Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Visualisierung stammartig wuchernder Zellen in der Qualle Cladonema. Die Whole-mount-Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung mit einem Stammzellmarker ermöglicht den Nachweis stammähnlicher Zellen, und die 5-Ethynyl-2'-Desoxyuridin-Markierung ermöglicht die Identifizierung proliferierender Zellen. Zusammen können aktiv wuchernde stammartige Zellen nachgewiesen werden.
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Methodenartikel
Fluoreszierende In situ Hybridisierung und 5-Ethynyl-2'-Desoxyuridin-Markierung für stammähnliche Zellen in der Hydrozoenqualle Cladonema pacificum
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Nesseltiere, einschließlich Seeanemonen, Korallen und Quallen, zeigen vielfältige Morphologie und Lebensstile, die sich in sitzenden Polypen und frei schwimmenden Medusen manifestieren. Wie etablierte Modelle wie Hydra und Nematostella zeigen, tragen Stammzellen und/oder proliferative Zellen zur Entwicklung und Regeneration von Nesseltierpolypen bei. Die zugrunde liegenden zellulären Mechanismen in den meisten Quallen, insbesondere im Medusa-Stadium, sind jedoch weitgehend unklar, und daher ist die Entwicklung einer robusten Methode zur Identifizierung spezifischer Zelltypen von entscheidender Bedeutung. Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll zur Visualisierung stammartig proliferierender Zellen in der Hydrozoenqualle Cladonema pacificum. Cladonema medusae besitzen verzweigte Tentakel, die während ihres gesamten Erwachsenenstadiums kontinuierlich wachsen und die Regenerationsfähigkeit aufrechterhalten und eine einzigartige Plattform bieten, um die zellulären Mechanismen zu untersuchen, die von proliferierenden und / oder stammartigen Zellen orchestriert werden. Die Whole-mount-Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) unter Verwendung eines Stammzellmarkers ermöglicht den Nachweis stammähnlicher Zellen, während die Pulsmarkierung mit 5-Ethynyl-2'-Desoxyuridin (EdU), einem S-Phasenmarker, die Identifizierung proliferierender Zellen ermöglicht. Durch die Kombination von FISH- und EdU-Markierung können wir aktiv proliferierende stammartige Zellen an festen Tieren nachweisen, und diese Technik kann breit auf andere Tiere angewendet werden, einschließlich Nicht-Modell-Quallenarten.
Einleitung
Cnidaria gilt als basal verzweigter Metazoenstamm, der Tiere mit Nerven und Muskeln enthält, was sie in eine einzigartige Position für das Verständnis der Evolution der Tierentwicklung und -physiologie versetzt 1,2. Nesseltiere werden in zwei Hauptgruppen eingeteilt: Anthozoen (z. B. Seeanemonen und Korallen) besitzen nur Planulalarven und sessilile Polypenstadien, während Medusozoa (Mitglieder von Hydrozoa, Staurozoa, Scyphozoa und Cubozoa) typischerweise die Form von frei schwimmenden Medusen oder Quallen sowie Planulalarven und Polypen annehmen. Nesseltiere weisen häufig eine hohe Regenerationsfähigkeit auf....
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Protokoll
HINWEIS: Details zu allen Materialien, Reagenzien und Geräten, die in diesem Protokoll verwendet werden, finden Sie in der Materialtabelle .
1. Sondensynthese
- RNA-Extraktion
- Legen Sie drei lebende Cladonema-Medusen , die in künstlichem Meerwasser (ASW) kultiviert werden, in ein 1,5-ml-Röhrchen mit einer 3,1-ml-Transferpipette mit abgeschnittener Spitze und entfernen Sie so viel ASW wie möglich.
HINWEIS: ASW wird hergestellt, indem eine Mischung von Mineralsalzen in Leitungswasser mit Chlorneutralisator aufgelöst wird; das endgültige spezifische Gewicht (S.G.) beträgt 1,018 oder ....
- Legen Sie drei lebende Cladonema-Medusen , die in künstlichem Meerwasser (ASW) kultiviert werden, in ein 1,5-ml-Röhrchen mit einer 3,1-ml-Transferpipette mit abgeschnittener Spitze und entfernen Sie so viel ASW wie möglich.
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Ergebnisse
Cladonema-Tentakel wurden als Modell verwendet, um die zellulären Prozesse der Morphogenese und Regeneration zu untersuchen15,16,17. Die Tentakelstruktur besteht aus einer Epithelröhre, in der sich stammartige Zellen oder i-Zellen im proximalen Bereich befinden, der als Tentakelkolben bezeichnet wird, und neue Zweige werden sequentiell an der Rückseite der distalen Region der Birne entlang der adaxialen Seite hinzugefüg.......
