Summary
כאן אנו מתארים פרוטוקול להדמיית תאים מתרבים דמויי גזע במדוזה Cladonema. הכלאה פלואורסצנטית שלמה באתרה עם סמן תאי גזע מאפשרת זיהוי של תאים דמויי גזע, ותיוג 5-אתיניל-2'-דאוקסיורידין מאפשר זיהוי של תאים מתרבים. יחד, ניתן לזהות תאים דמויי גזע המתרבים באופן פעיל.
Abstract
קנידריאנים, כולל שושנות ים, אלמוגים ומדוזות, מפגינים מורפולוגיה ואורחות חיים מגוונים המתבטאים בפוליפים ססיליים ובמדוזות שחייה חופשית. כפי שמודגם במודלים מבוססים כגון הידרה ונמטוסטלה, תאי גזע ו/או תאים מתרבים תורמים להתפתחות והתחדשות של פוליפים קנידריים. עם זאת, המנגנונים התאיים הבסיסיים ברוב המדוזות, במיוחד בשלב המדוזה, אינם ברורים במידה רבה, ולכן פיתוח שיטה איתנה לזיהוי סוגי תאים ספציפיים הוא קריטי. מאמר זה מתאר פרוטוקול להדמיית תאים מתרבים דמויי גזע במדוזה ההידרוזואנית Cladonema pacificum. ל-Cladonema medusae יש זרועות ציד מסועפות שגדלות ללא הרף ושומרות על יכולת התחדשות לאורך כל שלב הבוגרים שלהן, ומספקות פלטפורמה ייחודית שבאמצעותה ניתן לחקור את המנגנונים התאיים המתוזמרים על ידי תאים מתרבים ו/או דמויי גזע. הכלאה פלואורסצנטית שלמה באתרה (FISH) באמצעות סמן תאי גזע מאפשרת זיהוי של תאים דמויי גזע, בעוד תיוג פולסים עם 5-אתיניל-2'-דאוקסיורידין (EdU), סמן שלב S, מאפשר זיהוי של תאים מתרבים. בשילוב של תיוג FISH ו-EdU, אנו יכולים לזהות תאים דמויי גזע המתרבים באופן פעיל על בעלי חיים קבועים, וטכניקה זו יכולה להיות מיושמת באופן נרחב על בעלי חיים אחרים, כולל מיני מדוזות שאינן דוגמניות.
Introduction
Cnidaria נחשב לגוף מטזואני מסתעף בסיסי המכיל בעלי חיים עם עצבים ושרירים, מה שמציב אותם בעמדה ייחודית להבנת האבולוציה של התפתחות בעלי חייםופיזיולוגיה 1,2. קנידרים מסווגים לשתי קבוצות עיקריות: אנתוזואה (למשל, שושנות ים ואלמוגים) הם בעלי זחלי פלנולה בלבד ושלבי פוליפ ססיליים, בעוד שמדוסוזואה (חברי הידרוזואה, סטאורוזואה, סקיפוזואה וקובוזואה) לובשים בדרך כלל צורה של מדוזה בשחייה חופשית, או מדוזות, כמו גם זחלי פלנולה ופוליפים. קנידריאנים מפגינים בדרך כלל יכולת התחדשות גבוהה, והמנגנונים התאיים הבסיסיים שלהם, במיוחד החזקתם בתאי גזע בוגרים ובתאים מתרבים, משכו תשומת לב רבה 3,4. תאי גזע הידרוזואניים, שזוהו לראשונה בהידרה, ממוקמים בחללים הבין-תאיים שבין תאי אפיתל אקטודרמליים והם מכונים בדרך כלל תאים אינטרסטיציאליים או תאי i3.
תאי i הידרוזואניים חולקים מאפיינים משותפים הכוללים ריבוי פוטנציות, ביטוי של סמני תאי גזע שהשתמרו באופן נרחב (למשל, נאנוס, פיווי, ואסה), ופוטנציאל נדידה 3,5,6,7,8. כתאי גזע פונקציונליים, תאי i מעורבים באופן נרחב בהתפתחות, בפיזיולוגיה ובתגובות הסביבתיות של בעלי חיים הידרוזואניים, מה שמעיד על יכולת ההתחדשות הגבוהה שלהםופלסטיותם 3. בעוד שתאי גזע, בדומה לתאי i, לא זוהו מחוץ להידרוזואנים, אפילו במין המודל המבוסס Nematostella, תאים מתרבים עדיין מעורבים בתחזוקה והתחדשות של רקמות סומטיות, כמו גם בקו הנבט9. מכיוון שמחקרים בהתפתחות והתחדשות של מדוזות נערכו בעיקר על בעלי חיים מסוג פוליפ כמו הידרה, הידרקטיניה ונמטוסטלה, הדינמיקה התאית והתפקודים של תאי גזע במיני מדוזות נותרו ברובם ללא שינוי.
המדוזה ההידרוזואנית Clytia hemisphaerica , מין מדוזה קוסמופוליטית עם בתי גידול שונים ברחבי העולם, כולל הים התיכון וצפון אמריקה, שימשה כחיית מודל ניסיונית במספר מחקרים התפתחותיים ואבולוציוניים10. עם גודלה הקטן, הטיפול הקל והביציות הגדולות שלה, Clytia מתאימה לתחזוקת מעבדה, כמו גם להכנסת כלים גנטיים כגון שיטות הטרנסגנזה והנוקאאוטשנקבעו לאחרונה 11, מה שפותח את ההזדמנות לניתוח מפורט של המנגנונים התאיים והמולקולריים העומדים בבסיס הביולוגיה של המדוזות. בזרועות הציד Clytia medusa , תאי i ממוקמים באזור הפרוקסימלי, הנקרא הנורה, ואבות אבים כגון נמטובלסטים נודדים לקצה הדיסטלי תוך התמיינות לסוגי תאים שונים, כולל נמטוציטים12.
במהלך התחדשות של Clytia manubrium, איבר הפה של מדוזות, Nanos1 + i-תאים הנמצאים בגונדות נודדים לאזור שבו manubrium הוא איבד בתגובה לנזק ולהשתתף התחדשות של manubrium7. ממצאים אלה תומכים ברעיון שתאי i בקליטיה מתנהגים גם כתאי גזע פונקציונליים המעורבים במורפוגנזה ובהתחדשות. עם זאת, בהתחשב בכך המאפיינים של תאי i שונים בין בעלי חיים מייצגים מסוג פוליפ כגון הידרה ו Hydractinia3, ייתכן כי המאפיינים והפונקציות של תאי גזע מגוונים בין מיני מדוזות. יתר על כן, למעט קליטיה, טכניקות ניסיוניות הוגבלו עבור מדוזות אחרות, והדינמיקה המפורטת של תאים מתרבים ותאי גזע אינה ידועה13.
