Summary
ここでは、クラゲ クラドネーマにおける茎様増殖細胞を可視化するためのプロトコールについて述べる。幹細胞マーカーとのホールマウント蛍光 in situ ハイブリダイゼーションは幹細胞様細胞の検出を可能にし、5-エチニル-2'-デオキシウリジン標識は増殖細胞の同定を可能にします。一緒に、活発に増殖している幹細胞様細胞を検出することができる。
Abstract
イソギンチャク、サンゴ、クラゲなどの刺胞動物は、固着性ポリープや自由に泳ぐメデューサに現れる多様な形態とライフスタイルを示します。 ヒドラ や ネマトステラなどの確立されたモデルに例示されるように、幹細胞および/または増殖細胞は刺胞動物ポリープの発生と再生に寄与します。しかし、ほとんどのクラゲの根底にある細胞メカニズム、特にメデューサの段階はほとんど不明であるため、特定の細胞タイプを特定するための堅牢な方法を開発することが重要です。この論文は、ヒドロ虫クラゲ Cladonema pacificumにおける茎様増殖細胞を可視化するためのプロトコルを記載する。 Cladonema medusaeは、成体期を通じて継続的に成長し、再生能力を維持する分岐触手を備えており、増殖細胞および/または幹細胞様細胞によって調整される細胞メカニズムを研究するための独自のプラットフォームを提供します。幹細胞マーカーを用いたホールマウント蛍光 in situ ハイブリダイゼーション(FISH)は幹細胞様細胞の検出を可能にし、S期マーカーである5-エチニル-2'-デオキシウリジン(EdU)によるパルス標識は増殖細胞の同定を可能にします。FISH標識とEdU標識を組み合わせることで、固定動物で活発に増殖している幹細胞を検出することができ、この手法は非モデルクラゲ種を含む他の動物にも広く適用できます。
Introduction
刺胞動物は、神経と筋肉を持つ動物を含む基本的に分岐した後生動物門と考えられており、動物の発生と生理学の進化を理解するためのユニークな位置にあります1,2。刺胞動物は2つの主要なグループに分類されます:アントゾア(イソギンチャクやサンゴなど)はプラヌラ幼虫と固着性ポリープステージのみを持っていますが、メドゥソゾア(ヒドロゾア、スタウロゾア、シフォゾア、キュボゾアのメンバー)は通常、遊泳するメデューサ、またはクラゲ、およびプラヌラの幼虫とポリープの形をとります。刺胞動物は一般的に高い再生能力を示し、その根底にある細胞メカニズム、特に成体幹細胞と増殖細胞の所有が大きな注目を集めています3,4。Hydraで最初に同定されたヒドロ虫幹細胞は、外胚葉上皮細胞間質間質に位置し、一般に間質細胞またはi細胞と呼ばれます3。
ヒドロ虫i細胞は、多能性、広く保存されている幹細胞マーカー(Nanos、Piwi、Vasaなど)の発現、および遊走の可能性3,5,6,7,8を含む共通の特徴を共有しています。機能的な幹細胞として、i細胞はヒドロ虫動物の発生、生理学、環境応答に広く関与しており、その高い再生能力と可塑性を証明しています3。幹細胞は、i細胞と同様に、ヒドロ虫以外では同定されていませんが、確立されたモデル種である線虫でさえ、増殖細胞は依然として体細胞組織および生殖系列の維持と再生に関与しています9。刺胞動物の発生と再生に関する研究は、主にヒドラ、ヒドラクチニア、ネマトステラなどのポリープ型動物で行われてきたため、クラゲ種の幹細胞の細胞動態と機能はほとんど取り上げられていません。
ヒドロ虫クラゲ Clytia hemisphaerica は、地中海や北米を含む世界中で異なる生息地を持つ国際的なクラゲ種であり、いくつかの発生および進化研究で実験モデル動物として利用されています10。サイズが小さく、取り扱いが簡単で卵が大きいため、 Clytia は実験室でのメンテナンスや、最近確立されたトランスジェネシスやノックアウト法などの遺伝ツールの導入に適しており11、クラゲの生物学の根底にある細胞および分子メカニズムの詳細な分析の機会を開きます。 Clytia medusa触手では、i細胞は球根と呼ばれる近位領域に局在し、線虫などの前駆細胞は線虫細胞を含む異なる細胞型に分化しながら遠位先端に移動します12。
クラゲの口腔器官であるClytia manubriumの再生中に、生殖腺に存在するNanos1+ i細胞は、損傷に応答してマヌブリウムが失われる領域に移動し、マニュブリウム7の再生に関与します。これらの知見は、Clytiaのi細胞が、形態形成と再生に関与する機能的な幹細胞としても振る舞うという考えを支持している。しかし、ヒドラやヒドラクチニア3などの代表的なポリープ型動物ではi細胞の性質が異なることから、クラゲ種間で幹細胞の特性や機能が多様化している可能性があります。さらに、Clytiaを除いて、他のクラゲの実験技術は限られており、増殖細胞と幹細胞の詳細な動態は不明です13。
ヒドロ虫クラゲCladonema pacificumは、ウォーターポンプやろ過システムなしで実験室環境で保管できる新しいモデル生物です。クラドネマメデューサは、クラドネマ科に共通する特徴である枝分かれした触手と、球根14近くの外胚葉層に卵子と呼ばれる光受容体器官を持っています。触手分岐プロセスは、触手の軸方向に沿って現れる新しい分岐部位で発生します。時間が経つにつれて、触手は伸びて枝分かれし続け、古い枝は先端15に向かって押し出されます。さらに、クラドネーマの触手は切断後数日以内に再生する可能性があります。最近の研究では、クラドネーマの触手の分岐と再生における増殖細胞と幹細胞のような細胞の役割が示唆されています16,17。しかし、従来のin situハイブリダイゼーション(ISH)は、クラドネーマの遺伝子発現を可視化するために利用されてきましたが、分解能が低いため、幹細胞の動態を細胞レベルで詳細に観察することは現在のところ困難です。
