verbesserte Induktionsmethode vor, die von der traditionellen AD modifiziert wurde, um die Wirkung endogener Hormone auf die Dezidualisierung zu reduzieren. Basierend auf der Sicherstellung des Erfolgs der Dezidualisierungsinduktion ist es näher am physiologischen Zustand und eignet sich besser für Experimente, bei denen Embryofaktoren ausgeschlossen werden müssen.
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Protocol
Alle beschriebenen Tierversuche wurden vom Komitee für die Verwendung und Pflege von Tieren (Nr. 20171202) des Affiliated Drum Tower Hospital der Nanjing University Medical School genehmigt. Alle Vorgänge folgen den entsprechenden Richtlinien der Tierpflege- und -verwendungsbehörde sowie der nationalen Richtlinien.
HINWEIS: Die Mäuse wurden in einer spezifischen, pathogenfreien Umgebung (SPF) mit einer Temperatur von 22 °C ± 1 °C, einer relativen Luftfeuchtigkeit von 50 % ± 1 %, einem Hell-Dunkel-Zyklus von 12 h/12 h und freiem Zugang zu Futter und Wasser aufgezogen.
1. Ovarektomie der Maus
- Sterilisieren Sie die chirurgischen Instrumente 1 Tag vor der Operation mit einem Hochtemperatur- und Hochdrucksterilisator.
- Wiegen Sie 8 Wochen alte C57BL / 6-Mäuse und injizieren Sie intraperitoneal (i.p.) 1% Natrium-Pentobarbital entsprechend, um die Mäuse zu betäuben. Die verwendete Dosis beträgt 40 mg/kg17. Diese Dosis bietet 40-60 Minuten Sedierung, was den Anforderungen einer Ovariektomie entspricht. Für die präoperative Analgesie injizieren Sie Mäusen 5 mg/kg Meloxicam (s.c.).
HINWEIS: Eine erfolgreiche Anästhesie bei Mäusen kann durch das Verschwinden tiefer Muskelreflexe und gleichmäßiger Atmung angezeigt werden. Anzeichen für eine erfolgreiche Anästhesie sind kein Blinzeln beim Berühren des inneren Canthus, kein Schlucken beim Ziehen der Zunge, kein Beinbeugen beim Einklemmen der Haut zwischen den Zehen und kein Hüpfen beim Nadeln des Schwanzes. - Tragen Sie die schützende Augensalbe auf die Augäpfel auf, um Trockenheit während der Narkose zu vermeiden.
- Starten Sie die Operation, wenn die Mäuse vollständig betäubt sind. Platzieren und fixieren Sie die Mäuse in Bauchlage auf der Operationsfläche und rasieren Sie die Haare auf dem Rücken, nachdem Sie sie mit Seifenwasser benetzt haben. Desinfizieren Sie die Haut nach der Rasur mit 70% Ethanol.
- Die Operationsstelle befindet sich bei 0,5 cm (oder 1,0 cm unterhalb der Rippe) am oberen Rand der Oberschenkelwurzel beider Hinterbeine parallel zur Wirbelsäule (Abbildung 1A).
HINWEIS: Eine korrekte Inzisionsstelle ist für eine schnelle Lokalisierung des Eierstocks unerlässlich. - Nehmen Sie die Inzisionsstelle als Zentrum und desinfizieren Sie den Inzisionsbereich 3x mit Iodophor, dann legen Sie ein chirurgisches Tuch um den Inzisionsbereich.
- Machen Sie mit einer Schere einen Längsschnitt von ca. 0,5-1,0 cm. Schneiden Sie die Faszie ab und trennen Sie die Muskeln passiv mit einer Pinzette.
- Finden Sie ein Stück des weißen Fettpolsters im Inzisionsfeld in der Nähe des unteren Pols der Niere durch die dünne Muskelschicht (Abbildung 1B).