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Diskussion
Proliferierende Zellen und Stammzellen sind wichtige zelluläre Quellen in verschiedenen Prozessen wie Morphogenese, Wachstum und Regeneration21,22. Dieser Artikel beschreibt eine Methode zur Co-Färbung des Stammzellmarkers Nanos1 durch FISH- und EdU-Markierung in Cladonema medusae. Frühere Arbeiten mit EdU- oder BrdU-Markierung haben vorgeschlagen, dass proliferative Zellen in den Tentakelkolben16,17 lokalisieren,
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Offenlegungen
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde von AMED unter der Fördernummer JP22gm6110025 (an Y.N.) und von der JSPS KAKENHI Grant Number 22H02762 (an Y.N.) unterstützt.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 2-Mercaptoethanol | Wako | 137-06862 | |
| 3,1 mL Transferpipette | Thermo Scientific | 233-20S | |
| 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-Galactopyranosid (X-Gal) | Wako | 029-15043 | |
| Anti-DIG-POD | Roche | 11207733910 | |
| Cladonema pacificum Nanos1 Forward Primer | 5'- AAGAGACACAGTCATTATCAAGC GA-3' | ||
| Cladonema pacificum Nanos1 Reverse Primer | 5'-CGACGTGTCCAATTTTACGTGCT -3' | ||
| Cladonema pacificum Piwi Forward Primer | 5'- AAAAGAGCAGCGGCCAGAAAGA AGGC -3' | ||
| Cladonema pacificum Piwi Reverse Primer | 5'- GCGGGTCGCATACTTGTTGGTA CTGGC -3' | ||
| Click-iT EdU Zellproliferationskit für die Bildgebung, Alexa Fluor 488 Farbstoff | Invitrogen | C10337 | EdU-Kit |
| Coroline von | GEX Co. ltd | N/A | Chlorneutralisator |
| DIG Nukleinsäure-Nachweiskit Blockierungsreagenz | Roche | 11175041910 | Blockierungspuffer |
| DIG-RNA-Markierungsmix | Roche | 11277073910 | |
| DTT | Promega | P117B | |
| ECOS zuständige Zelle DH5α | NIPPON GENE | 316-06233 | kompetente Zelle |
| Schnelles Gen-Gel/PCR-Extraktionskit | Schnelles Gen | FG-91302 | Gel-Extraktionskit |
| Schnelles Genplasmid-Mini-Kit | Schnelles Gen | FG-90502 | Plasmid-Miniprep |
| Formamid | Wako | 068-00426 | |
| Heparin-Natriumsalz aus Schweinen | SIGMA-ALDRICH | H3393-10KU | |
| Isopropyl-β-D(-)-thiogalactopyranosid (IPTG) | Wako | 096-05143 | |
| LB Agar | Invitrogen | 22700-025 | Agarplatte |
| LB Bouillon Base | Invitrogen | 12780-052 | LB medium |
| Maleinsäure | Wako | 134-00495 | |
| mini Quick Spin RNA Säulen | Roche | 11814427001 | Aufräumkolonne |
| NaCl | Wako | 191-01665 | |
| NanoDrop OneC Mikrovolumen-UV-Vis-Spektralphotometer mit Wi-Fi | Thermo Scientific | ND-ONEC-W | Spektralphotometer |
| Polyoxyethlen (20) Sorbitanmonolaurat (Tween-20) | Wako | 166-21115 | |
| PowerMasher 2 | nippi | 891300 | Homogenisator |
| Proteinase K | Nacarai Tesque | 29442-14 | |
| RNase-Inhibitor | TaKaRa | 2313A | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74004 | Gesamt-RNA-Isolationskit |
| RQ1 RNase-freie Dnase | Promega | M6101 | |
| Kochsalzlösung Natriumcitrat Puffer 20x Pulver (20x SSC) | TaKaRa | T9172 | |
| SEA LIFE | Marin Tech | N/A | Mischung aus Mineralsalzen |
| T3 RNA-Polymerase | Roche | 11031163001 | |
| T7 RNA-Polymerase | Roche | 10881767001 | |
| TAITEC HB-100 | TAITEC | 0040534-000 | Hybridisierungs-Incuvator |
| TaKaRa Ex Taq | TaKaRa | RR001A | Taq DNA-Polymerase |
| TaKaRa PrimeScript 2 1st strang cDNA Synthese Kit | TaKaRa | 6210A | cDNA |
| Synthese Kit Target Klon | TOYOBO | TAK101 | pTA2 |
| Vektor-tRNA | Roche | 10109541001 | |
| TSA Plus Cyanin 5 | AKOYA Biosciences | NEL745001KT | Tyramid-Signalamplifikationstechnik (TSA) |
| Zeiss LSM 880 | ZEISS | N/A | konfokales Laser-Scanning-Mikroskop |
Referenzen
- Leclère, L., Röttinger, E. Diversity of cnidarian muscles: Function, anatomy, development and regeneration. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 157(2017).
- Bosch, T. C. G., et al. Back to the basics: Cnidarians start to fire....
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Nachdrucke und Genehmigungen