この論文では、FISHによってクラドネーマの幹細胞様細胞を可視化し、細胞増殖のマーカーであるEdUと共染色する方法について説明しています18。幹細胞マーカー5,17であるNanos1の発現パターンをFISHで可視化することで、幹細胞様細胞の分布を1細胞レベルで同定することができます。さらに、Nanos1発現とEdU標識の共染色により、活発に増殖している幹細胞様細胞を区別することができます。幹細胞様細胞と増殖細胞の両方をモニタリングするこの方法は、クラドネーマにおける触手の分岐、組織の恒常性、臓器再生など、幅広い研究分野に適用でき、同様のアプローチは他のクラゲ種にも適用できます。
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Protocol
注意: このプロトコルで使用されるすべての材料、試薬、および機器に関連する詳細については、 材料の表 を参照してください。
1. プローブ合成
- RNA抽出
- 人工海水(ASW)で培養した生きたクラ ドネマ ・メデューサ3種を、先端を切り落とした3.1mLトランスファーピペットを用いて1.5mLチューブに入れ、できるだけ多くのASWを除去します。
注:ASWは、ミネラル塩の混合物を水道水に塩素中和剤で溶解することによって調製されます。最終的な比重(SG)は1.018または1000分の1(ppt)は~27です。 - 1.5 mLチューブを液体窒素で凍結して、RNase活性を阻害します。2-メルカプトエタノール(1 μL/100 μLの溶解バッファー)を添加したトータルRNA単離キットから30 μLの溶解バッファーを追加し、ホモジナイザーを使用して溶解バッファーでサンプルをホモジナイズします。
注:バッファーとサンプルがチューブからオーバーフローするのを防ぐために、少量の溶解バッファーによる均質化をお勧めします。 - 570 μLの溶解バッファーを加え、トータルRNAアイソレーションキットのプロトコルに従ってトータルRNAを抽出します(図1)。
- 抽出したRNAの濃度を分光光度計で測定し、使用するまで-80°Cで保存します。
- 人工海水(ASW)で培養した生きたクラ ドネマ ・メデューサ3種を、先端を切り落とした3.1mLトランスファーピペットを用いて1.5mLチューブに入れ、できるだけ多くのASWを除去します。
- cDNA合成
- キットを用いて、メデューサから抽出した全RNAを鋳型としてcDNAを合成する(図 1及び 表1)。
- 65°Cで5分間インキュベートします。
- 氷の上で急速に冷却します。
- ステップ1.2.1の混合物を用いてcDNA合成を行う(表1)。ピペッティングで十分に混合し、42°Cで60分間インキュベートします。
- 95°Cで5分間インキュベートします。
- 氷の上で急速に冷却します。
- 分光光度計を使用して合成されたcDNAの濃度を測定し、使用するまで-20°C以下で保存します。
- PCR産物合成
- PCRテンプレートを作成するには、プライマー-BLASTを使用して特定のプライマーを設計します。NCBIデータまたはRNA-seqデータから参照配列を調達します。
注:このプロトコルで使用されるプライマーについては、 材料表 を参照してください。 - 標的配列を増幅するには、制限酵素の使用を必要としないTAクローニングを行う。3'末端にアデニンが付加されたPCR産物を得るには、次の設定を使用します:98°Cで2分間;98°Cで10秒間、55-60°Cで30秒間、72°Cで1分間の35サイクル。 反応にはTaq DNAポリメラーゼを使用してください(表1)。
注:PCR条件を決定するには、使用するDNAポリメラーゼに付属のプロトコルに従い、一般的に推奨されるアニーリング温度と延長時間を提供します。 - PCR産物を1%アガロースゲルに通し、目的のバンドを切り取ります。ゲル抽出キットを使用して、カットゲルからPCR産物を抽出します。
- PCRテンプレートを作成するには、プライマー-BLASTを使用して特定のプライマーを設計します。NCBIデータまたはRNA-seqデータから参照配列を調達します。
- 結紮
- 試薬を混合し(表1)、37°Cで30分間インキュベートすることにより、PCR産物を3'チミンオーバーハングでベクターにリゲートします(図1)。
注:ベクター:PCRの分子比は1:>3である必要があります。pTA2 のベクトル サイズは約 3 KB です。PCR産物(インサート)がA(kb)およびB(ng/μL)の場合、採取されるインサート( 表1のX)の容量は、([50 ngのベクター×1 kbのインサート])/(3 kbのベクター×[1/3])= 50·挿入のng。インサートの濃度がB ng / μLの場合、採取量は50·A/B μLのインサート。
- 試薬を混合し(表1)、37°Cで30分間インキュベートすることにより、PCR産物を3'チミンオーバーハングでベクターにリゲートします(図1)。
- 変態とめっき