HINWEIS: Das weiße Fettpolster ist der offensichtlichste Indikator für die Lage des Eierstocks. - Klemmen Sie die Fettmasse mit hämostatischen Clips fest und ziehen Sie den vom Fettpolster umwickelten Eierstock aus dem Einschnitt.
- Klemmen Sie die Verbindung von Eierstock und Eileiter mit einer gebogenen Pinzette fest und entfernen Sie den Eierstock entlang des Eierstockstiels mit einer Schere. Stoppen Sie die Blutung mit einem Elektrokoagulationsstift oder einer Nadel einer 1-ml-Spritze, die auf der Alkohollampe erhitzt wird.
HINWEIS: Achten Sie darauf, den Eileiter zu erhalten, der das anatomische Wahrzeichen für die anschließende Injektion von Sesamöl in die Gebärmutterhörner ist. - Spülen Sie den chirurgischen Schnitt mit normaler Kochsalzlösung ab, um eine Anhaftung des Gewebes zu verhindern, verwenden Sie eine 4-0-Naht, um den Muskel bzw. die Haut zu nähen, und desinfizieren Sie den chirurgischen Schnitt erneut mit Jodophor.
- Setzen Sie die Mäuse in Bauchlage in den Käfig und reanimieren Sie sie in einem 25 °C warmen Inkubator, der mit einer Lichtquelle und einem Belüftungssystem ausgestattet ist, für ca. 2 h.
- Achten Sie nach der Operation auf die Mäuse, setzen Sie sie allein wieder an den ursprünglichen Futterplatz, bis sie sich vollständig erholt haben, und geben Sie ihnen genügend Wasser und Futter.
2. Postoperative Ruhe und Östrogen- und Progesteronformulierung
- Stellen Sie sicher, dass die Mäuse nach der Ovariektomie 2 Wochen lang ruhen.
- In einem ultrasauberen Schrank Östrogen (2 ng/μl) und Progesteron (0,2 ng/μl) in Sesamöl in RNA-enzymfreien Zentrifugenröhrchen geben.
- Stellen Sie die Zentrifugenröhrchen in ein thermostatisches Wasserbad bei 37 °C und schütteln Sie die Röhrchen kontinuierlich, um die Auflösung zu beschleunigen.
- Teilen Sie die Sesamöllösung nach vollständiger Auflösung zur bequemen Verwendung in 100 μl Aliqouts auf. Lagern Sie die vorbereiteten Östrogen- und Progesteronlösungen im Kühlschrank bei 4 °C.
3. Induziertes künstliches Dezidualisierungsmodell
- Subkutan (s.c.) injizieren Sie 3 Tage lang 100 ng Östrogen in 50 μl Sesamöl in jede Maus, gefolgt von 2 Ruhetagen15.
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass Östrogen und Progesteron formuliert und an verschiedenen Stellen platziert wurden. Jede Kontamination von Östrogen durch Progesteron kann zum Versagen führen. - Injizieren Sie (s.c.) 1 mg Progesteron und 10 ng Östrogen in 50 μl Sesamöl für weitere 3 Tage in jede Maus15.
- Betreiben Sie die Mäuse, um das künstliche Dezidualisierungsmodell15 6 h nach der dritten kombinierten Östrogen-Progesteron-Injektion zu induzieren.
- Suchen Sie das Uterushorn am unteren Ende der Eileiter und injizieren Sie 20 μl Sesamöl langsam zusammen mit dem Uterushorn, schieben Sie das Gewebe zurück, nähen Sie den Schnitt und lassen Sie die Maus sich erholen. Der Operationsansatz ist derselbe wie bei der Ovarektomieder Maus 15.
HINWEIS: Fahren Sie mit der zweiten Operation nur im Falle einer erfolgreichen Ovarektomie fort (Hautschnitt ist gut verheilt, der Eierstock ist vollständig herausgeschnitten und das verbleibende Ende des Eileiters haftet nicht am umgebenden Gewebe).