המדוזה ההידרוזואנית Cladonema pacificum היא אורגניזם מודל מתפתח שניתן לשמור בסביבת מעבדה ללא משאבת מים או מערכת סינון. למדוזה Cladonema יש זרועות ציד מסועפות, מאפיין נפוץ במשפחת Cladonematidae, ואיבר פוטורצפטור הנקרא ocellus בשכבה האקטודרמלית ליד הנורה14. תהליך הסתעפות זרועות הציד מתרחש באתר הסתעפות חדש המופיע לאורך הצד האדאקסיאלי של זרוע הציד. עם הזמן, זרועות הציד ממשיכות להתארך ולהסתעף, כאשר הענפים הישנים נדחקים החוצה לכיוון קצה15. בנוסף, זרועות הקלדונמה יכולות להתחדש תוך מספר ימים לאחר קטיעה. מחקרים אחרונים הציעו את תפקידם של תאים מתרבים ותאים דמויי גזע בהסתעפות זרועות ציד והתחדשות בקלדונמה16,17. עם זאת, בעוד הכלאה קונבנציונלית באתרה (ISH) נוצלה כדי לדמיין ביטוי גנים בקלדונמה, בשל הרזולוציה הנמוכה שלה, כיום קשה לצפות בדינמיקה של תאי גזע ברמה התאית בפירוט.
מאמר זה מתאר שיטה להדמיית תאים דמויי גזע בקלדונמה על ידי FISH וצביעה משותפת עם EdU, סמן של התפשטות תאים18. אנו מדמיינים את תבנית הביטוי של Nanos1, סמן תאי גזע 5,17, על ידי FISH, המאפשרת זיהוי של התפלגות תאים דמויי גזע ברמת התא הבודד. בנוסף, הצביעה המשותפת של ביטוי Nanos1 עם תיוג EdU מאפשרת להבחין בין תאים דמויי גזע המתרבים באופן פעיל. שיטה זו לניטור תאים דמויי גזע ותאים מתרבים יכולה להיות מיושמת על מגוון רחב של אזורי חקירה, כולל הסתעפות זרועות ציד, הומאוסטזיס רקמות והתחדשות איברים בקלדונמה, וגישה דומה יכולה להיות מיושמת על מיני מדוזות אחרים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים הקשורים לכל החומרים, הריאגנטים והציוד המשמשים בפרוטוקול זה.
1. סינתזת בדיקה
- מיצוי RNA
- הניחו שלוש מדוזות Cladonema חיות שגודלו במי ים מלאכותיים (ASW) בצינור של 1.5 מ"ל באמצעות פיפטה של 3.1 מ"ל עם קצה מנותק, והסירו כמה שיותר ASW.
הערה: ASW מוכן על ידי המסת תערובת של מלחים מינרליים במי ברז עם מנטרל כלור; כוח המשיכה הסגולי הסופי (S.G.) הוא 1.018 או החלקים לאלף (ppt) הוא ~27. - הקפיאו את צינורות ה-1.5 מ"ל בחנקן נוזלי כדי לעכב את פעילות ה-RNase. הוסף 30 μL של מאגר ליזיס מתוך ערכת בידוד ה-RNA הכוללת שבה נוספו 2-mercaptoethanol (1 μL/100 μL של חיץ ליזה) והומוגניות של הדגימות במאגר הליזיס באמצעות הומוגנייזר.
הערה: כדי למנוע הצפה של המאגר ודגימה מהצינורות, מומלץ הומוגניזציה עם כמות קטנה של מאגר תזה. - הוסיפו 570 μL של מאגר ליזה והוציאו את סך הרנ"א בהתאם לפרוטוקול של ערכת הבידוד הכוללת של רנ"א (איור 1).
- יש למדוד את ריכוז הרנ"א המופק באמצעות ספקטרופוטומטר ולאחסן בטמפרטורה של 80°C- עד לשימוש.
- הניחו שלוש מדוזות Cladonema חיות שגודלו במי ים מלאכותיים (ASW) בצינור של 1.5 מ"ל באמצעות פיפטה של 3.1 מ"ל עם קצה מנותק, והסירו כמה שיותר ASW.
- סינתזת cDNA
- באמצעות ערכה, סנתז cDNA באמצעות סך הרנ"א המופק מהמדוזה כתבנית (איור 1 וטבלה 1).
- דגירה ב-65°C למשך 5 דקות.
- מצננים במהירות על קרח.
- בצע סינתזת cDNA עם התערובת משלב 1.2.1 (טבלה 1). מערבבים היטב על ידי פיפטינג ודגירה בטמפרטורה של 42 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות.
- דגירה ב-95°C למשך 5 דקות.
- מצננים במהירות על קרח.
- יש למדוד את ריכוז ה-cDNA המסונתז באמצעות ספקטרופוטומטר ולאחסן בטמפרטורה של 20°C- או מתחת ל-20 מעלות צלזיוס עד לשימוש.
- סינתזת מוצר PCR
- כדי ליצור תבנית PCR, עצב את הפריימר הספציפי באמצעות Primer-BLAST. מקור רצף הייחוס מנתוני NCBI או מנתוני RNA-seq.
הערה: עיין בטבלת החומרים עבור הפריימרים המשמשים בפרוטוקול זה. - כדי להגביר את רצף היעד, בצע שיבוט TA, שאינו דורש שימוש באנזימי הגבלה. כדי לקבל מוצר PCR שבו אדנין נוסף בקצה 3 ', השתמש בהגדרות הבאות: 98 °C למשך 2 דקות; 35 מחזורים של 98 מעלות צלזיוס למשך 10 שניות, 55-60 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, 72 מעלות צלזיוס למשך דקה אחת.
הערה: כדי לקבוע את תנאי ה-PCR, פעל לפי הפרוטוקול המלווה את ה-DNA פולימראז שבו יש להשתמש, שבדרך כלל מספק טמפרטורת חישול מומלצת וזמן הארכה. - הפעל את מוצר ה- PCR באמצעות ג'ל אגרוז של 1% וחתך את רצועת העניין. חלצו את מוצרי ה-PCR מהג'לים החתוכים באמצעות ערכת מיצוי ג'ל.
- כדי ליצור תבנית PCR, עצב את הפריימר הספציפי באמצעות Primer-BLAST. מקור רצף הייחוס מנתוני NCBI או מנתוני RNA-seq.
- קשירה
- הצמידו את מכפלת ה-PCR לווקטור באמצעות תימין בגודל 3' על-ידי ערבוב הריאגנטים (טבלה 1) ודגרה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות (איור 1).
הערה: היחס המולקולרי של וקטור:PCR צריך להיות 1:>3. גודל וקטור pTA2 הוא כ 3 kb. אם מכפלת ה-PCR (הוספה) היא A (kb) ו-B (ng/μL), ניתן לחשב את נפח ההוספה (X בטבלה 1) שיש לקחת על-ידי ([50 ננוגרם של וקטור × קילו-בייט של הוספה])/(3 קילו-× וקטורי [1/3]) = 50· ng של הוספה. אם ריכוז התוספת הוא B ng/μL, אז הנפח שנלקח הוא 50· A/B μL של הוספה.
- הצמידו את מכפלת ה-PCR לווקטור באמצעות תימין בגודל 3' על-ידי ערבוב הריאגנטים (טבלה 1) ודגרה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות (איור 1).