- 形質転換のために、コンピテントセルを氷上で解凍し、それぞれ20 μLのアリコートに分注します。PCR産物(コンピテントセルボリュームの5%未満)を含むプラスミドを1 μL加え、ボルテックスを1秒間加えます。氷上で5分間インキュベートした後、42°Cで45秒間インキュベートし、1秒間ボルテックスします。
- カタボライト抑制(SOC)培地(栄養豊富な細菌培養培地)を含む180 μLのスーパーオプティマルブロスをコンピテントセルに加え、37°Cで30分間インキュベートします。30分後、コンピテントセルをアンピシリン、5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-β-D-ガラクトピラノシド(X-gal)、イソプロピル-β-d-1-チオガラクトピラノシド(IPTG)を含む寒天プレートに広げ、37°Cで12〜16時間インキュベートします(図1)。
注:X-galとIPTGは、青と白のコロニーを選択するために使用されます。
- 液体培養
- プレート上の白と青のコロニーから白いコロニーを選びます。それをアンピシリンを含む3〜5 mLのLB培地に加え、シェーカーで37°Cで12〜16時間インキュベートします(図1)。
- ミニプレップ
- プラスミドミニプレップを用いてLB培地からプラスミドを抽出します(図1)。
- 分光光度計を用いてプラスミド濃度を定量する。
- シーケンスを読みます。
- プラスミドのDNA配列を読み取るには、サンガーシーケンシングのためにプラスミドを送り、ソフトウェアを使用してゲノム/トランスクリプトーム配列とアラインメントし、ターゲット配列が適切に合成されているかどうかを確認し、ターゲット配列がプラスミドに挿入される方向(5'から3'または3'から5')を評価します。
注:標的配列が3'末端近くのRNAポリメラーゼ結合部位から5'〜3'方向にプラスミドに挿入されている場合、アンチセンスプローブは in vitro 転写によって生成できます。ターゲット配列が逆の3'〜5'方向に挿入されると、センスプローブ(ネガティブコントロール)を生成できます。pTA2などのベクターを用いる場合、目的に応じて2つの転写結合部位を用いることができる。
- プラスミドのDNA配列を読み取るには、サンガーシーケンシングのためにプラスミドを送り、ソフトウェアを使用してゲノム/トランスクリプトーム配列とアラインメントし、ターゲット配列が適切に合成されているかどうかを確認し、ターゲット配列がプラスミドに挿入される方向(5'から3'または3'から5')を評価します。
- インビトロ 転写
- プラスミド内のRNAポリメラーゼ結合部位(T7/T3結合部位など)の外側のプライマーを用いてPCRを行うことにより、作成したプラスミドからDNA鋳型を調製します(図1)。
注:M13-20フォワードプライマーやM13リバースプライマーなどのユニバーサルプライマーを使用して、RNAポリメラーゼ結合部位を含むDNAテンプレートを調製できます。 - PCR増幅後にゲル/PCR抽出キットを使用してテンプレートを精製します。
- 以下に示す試薬を混合し、37°Cで3時間転写反応を行う(図 1及び 表1)。
- 1.5 μLのDNaseを添加し、37°Cで30分間インキュベートします。
- RNaseフリーの水10 μLを加え、クリーンアップカラムを使用して転写反応溶液からプローブを精製します。
- 1%アガロースゲルに1 μLをロードして合成したRNAのサイズを確認し、分光光度計を使用して濃度を決定します。
注:合成されたRNAプローブの濃度は少なくとも100 ng / μLである必要があります。 - ホルムアミドを30 μL添加し、-20°C以下で保存します。
- プラスミド内のRNAポリメラーゼ結合部位(T7/T3結合部位など)の外側のプライマーを用いてPCRを行うことにより、作成したプラスミドからDNA鋳型を調製します(図1)。
2. EdUの組み込みと固定
- 3.5 mLトランスファーピペットを使用して、 Cladonema medusae(チューブあたり5〜10匹)を1.5 mLチューブに入れ、ASWを総容量500 μLまで加えます。 7.5 μLの10 mM EdUストック溶液を加え、サンプルを22°Cで1時間インキュベートします(図2)。EdUの最終濃度は150μMです。
注意: 5〜7日齢のメデューサを使用して、3番目の枝の形成を監視します(図3A)。メデューサがポリープから剥離する日は1日目としてカウントされ、5日目に、メデューサは通常、主触手に3番目の枝を示し始めます。 - 1時間後、EdUを含むASWをできるだけ多く取り除きます。
- メデューサを麻酔するには、H 2 Oに7%MgCl2を加え、5分間インキュベートします。
- H2O中の7%MgCl2を除去し、ASW中の4%パラホルムアルデヒド(PFA)を用いてメデューサを4°Cで一晩固定します(図2)。
注:EdUを組み込まずにFISHを実行する場合、麻酔後にEdUで処理されたものと同様にサンプルを固定できます(ステップ2.3-2.4)。
3. 蛍光in situ ハイブリダイゼーション
- プロテイナーゼ処理と固定後
- PFAを取り出し、0.1%トゥイーン-20(PBST)を含むPBSでサンプルを3 x 10分間洗浄します。洗浄ごとに300〜500μLのPBSTを使用してください。