HINWEIS: Für die Induktion des AD-Modells sind 20 μl Sesamöl geeignet; mehr als 20 μl Sesamöl dringen leicht in die andere Seite ein. - Injizieren Sie 50 μl Sesamöl mit 1 mg Progesteron und 10 ng Östrogen (H.) für weitere 4 Tage. Siehe Details in Abbildung 215,18.
4. Probenentnahme
- Euthanasieren Sie die Mäuse (n = 6) durch Kohlendioxid-Erstickung und sammeln Sie die Uteri. Beobachten Sie die Form der beidseitigen Uteri, machen Sie Fotos und wiegen Sie die Gebärmutterhörner (Abbildung 3A, B).
- Fixieren Sie 3-5 mm des Gebärmuttergewebes mit 10% Formalin, betten Sie es in Paraffin ein und schneiden Sie sie. Färben Sie die Schnitte mit Hämatoxylin und Eosin, um die morphologischen Veränderungen zu beobachten19 (Abbildung 4A).
- Weitere 3-5 mm des Gebärmuttergewebes in eine optimale Schnitttemperaturmischung (OCT) einbetten, in flüssigem Stickstoff einfrieren und in einem Kühlschrank bei −80 °C lagern. Gefrorener Schnitt des Gewebes auf 10 μm und Nachweis der alkalischen Phosphataseaktivität im Uterusgewebe durch die Azo-Kopplungsmethode20 (Abbildung 4B).
HINWEIS: Zufriedenstellende Ergebnisse können mit gefrorenen Schnitten erzielt werden, um den ALP-Gehalt zu erkennen, nicht mit Paraffinschnitten. - Extrahieren Sie die Gesamt-RNAs des Uterus mit Trizol-Reagenz und führen Sie eine quantitative Echtzeit-PCR (qPCR) auf einem Echtzeit-PCR-System (Materialtabelle) mit qPCR-Mastermix (Materialtabelle) durch, um die relative mRNA-Expression von Mitglied der Prolaktinfamilie 8 der Unterfamilie 2 (Prl8a2), der alkalischen Phosphatase Leber/Knochen/Niere (Alpl) und des insulinähnlichen Wachstumsfaktor-bindenden Proteins 1 (Igfbp1)15 durch Normalisierung auf 18S-mRNA-Spiegel nachzuweisen (Abbildung 4C-E ). Befolgen Sie die PCR-Bedingungen: Stufe 1, 95 °C für 30 s; Stufe 2, 95 °C für 10 s und 60 °C für 30 s; Wiederholen Sie den Zyklus 40x. Eine vollständige Liste der Primersequenzen ist in Tabelle 1 enthalten.
- Analysieren Sie qPCR-Daten mit der 2-ΔΔCT-Methode und einer t-Test-Methode zur statistischen Analyse in der entsprechenden Software. In dieser Studie wurde p < 0,05 als statistisch signifikant angesehen.
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Representative Results
Die Indizes des Maus-Dezidualisierungsmodells umfassen die allgemeine Morphologie des Uterus, das Massenverhältnis des dezidualisierten und nicht dezidualisierten Uterus, die histologische Morphologie des Endometriums und das Expressionsniveau der Dezidualisierungsmarkermoleküle. Die allgemeine Morphologie des künstlichen dezidualisierten Uterus von Mäusen, die durch Öl induziert werden, ist näher an der des Uterus in der Schwangerschaft. Der Uteruskörper wird dick und die Gebärmutterhöhle wird kleiner als die nicht induzierte Seite. Das Volumen und das Gewicht des induzierten Uterushorns sind signifikant höher als das der nicht induzierten Seite (Abbildung 3A,B). Die HE-Färbung von Uterusgewebe zeigte, dass die Drüsen verschwinden und sich die endometrialen Stromazellen auf dem induzierten Horn in große, runde, zytoplasmatische und mehrkernige Dezidualzellen mit unklaren Zellgrenzen differenzieren. Die nicht induzierten Seitenschnitte zeigen die Morphologie des Endometriumgewebes in einem normalen physiologischen Zustand (Abbildung 4A). Das Ergebnis der Azo-Kopplungsmethode zeigte, dass der alkalische Phosphatase-Gehalt der ölinduzierten Seite signifikant höher war als der der nicht-induzierten Seite (Abbildung 4B). Die qPCR-Ergebnisse zeigten, dass die mRNA-Expression von Prl8a2, Alpl und Igfbp1 im induzierten Horn signifikant höher war als die im nicht induzierten Horn, was darauf hindeutet, dass Öl bei Mäusen eine künstliche Dezidualisierung induzieren kann (Abbildung 4C-E).
