Waiting
Login-Verarbeitung ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Флуоресцентная гибридизация in situ и маркировка 5-этинил-2'-дезоксиуридина для стволовых клеток в гидрозоанской медузе Cladonema pacificum

Published: August 3, 2022 doi: 10.3791/64285
Automatic Translation
1, 1, 2, 2
1Graduate School of Life Sciences, Tohoku University, 2Graduate School of Pharmaceutical Sciences, The University of Tokyo

Summary

Здесь мы описываем протокол визуализации стволовых пролиферирующих клеток в медузе Cladonema. Флуоресцентная гибридизация in situ с маркером стволовых клеток позволяет обнаруживать стволовые клетки, а маркировка 5-этинил-2'-дезоксиуридином позволяет идентифицировать пролиферирующие клетки. Вместе могут быть обнаружены активно размножающиеся стволовые клетки.

Abstract

Книдарии, в том числе морские анемоны, кораллы и медузы, демонстрируют разнообразную морфологию и образ жизни, которые проявляются в сидячих полипах и свободно плавающих медузах. Как показано на примере установленных моделей , таких как Гидра и Нематостелла, стволовые клетки и / или пролиферативные клетки способствуют развитию и регенерации книдарийных полипов. Тем не менее, основные клеточные механизмы у большинства медуз, особенно на стадии медузы, в значительной степени неясны, и, таким образом, разработка надежного метода идентификации конкретных типов клеток имеет решающее значение. В этой статье описывается протокол визуализации стволовых пролиферирующих клеток у гидрозоанской медузы Cladonema pacificum. Cladonema medusae обладают разветвленными щупальцами, которые непрерывно растут и поддерживают регенеративную способность на протяжении всей своей взрослой стадии, обеспечивая уникальную платформу для изучения клеточных механизмов, организованных пролиферирующими и / или стволовыми клетками. Флуоресцентная гибридизация in situ (FISH) с использованием маркера стволовых клеток позволяет обнаруживать стволовые клетки, в то время как пульсовая маркировка 5-этинил-2'-дезоксиуридином (EdU), маркером S-фазы, позволяет идентифицировать пролиферирующие клетки. Сочетая маркировку FISH и EdU, мы можем обнаруживать активно размножающиеся стволовые клетки на фиксированных животных, и этот метод может быть широко применен к другим животным, включая немодельные виды медуз.

Introduction

Cnidaria считается базально ветвящимся метазойным типом, содержащим животных с нервами и мышцами, что ставит их в уникальное положение для понимания эволюции развития животных и физиологии 1,2. Книдарии подразделяются на две основные группы: Anthozoa (например, морские анемоны и кораллы) обладают только личинками планулы и сидячими полипами, в то время как Medusozoa (члены Hydrozoa, Staurozoa, Scyphozoa и Cubozoa) обычно принимают форму свободно плавающих медуз, или медуз, а также личинок планулы и полипов. Книдарийцы обычно демонстрируют высокую регенеративную способность, и их основные клеточные механизмы, особенно их обладание взрослыми стволовыми клетками и пролиферативными клетками, привлекли большое внимание 3,4. Первоначально идентифицированные у гидры, гидрозоановые стволовые клетки расположены в интерстициальных пространствах между эпителиальными клетками эктодермии и обычно называются интерстициальными клетками или i-клетками3.

Гидрозоановые i-клетки имеют общие характеристики, которые включают мультипотентность, экспрессию широко сохраненных маркеров стволовых клеток (например, Nanos, Piwi, Vasa) и миграционный потенциал 3,5,6,7,8. Как функциональные стволовые клетки, i-клетки активно участвуют в развитии, физиологии и реакциях окружающей среды гидрозоанских животных, что свидетельствует об их высокой регенеративной способности и пластичности3. В то время как стволовые клетки, похожие на i-клетки, не были идентифицированы вне гидрозоанов, даже у установленного модельного вида Nematostella, пролиферативные клетки все еще участвуют в поддержании и регенерации соматической ткани, а также зародышевой линии9. Поскольку исследования в области развития и регенерации книдариев были преимущественно проведены на животных полипового типа, таких как гидра, гидрактиния и нематостелла, клеточная динамика и функции стволовых клеток у видов медуз остаются в значительной степени без внимания.

Гидрозойская медуза Clytia hemisphaerica, космополитический вид медуз с различными местами обитания по всему миру, включая Средиземное море и Северную Америку, была использована в качестве экспериментального модельного животного в нескольких исследованиях развития и эволюции10. Благодаря своим небольшим размерам, простоте обращения и большим яйцам, Clytia подходит для лабораторного обслуживания, а также для внедрения генетических инструментов, таких как недавно установленные методы трансгенеза и нокаута11, открывая возможность для подробного анализа клеточных и молекулярных механизмов, лежащих в основе биологии медуз. В щупальце Clytia medusa i-клетки локализуются в проксимальной области, называемой луковицей, а предшественники, такие как нематобласты, мигрируют к дистальной кончику, дифференцируясь в различные типы клеток, включая нематоциты12.

Во время регенерации Clytia manubrium, орального органа медуз, Nanos1+ i-клетки, которые присутствуют в гонадах, мигрируют в область, где манубрий теряется в ответ на повреждение и участвуют в регенерации манубриума7. Эти результаты подтверждают идею о том, что i-клетки в Clytia также ведут себя как функциональные стволовые клетки, которые участвуют в морфогенезе и регенерации. Однако, учитывая, что свойства i-клеток различаются у репрезентативных животных полипового типа, таких как гидра и гидрактиния3, возможно, что характеристики и функции стволовых клеток разнообразны среди видов медуз. Кроме того, за исключением Клитии, экспериментальные методы были ограничены для других медуз, а подробная динамика пролиферативных клеток и стволовых клеток неизвестна13.