注:このステップからハイブリダイゼーションの終わりまで、実験は手袋とマスクを着用してRNaseフリー環境で実行する必要があります。このステップの1x PBSは、DECC処理水で作成する必要があります。ハイブリダイゼーション後、DEPC処理なしで水で作った1x PBSを使用できます。一部のISHおよびFISHプロトコルでは、メタノールステップを使用してサンプルを脱水するため、固定サンプルを-20°Cで使用まで保存できます。余分な作業を避けるために、特にサンプルをPBSTに数日間保持できるため、脱水プロセスはこのプロトコルから省略されています。 - 固定後、抗DIG-POD抗体O.N.インキュベーションステップ(ステップ3.4.2)を除き、サンプルをシェーカー上の1.5 mLチューブに入れます。洗浄後、PBST中のプロテイナーゼKストック溶液10 mg/mLを加え、メデューサをプロテイナーゼK(最終濃度:10 μg/mL)とともに37°Cで10分間インキュベートします。
- プロテイナーゼK溶液を除去し、PBSTでサンプルを2 x 1分間洗浄します。
- メデューサをポストフィックスするには、1x PBSに4%PFAを加え、37°Cで15分間インキュベートします。
- PFA溶液を取り出し、PBSTでサンプルを2 x 10分間洗浄します。
注:標的遺伝子が低バックグラウンドシグナルで高発現している場合は、ステップ3.1.2〜3.1.5をスキップできます。
- PFAを取り出し、0.1%トゥイーン-20(PBST)を含むPBSでサンプルを3 x 10分間洗浄します。洗浄ごとに300〜500μLのPBSTを使用してください。
- 雑種形成
- PBSTを除去し、ハイブリダイゼーションバッファー(HBバッファー、 表1)を追加します。サンプルをHBバッファー中で室温(RT)で15分間インキュベートします。ハイブリダイゼーションを成功させるのに十分な容量を提供する300〜400 μLのHBバッファーを使用してください。
注:HBバッファー、洗浄バッファー1、および洗浄バッファー2は、20x SSCストックで調製されます。HBバッファーは-20°C以下で保存されており、使用前にRTに持ち込む必要があります。 - HB バッファを削除し、新しい HB バッファを追加します。ハイブリダイゼーションインキュベーター内で55°Cで少なくとも2時間プレハイブリダイズする。
- HBバッファーを除去し、ステップ1.9.7で保存したプローブを含むHBバッファーでインキュベートします(最終プローブ濃度:HBバッファー中の0.5-1 ng / μL)。ハイブリダイゼーションインキュベーター内で55°Cで18〜24時間ハイブリダイズする(図2)。
注:FISHシグナルの強度と特異性は、ターゲット遺伝子の発現、プローブの長さと特異性によって異なる場合があります。強度を上げるために、ハイブリダイゼーション期間(18〜72時間)や温度(50〜65°C)などのパラメータを調整し、さまざまなプローブを試験することができます。非特異的シグナルを回避するために、プロテイナーゼK処理(濃度および持続時間)を改変することができる19。
- PBSTを除去し、ハイブリダイゼーションバッファー(HBバッファー、 表1)を追加します。サンプルをHBバッファー中で室温(RT)で15分間インキュベートします。ハイブリダイゼーションを成功させるのに十分な容量を提供する300〜400 μLのHBバッファーを使用してください。
- プローブの取り外し
- プローブを含むHBバッファーを取り外し、洗浄バッファー1を追加します(表1)。サンプルを洗浄バッファー1で55°Cで2 x 15分間洗浄します。 300〜400μLの洗浄バッファーを使用してください。
注:プローブを含むHBバッファーは、最大約10回まで繰り返し使用できます。廃棄する代わりに、使用済みのHBバッファーを含むプローブを-20°C以下に保管してください。 使用前に、洗浄バッファー1、洗浄バッファー2、2x SSC、およびPBSTを55°Cで予熱します。 - 洗浄バッファー1を除去し、次に洗浄バッファー2を追加します(表1)。サンプルを洗浄バッファー2で55°Cで2 x 15分間洗浄します。
- 洗浄バッファー2を取り外し、次に2x SSCを追加します。サンプルを2x SSCで55°Cで2 x 15分間洗浄します。
- 2x SSCを取り外し、予熱したPBSTを追加します。サンプルをRTでPBSTで1 x 15分間洗浄します。
- プローブを含むHBバッファーを取り外し、洗浄バッファー1を追加します(表1)。サンプルを洗浄バッファー1で55°Cで2 x 15分間洗浄します。 300〜400μLの洗浄バッファーを使用してください。
- 抗DIG抗体インキュベーション
- PBST を削除し、1% ブロッキング バッファーを追加します。ロッカーでゆっくりと振とうしながら、RTで少なくとも1時間サンプルをインキュベートします。
注:5%ブロッキングバッファーストックを希釈して、1%ブロッキングバッファーを新たに調製します(表1)。振とうの結果としてサンプルが蓋の後ろや壁にくっつく傾向があるため、次の抗体反応の前にサンプルを確認してください。 - ブロッキング後、1%ブロッキングバッファーを除去し、抗DIG-POD溶液(1:500、1%ブロッキングバッファー中)を添加し、サンプルO.N.を4°Cでインキュベートします(図2)。
注意: 非特異的シグナルの検出を防ぐために、インキュベーション時間を12〜16時間以内に保つように注意してください。
- PBST を削除し、1% ブロッキング バッファーを追加します。ロッカーでゆっくりと振とうしながら、RTで少なくとも1時間サンプルをインキュベートします。