Abbildung 1: Der operative Schnitt der Ovarektomie der Maus. (A) Position der Ovarektomie der Maus. (B) Die Position des Eierstocks der Maus während der Ovarektomie. (C) Die Stelle des Eierstocks während der Ovarektomie. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Der Ablauf der Operation. Das gesamte Verfahren umfasst die Ovarektomie, die postoperative Ruhe, die Induktion des künstlichen Dezidualisierungsmodells und die phänotypische Validierung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Generierung des künstlichen Dezidualisierungsmodells der Maus . (A) Repräsentatives Bild der künstlichen Dezidualisierung durch Öl. Der rechten Gebärmutter wurde kein Öl injiziert, das als Öl (-) bezeichnet wird. Der linken Gebärmutter wurde Öl injiziert, das als Öl (+) bezeichnet wird. (B) Das Gewicht der Gebärmutter, die mit oder ohne Öl injiziert wird. p < 0,001. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Validierung des künstlichen Dezidualisierungsmodells der Maus . (A) Repräsentatives HE-Bild der künstlichen Dezidualisierung, die durch Öl induziert wird. Maßstabsbalken = 1 mm und 100 μm. (B) Die Azo-Kopplungsmethode detektierte die alkalische Phosphataseaktivität von künstlichem Decidua. Maßstabsbalken = 200 μm und 50 μm. (C) Das Expressionsniveau der Prl8a2-mRNA wurde mittels qPCR nachgewiesen. * S. < 0,05. (D) Das Expressionsniveau der Alpl-mRNA . ** S. < 0,01. (E) Das Expressionsniveau der Igfbp1-mRNA . ** S. < 0,01. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
| Igfbp1 Maus qPCR-F | GCCCAACAGAAAGCAGGAGATG |
| Igfbp2 Maus qPCR-R | GTAGACACACCAGCAGAGTCCA |
| Prl8a2 Maus qPCR-F | ACCACAACCCATTCTCAGCTGG |
| Prl8a2 Maus qPCR-R | TGTTCAGGTCCATGAGCTGGTG |
| Alpl Maus qPCR-F | CCAGAAAGACACCTTGACTGTGG |
| Alpl Maus qPCR-R | TCTTGTCCGTGTCGCTCACCAT |
| 18s Maus qPCR-F | ATGGCCGTTCTTAGTTGGTG |
| 18s Maus qPCR-R | CGGACATCTAAGGGCATCAC |
Tabelle 1: Liste der Primer-Sequenzen.
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Discussion
Die Dezidualisierung bei Mäusen ist ein spontaner Prozess, der von der Anwesenheit von Embryonen abhängt, die sich vom Menschen unterscheiden. Es wurde jedoch festgestellt, dass künstliche Stimulation wie die Injektion von Glasperlen in die Gebärmutter und die Verletzung der Gebärmutter eine Dezidualisierung des Endometriums anstelle von Embryonen induzieren kann. Darüber hinaus fanden die Forscher heraus, dass viele Faktoren eine Dezidualisierung induzieren oder an der Dezidualisierung teilnehmen können, wie z. B. die Injektion von Steroidhormonen, Prostaglandinen und wachstumshemmenden Faktoren in die Gebärmutterhöhle21. Verglichen mit den oben genannten Modellierungsmethoden kann das hier beschriebene Mausmodell mit Ovarektomie, bei dem Sesamöl als Stimulans verwendet wird, die Auswirkungen von endogen produziertem Östrogen und Progesteron ausschließen. Daher ist es wirtschaftlich und einfach zu bedienen.