- טרנספורמציה וציפוי
- לצורך טרנספורמציה, הפשירו את התאים המוכשרים על הקרח וחילקו אותם ל-20 μL aliquots כל אחד. הוסף 1 μL של פלסמידים המכילים את המוצר PCR (פחות מ 5% של נפח התא המוסמך) ומערבולת במשך 1 s. דגירה על קרח במשך 5 דקות, ולאחר מכן דגירה ב 42 מעלות צלזיוס במשך 45 שניות, מערבולת במשך 1 שניות.
- יש להוסיף 180 מיקרו-ליטר של ציר Super Optimal עם מדיום דיכוי קטבוליטים (SOC) (מדיום תרבית חיידקים עשיר מבחינה תזונתית) לתאים המוכשרים ולדגור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. לאחר 30 דקות, מרחו את התאים המתאימים על צלחת אגר המכילה אמפיצילין, 5-ברומו-4-כלורו-3-אינדוליל-בטא-D-גלקטו-פירנוסייד (X-gal), ואיזופרופיל-β-d-1-תיוגלקטופיראנוזיד (IPTG), ודגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 12-16 שעות (איור 1).
הערה: X-gal ו- IPTG משמשים לבחירת מושבות כחולות ולבנות.
- תרבות נוזלית
- בחר מושבה לבנה מתוך המושבות הלבנות והכחולות על הצלחת. הוסיפו אותו ל-3-5 מ"ל של LB בינוני עם אמפיצילין ודגרו על שייקר במשך 12-16 שעות ב-37 מעלות צלזיוס (איור 1).
- מיניפרפ
- חלצו את הפלסמיד ממדיום ה-LB באמצעות מיניפרפ פלסמיד (איור 1).
- לכמת את ריכוז הפלסמיד באמצעות ספקטרופוטומטר.
- קרא את הרצף.
- כדי לקרוא את רצף הדנ"א של הפלסמיד, שלח את הפלסמיד לריצוף סנגר ולאחר מכן השתמש בתוכנה כדי ליישר אותו עם רצף הגנום/תעתיק כדי לאשר אם רצף המטרה מסונתז כראוי ולהעריך באיזה כיוון רצף המטרה מוכנס לפלסמיד (5' עד 3' או 3' עד 5').
הערה: אם רצף המטרה מוכנס לפלסמיד בכיוון 5' עד 3' מאתר קשירת ה-RNA פולימראז בסמוך לקצה ה-3', ניתן ליצור בדיקה אנטיסנסואלית על-ידי שעתוק במבחנה . אם רצף המטרה מוכנס בכיוון ההפוך 3' עד 5', ניתן ליצור בדיקה חושית (בקרה שלילית). אם משתמשים בווקטורים כגון pTA2, ניתן להשתמש בשני אתרי קשירה של תמלול בהתאם למטרה.
- כדי לקרוא את רצף הדנ"א של הפלסמיד, שלח את הפלסמיד לריצוף סנגר ולאחר מכן השתמש בתוכנה כדי ליישר אותו עם רצף הגנום/תעתיק כדי לאשר אם רצף המטרה מסונתז כראוי ולהעריך באיזה כיוון רצף המטרה מוכנס לפלסמיד (5' עד 3' או 3' עד 5').
- תמלול במבחנה
- הכינו את תבנית הדנ"א מהפלסמיד שנוצר על-ידי ביצוע PCR באמצעות פריימרים מחוץ לאתר הקישור של RNA פולימראז (לדוגמה, אתרי קשירה T7/T3) בפלסמיד (איור 1).
הערה: ניתן להשתמש בפריימרים אוניברסליים כגון פריימר קדמי M13-20 ופריימר הפוך M13 להכנת תבנית DNA הכוללת אתרי קשירה של RNA פולימראז. - טהרו את התבנית לאחר הגברת PCR באמצעות ערכת מיצוי ג'ל/PCR.
- ערבבו את הריאגנטים המוצגים להלן, ובצעו את תגובת השעתוק בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 3 שעות (איור 1 וטבלה 1).
- יש להוסיף 1.5 μL של DNase ולדגור בטמפרטורה של 37°C למשך 30 דקות.
- הוסף 10 μL של מים ללא RNase וטהר את הבדיקה מתמיסת תגובת השעתוק באמצעות עמודת ניקוי.
- בדוק את גודל ה- RNA המסונתז על ידי טעינת 1 μL על ג'ל אגרוז של 1% וקבע את הריכוז באמצעות ספקטרופוטומטר.
הערה: בדיקות RNA מסונתזות צריכות להיות בריכוז של לפחות 100 ng/μL. - הוסף 30 μL של formamide לאחסון בטמפרטורה של −20 °C או פחות.
- הכינו את תבנית הדנ"א מהפלסמיד שנוצר על-ידי ביצוע PCR באמצעות פריימרים מחוץ לאתר הקישור של RNA פולימראז (לדוגמה, אתרי קשירה T7/T3) בפלסמיד (איור 1).
2. התאגדות וקיבעון של EdU
- הנח את Cladonema medusae (5-10 בעלי חיים לכל צינור) בצינורות של 1.5 מ"ל באמצעות פיפטה להעברה של 3.5 מ"ל והוסף ASW עד לנפח כולל של 500 μL. הוסף 7.5 μL של תמיסת מלאי EdU של 10 mM ודגר את הדגימות במשך שעה אחת ב-22 °C (איור 2). הריכוז הסופי של EdU הוא 150 מיקרומטר.
הערה: השתמשו במדוזה בת 5-7 ימים כדי לעקוב אחר היווצרות ענף שלישי (איור 3A). היום שבו המדוזה מתנתקת מהפוליפ נספרת כיום 1, וביום החמישי, המדוזות בדרך כלל מתחילות להציג ענף שלישי על זרועות הציד העיקריות שלהן. - לאחר שעה אחת, הסר כמה שיותר ASW המכיל EdU.
- כדי להרדים את המדוזה, להוסיף 7% MgCl 2 ב H2 O ולדגור במשך5 דקות.
- הסירו את ה-7% MgCl 2 ב-H 2 O וקבעו את המדוזה למשך הלילה (O.N.) ב-4 מעלות צלזיוס עם 4% פרפורמלדהיד (PFA) ב-ASW (איור 2).
הערה: בעת ביצוע FISH ללא שילוב EdU, ניתן לתקן דגימות באופן דומה לאלה שטופלו ב- EdU לאחר הרדמה (שלבים 2.3-2.4).
3. הכלאה פלואורסצנטית באתרה
- טיפול בפרוטאינאז ופוסט קיבוע
- הסר את ה- PFA ושטוף את הדגימות עם PBS המכיל 0.1% Tween-20 (PBST) למשך 3 x 10 דקות. יש להשתמש ב-300-500 מיקרו-ליטר PBST לכל כביסה.