- DIG標識プローブの検出
- アンチ DIG-POD ソリューションを削除し、トリス-NaCl-トゥイーンバッファーを追加します(TNT、 表 1)。サンプルをTNTでRTで3 x 10分間洗浄します。
注:チラミドシグナル増幅(TSA)技術を使用すると、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識試薬(抗DIG-PODなど)に対する解像度の高い画像が得られます。 - 蛍光色素結合チラミド(Cy5-チラミド)ストック溶液(1:50)を増幅希釈バッファーで希釈し、活性Cy5-チラミド溶液を作ります(図2)。
- できるだけ多くのTNTを除去してから、活性Cy5-チラミド溶液を追加します。サンプルを暗所で10分間インキュベートします。
- サンプルをPBSTで暗所で3 x 10分間洗浄します。
- アンチ DIG-POD ソリューションを削除し、トリス-NaCl-トゥイーンバッファーを追加します(TNT、 表 1)。サンプルをTNTでRTで3 x 10分間洗浄します。
- EdUの検出
注:EdUキットは、組み込まれたEdUを蛍光シグナルとして検出します(図2)。- EdU検出カクテルを調製するには、 表1に示すように成分を混合します。各サンプルに100 μLのEdU検出カクテルを使用してください。
注:10倍反応緩衝液添加剤を超純水で希釈して、1x反応緩衝剤を準備します。 - PBST を削除してから、EdU 検出カクテルを追加します。暗闇の中で30分間インキュベートします。
- 暗所でPBSTで3 x 10分間洗浄します。
- EdU検出カクテルを調製するには、 表1に示すように成分を混合します。各サンプルに100 μLのEdU検出カクテルを使用してください。
- DNA染色
- ヘキスト33342(1:500)をPBSTで希釈して、ヘキスト溶液を調製します。PBST を削除し、ヘキスト ソリューションを追加します。サンプルを暗所で30分間インキュベートします(図2)。
- 暗所で3〜4 x 10分間PBSTでサンプルを洗浄します。
- マウンティング
- サンプルが押しつぶされるのを防ぐために、スライドガラスにバンクを作ります。スライドガラスにビニールテープを貼り、中央をくり抜きます。
- チップを切り落とした状態で3.1 mLトランスファーピペットを使用して、メデューサをスライドガラス上のバンクに移します。
注意: 触手が重ならないように注意してください。 - P200ピペットでPBSTをすべて取り出し、封入剤として70%グリセロールをゆっくりと加えます(図2)。
注:70%グリセロールの代わりに、退色防止封入剤を使用して蛍光の退色を防ぐことができます。 - 鉗子でメデューサの上にカバーガラスをそっと置き、カバーガラスの側面を透明なマニキュアで密封します。
- すぐに顕微鏡観察を行わない場合は、スライドを暗所で4°Cに保ちます。
- イメージング
- レーザー走査型共焦点顕微鏡を使用して画像を取得します。シングルセル解像度の場合は、40倍のオイルレンズまたは高倍率のレンズを使用します。
- 画像取得後、ImageJ/FIJIソフトウェアを使用して画像を開き、マルチポイントツール20でEdU+および/またはNanos1+に陽性のセルをカウントします。
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Representative Results
クラドネーマ触手は、形態形成と再生の細胞プロセスを研究するためのモデルとして使用されています15,16,17。触手構造は、触手球と呼ばれる近位領域に幹状細胞(i細胞)が位置する上皮管で構成され、鰗茎の遠位領域の後部に軸側に沿って新しい枝が順次追加されます(図3A)15。以前の報告では、細胞増殖は触手球と新しい分岐部位の両方で、EdUまたはBrdU標識のいずれかを使用して活発であることが示されています16,17。しかし、in situハイブリダイゼーションの分解能により、幹細胞様細胞が本当に増殖性であるかどうかは不明である。幹細胞様細胞と増殖細胞の両方を細胞レベルで同時に可視化するために、同じサンプルで幹細胞マーカー(Nanos1またはPiwi)に対してFISHを、S期細胞に対してEdU標識を行いました。
FISHによる細胞分解能では、Nanos1の発現は触手球と新しい分岐部位に局在していました(図3B)。Piwiは触手球と新しい分岐部位でもNanos1と同様のパターンで発現しました(図3C)。これらの結果は、7日齢のメデューサの出芽枝がNanos1とPiwiによってほぼ均一に標識された以前の報告17のホールマウントin situハイブリダイゼーションからの観察と一致していました。幹細胞様細胞の蓄積の始まりを視覚化するために、5日齢のメデューサの新しい分岐部位を監視しました。Nanos1発現とEdU陽性細胞の共標識により、触手内の幹細胞様細胞と増殖細胞の空間パターンが明らかになりました(図4A)。EdU+細胞とNanos1+細胞のグロス分布は以前の報告と一致していましたが16,17、EdU+細胞は触手球全体に広く分布していましたが、Nanos1+細胞は触手球と新しい分岐部位でより局所的に蓄積しました(図4Aおよび図4E ).これらのことから、発生時期や病期によって幹細胞と増殖細胞の分布がはっきりしていることが示唆された。