Гидрозоанская медуза Cladonema pacificum является новым модельным организмом, который может содержаться в лабораторных условиях без водяного насоса или системы фильтрации. Cladonema medusa имеет разветвленные щупальца, общую характеристику в семействе Cladonematidae, и орган фоторецепторов, называемый ocellus на эктодермальном слое около луковицы14. Процесс ветвления щупальца происходит на новом месте ветвления, которое появляется вдоль адаксиальной стороны щупальца. Со временем щупальца продолжают удлиняться и ветвиться, а старые ветви выталкиваются к кончику15. Кроме того, щупальца Cladonema могут регенерировать в течение нескольких дней после ампутации. Недавние исследования показали роль пролиферирующих клеток и стволовых клеток в разветвлении и регенерации щупальца в Cladonema 16,17. Однако, в то время как обычная гибридизация in situ (ISH) использовалась для визуализации экспрессии генов в Cladonema, из-за ее низкого разрешения в настоящее время трудно наблюдать динамику стволовых клеток на клеточном уровне в деталях.

В данной статье описывается метод визуализации стволовых клеток в Cladonema методом FISH и совместного окрашивания с EdU, маркером пролиферации клеток18. Мы визуализируем паттерн экспрессии Nanos1, маркера стволовых клеток 5,17, с помощью FISH, который позволяет идентифицировать распределение стволовых клеток на уровне одной клетки. Кроме того, совместное окрашивание экспрессии Nanos1 маркировкой EdU позволяет различать активно пролиферирующие стволовые клетки. Этот метод мониторинга как стволовых, так и пролиферативных клеток может быть применен к широкому спектру исследуемых областей, включая ветвление щупалец, гомеостаз тканей и регенерацию органов при кладонеме, и аналогичный подход может быть применен к другим видам медуз.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ПРИМЕЧАНИЕ: См. Таблицу материалов для получения подробной информации , относящейся ко всем материалам, реагентам и оборудованию, используемым в этом протоколе.

1. Зондовый синтез

  1. Экстракция РНК
    1. Поместите три живых Cladonema medusae, которые культивируются в искусственную морскую воду (ASW), в трубку объемом 1,5 мл, используя передаточную пипетку объемом 3,1 мл с отрезанным наконечником, и удалите как можно больше ASW.
      ПРИМЕЧАНИЕ: ASW получают путем растворения смеси минеральных солей в водопроводной воде с нейтрализатором хлора; конечный удельный вес (S.G.) равен 1,018 или частей на тысячу (ppt) ~ 27.
    2. Заморозьте пробирки объемом 1,5 мл в жидком азоте, чтобы ингибировать активность РНКазы. Добавьте 30 мкл буфера лизиса из набора для выделения общей РНК, в который был добавлен 2-меркаптоэтанол (1 мкл /100 мкл буфера лизиса), и гомогенизируйте образцы в буфере лизиса с использованием гомогенизатора.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы избежать переполнения буфера и образца из пробирок, рекомендуется гомогенизация с небольшим количеством буфера лизиса.
    3. Добавьте 570 мкл буфера лизиса и извлеките общую РНК в соответствии с протоколом комплекта полной изоляции РНК (рисунок 1).
    4. Измерьте концентрацию экстрагированной РНК с помощью спектрофотометра и храните при −80 °C до использования.
  2. Синтез кДНК
    1. Используя набор, синтезируйте кДНК, используя общую РНК, извлеченную из медуз, в качестве шаблона (рисунок 1 и таблица 1).
    2. Инкубировать при 65 °C в течение 5 мин.
    3. Быстро остывает на льду.
    4. Осуществляют синтез кДНК со смесью со стадии 1.2.1 (таблица 1). Тщательно перемешать путем пипетки и инкубировать при 42 °C в течение 60 мин.
    5. Инкубировать при 95 °C в течение 5 мин.
    6. Быстро остывает на льду.
    7. Измеряют концентрацию синтезированной кДНК с помощью спектрофотометра и хранят при температуре или ниже −20 °C до использования.
  3. Синтез продукта ПЦР
    1. Чтобы создать шаблон ПЦР, спроектируйте конкретную грунтовку с помощью Primer-BLAST. Источник эталонной последовательности из данных NCBI или данных RNA-seq.
      ПРИМЕЧАНИЕ: См. Таблицу материалов для грунтовок, используемых в этом протоколе.
    2. Для усиления целевой последовательности выполняют клонирование ТА, которое не требует применения рестрикционных ферментов. Для получения продукта ПЦР, в который добавляют аденин на конце 3', используйте следующие настройки: 98 °C в течение 2 мин; 35 циклов 98 °C в течение 10 с, 55-60 °C в течение 30 с, 72 °C в течение 1 мин. Для реакций используют ДНК-полимеразу Taq (табл. 1).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы определить условия ПЦР, следуйте протоколу, который сопровождает используемую ДНК-полимеразу, которая обычно обеспечивает рекомендуемую температуру отжига и время продления.
    3. Пропустите продукт ПЦР через 1% агарозный гель и вырежьте интересующую полосу. Извлеките продукты ПЦР из разрезанных гелей с помощью набора для экстракции геля.
  4. Лигатура
    1. Лигируйте продукт ПЦР к вектору с 3' тиминовыми навесами путем смешивания реагентов (таблица 1) и инкубации при 37 °C в течение 30 мин (рисунок 1).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Молекулярное соотношение вектор:ПЦР должно составлять 1:>3. Размер вектора pTA2 составляет приблизительно 3 кб. Если продукт ПЦР (вставка) равен A (kb) и B (ng/μL), объем вкладыша (X в таблице 1), который необходимо взять, может быть рассчитан по ([50 нг векторной × A kb вставки])/(3 kb vector × [1/3]) = 50· Нг вставки. Если концентрация вставки составляет В нг/мкл, то взятый объем равен 50· А/В мкл вставки.
  5. Трансформация и нанесение покрытий
    1. Для трансформации разморозьте компетентные клетки на льду и распределите их в аликвоты по 20 мкл каждая. Добавьте 1 мкл плазмид, содержащих продукт ПЦР (менее 5% от компетентного клеточного объема) и вихрь в течение 1 с. Инкубировать на льду в течение 5 мин, а затем инкубировать при 42 °C в течение 45 с, а вихрь в течение 1 с.
    2. Добавьте 180 мкл супероптимального бульона со средой подавления катаболита (SOC) (богатая питательными веществами бактериальная культуральная среда) к компетентным клеткам и инкубируйте при 37 °C в течение 30 мин. Через 30 мин распределите компетентные клетки на агаровую пластину, содержащую ампициллин, 5-бром-4-хлор-3-индолил-бета-D-галакто-пиранозид (X-галлон) и изопропил-β-d-1-тиогалакопиранозид (IPTG), и инкубируйте при 37 °C в течение 12-16 ч (рисунок 1).
      ПРИМЕЧАНИЕ: X-gal и IPTG используются для выбора синих и белых колоний.
  6. Жидкая культура
    1. Выберите белую колонию из белых и синих колоний на тарелке. Добавьте его в 3-5 мл среды LB с ампициллином и инкубируйте на шейкере в течение 12-16 ч при 37 °C (рисунок 1).
  7. Минипреп
    1. Извлеките плазмиду из среды LB с помощью плазмидного минипрепа (рисунок 1).
    2. Количественно оцените концентрацию плазмиды с помощью спектрофотометра.
  8. Прочитайте последовательность.
    1. Чтобы прочитать последовательность ДНК плазмиды, отправьте плазмиду для секвенирования Сэнгера, а затем используйте программное обеспечение для выравнивания ее с последовательностью генома / транскриптома, чтобы подтвердить, правильно ли синтезирована целевая последовательность, и оценить, в каком направлении целевая последовательность вставлена в плазмиду (от 5' до 3' или от 3' до 5').
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если целевая последовательность вставлена в плазмиду в направлении от 5' до 3' от места связывания РНК-полимеразы около конца 3', антисмысловый зонд может быть сгенерирован транскрипцией in vitro . Если целевая последовательность вставлена в обратном направлении от 3' до 5', может быть сгенерирован датчик (отрицательный контроль). При использовании векторов, таких как pTA2, можно использовать два сайта связывания транскрипции в зависимости от цели.
  9. Транскрипция in vitro
    1. Подготовьте шаблон ДНК из созданной плазмиды, выполнив ПЦР с использованием праймеров вне сайта связывания РНК-полимеразы (например, сайтов связывания T7/T3) в плазмиде (рисунок 1).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Универсальные праймеры, такие как форвардный праймер M13-20 и обратный праймер M13, могут быть использованы для подготовки шаблона ДНК, который включает сайты связывания РНК-полимеразы.
    2. Очистите шаблон после амплификации ПЦР с помощью набора для экстракции геля/ПЦР.
    3. Смешайте реагенты, показанные ниже, и выполните реакцию транскрипции при 37 °C в течение 3 ч (рисунок 1 и таблица 1).
    4. Добавить 1,5 мкл ДНКазы и инкубировать при 37 °C в течение 30 мин.
    5. Добавьте 10 мкл рваной воды и очистите зонд от реакционного раствора транскрипции с помощью очистительной колонны.
    6. Проверьте размер синтезированной РНК, загрузив 1 мкл на 1% агарозный гель и определите концентрацию с помощью спектрофотометра.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Синтезированные РНК-зонды должны иметь концентрацию не менее 100 нг/мкл.
    7. Добавить 30 мкл формамида для хранения при температуре или ниже −20 °C.