הערה: משלב זה ועד סוף ההכלאה, הניסוי צריך להתבצע בסביבה נטולת RNase, כשהוא לובש כפפות ומסכה. 1x PBS בשלב זה חייב להתבצע עם מים מטופלים DEPC. לאחר הכלאה, 1x PBS שנעשו עם מים ללא טיפול DEPC ניתן להשתמש. חלק מהפרוטוקולים של ISH ו-FISH מייבשים דגימות באמצעות שלבי מתנול, מה שמאפשר לשמור את הדגימות הקבועות בטמפרטורה של 20°C- עד לשימוש. כדי למנוע עבודה מיותרת, תהליך התייבשות מושמט מפרוטוקול זה, במיוחד מכיוון שניתן לשמור את הדגימות ב- PBST עד מספר ימים. - לאחר הקיבוע, הניחו את הדגימה בצינורות של 1.5 מ"ל על שייקר, למעט שלב הדגירה נגד נוגדן DIG-POD O.N. (שלב 3.4.2). לאחר הכביסה, יש להוסיף תמיסת מלאי של 10 מ"ג/מ"ל Proteinase K ב-PBST ולדגור על המדוזה עם פרוטאינאז K (ריכוז סופי: 10 מיקרוגרם/מ"ל) בטמפרטורה של 37°C למשך 10 דקות.
- הסר את תמיסת Proteinase K ושטוף את הדגימות במשך 2 x 1 דקות עם PBST.
- כדי לפרסם את המדוזה, יש להוסיף 4% PFA ב-PBS אחד ולדגירה ב-37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
- הסר את תמיסת PFA ושטוף את הדגימות במשך 2 x 10 דקות עם PBST.
הערה: אם גן המטרה מתבטא מאוד עם אות רקע נמוך, ניתן לדלג על שלבים 3.1.2-3.1.5.
- הסר את ה- PFA ושטוף את הדגימות עם PBS המכיל 0.1% Tween-20 (PBST) למשך 3 x 10 דקות. יש להשתמש ב-300-500 מיקרו-ליטר PBST לכל כביסה.
- הכלאה
- הסר את ה- PBST והוסף מאגר היברידיזציה (מאגר HB, טבלה 1). דגירה של הדגימות ב-HB Buffer למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר (RT). השתמש ב- 300-400 μL של HB Buffer, המספק נפח מספיק להיברידיזציה מוצלחת.
הערה: מאגר HB, מאגר כביסה 1 ומאגר כביסה 2 מוכנים עם מלאי SSC של 20x. HB Buffer מאוחסן בטמפרטורה של −20°C או מתחת לכך, ויש להביא אותו ל-RT לפני השימוש. - הסר את מאגר HB והוסף מאגר HB חדש. קדם-הכלאה ב-55 מעלות צלזיוס למשך שעתיים לפחות באינקובטור הכלאה.
- הסר את מאגר HB ודגר עם HB Buffer המכיל את הגשושיות שאוחסנו בשלב 1.9.7 (ריכוז בדיקה סופי: 0.5-1 ng/μL במאגר HB). הכלאה ב-55 מעלות צלזיוס למשך 18-24 שעות (איור 2) באינקובטור הכלאה.
הערה: עוצמת האות והספציפיות של FISH עשויות להשתנות בהתאם לביטוי גני היעד, כמו גם לאורך הבדיקה ולספציפיותה. כדי להגביר את העוצמה, ניתן להתאים פרמטרים כגון משך הכלאה (18-72 שעות) וטמפרטורה (50-65 מעלות צלזיוס), וניתן לבדוק בדיקות שונות. כדי למנוע אותות לא ספציפיים, טיפול Proteinase K (ריכוז ומשך) ניתן לשנות19.
- הסר את ה- PBST והוסף מאגר היברידיזציה (מאגר HB, טבלה 1). דגירה של הדגימות ב-HB Buffer למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר (RT). השתמש ב- 300-400 μL של HB Buffer, המספק נפח מספיק להיברידיזציה מוצלחת.
- הסרת בדיקה
- הסר את מאגר HB המכיל בדיקות ולאחר מכן הוסף את מאגר Wash 1 (טבלה 1). שטפו את הדוגמאות עם Wash Buffer 1 למשך 2 x 15 דקות בטמפרטורה של 55 מעלות צלזיוס. יש להשתמש ב-300-400 μL של מאגר כביסה.
הערה: ניתן להשתמש במאגר HB המכיל בדיקות שוב ושוב, עד כעשר פעמים. במקום להשליך, אחסן את מאגר HB המשומש המכיל בדיקות ב- −20 מעלות צלזיוס או מתחתיהן. לפני השימוש יש לחמם מראש את חיץ הכביסה, את מאגר הכביסה 2, את ה-2x SSC ואת ה-PBST בטמפרטורה של 55°C לפני השימוש. - הסר את מאגר הכביסה 1 ולאחר מכן הוסף את מאגר הכביסה 2 (טבלה 1). שטפו את הדוגמאות עם Wash Buffer 2 למשך 2 x 15 דקות בטמפרטורה של 55 מעלות צלזיוס.
- הסר את Wash Buffer 2 ולאחר מכן הוסף 2x SSC. לשטוף את הדגימות עם 2x SSC במשך 2 x 15 דקות ב 55 מעלות צלזיוס.
- הסר 2x SSC ולאחר מכן הוסף PBST שחומם מראש. שטפו את הדגימות במשך 1 x 15 דקות עם PBST ב- RT.
- הסר את מאגר HB המכיל בדיקות ולאחר מכן הוסף את מאגר Wash 1 (טבלה 1). שטפו את הדוגמאות עם Wash Buffer 1 למשך 2 x 15 דקות בטמפרטורה של 55 מעלות צלזיוס. יש להשתמש ב-300-400 μL של מאגר כביסה.
- דגירה של נוגדנים נגד DIG
- הסר PBST ולאחר מכן הוסף מאגר חסימה של 1%. דגרו את הדגימות למשך שעה אחת לפחות ב-RT תוך כדי ניעור איטי על נדנדה.
הערה: הכן מאגר חוסם 1% טרי על ידי דילול מלאי מאגר חוסם של 5% (טבלה 1). בדוק את הדגימות לפני תגובת הנוגדנים הבאה מכיוון שהדגימה נוטה להידבק לחלק האחורי של המכסה או הקיר כתוצאה מרעידות. - לאחר החסימה, הסר את מאגר החסימה של 1%, הוסף פתרון נגד DIG-POD (1:500, במאגר חסימה של 1%), ודגירה של דגימות O.N. ב-4 מעלות צלזיוס (איור 2).
הערה: הקפד לשמור על זמן הדגירה בטווח של 12-16 שעות כדי למנוע זיהוי של אותות לא ספציפיים.
- הסר PBST ולאחר מכן הוסף מאגר חסימה של 1%. דגרו את הדגימות למשך שעה אחת לפחות ב-RT תוך כדי ניעור איטי על נדנדה.
- זיהוי בדיקה עם תווית DIG
- הסר את הפתרון נגד DIG-POD ולאחר מכן הוסף את Tris-NaCl-Tween Buffer (TNT, טבלה 1). שטפו את הדגימות עם TNT במשך 3 x 10 דקות ב- RT.