球根と新しい分岐部位のより詳細なビューは、EdUシグナルが核染色と融合するのに対し、Nanos1発現は核周囲の細胞質に拘束されていることが明らかになり、以前の報告5と一致しました(図4B、C)。細胞のほんの一部(19.79%)は、EdUとNanos1の共標識を示しました(EdU+ Nanos1+;図4B、C、黄色の矢印、および図4D)は、これらの細胞が活発に増殖する幹細胞集団であることを示唆している。興味深いことに、細胞の14.46%が球根の中央と新しい分岐部位にEdU+ Nanos1-であることがわかり、非幹様増殖細胞の存在が示唆されました(図4B、C、白い矢印、および図4D)。対照的に、細胞の26.32%が球根の基部と新しい分岐部位でEdU− Nanos1+であることが観察され、EdUパルス標識ではどちらも検出されない、スローサイクルまたは静止のいずれかの幹細胞集団の存在を示しています(図4B、C、黄色の矢印、および図4D)。
図1: in situ ハイブリダイゼーションのためのプローブ合成のスキーム。 メデューサからのトータルRNAの抽出とトータルRNAからのcDNA合成。 ナノs1特異的PCR産物は、cDNAから合成された。PCR産物をベクターにライゲーションし、コンピテントセル培養を通じて増幅ベクターを回収しました。RNAポリメラーゼ結合部位を有するPCR産物は、プラスミドを鋳型として合成した。DIG標識RNAプローブは、 インビトロ 転写により合成した。略語:DIG =ジゴキシゲニン。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:EdUと蛍光in situハイブリダイゼーション共染色のスキーム。メデューサを150 μM EdUで1時間インキュベートしました。続いて、メデューサをH2O中の7%MgCl2で麻酔し(組織を弛緩させるため)、4°Cで4%PFA O.N.で固定した。 固定後、サンプルをHBバッファーとプローブ付きハイブリダイズさせ、55°Cで20〜24時間行った。 ハイブリダイゼーション反応後、サンプルを洗浄し、4°Cで抗DIG−POD溶液O.N.と共にインキュベートした。 メデューサをCy5-チラミド溶液で10分間染色した後、EdUを30分間検出し、Hoechst 33342で30分間染色した。すべての染色プロセスを完了した後、メデューサをスライドガラスに取り付け、共焦点顕微鏡で画像を取得しました。略語:EdU = 5-エチニル-2'-デオキシウリジン;FISH =蛍光in situハイブリダイゼーション;PFA = パラホルムアルデヒド;O.N. =一晩;HB =ハイブリダイゼーション。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:クラドネーマ・メデューサ触手の近位側におけるNanos1とPiwiの発現パターン。 (A)クラドネーマメデューサと触手の概略図。触手の副軸側:新しい分岐部位に順次形成された新しい枝を有する触手球(最も近位の領域)。挿入図(破線の四角)は、共焦点画像によってキャプチャされた領域を示します。(B)生後7日目のクラドネマメデューサの触手の近位、アダキシャル側からのNanos1遺伝子発現のFISH画像。(C)生後7日目のクラドネマメデューサの触手の近位、アダキシャル側からのピウィ遺伝子発現のFISH画像。DNA:グリーン、ナノス1:マゼンタ。ナノス1 FISHのみの画像の場合はB'-C'。スケールバー = 100 μm (B、C)。略称:FISH =蛍光in situハイブリダイゼーション。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:クラドネマ・メデューサ触手の近位、アダキシャル側のEdUおよびNanos1発現パターン。 (A-C)Nanos1発現およびEdUと共標識されたクラドネマメデューサ触手の近位アダキシャル側の画像;5日齢のメデューサを使用しました。(A)触手の概要。黄色の破線の四角形は、BとCの領域を示します。(B)触手球の倍率。(C)新しい分岐部位の拡大。黄色の矢印は、EdUとNanos1の両方に陽性の細胞を示します。黄色の矢印は、Nanos1に対してのみ陽性である細胞を示す。白い矢印は、EdUに対してのみ陽性の細胞を示す。A-Cパネルは、DNA(青)、EdU(緑)、およびNanos1(マゼンタ)のマージ画像です。A'-C'はEdUのみの画像のパネルです。A''-C'' は Nanos1 FISH のみの画像用です。スケールバー= 100μm(A)、50μm(B、C)。(d)触手の基底側にあるEdUおよび/またはNanos1陽性細胞の定量(定量領域=30.10μm2平方、n=6、合計249細胞)。EdU+ ナノス1−細胞、14.46%;EdU+ ナノス1+細胞、19.79%;EdU−ナノ1+細胞、26.32%;EdU−ナノs1−細胞、39.44%。(E)アダキシャル側からのクラドネマメデューサ触手の概略図。EdU+細胞とNanos1+細胞の全体的な分布をそれぞれEとE'に示します。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
表1:このプロトコルにおけるさまざまなPCR反応とバッファーの組成。 ライゲーション反応におけるPCR産物の量(X μL)を計算するには、プロトコルステップ1.4の後の注を参照してください。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