2. Регистрация и фиксация EdU

  1. Поместите Cladonema medusae (5-10 животных на трубку) в пробирки по 1,5 мл с помощью передаточной пипетки объемом 3,5 мл и добавьте ASW до общего объема 500 мкл. Добавьте 7,5 мкл 10 мМ раствора EdU и инкубируйте образцы в течение 1 ч при 22 °C (рисунок 2). Конечная концентрация EdU составляет 150 мкМ.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте 5-7-дневные медузы для мониторинга образования третьей ветви (рисунок 3А). День, когда медузы отделяются от полипа, считается днем 1, а на 5-й день медузы обычно начинают проявлять третью ветвь на своих основных щупальцах.
  2. Через 1 ч удалить как можно больше ASW, содержащей EdU.
  3. Для обезболивания медуз добавляют 7% MgCl2 вH2Oи инкубируют в течение 5 мин.
  4. Удалить 7% MgCl2 вH2O изафиксироватьмедузу на ночь (O.N.) при 4 °C с 4% параформальдегидом (PFA) в ASW (рисунок 2).
    ПРИМЕЧАНИЕ: При выполнении FISH без включения EdU образцы могут быть зафиксированы аналогично образцам, обработанным EdU после анестезии (этапы 2.3-2.4).

3. Флуоресцентная гибридизация in situ

  1. Лечение протеиназой и постфиксация
    1. Снимите PFA и промывайте образцы PBS, содержащим 0,1% Tween-20 (PBST) в течение 3 x 10 мин. Используйте 300-500 мкл PBST на стирку.
      ПРИМЕЧАНИЕ: От этого шага до конца гибридизации эксперимент должен проводиться в среде, свободной от РНКазы, в перчатках и маске. 1x PBS на этом этапе должен быть изготовлен из воды, обработанной DEPC. После гибридизации можно использовать 1x PBS, изготовленный с водой без обработки DEPC. Некоторые протоколы ISH и FISH обезвоживают образцы с использованием этапов метанола, что позволяет сохранять фиксированные образцы при -20 °C до использования. Чтобы избежать лишней работы, процесс обезвоживания исключен из этого протокола, особенно потому, что образцы могут храниться в PBST до нескольких дней.
    2. После фиксации поместите образец в пробирки объемом 1,5 мл на шейкер, за исключением стадии инкубации антитела O.N. анти-DIG-POD (этап 3.4.2). После промывки добавляют 10 мг/мл раствора протеиназы К в ПБСТ и инкубируют медузу с протеиназой К (конечная концентрация: 10 мкг/мл) при 37 °C в течение 10 мин.
    3. Удалить раствор протеиназы К и промыть образцы в течение 2 х 1 мин с ПБСТ.
    4. Для постфикса медузы добавляют 4% PFA в 1x PBS и инкубируют при 37 °C в течение 15 мин.
    5. Удалите раствор PFA и промывайте образцы в течение 2 x 10 минут pBST.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если ген-мишень высоко экспрессируется с низким фоновым сигналом, шаги 3.1.2-3.1.5 могут быть пропущены.
  2. Гибридизация
    1. Удалите PBST и добавьте буфер гибридизации (HB Buffer, таблица 1). Инкубируйте образцы в HB Buffer в течение 15 мин при комнатной температуре (RT). Используйте 300-400 мкл HB Buffer, который обеспечивает достаточный объем для успешной гибридизации.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Hb Buffer, Wash Buffer 1 и Wash Buffer 2 готовятся с 20-кратным запасом SSC. HB Buffer хранится при температуре или ниже −20 °C и должна быть доведена до RT перед использованием.
    2. Удалите буфер HB и добавьте новый HB Buffer. Прегибридировать при 55 °C в течение не менее 2 ч в гибридизационном инкубаторе.
    3. Удалите буфер HB и инкубируйте с HB Buffer, содержащим зонды, которые хранились на этапе 1.9.7 (конечная концентрация зонда: 0,5-1 нг/мкл в HB Buffer). Гибридизируйте при 55 °C в течение 18-24 ч (рис. 2) в гибридизационном инкубаторе.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Интенсивность и специфичность сигнала FISH могут варьироваться в зависимости от экспрессии генов-мишеней, а также длины и специфичности зонда. Для увеличения интенсивности можно регулировать такие параметры, как продолжительность гибридизации (18-72 ч) и температура (50-65 °C), а также тестировать различные зонды. Чтобы избежать неспецифических сигналов, лечение протеиназой К (концентрация и продолжительность) может быть модифицировано19.
  3. Удаление зонда
    1. Удалите буфер HB, содержащий зонды, а затем добавьте буфер очистки 1 (таблица 1). Промывайте образцы с помощью Wash Buffer 1 в течение 2 x 15 мин при 55 °C. Используйте 300-400 мкл промывочного буфера.
      ПРИМЕЧАНИЕ: HB Buffer, содержащие зонды, могут использоваться многократно, примерно до десяти раз. Вместо того, чтобы выбрасывать, храните использованный HB Buffer, содержащий зонды, при температуре или ниже −20 °C. Перед использованием разогрейте Wash Buffer 1, Wash Buffer 2, 2x SSC и PBST при 55 °C.
    2. Удалите буфер стирки 1, а затем добавьте буфер стирки 2 (таблица 1). Промывайте образцы с помощью Wash Buffer 2 в течение 2 x 15 мин при 55 °C.
    3. Удалите Wash Buffer 2, а затем добавьте 2x SSC. Промывайте образцы с 2x SSC в течение 2 x 15 мин при 55 °C.
    4. Удалите 2X SSC, а затем добавьте предварительно нагретый PBST. Промывайте образцы в течение 1 х 15 мин с PBST на RT.