הערה: השימוש בטכניקת הגברת אות הטירמיד (TSA) מספק תמונה ברזולוציה טובה יותר כנגד ריאגנטים בעלי תווית פרוקסידאז חזרת (לדוגמה, anti-DIG-POD). - דילול תמיסת מלאי של טירמיד מצומד צבע פלואורסצנטי (Cy5-tyramide) (1:50) במאגר דילול ההגברה כדי ליצור את תמיסת Cy5-tyramide הפעילה (איור 2).
- הסר כמה שיותר TNT ולאחר מכן הוסף את הפתרון Cy5-tyramide פעיל. לדגור את הדגימות במשך 10 דקות בחושך.
- לשטוף את הדגימות עם PBST במשך 3 x 10 דקות בחושך.
- הסר את הפתרון נגד DIG-POD ולאחר מכן הוסף את Tris-NaCl-Tween Buffer (TNT, טבלה 1). שטפו את הדגימות עם TNT במשך 3 x 10 דקות ב- RT.
- זיהוי של EdU
הערה: ערכת EdU מזהה EdU משולב כאותות פלואורסצנטיים (איור 2).- כדי להכין את קוקטייל זיהוי EdU, ערבבו את הרכיבים כפי שמוצג בטבלה 1. השתמש ב-100 μL של קוקטייל זיהוי EdU עבור כל דגימה.
הערה: הכן תוסף מאגר תגובה 1x על ידי דילול תוסף מאגר תגובה 10x עם מים טהורים במיוחד. - הסר PBST ולאחר מכן הוסף את קוקטייל זיהוי EdU. לדגור בחושך במשך 30 דקות.
- לשטוף עם PBST במשך 3 x 10 דקות בחושך.
- כדי להכין את קוקטייל זיהוי EdU, ערבבו את הרכיבים כפי שמוצג בטבלה 1. השתמש ב-100 μL של קוקטייל זיהוי EdU עבור כל דגימה.
- צביעת דנ"א
- דילול Hoechst 33342 (1:500) ב- PBST כדי להכין את פתרון Hoechst. הסר את ה- PBST ולאחר מכן הוסף את פתרון Hoechst. דגרו את הדגימות במשך 30 דקות בחושך (איור 2).
- לשטוף את הדגימות עם PBST במשך 3-4 x 10 דקות בחושך.
- הרכבה
- צור בנק על שקופית הזכוכית כדי למנוע את ריסוק הדגימה. מרחו את סרט הוויניל על שקופית הזכוכית והחללו את המרכז.
- העבירו את המדוזה לגדה שעל זכוכית השקופיות באמצעות פיפטה להעברה של 3.1 מ"ל כשהקצה נחתך.
הערה: יש להיזהר שלא לתת לזרועות הציד לחפוף. - הסר כל PBST עם פיפטה P200, ולאחר מכן הוסף באיטיות 70% גליצרול כמדיום ההרכבה (איור 2).
הערה: במקום 70% גליצרול, ניתן להשתמש במדיום הרכבה מונע דהייה כדי למנוע את דהיית הפלואורסצנטיות. - יש להניח בעדינות כיסוי על המדוזה בעזרת מלקחיים, ולאטום את צד הכיסוי עם לק שקוף.
- שמור את השקופיות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס בחושך אם לא מבצע מיד תצפית מיקרוסקופיה.
- דימות
- השתמש במיקרוסקופ קונפוקלי לסריקת לייזר כדי להשיג תמונות. לרזולוציה של תא בודד, השתמש בעדשת שמן של 40x או בעדשה להגדלה גבוהה יותר.
- לאחר רכישת התמונה, פתח את התמונות באמצעות תוכנת ImageJ/FIJI וספור תאים חיוביים עבור EdU+ ו/או Nanos1+ על ידי הכלי הרב-נקודתי20.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
זרועות הציד של קלדונמה שימשו כמודל לחקר התהליכים התאיים של מורפוגנזה והתחדשות15,16,17. מבנה זרועות הציד מורכב מצינור אפיתל שבו תאים דמויי גזע, או תאי i, ממוקמים באזור הפרוקסימלי, הנקרא נורת זרועות ציד, וענפים חדשים מתווספים ברצף לחלק האחורי של האזור הדיסטלי של הנורה לאורך הצד האדקסיאלי (איור 3A)15. דיווחים קודמים הצביעו על כך שהתפשטות התאים פעילה הן בנורת זרועות הציד והן באתרי ההסתעפות החדשים באמצעות EdU או BrdU המסמנים16,17. עם זאת, בשל הרזולוציה של הכלאה באתרה, לא ברור אם תאים דמויי גזע הם באמת מתרבים או לא. כדי להמחיש הן תאים דמויי גזע והן תאים מתרבים בו-זמנית ברמה התאית, ביצענו FISH עבור סמני תאי גזע (Nanos1 או Piwi) ותיוג EdU עבור תאי פאזה S באותן דגימות.
ברזולוציה תאית של FISH, הביטוי של Nanos1 היה מקומי בנורת זרועות הציד ובאתר ההסתעפות החדש (איור 3B). פיווי בא לידי ביטוי גם בנורת זרועות הציד ובאתר ההסתעפות החדש בתבנית דומה לזו של Nanos1 (איור 3C). תוצאות אלה עלו בקנה אחד עם התצפיות מהכלאה של הר שלם באתרו בדו"ח קודם17, שבו הענף הניצני של מדוזה בת 7 ימים סומן כמעט באופן אחיד על ידי Nanos1 ו- Piwi. כדי לדמיין את תחילת ההצטברות של תאים דמויי גזע, עקבנו אחר אתר ההסתעפות החדש של מדוזה בת 5 ימים. התיוג המשותף של ביטוי Nanos1 ותאים חיוביים ל-EdU חשף את התבנית המרחבית של תאים דמויי גזע ותאים מתרבים בזרועות הציד (איור 4A). אף על פי שההתפלגויות הגולמיות של תאי EdU+ ו-Nanos1+ היו עקביות עם דיווחים קודמים16,17, תאי EdU+ היו מפוזרים באופן נרחב יותר בכל נורת זרועות הציד, לפחות בתחילת ההסתעפות, בעוד שתאי Nanos1+ הצטברו באופן מקומי יותר בנורת זרועות הציד ובאתר ההסתעפות החדש (איור 4A ואיור 4E ). תצפיות אלה מציעות כי חלוקות שונות של תאים דמויי גזע ותאים מתרבים מזוהות בהתאם לתזמון ההתפתחותי ולשלבים שונים.