増殖細胞および幹細胞は、形態形成、成長、および再生などの様々な過程において重要な細胞源である21,22。この論文では、クラドネマメデューサにおけるFISHおよびEdU標識によって幹細胞マーカーNanos1を共染色する方法について説明しています。EdUまたはBrdU標識を用いた以前の研究では、増殖細胞が触手球根に局在することが示唆されています16,17が、それらの分子特性は不明でした。本研究は、増殖細胞の分布とNanos1+幹細胞様細胞の局在を同時に決定することを示しています(図4)。結果は、いくつかの増殖細胞がNanos1を発現しているが、他の細胞はEdUのみでマークされており、Nanos1を発現していないことを示しており、幹細胞の不均一性、または他の増殖細胞の存在を示唆している。触手の分岐、組織の恒常性、臓器再生、生殖細胞の維持など、クラドネマのさまざまなプロセス中の詳細な幹細胞分布を解剖することは興味深いでしょう。
動物の幹細胞を可視化するための主なボトルネックは、幹細胞マーカーの初期同定です。刺胞動物では、非ヒドロ虫では幹細胞マーカーが同定されていないため3、現段階では、幹細胞マーカーへのFISHの直接適用はヒドロ虫に限定されたままです。それにもかかわらず、FISHは細胞レベルで特定の遺伝子発現の検出を可能にするため、プローブを変更することにより、この方法を拡張して、目的の遺伝子の空間発現パターンを詳細に観察することができます。例えば、前駆細胞や分化細胞のマーカーを用いて、クラドネーマ触手における特定の細胞種の分布を確認することができます。注意点として、本プロトコルは、発現レベルおよびmRNA安定性の違いにより、目的の遺伝子に応じて変更しなければならない場合があります。特に、非特異的シグナルおよび弱いシグナルは、FISHに関連する一般的な問題である。ハイブリダイゼーションの時間および温度を変更し、漂白試薬(ホルムアミドまたはメタノール)を使用し、他のパラメータ(TSA反応時間、プロテイナーゼK処理、ハイブリダイゼーション後の洗浄)を調整すると、より明瞭なシグナルおよびより少ない非特異的シグナルが得られ得る23,24。同じ分類群7,25,26内であっても、1つのFISHプロトコルが他の種に適用できない可能性があるため、使用する動物モデルに適したFISHプロトコルを選択することも重要です。
EdU標識は、一般に増殖細胞を検出するために使用されるが、濃度およびインキュベーション時間を変えることによって異なる実験目的に使用することができる27。増殖細胞を検出するには、EdU取り込みの成功期間と濃度を決定することが重要です。この研究で用いたパルス標識では、S期を短時間通過した増殖細胞のみがマーキングされており、同様の短いインキュベーション法が他の刺胞動物の増殖細胞を検出するために利用されてきました6,28,29。対照的に、長期のEdU取り込みとNanos1 FISHの組み合わせは、スローサイクルまたは静止幹細胞の存在を明らかにし得る27。増殖細胞だけでなく、分裂せずにDNA合成を受けたエンドサイクリング細胞にもマークを付けることが可能です。さらに、EdU標識細胞をより長い期間追跡することにより、増殖細胞とその細胞系譜に関連する遊走および分化のための細胞能力を決定することができます6,30。
FISHとEdUまたはBrdU染色の組み合わせが使用されてきましたが7,31、ここで確立された方法は、異なるクラゲ種を含む他の海洋無脊椎動物および非モデル動物に容易に適用できます。EdU染色はBrdU染色18よりも簡単で感度が高く、インキュベーション時間が短いため、長期の細胞標識にEdUを使用した以前の研究とは異なり、増殖細胞の検出が可能になります7。近年、次世代シークエンス技術の進歩に伴い、多くの生物種がゲノムや遺伝子発現情報を入手できるようになりました。幹細胞と増殖細胞の同定は、幹細胞の不均一性と多様性を理解し、さまざまな生物学的現象の根底にある細胞動態への洞察を提供するための効果的なアプローチであり続けます。
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Disclosures
著者は開示する利益相反を持っていません。
Acknowledgments
本研究は、AMEDの課題番号JP22gm6110025(Y.N.宛)およびJSPS科研費22H02762(Y.N.宛)の支援を受けて行われました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Mercaptoethanol | Wako | 137-06862 | |
| 3.1 mL transfer pipette | Thermo Scientific | 233-20S | |
| 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-Gal) | Wako | 029-15043 | |
| anti-DIG-POD | Roche | 11207733910 | |
| Cladonema pacificum Nanos1 forward primer | 5’-AAGAGACACAGTCATTATCAAGC GA-3’ |
||
| Cladonema pacificum Nanos1 reverse primer | 5’-CGACGTGTCCAATTTTACGTGCT -3’ | ||