  4. Инкубация антител анти-DIG
    1. Удалите PBST, а затем добавьте 1% блокирующего буфера. Инкубируйте образцы в течение не менее 1 ч при РТ при медленном встряхивании на коромысле.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Приготовьте 1% блокирующего буфера заново, разбавив 5% блокирующего буферного запаса (таблица 1). Проверьте образцы перед следующей реакцией антител, потому что образец имеет тенденцию прилипать к задней части крышки или стенке в результате тряски.
    2. После блокировки удалите 1% блокирующий буфер, добавьте анти-DIG-POD раствор (1:500, в 1% блокирующем буфере) и инкубируйте образцы O.N. при 4 °C (рисунок 2).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, чтобы время инкубации оставалось в течение 12-16 ч, чтобы предотвратить обнаружение неспецифических сигналов.
  5. Обнаружение зонда с маркировкой DIG
    1. Удалите анти-DIG-POD раствор, а затем добавьте буфер Tris-NaCl-Tween (TNT, таблица 1). Промывайте образцы тротилом в течение 3 х 10 мин на RT.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Использование метода усиления тирамидного сигнала (TSA) обеспечивает лучшее разрешение изображения против реагентов, меченных пероксидазой хрена (например, анти-DIG-POD).
    2. Разбавляют флуоресцентный краситель-конъюгированный тирамид (Cy5-тирамид) стоковым раствором (1:50) в буфере амплификационного разбавителя для получения активного раствора Cy5-тирамида (фиг.2).
    3. Удалите как можно больше тротила, а затем добавьте активный раствор Cy5-тирамида. Инкубировать образцы в течение 10 мин в темноте.
    4. Промывайте образцы PBST в течение 3 x 10 мин в темноте.
  6. Обнаружение EdU
    ПРИМЕЧАНИЕ: Комплект EdU обнаруживает встроенные EdU в виде флуоресцентных сигналов (рисунок 2).
    1. Чтобы приготовить коктейль для обнаружения EdU, смешайте компоненты, как показано в таблице 1. Используйте 100 мкл коктейля обнаружения EdU для каждого образца.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Приготовьте 1-кратную реакционную буферную добавку, разбавив 10-кратную добавку реакционного буфера сверхчистой водой.
    2. Удалите PBST, а затем добавьте коктейль обнаружения EdU. Инкубировать в темноте в течение 30 мин.
    3. Мойте с ПБСТ в течение 3 х 10 мин в темноте.
  7. Окрашивание ДНК
    1. Разбавить Hoechst 33342 (1:500) в PBST для приготовления раствора Hoechst. Удалите PBST, а затем добавьте раствор Hoechst. Инкубируйте образцы в течение 30 мин в темноте (рисунок 2).
    2. Промывайте образцы ПБСТ в течение 3-4 х 10 мин в темноте.
  8. Установка
    1. Сделайте банку на стеклянной горке, чтобы предотвратить дробление образца. Нанесите виниловую ленту на стеклянную горку и выдолблите центр.
    2. Переложите медузу в банку на скользящем стекле с помощью передаточной пипетки объемом 3,1 мл с отрезанным наконечником.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, чтобы не позволить щупальцам перекрываться.
    3. Удалите любой PBST с помощью пипетки P200, а затем медленно добавьте 70% глицерина в качестве монтажной среды (рисунок 2).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Вместо 70% глицерина можно использовать антивядающую монтажную среду для предотвращения выцветания флуоресценции.
    4. Аккуратно поместите на медузу щипцами обложку, а боковую часть обшивки заклейте прозрачным лаком для ногтей.
    5. Держите слайды при температуре 4 °C в темноте, если не сразу выполняете микроскопическое наблюдение.
  9. Отображение
    1. Используйте лазерный сканирующий конфокальный микроскоп для получения изображений. Для одноэлементного разрешения используйте 40-кратную масляную линзу или линзу для более высокого увеличения.
    2. После получения изображения откройте изображения с помощью программного обеспечения ImageJ/FIJI и подсчитайте ячейки, которые являются положительными для EdU+ и/или Nanos1+ с помощью многоточечного инструмента20.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Щупальца кладонема были использованы в качестве модели для изучения клеточных процессов морфогенеза и регенерации 15,16,17. Структура щупальца состоит из эпителиальной трубки, где стволовые клетки, или i-клетки, расположены в проксимальной области, называемой колбой щупальца, а новые ветви последовательно добавляются к задней части дистальной области луковицы вдоль адаксиальной стороны (рисунок 3A)15. Предыдущие отчеты указывали, что пролиферация клеток активна как в колбе щупальца, так и в новых местах ветвления с использованием маркировки EdU или BrdU16,17. Однако из-за разрешения гибридизации in situ неясно, являются ли стволовые клетки действительно пролиферативными или нет. Чтобы визуализировать как стволовые, так и пролиферативные клетки одновременно на клеточном уровне, мы выполнили FISH для маркеров стволовых клеток (Nanos1 или Piwi) и маркировку EdU для клеток S-фазы в одних и тех же образцах.