Die Eierstöcke sollten sauber entfernt werden, um Reste von Eierstockgewebe zu vermeiden, die die anschließende Induktion der Dezidualisierung beeinträchtigen. Dieser Schritt zielt darauf ab, die Auswirkungen von endogenem Östrogen und Progesteron, das von den Eierstöcken produziert wird, zu reduzieren. Eine Schädigung des Eileiters sollte vermieden werden, da er als Zeichen für die Suche nach der Gebärmutter verwendet werden kann, wenn das Sesamöl in die Gebärmutterhöhle injiziert wird. Wenn eine Bauchadhäsion oder Eileiterentfernung auftritt, muss der Bediener darauf achten, die Gebärmutter vom Darm zu unterscheiden.
Bei der subkutanen Injektion tritt leicht ein Ölaustritt auf. Man sollte die Bauchhaut als subkutane Injektionsstelle wählen und die Brustwarzen meiden. Es ist notwendig, das Öl zu injizieren und die Nadel langsam herauszuziehen. Wenn die Nadel nicht herausgezogen werden kann, wenn die Maus aktiv ist, führt dies leicht zu Undichtigkeiten. Man sollte einen Moment lang mit einem Wattebausch auf die Nadelstelle drücken, um ein Auslaufen zu verhindern. Bei dieser Operation wurden exogene Östrogen- und Progesteron-Injektionen verwendet, um den Hormonspiegel der Mäuse vor der induzierenden Dezidualisierungsoperation stabil zu halten. Diese Injektionsmethode simulierte Hormonveränderungen in der Periimplantationsphase von Mäusen. Hier induzierten wir die Dezidualisierung nach dem zweiten Östrogenpeak.
Der Schlüssel zum Erfolg dieser Operation ist die Menge des injizierten Sesamöls. Zu viel Sesamöl dringt in den Hohlraum des anderen Horns der Uteri ein. Unzureichendes Sesamöl führt zu einer verminderten Dezidualisierungsreaktion oder einer ungleichmäßigen Dezidualisierung entlang der Gebärmutter, was zu unerwarteten experimentellen Unterschieden führt. Während der Operation sollte man die Spritzennadel bei der Injektion von Sesamöl in die Gebärmutterhöhle einführen und vorsichtig hin und her ziehen, um sicherzustellen, dass sich die Nadel in der Gebärmutterhöhle befindet. Ein Teil der Gebärmutterhöhle kann bei erfolgreicher Injektion als transparent angesehen werden. Man sollte den Nadelstich vorsichtig mit einer Pinzette für etwa 10 s festklemmen, um sicherzustellen, dass er geschlossen ist, was das Austreten von Sesamöl nach dem Herausziehen der Nadel verhindern kann. Drücken Sie gleichzeitig den Uteruskörper vorsichtig mit der Nadel nach unten, damit sich das Sesamöl gleichmäßig in der Gebärmutterhöhle verteilt.
Die Behandlung nach der Operation und die Wiederbelebung sind weitere Schlüssel zum Erfolg dieses Modells. Erstens ist es wichtig, während der Operation eine sterile Umgebung für den Einschnitt zu schaffen. Desinfizieren Sie vor der Wiederbelebung der Mäuse den Operationsschnitt mit Jodophor und bedecken Sie ihn mit einem Stück medizinischer Gaze, um das Auftreten von Infektionen zu verringern. Nach der Operation müssen die Mäuse 2-3 Stunden lang Anästhetika metabolisieren, um sich zu erholen. Während dieser Zeit müssen die Mäuse in einen 25 °C heißen Inkubator gegeben werden, um sich schneller zu erholen und eine Unterkühlung zu vermeiden, die durch die Desinfektion mit 70% Alkohol und Jodophor verursacht wird. Man sollte auf die Heilung innerhalb weniger Tage nach der Operation achten und Arten von operativen Komplikationen wie Schnittrisse, Schwellungen, Ulzerationen usw. rechtzeitig behandeln.