| Cladonema pacificum Piwi forward primer | 5’- AAAAGAGCAGCGGCCAGAAAGA AGGC -3’ |
||
| Cladonema pacificum Piwi reverse primer | 5’- GCGGGTCGCATACTTGTTGGTA CTGGC -3’ |
||
| Click-iT EdU Cell Proliferation Kit for Imaging, Alexa Fluor 488 dye | Invitrogen | C10337 | EdU kit |
| Coroline off | GEX Co. ltd | N/A | chlorine neutralizer |
| DIG Nucleic Acid Detection Kit Blocking Reagent | Roche | 11175041910 | blocking buffer |
| DIG RNA labeling mix | Roche | 11277073910 | |
| DTT | Promega | P117B | |
| ECOS competent cell DH5α | NIPPON GENE | 316-06233 | competent cell |
| Fast gene Gel/PCR Extraction kit | Fast gene | FG-91302 | gel extraction kit |
| Fast gene plasmid mini kit | Fast gene | FG-90502 | plasmid miniprep |
| Formamide | Wako | 068-00426 | |
| Heparin sodium salt from porcine | SIGMA-ALDRICH | H3393-10KU | |
| Isopropyl-β-D(-)-thiogalactopyranoside (IPTG) | Wako | 096-05143 | |
| LB Agar | Invitrogen | 22700-025 | agar plate |
| LB Broth Base | Invitrogen | 12780-052 | LB medium |
| Maleic acid | Wako | 134-00495 | |
| mini Quick spin RNA columns | Roche | 11814427001 | clean-up column |
| NaCl | Wako | 191-01665 | |
| NanoDrop OneC Microvolume UV-Vis Spectrophotometer with Wi-Fi | Thermo Scientific | ND-ONEC-W | spectrophotometer |
| Polyoxyethlene (20) Sorbitan Monolaurate (Tween-20) | Wako | 166-21115 | |
| PowerMasher 2 | nippi | 891300 | homogenizer |
| Proteinase K | Nacarai Tesque | 29442-14 | |
| RNase Inhibitor | TaKaRa | 2313A | |
| RNeasy Mini kit | Qiagen | 74004 | total RNA isolation kit |
| RQ1 RNase-Free Dnase | Promega | M6101 | |
| Saline Sodium Citrate Buffer 20x powder (20x SSC) | TaKaRa | T9172 | |
| SEA LIFE | Marin Tech | N/A | mixture of mineral salts |
| T3 RNA polymerase | Roche | 11031163001 | |
| T7 RNA polymerase | Roche | 10881767001 | |
| TAITEC HB-100 | TAITEC | 0040534-000 | Hybridization incuvator |
| TaKaRa Ex Taq | TaKaRa | RR001A | Taq DNA polymerase |
| TaKaRa PrimeScript 2 1st strand cDNA Synthesis Kit | TaKaRa | 6210A | cDNA synthesis kit |
| Target Clone | TOYOBO | TAK101 | pTA2 Vector |
| tRNA | Roche | 10109541001 | |
| TSA Plus Cyanine 5 | AKOYA Biosciences | NEL745001KT | tyramide signal amplification (TSA) technique |
| Zeiss LSM 880 | ZEISS | N/A | laser scanning confocal microscope |
References
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