При клеточном разрешении FISH экспрессия Nanos1 локализована на щупальце колбы и новом месте ветвления (рисунок 3B). Piwi также был выражен в лампе щупальца и в новом месте ветвления по схеме, аналогичной Nanos1 (рисунок 3C). Эти результаты соответствовали наблюдениям за гибридизацией in situ в предыдущем отчете17, где почковая ветвь 7-дневной медузы была почти равномерно помечена Nanos1 и Piwi. Чтобы визуализировать начало накопления стволовых клеток, мы наблюдали за новым местом ветвления 5-дневной медузы. Совместная маркировка экспрессии Nanos1 и EdU-положительных клеток выявила пространственную картину стволовых клеток и пролиферативных клеток в щупальце (рисунок 4A). Хотя валовые распределения ячеек EdU+ и Nanos1+ соответствовали предыдущим отчетам16,17, ячейки EdU+ были более широко распространены по всей колбе щупальца, по крайней мере, в начале ветвления, в то время как клетки Nanos1+ накапливались более локально в щупальце колбы и новом месте ветвления (рисунок 4A и рисунок 4E). ). Эти наблюдения свидетельствуют о том, что различные распределения стволовых клеток и пролиферирующих клеток обнаруживаются в зависимости от сроков развития и различных стадий.

Более детальный вид колбы и нового места ветвления показал, что сигналы EdU сливаются с ядерным окрашиванием, тогда как экспрессия Nanos1 ограничена цитоплазмой, окружающей ядро, что согласуется с предыдущим отчетом5 (рисунок 4B, C). Часть (19,79%) клеток продемонстрировала комаркировку EdU и Nanos1 (EdU+ Nanos1+; Рисунок 4B, C, желтые наконечники стрелок и рисунок 4D), предполагая, что эти клетки являются активно пролиферирующей популяцией стволовых клеток. Интересно, что 14,46% клеток оказались EdU+ Nanos1− в середине луковицы и в новом месте ветвления, что свидетельствует о наличии нестебельных пролиферативных клеток (рисунок 4B, C, белые стрелки и рисунок 4D). Напротив, 26,32% клеток были EdU− Nanos1+ в основании луковицы и в новом месте ветвления, что указывает на наличие популяции стволовых клеток, которая либо медленно циклична, либо находится в состоянии покоя, ни одна из которых не обнаруживается пульсовой маркировкой EdU (рисунок 4B, C, желтые стрелки и рисунок 4D).