מבט מפורט יותר על הנורה ואתר ההסתעפות החדש גילה שאותות EdU מתמזגים עם כתמים גרעיניים, בעוד שביטוי Nanos1 מוגבל לציטופלסמה המקיפה את הגרעין, בהתאם לדיווח קודם5 (איור 4B,C). חלק קטן (19.79%) מהתאים הציגו תיוג משותף של EdU ו-Nanos1 (EdU+ Nanos1+; איור 4B,C, ראשי חץ צהובים ואיור 4D), מה שמרמז על כך שהתאים האלה הם אוכלוסיית תאי גזע המתרבים באופן פעיל. באופן מסקרן, 14.46% מהתאים נמצאו כ-EdU+ Nanos1− במרכז הנורה ובאתר ההסתעפות החדש, מה שמרמז על נוכחותם של תאים מתרבים שאינם דמויי גזע (איור 4B,C, חיצים לבנים ואיור 4D). לעומת זאת, 26.32% מהתאים נצפו כ-EdU− Nanos1+ בבסיס הנורה ובאתר ההסתעפות החדש, מה שמצביע על נוכחות של אוכלוסיית תאי גזע שהיא מחזורית איטית או שקטה, שאף אחד מהם לא זוהה על-ידי תיוג דופק EdU (איור 4B,C, חיצים צהובים ואיור 4D).
איור 1: סכימה של סינתזת הגשושית להכלאה באתרה . מיצוי סך הרנ"א ממדוזה וסינתזת cDNA מסך הרנ"א. מוצרי PCR ספציפיים ל-Nanos1 סונתזו מה-cDNA. מוצרי ה-PCR נקשרו לווקטורים, וקטורים מוגברים נאספו באמצעות תרבית תאים מוסמכת. מוצרי ה-PCR עם אתרי קשירת RNA פולימראז סונתזו באמצעות הפלסמידים כתבניות. בדיקות RNA המסומנות על ידי DIG סונתזו על ידי שעתוק במבחנה . קיצורים: DIG = דיגוקסיגנין. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2: סכימה של EdU והכלאה פלואורסצנטית באתרה. מדוזה הודגמה עם 150 μM EdU במשך שעה אחת. לאחר מכן, המדוזה הורדמה (כדי להרפות את הרקמה) עם 7% MgCl 2 ב- H2 O וקבועה עם4% PFA O.N. ב 4 מעלות צלזיוס. לאחר הקיבוע, הדגימות הוכלאו עם HB Buffer עם בדיקה במשך 20-24 שעות ב 55 מעלות צלזיוס. לאחר תגובת ההכלאה, הדגימות נשטפו והודגרו עם תמיסת אנטי-DIG-POD O.N. בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. המדוזה הוכתמה בתמיסת Cy5-tyramide במשך 10 דקות, ולאחר מכן זיהוי של EdU למשך 30 דקות והכתמה עם Hoechst 33342 למשך 30 דקות. לאחר השלמת כל תהליכי הצביעה, הורכבו המדוזות על מגלשת הזכוכית, והתקבלו תמונות במיקרוסקופ קונפוקלי. קיצורים: EdU = 5-אתיניל-2'-דאוקסיורידין; FISH = הכלאה פלואורסצנטית באתרה; PFA = פרפורמלדהיד; O.N. = לילה; HB = הכלאה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 3: תבניות ביטוי של Nanos1 ו-Piwi בצד האדוקסיאלי הפרוקסימלי של זרועות הציד Cladonema medusa. (A) סכמת של מדוזה וזרועות ציד של קלדונמה. הצד האדאקסיאלי של זרוע הציד: נורת זרועות הציד (האזור הפרוקסימלי ביותר) עם ענפים חדשים שנוצרו ברצף באתר ההסתעפות החדש. הכניסה (ריבוע מקווקו) מציינת את השטח שנלכד על-ידי התמונה הקונפוקלית. (B) תמונות FISH של ביטוי גנים Nanos1 מהצד הפרוקסימלי, האדאקסיאלי של זרוע הציד של מדוזה Cladonema בת 7 ימים. (C) תמונות FISH של ביטוי גנים Piwi מהצד הפרוקסימלי, האדוקסלי, של זרועות הציד של מדוזה Cladonema בת 7 ימים. דנ"א: ירוק, נאנוס1: מגנטה. B'-C' עבור Nanos1 FISH רק תמונות. סרגלי קנה מידה = 100 מיקרומטר (B,C). קיצור: FISH = הכלאה פלואורסצנטית באתרה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 4: תבניות ביטוי של EdU ו-Nanos1 בצד הפרוקסימלי והאדאקסיאלי של זרועות הציד של Cladonema medusa. (A-C) תמונות של הצד האדוקסיאלי הפרוקסימלי של זרועות הציד Cladonema medusa המסומנות יחד עם ביטוי Nanos1 ו- EdU; נעשה שימוש במדוזות בנות 5 ימים. (A) סקירה כללית של זרועות הציד. ריבועים מקווקווים צהובים מציינים את האזורים B ו- C. (B) הגדלה של נורת זרועות הציד. (ג) הגדלה של אתר הסתעפות חדש. ראשי חץ צהובים מציינים את התאים החיוביים הן עבור EdU והן עבור Nanos1. חיצים צהובים מציינים את התאים שהם חיוביים רק עבור Nanos1. חיצים לבנים מציינים תאים חיוביים רק עבור EdU. לוחות A-C הם תמונות ממוזגות עבור דנ"א (כחול), EdU (ירוק) ו - Nanos1 (מגנטה). A'-C' הם לוחות עבור תמונות EdU בלבד; A''-C'' הם עבור Nanos1 FISH רק תמונות. פסי קנה מידה = 100 מיקרומטר (A), 50 מיקרומטר (B, C). (D) כימות של תאים חיוביים ל-EdU ו/או Nanos1 בצד הבסיסי של זרוע הציד (אזור כימות = 30.10 מיקרומטר2 מרובע, n = 6, סה"כ 249 תאים). EdU+ Nanos1− תאים, 14.46%; EdU+ Nanos1+ תאים, 19.79%; EdU− Nanos1+ תאים, 26.32%; תאי EdU− Nanos1− , 39.44%. (E) סכמת של זרוע קלדונמה מדוזה מהצד האדאקסיאלי. ההתפלגות הכוללת של תאי EdU+ ותאי Nanos1+ מוצגת ב-E וב-E', בהתאמה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
טבלה 1: הרכב תגובות ומאגרי PCR שונים בפרוטוקול זה. כדי לחשב את נפח מכפלת ה-PCR (X μL) בתגובת הקשירה, עיין בהערה לאחר שלב 1.4 של הפרוטוקול. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
תאים מתרבים ותאי גזע הם מקורות תאיים חשובים בתהליכים שונים כגון מורפוגנזה, גדילה והתחדשות21,22. מאמר זה מתאר שיטה להכתמה משותפת של סמן תאי הגזע Nanos1 על ידי תיוג FISH ו- EdU ב- Cladonema medusae. עבודות קודמות שהשתמשו בתיוג EdU או BrdU הציעו כי תאים מתרבים מתמקמים לנורות זרועות הציד16,17, אך המאפיינים המולקולריים שלהם לא היו ברורים. המחקר הנוכחי מראה את הקביעה הבו-זמנית של התפלגות התאים המתרבים ושל לוקליזציה של תאים דמויי גזע מסוג Nanos1+ (איור 4). התוצאות הראו כי חלק מהתאים המתרבים ביטאו את Nanos1, אך תאים אחרים סומנו רק ב-EdU ולא ביטאו את Nanos1, מה שמרמז על קיומה של הטרוגניות של תאי גזע או, באופן פוטנציאלי, של תאים מתרבים אחרים. יהיה מעניין לנתח את התפלגות תאי הגזע המפורטת במהלך תהליכים שונים בקלדונמה, כולל הסתעפות זרועות ציד, הומאוסטזיס של רקמות, התחדשות איברים ותחזוקת תאי נבט.