Prl8a2 und Alpl sind die klassischsten Dezidualisierungsmarker. Igfbp1 ist auch das Hauptprotein in dezidualisierten Zellen in Mäusen und gilt als spezifischer Marker für die Dezidualisierung in Mäusen. Die Expressionsniveaus von Prl8a2-, Alpl- und Igfbp1-mRNA im ölinduzierten Uterushorn sind im Vergleich zur Kontrollseite ohne Ölinjektion signifikant erhöht. Darüber hinaus ist die Aktivität der alkalischen Phosphatase auf der ölinduzierten Seite signifikant höher als auf der Kontrollseite. Diese Ergebnisse deuten alle auf den Erfolg des künstlichen Dezidualisierungsmodells15 hin.
Das künstliche Dezidualisierungsmodell der Maus kann verwendet werden, um pathogene Unfruchtbarkeitsmoleküle zu validieren und ein gutes Validierungsmodell für die Diagnose und Behandlung von Unfruchtbarkeit im Zusammenhang mit abnormaler Endometriumdezidualisierung bereitzustellen. Dieses Modell ist nützlich für die Untersuchung von Fortpflanzungskrankheiten, wie z. B. wiederholte Abtreibung und wiederholtes Implantationsversagen. Es wird verwendet, um die Rolle mütterlicher Faktoren bei der Einnistung und Invasion von Embryonen zu untersuchen. Dieses AD-Modell hat eine gute Sicherheit, eine hohe Erfolgsquote und löst den Einfluss endogener Hormone. Es ist jedoch ein zeitaufwändiger und sehr anspruchsvoller Prozess. Wir werden unsere experimentellen Methoden weiter optimieren, um die Forschung zu erleichtern.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Die Autoren bedanken sich für die Unterstützung durch die National Nature Science Foundation of China (82001629, XQS), das Youth Program of Natural Science Foundation of Jiangsu Province (BK20200116, XQS) und die Postdoctoral Research Funding der Provinz Jiangsu (2021K277B, XQS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Estrogen | Sigma | E2758 | Hormone supplement |
| Progesterone | Sigma | P0130 | Hormone supplement |
| Sesame oil | Sigma | S3547 | Hormone supplement |
| Sodium pentobarbital | Dainippon Sumitomo Pharma Co.,Ltd. | Anaesthesia | |
| Meloxicam injection | Qilu Animal Health Products Co., Ltd | Analgesia | |
| Alkaline phophatase stain kit(kaplow's/azo coupling method) | Solarbio | G1480 | Alkaline phophatase stain |
| Eosin | Servicebio | G1005-2 | HE stain |
| Hematoxylin | Servicebio | G1005-1 | HE stain |
| ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix | Vazyme | Q711-02 | qPCR |
| 70% ethanol | Lircon | ZH1120090 | Disinfect |
| Iodophor | Runzekang | RZK-DF | Disinfect |
| Erythromycin Eye Ointment | Guangzhou Baiyunshan | Mice eyeball protect | |
| 4-0 suture | Ethicon | W329 | Incision suture |
| 10% formalin | Yulu | L25010118 | Tissue fix |
| Optimal cutting temperature compound | Sakura | 4583 | Ssection |
| Trizol reagent | Ambion | 15596018 | qPCR |
References
- Carson, S. A., Kallen, A. N. Diagnosis and management of infertility: A review. JAMA. 326 (1), 65-76 (2021).