Figure 1
Рисунок 1: Схема зондового синтеза для гибридизации in situ . Экстракция общей РНК из медуз и синтез кДНК из общей РНК. Nanos1-специфические продукты ПЦР были синтезированы из кДНК. Продукты ПЦР были лигированы в векторы, а амплифицированные векторы были собраны с помощью компетентной клеточной культуры. Продукты ПЦР с сайтами связывания РНК-полимеразы синтезировали с использованием плазмид в качестве шаблонов. Меченые DIG РНК-зонды были синтезированы транскрипцией in vitro . Сокращения: DIG = дигоксигенин. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Схема совместного окрашивания EdU и флуоресцентной гибридизации in situ . Медузы инкубировали со 150 мкМ ЭдУ в течение 1 ч. Впоследствии медузы анестезировали (для расслабления тканей) 7%MgCl2 вH2Oи фиксировали 4% PFA O.N. при 4 °C. После фиксации образцы гибридизировали с HB Buffer с зондом в течение 20-24 ч при 55 °C. После реакции гибридизации образцы промывали и инкубировали анти-DIG-POD раствором O.N. при 4 °C. Медузы окрашивали раствором Cy5-тирамида в течение 10 мин с последующим обнаружением EdU в течение 30 мин и окрашиванием Hoechst 33342 в течение 30 мин. После завершения всех процессов окрашивания медузы монтировались на стеклянную горку, а изображения получались с помощью конфокального микроскопа. Сокращения: EdU = 5-этинил-2'-дезоксиуридин; FISH = флуоресцентная гибридизация in situ ; PFA = параформальдегид; O.N. = ночь; HB = гибридизация. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Паттерны экспрессии Nanos1 и Piwi на проксимальной адаксиальной стороне щупальца Cladonema medusa. (A) Схема Cladonema medusa и щупальца. Адаксиальная сторона щупальца: колба щупальца (самая близкая область) с новыми ветвями, последовательно образующимися на новом участке ветвления. Вставка (пунктирная квадрат) указывает на область, захваченную конфокальным изображением. (B) ИЗОБРАЖЕНИЯ FISH экспрессии гена Nanos1 с проксимальной, адаксиальной стороны щупальца 7-дневной Cladonema medusa. (C) ИЗОБРАЖЕНИЯ FISH экспрессии гена Piwi с проксимальной, адаксиальной стороны щупальца 7-дневной Cladonema medusa. ДНК: зеленый, Nanos1: пурпурный. B'-C' только для изображений Nanos1 FISH. Шкала стержней = 100 мкм (B,C). Аббревиатура: FISH = флуоресцентная гибридизация in situ. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4: Паттерны экспрессии EdU и Nanos1 на проксимальной, адаксиальной стороне щупальца Cladonema medusa. (A-C) Изображения проксимальной адаксиальной стороны щупальца Cladonema medusa, меченого совместно с экспрессией Nanos1 и EdU; Использовались 5-дневные медузы. (A) Обзор щупальца. Желтыми пунктирными квадратами обозначены области B и C. (B) Увеличение щупальца колбы. (C) Увеличение нового места ветвления. Желтые наконечники стрелок указывают на клетки, которые являются положительными как для EdU, так и для Nanos1. Желтые стрелки указывают на клетки, которые являются положительными только для Nanos1. Белые стрелки указывают только на положительные ячейки для EdU. Панели A-C представляют собой объединенные изображения для ДНК (синий), EdU (зеленый) и Nanos1 (пурпурный). A'-C' - это панели только для изображений EdU; A''-C'' предназначены только для изображений Nanos1 FISH. Шкала стержней = 100 мкм (A), 50 мкм (B, C). (D) Количественная оценка ЭдУ- и/или Nanos1-положительных клеток в базальной стороне щупальца (площадь количественной оценки = 30,10мкм2 квадрата, n = 6, всего 249 клеток). EdU+ Nanos1− ячейки, 14,46%; Ячейки EdU+ Nanos1+, 19,79%; Ячейки EdU− Nanos1+, 26,32%; EdU− Nanos1− ячейки, 39,44%. (E) Схема щупальца Cladonema medusa с адаксиальной стороны. Общее распределение клеток EdU+ и Nanos1+ показано в E и E' соответственно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Таблица 1: Состав различных реакций ПЦР и буферов в данном протоколе. Чтобы рассчитать объем продукта ПЦР (X мкл) в реакции лигирования, см. примечание после этапа протокола 1.4. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Пролиферирующие клетки и стволовые клетки являются важными клеточными источниками в различных процессах, таких как морфогенез, рост и регенерация21,22. В данной статье описывается способ совместного окрашивания маркера стволовых клеток Nanos1 с помощью маркировки FISH и EdU в Cladonema medusae. Предыдущая работа с использованием маркировки EdU или BrdU предполагала, что пролиферативные клетки локализуются в щупальце луковиц16,17, но их молекулярные характеристики были неясны. Настоящее исследование показывает одновременное определение распределения пролиферативных клеток и локализации стволовых клеток Nanos1+ (рисунок 4). Результаты показали, что некоторые пролиферативные клетки экспрессировали Nanos1, но другие клетки были отмечены только EdU и не экспрессировали Nanos1, предполагая существование гетерогенности стволовых клеток или, потенциально, других пролиферативных клеток. Будет интересно проанализировать подробное распределение стволовых клеток во время различных процессов в Cladonema, включая ветвление щупальца, гомеостаз тканей, регенерацию органов и поддержание зародышевых клеток.

Основным узким местом для визуализации стволовых клеток у животных является первоначальная идентификация маркеров стволовых клеток. У книдариев маркеры стволовых клеток не были идентифицированы в негидрозоанах3, и, таким образом, на данном этапе прямое применение FISH для маркеров стволовых клеток остается ограниченным гидрозоанами. Тем не менее, FISH позволяет обнаруживать специфическую экспрессию генов на клеточном уровне, и, таким образом, изменяя зонды, этот метод может быть расширен для наблюдения пространственных паттернов экспрессии любых генов, представляющих интерес в деталях. Например, используя маркеры клеток-предшественников и дифференцированных клеток, мы можем проверить распределение конкретных типов клеток в щупальцах Cladonema. В качестве предостережения, настоящий протокол, возможно, придется модифицировать в зависимости от генов, представляющих интерес, из-за различий в уровнях экспрессии и стабильности мРНК. В частности, неспецифические сигналы и слабые сигналы являются общими проблемами, связанными с FISH. Изменение времени и температуры гибридизации с использованием отбеливающих реагентов (формамид или метанол) и корректировка других параметров (время реакции TSA, обработка протеиназой К, промывка после гибридизации) могут дать более четкие сигналы и меньшее количество неспецифических сигналов23,24. Также важно выбрать протокол FISH, соответствующий используемой модели животного происхождения, поскольку один протокол FISH может быть неприменим к другим видам, даже в пределах того же таксона 7,25,26.