צוואר הבקבוק העיקרי להדמיית תאי גזע בבעלי חיים הוא הזיהוי הראשוני של סמני תאי גזע. בקנידריאנים, סמנים של תאי גזע לא זוהו בתאים שאינם הידרוזואנים3, ולכן, בשלב זה, היישום הישיר של FISH עבור סמני תאי גזע נותר מוגבל להידרוזואנים. עם זאת, FISH מאפשר זיהוי של ביטוי גנים ספציפיים ברמה התאית, וכך, על ידי שינוי בדיקות, ניתן להרחיב שיטה זו כדי לבחון את דפוסי הביטוי המרחבי של כל הגנים המעניינים בפירוט. לדוגמה, באמצעות סמנים של תאי אב ותאים ממוינים, אנו יכולים לאמת את התפלגות סוגי התאים הספציפיים בזרועות הקלדונמה. כאזהרה, ייתכן שיהיה צורך לשנות את הפרוטוקול הנוכחי בהתאם לגנים המעניינים עקב הבדלים ברמות הביטוי ויציבות ה-mRNA. בפרט, אותות לא ספציפיים ואותות חלשים הם בעיות נפוצות הקשורות ל- FISH. שינוי זמן ההכלאה והטמפרטורה, שימוש בריאגנטים להלבנה (פורמיד או מתנול), והתאמת פרמטרים אחרים (זמן תגובה TSA, טיפול פרוטאינאז K, שטיפה לאחר הכלאה) עשויים להניב אותות ברורים יותר ופחות אותות לא ספציפיים23,24. חשוב גם לבחור פרוטוקול FISH המתאים למודל החי שבו נעשה שימוש, שכן פרוטוקול FISH אחד עשוי שלא להיות ישים למינים אחרים, אפילו בתוך אותו טקסון 7,25,26.
תיוג EdU משמש בדרך כלל לאיתור תאים מתרבים, אך ניתן להשתמש בו למטרות ניסוי שונות על ידי שינוי הריכוז וזמן הדגירה27. כדי לזהות תאים מתרבים, חיוני לקבוע משך וריכוז מוצלחים לשילוב EdU. בתיוג הדופק ששימש בעבודה זו סומנו רק תאים מתרבים שעברו את שלב S לפרק זמן קצר, ושיטות דגירה קצרות דומות שימשו לאיתור תאים מתרבים אצל קנידריאנים אחרים 6,28,29. לעומת זאת, השילוב של שילוב ממושך של EdU ו-Nanos1 FISH עשוי לחשוף נוכחות של תאי גזע בעלי מחזור איטי או שקטים27. ניתן גם לסמן לא רק תאים מתרבים אלא גם תאים אנדוציקליים שעברו סינתזת DNA ללא חלוקה. יתר על כן, על ידי מעקב אחר תאים המסומנים ב-EdU למשך זמן ארוך יותר, אנו יכולים לקבוע את יכולת ההעברה וההתמיינות התאית הקשורה לתאים מתרבים ואת שושלת התאים שלהם 6,30.
בעוד שהשילוב של צביעת FISH ו- EdU או BrdU שימש 7,31, השיטה שנקבעה כאן יכולה להיות מיושמת בקלות על חסרי חוליות ימיים אחרים ובעלי חיים שאינם מודלים, כולל מיני מדוזות שונים. צביעת EdU פשוטה ורגישה יותר מצביעתBrdU 18, ועם הדגירה בזמן הקצר שלה, היא מאפשרת זיהוי של תאים מתרבים, בניגוד למחקר הקודם שהשתמש ב- EdU לתיוג תאים לטווח ארוך7. בשנים האחרונות, עם התקדמות טכנולוגיות הריצוף של הדור הבא, מידע על גנום וביטוי גנים הפך לזמין עבור מינים רבים. זיהוי תאי גזע ותאים מתרבים ימשיך להיות גישה יעילה להבנת ההטרוגניות והמגוון של תאי גזע ומתן תובנות על הדינמיקה התאית העומדת בבסיס תופעות ביולוגיות שונות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי AMED תחת מענק מספר JP22gm6110025 (ל- Y.N.) ועל ידי מענק JSPS KAKENHI מספר 22H02762 (ל- Y.N.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Mercaptoethanol | Wako | 137-06862 | |
| 3.1 mL transfer pipette | Thermo Scientific | 233-20S | |
| 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-Gal) | Wako | 029-15043 | |
| anti-DIG-POD | Roche | 11207733910 | |
| Cladonema pacificum Nanos1 forward primer | 5’-AAGAGACACAGTCATTATCAAGC GA-3’ |
||
| Cladonema pacificum Nanos1 reverse primer | 5’-CGACGTGTCCAATTTTACGTGCT -3’ | ||
| Cladonema pacificum Piwi forward primer | 5’- AAAAGAGCAGCGGCCAGAAAGA AGGC -3’ |
||
| Cladonema pacificum Piwi reverse primer | 5’- GCGGGTCGCATACTTGTTGGTA CTGGC -3’ |
||
| Click-iT EdU Cell Proliferation Kit for Imaging, Alexa Fluor 488 dye | Invitrogen | C10337 | EdU kit |
| Coroline off | GEX Co. ltd | N/A | chlorine neutralizer |
| DIG Nucleic Acid Detection Kit Blocking Reagent | Roche | 11175041910 | blocking buffer |
| DIG RNA labeling mix | Roche | 11277073910 | |
| DTT | Promega | P117B | |
| ECOS competent cell DH5α | NIPPON GENE | 316-06233 | competent cell |
| Fast gene Gel/PCR Extraction kit | Fast gene | FG-91302 | gel extraction kit |
| Fast gene plasmid mini kit | Fast gene | FG-90502 | plasmid miniprep |
| Formamide | Wako | 068-00426 | |
| Heparin sodium salt from porcine | SIGMA-ALDRICH | H3393-10KU | |
| Isopropyl-β-D(-)-thiogalactopyranoside (IPTG) | Wako | 096-05143 | |
| LB Agar | Invitrogen | 22700-025 | agar plate |
| LB Broth Base | Invitrogen | 12780-052 | LB medium |
| Maleic acid | Wako | 134-00495 | |
| mini Quick spin RNA columns | Roche | 11814427001 | clean-up column |
| NaCl | Wako | 191-01665 | |
| NanoDrop OneC Microvolume UV-Vis Spectrophotometer with Wi-Fi | Thermo Scientific | ND-ONEC-W | spectrophotometer |
| Polyoxyethlene (20) Sorbitan Monolaurate (Tween-20) | Wako | 166-21115 | |
| PowerMasher 2 | nippi | 891300 | homogenizer |
| Proteinase K | Nacarai Tesque | 29442-14 | |
| RNase Inhibitor | TaKaRa | 2313A | |
| RNeasy Mini kit | Qiagen | 74004 | total RNA isolation kit |
| RQ1 RNase-Free Dnase | Promega | M6101 | |
| Saline Sodium Citrate Buffer 20x powder (20x SSC) | TaKaRa | T9172 | |
| SEA LIFE | Marin Tech | N/A | mixture of mineral salts |
| T3 RNA polymerase | Roche | 11031163001 | |
| T7 RNA polymerase | Roche | 10881767001 | |
| TAITEC HB-100 | TAITEC | 0040534-000 | Hybridization incuvator |
| TaKaRa Ex Taq | TaKaRa | RR001A | Taq DNA polymerase |
| TaKaRa PrimeScript 2 1st strand cDNA Synthesis Kit | TaKaRa | 6210A | cDNA synthesis kit |
| Target Clone | TOYOBO | TAK101 | pTA2 Vector |
| tRNA | Roche | 10109541001 | |
| TSA Plus Cyanine 5 | AKOYA Biosciences | NEL745001KT | tyramide signal amplification (TSA) technique |
| Zeiss LSM 880 | ZEISS | N/A | laser scanning confocal microscope |
References
- Leclère, L., Röttinger, E. Diversity of cnidarian muscles: Function, anatomy, development and regeneration. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 157 (2017).