- Yatsenko, S. A., Rajkovic, A. Genetics of human female infertility dagger. Biology of Reproduction. 101 (3), 549-566 (2019).
- Sang, Y., Li, Y., Xu, L., Li, D., Du, M. Regulatory mechanisms of endometrial decidualization and pregnancy-related diseases. Acta Biochimica et Biophysica Sinica. 52 (2), 105-115 (2020).
- Ng, S. W., et al. Endometrial decidualization: The primary driver of pregnancy health. International Journal of Molecular Sciences. 21 (11), 4092 (2020).
- Birgit, G., Brosens, J. J. Cyclic decidualization of the human endometrium in reproductive health and failure. Endocrine Reviews. 35 (6), 851-905 (2014).
- Owusu-Akyaw, A., Krishnamoorthy, K., Goldsmith, L. T., Morelli, S. S. The role of mesenchymal-epithelial transition in endometrial function. Human Reproduction Update. 25 (1), 114-133 (2019).
- Paulson, E. E., Comizzoli, P. Endometrial receptivity and embryo implantation in carnivores-commonalities and differences with other mammalian species. Biology of Reproduction. 104 (4), 771-783 (2021).
- Kelleher, A. M., Milano-Foster, J., Behura, S. K., Spencer, T. E. Uterine glands coordinate on-time embryo implantation and impact endometrial decidualization for pregnancy success. Nature Communications. 9 (1), 2435 (2018).
- Tian, J., et al. Attenuated monoamine oxidase a impairs endometrial receptivity in women with adenomyosis via downregulation of FOXO1dagger. Biology of Reproduction. 105 (6), 1443-1457 (2021).
- Large, M. J., DeMayo, F. J. The regulation of embryo implantation and endometrial decidualization by progesterone receptor signaling. Molecular and Cellular Endocrinology. 358 (2), 155-165 (2012).
- Dunn, C. L., Kelly, R. W., Critchley, H. O. Decidualization of the human endometrial stromal cell: an enigmatic transformation. Reproductive BioMedicine Online. 7 (2), 151-161 (2003).
- Zhu, H., Hou, C. C., Luo, L. F., Hu, Y. J., Yang, W. X. Endometrial stromal cells and decidualized stromal cells: Origins, transformation and functions. Gene. 551 (1), 1-14 (2014).
- Jose, R. M., et al. Endometrial and decidual stromal precursors show a different decidualization capacity. Reproduction. 160 (1), 83-91 (2020).
- Pan-Castillo, B., et al. Morphophysical dynamics of human endometrial cells during decidualization. Nanomedicine. 14 (7), 2235-2245 (2018).
- Wang, C., et al. Comparative analysis of mouse decidualization models at the molecular level. Genes. 11 (8), 935 (2020).
- De Clercq, K., Hennes, A., Vriens, J. Isolation of mouse endometrial epithelial and stromal cells for in vitro decidualization. Journal of Visualized Experiments. (121), e55168 (2017).
- Kerger, H., et al. Microvascular oxygen delivery and interstitial oxygenation during sodium pentobarbital anesthesia. Anesthesiology. 86 (2), 372-386 (1997).
- Filant, J., Spencer, T. E. Endometrial glands are essential for blastocyst implantation and decidualization in the mouse uterus. Biology of Reproduction. 88 (4), 93 (2013).
- Sheng, X., et al. The mitochondrial protease LONP1 maintains oocyte development and survival by suppressing nuclear translocation of AIFM1 in mammals. EBioMedicine. 75, 103790 (2022).
- Grogg, E., Pearse, A. G. Coupling azo dye methods for histochemical demonstration of alkaline phosphatase. Nature. 170 (4327), 578-579 (1952).
- Labarta, E., et al. Analysis of serum and endometrial progesterone in determining endometrial receptivity. Human Reproduction. 36 (11), 2861-2870 (2021).