Маркировка EdU обычно используется для обнаружения пролиферативных клеток, но может быть использована для различных экспериментальных целей путем изменения концентрации и времени инкубации27. Чтобы обнаружить пролиферирующие клетки, важно определить успешную продолжительность и концентрацию для включения EdU. В пульсовой маркировке, используемой в этой работе, были отмечены только пролиферативные клетки, которые прошли через S-фазу в течение короткого периода времени, и аналогичные короткие методы инкубации были использованы для обнаружения пролиферирующих клеток у других книдарий 6,28,29. Напротив, комбинация длительной инкорпорации EdU и Nanos1 FISH может выявить наличие медленно циклических или покоящихся стволовых клеток27. Также можно отметить не только пролиферативные клетки, но и эндоцициклирующие клетки, которые подверглись синтезу ДНК без деления. Кроме того, отслеживая клетки, меченые EdU, в течение более длительного времени, мы можем определить клеточную способность к миграции и дифференцировке, связанную с пролиферативными клетками и их клеточной линией 6,30.

В то время как комбинация окрашивания FISH и EdU или BrdU была использована 7,31, метод, установленный здесь, может быть легко применен к другим морским беспозвоночным и немодельным животным, включая различные виды медуз. Окрашивание EdU является более простым и чувствительным, чем окрашивание BrdU18, и благодаря его короткому времени инкубации оно позволяет обнаруживать пролиферирующие клетки, в отличие от предыдущего исследования, в котором использовался EdU для долгосрочной маркировки клеток7. В последние годы, с развитием технологий секвенирования следующего поколения, информация о геноме и экспрессии генов стала доступной для многих видов. Идентификация стволовых клеток и пролиферативных клеток будет по-прежнему эффективным подходом к пониманию гетерогенности и разнообразия стволовых клеток и дает представление о клеточной динамике, лежащей в основе различных биологических явлений.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

У авторов нет конфликта интересов для раскрытия.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана AMED под номером гранта JP22gm6110025 (к Y.N.) и грантом JSPS KAKENHI No 22H02762 (к Y.N.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Mercaptoethanol  Wako 137-06862
3.1 mL transfer pipette Thermo Scientific 233-20S
5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-Gal) Wako 029-15043
anti-DIG-POD Roche 11207733910
Cladonema pacificum Nanos1 forward primer 5’-AAGAGACACAGTCATTATCAAGC
GA-3’
Cladonema pacificum Nanos1 reverse primer 5’-CGACGTGTCCAATTTTACGTGCT -3’
Cladonema pacificum Piwi forward primer 5’- AAAAGAGCAGCGGCCAGAAAGA
AGGC -3’
Cladonema pacificum Piwi reverse primer 5’- GCGGGTCGCATACTTGTTGGTA
CTGGC -3’
Click-iT EdU Cell Proliferation Kit for Imaging, Alexa Fluor 488 dye Invitrogen  C10337 EdU kit
Coroline off GEX Co. ltd N/A chlorine neutralizer
DIG Nucleic Acid Detection Kit Blocking Reagent Roche 11175041910 blocking buffer 
DIG RNA labeling mix  Roche 11277073910
DTT  Promega P117B
ECOS competent cell DH5α NIPPON GENE 316-06233 competent cell
Fast gene Gel/PCR Extraction kit Fast gene FG-91302 gel extraction kit
Fast gene plasmid mini kit Fast gene FG-90502 plasmid miniprep
Formamide Wako  068-00426
Heparin sodium salt from porcine SIGMA-ALDRICH  H3393-10KU
Isopropyl-β-D(-)-thiogalactopyranoside (IPTG) Wako 096-05143
LB Agar Invitrogen 22700-025 agar plate
LB Broth Base Invitrogen 12780-052 LB medium
Maleic acid Wako 134-00495
mini Quick spin RNA columns Roche 11814427001 clean-up column
NaCl Wako  191-01665
NanoDrop OneC Microvolume UV-Vis Spectrophotometer with Wi-Fi Thermo Scientific ND-ONEC-W spectrophotometer
Polyoxyethlene (20) Sorbitan Monolaurate (Tween-20) Wako  166-21115
PowerMasher 2 nippi  891300 homogenizer
Proteinase K Nacarai Tesque  29442-14
RNase Inhibitor TaKaRa 2313A
RNeasy Mini kit Qiagen  74004 total RNA isolation kit
RQ1 RNase-Free Dnase Promega M6101
Saline Sodium Citrate Buffer 20x powder (20x SSC) TaKaRa T9172
SEA LIFE Marin Tech N/A mixture of mineral salts
T3 RNA polymerase  Roche 11031163001
T7 RNA polymerase  Roche 10881767001
TAITEC HB-100 TAITEC 0040534-000 Hybridization incuvator
TaKaRa Ex Taq  TaKaRa RR001A Taq DNA polymerase
TaKaRa PrimeScript 2 1st strand cDNA Synthesis Kit TaKaRa 6210A cDNA synthesis kit
Target Clone TOYOBO  TAK101 pTA2 Vector
tRNA Roche 10109541001
TSA Plus Cyanine 5 AKOYA Biosciences NEL745001KT tyramide signal amplification (TSA) technique
Zeiss LSM 880 ZEISS N/A laser scanning confocal microscope