- Bosch, T. C. G., et al. Back to the basics: Cnidarians start to fire. Trends in Neurosciences. 40 (2), 92-105 (2017).
- Gold, D. A., Jacobs, D. K. Stem cell dynamics in Cnidaria: Are there unifying principles. Development Genes and Evolution. 223 (1-2), 53-66 (2013).
- Technau, U., Steele, R. E. Evolutionary crossroads in developmental biology: Cnidaria. Development. 138 (8), 1447-1458 (2011).
- Leclère, L., et al. Maternally localized germ plasm mRNAs and germ cell/stem cell formation in the cnidarian Clytia. Developmental Biology. 364 (2), 236-248 (2012).
- Bradshaw, B., Thompson, K., Frank, U. Distinct mechanisms underlie oral vs aboral regeneration in the cnidarian Hydractinia echinata. eLife. 4, 05506 (2015).
- Sinigaglia, C., et al. Pattern regulation in a regenerating jellyfish. eLife. 9, 54868 (2020).
- David, C. N. Interstitial stem cells in Hydra: Multipotency and decision-making. The International Journal of Developmental Biology. 56 (6-7-8), 489-497 (2012).
- Röttinger, E. Nematostella vectensis, an emerging model for deciphering the molecular and cellular mechanisms underlying whole-body regeneration. Cells. 10 (10), 2692 (2021).
- Houliston, E., Momose, T., Manuel, M. Clytia hemisphaerica: A jellyfish cousin joins the laboratory. Trends in Genetics. 26 (4), 159-167 (2010).
- Peron, S., Houliston, E., Leclère, L. The Marine Jellyfish Model, Clytia hemisphaerica. Handbook of Marine Model Organisms in Experimental Biology. Boutet, A., Shierwater, B. , CRC Press. Boca. Raton, FL. 129-147 (2021).
- Denker, E., Manuel, M., Leclère, L., Le Guyader, H., Rabet, N. Ordered progression of nematogenesis from stem cells through differentiation stages in the tentacle bulb of Clytia hemisphaerica (Hydrozoa, Cnidaria). Developmental Biology. 315 (1), 99-113 (2008).
- Fujita, S., Kuranaga, E., Nakajima, Y. Regeneration potential of jellyfish: Cellular mechanisms and molecular insights. Genes. 12 (5), 758 (2021).
- Suga, H., et al. Flexibly deployed Pax genes in eye development at the early evolution of animals demonstrated by studies on a hydrozoan jellyfish. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (32), 14263-14268 (2010).
- Fujiki, A. Branching pattern and morphogenesis of medusa tentacles in the jellyfish Cladonema pacificum (Hydrozoa, Cnidaria). Zoological Letters. 5 (12), 13 (2019).
- Fujita, S., Kuranaga, E., Nakajima, Y. Cell proliferation controls body size growth, tentacle morphogenesis, and regeneration in hydrozoan jellyfish Cladonema pacificum. PeerJ. 7, 7579 (2019).
- Hou, S., Zhu, J., Shibata, S., Nakamoto, A., Kumano, G. Repetitive accumulation of interstitial cells generates the branched structure of Cladonema medusa tentacles. Development. 148 (23), (2021).
- Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (7), 2415-2420 (2008).
- Angerer, L. M., Angerer, R. C. Detection of poly A + RNA in sea urchin eggs and embryos by quantitative in situ hybridization. Nucleic Acids Research. 9 (12), 2819-2840 (1981).
- Rakotomamonjy, J., Guemez-Gamboa, A. Purkinje cell survival in organotypic cerebellar slice cultures. Journal of Visualized Experiments. (154), e60353 (2019).
- Tanaka, E. M., Reddien, P. W. The cellular basis for animal regeneration. Developmental Cell. 21 (1), 172-185 (2011).
- Penzo-Méndez, A. I., Stanger, B. Z.
- Sinigaglia, C., Thiel, D., Hejnol, A., Houliston, E., Leclère, L. A safer, urea-based in situ hybridization method improves detection of gene expression in diverse animal species. Developmental Biology. 434 (1), 15-23 (2018).
- King, R. S., Newmark, P. A. In situ hybridization protocol for enhanced detection of gene expression in the planarian Schmidtea mediterranea. BMC Developmental Biology. 13 (1), 8 (2013).
- Flici, H., et al. An evolutionarily conserved SoxB-Hdac2 crosstalk regulates neurogenesis in a cnidarian. Cell Reports. 18 (6), 1395-1409 (2017).
- He, S., et al. An axial Hox code controls tissue segmentation and body patterning in Nematostella vectensis. Science. 361 (6409), 1377-1380 (2018).
- Govindasamy, N., Murthy, S., Ghanekar, Y. Slow-cycling stem cells in hydra contribute to head regeneration. Biology Open. 3 (12), 1236-1244 (2014).
- Passamaneck, Y. J., Martindale, M. Q. Cell proliferation is necessary for the regeneration of oral structures in the anthozoan cnidarian Nematostella vectensis. BMC Developmental Biology. 12 (1), 34 (2012).
- Gold, D. A., et al. Structural and developmental disparity in the tentacles of the moon jellyfish Aurelia sp.1. PLoS One. 10 (8), 0134741 (2015).
- Gold, D. A., Nakanishi, N., Hensley, N. M., Hartenstein, V., Jacobs, D. K. Cell tracking supports secondary gastrulation in the moon jellyfish Aurelia. Development Genes and Evolution. 226 (6), 383-387 (2016).
- Cheng, L. -C., Alvarado, A. S. Whole-mount BrdU staining with fluorescence in situ hybridization in planarians. Planarian Regeneration. 1774, 423-434 (2018).