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Leclère, L., Röttinger, E. Diversity of cnidarian muscles: Function, anatomy, development and regeneration. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 157 (2017).
  2. Bosch, T. C. G., et al. Back to the basics: Cnidarians start to fire. Trends in Neurosciences. 40 (2), 92-105 (2017).
  3. Gold, D. A., Jacobs, D. K. Stem cell dynamics in Cnidaria: Are there unifying principles. Development Genes and Evolution. 223 (1-2), 53-66 (2013).
  4. Technau, U., Steele, R. E. Evolutionary crossroads in developmental biology: Cnidaria. Development. 138 (8), 1447-1458 (2011).
  5. Leclère, L., et al. Maternally localized germ plasm mRNAs and germ cell/stem cell formation in the cnidarian Clytia. Developmental Biology. 364 (2), 236-248 (2012).
  6. Bradshaw, B., Thompson, K., Frank, U. Distinct mechanisms underlie oral vs aboral regeneration in the cnidarian Hydractinia echinata. eLife. 4, 05506 (2015).
  7. Sinigaglia, C., et al. Pattern regulation in a regenerating jellyfish. eLife. 9, 54868 (2020).
  8. David, C. N. Interstitial stem cells in Hydra: Multipotency and decision-making. The International Journal of Developmental Biology. 56 (6-7-8), 489-497 (2012).
  9. Röttinger, E. Nematostella vectensis, an emerging model for deciphering the molecular and cellular mechanisms underlying whole-body regeneration. Cells. 10 (10), 2692 (2021).
  10. Houliston, E., Momose, T., Manuel, M. Clytia hemisphaerica: A jellyfish cousin joins the laboratory. Trends in Genetics. 26 (4), 159-167 (2010).
  11. Peron, S., Houliston, E., Leclère, L. The Marine Jellyfish Model, Clytia hemisphaerica. Handbook of Marine Model Organisms in Experimental Biology. Boutet, A., Shierwater, B. , CRC Press. Boca. Raton, FL. 129-147 (2021).
  12. Denker, E., Manuel, M., Leclère, L., Le Guyader, H., Rabet, N. Ordered progression of nematogenesis from stem cells through differentiation stages in the tentacle bulb of Clytia hemisphaerica (Hydrozoa, Cnidaria). Developmental Biology. 315 (1), 99-113 (2008).
  13. Fujita, S., Kuranaga, E., Nakajima, Y. Regeneration potential of jellyfish: Cellular mechanisms and molecular insights. Genes. 12 (5), 758 (2021).
  14. Suga, H., et al. Flexibly deployed Pax genes in eye development at the early evolution of animals demonstrated by studies on a hydrozoan jellyfish. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (32), 14263-14268 (2010).
  15. Fujiki, A. Branching pattern and morphogenesis of medusa tentacles in the jellyfish Cladonema pacificum (Hydrozoa, Cnidaria). Zoological Letters. 5 (12), 13 (2019).
  16. Fujita, S., Kuranaga, E., Nakajima, Y. Cell proliferation controls body size growth, tentacle morphogenesis, and regeneration in hydrozoan jellyfish Cladonema pacificum. PeerJ. 7, 7579 (2019).
  17. Hou, S., Zhu, J., Shibata, S., Nakamoto, A., Kumano, G. Repetitive accumulation of interstitial cells generates the branched structure of Cladonema medusa tentacles. Development. 148 (23), (2021).
  18. Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (7), 2415-2420 (2008).
  19. Angerer, L. M., Angerer, R. C. Detection of poly A + RNA in sea urchin eggs and embryos by quantitative in situ hybridization. Nucleic Acids Research. 9 (12), 2819-2840 (1981).
  20. Rakotomamonjy, J., Guemez-Gamboa, A. Purkinje cell survival in organotypic cerebellar slice cultures. Journal of Visualized Experiments. (154), e60353 (2019).
  21. Tanaka, E. M., Reddien, P. W. The cellular basis for animal regeneration. Developmental Cell. 21 (1), 172-185 (2011).
  22. Penzo-Méndez, A. I., Stanger, B. Z. Organ-size regulation in mammals. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (9), 019240 (2015).
  23. Sinigaglia, C., Thiel, D., Hejnol, A., Houliston, E., Leclère, L. A safer, urea-based in situ hybridization method improves detection of gene expression in diverse animal species. Developmental Biology. 434 (1), 15-23 (2018).
  24. King, R. S., Newmark, P. A. In situ hybridization protocol for enhanced detection of gene expression in the planarian Schmidtea mediterranea. BMC Developmental Biology. 13 (1), 8 (2013).
  25. Flici, H., et al. An evolutionarily conserved SoxB-Hdac2 crosstalk regulates neurogenesis in a cnidarian. Cell Reports. 18 (6), 1395-1409 (2017).
  26. He, S., et al. An axial Hox code controls tissue segmentation and body patterning in Nematostella vectensis. Science. 361 (6409), 1377-1380 (2018).
  27. Govindasamy, N., Murthy, S., Ghanekar, Y. Slow-cycling stem cells in hydra contribute to head regeneration. Biology Open. 3 (12), 1236-1244 (2014).
  28. Passamaneck, Y. J., Martindale, M. Q. Cell proliferation is necessary for the regeneration of oral structures in the anthozoan cnidarian Nematostella vectensis. BMC Developmental Biology. 12 (1), 34 (2012).
  29. Gold, D. A., et al. Structural and developmental disparity in the tentacles of the moon jellyfish Aurelia sp.1. PLoS One. 10 (8), 0134741 (2015).
  30. Gold, D. A., Nakanishi, N., Hensley, N. M., Hartenstein, V., Jacobs, D. K. Cell tracking supports secondary gastrulation in the moon jellyfish Aurelia. Development Genes and Evolution. 226 (6), 383-387 (2016).
  31. Cheng, L. -C., Alvarado, A. S. Whole-mount BrdU staining with fluorescence in situ hybridization in planarians. Planarian Regeneration. 1774, 423-434 (2018).

Tags

Биология развития выпуск 186 FISH EdU медуза медуза Cladonema pacificum стволовые клетки пролиферация клеток
Флуоресцентная гибридизация <em>in situ</em> и маркировка 5-этинил-2'-дезоксиуридина для стволовых клеток в гидрозоанской <em>медузе Cladonema pacificum</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fujita, S., Kuranaga, E., Miura, M., … More

Fujita, S., Kuranaga, E., Miura, M., Nakajima, Y. i. Fluorescent In Situ Hybridization and 5-Ethynyl-2'-Deoxyuridine Labeling for Stem-Like Cells in the Hydrozoan Jellyfish Cladonema pacificum. J. Vis. Exp. (186), e64285, doi:10.3791/64285 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter