Summary
여기에서는 비강 자가 조립 나노에멀젼 종양 백신의 시험 관 내 및 생체 내 비강 내 진단 및 평가를 위한 자세한 방법을 제시 합니다.
Abstract
에피토프 펩타이드는 안전성, 높은 특이성 및 편리한 생산으로 인해 종양 백신 분야에서 광범위한 관심을 끌었습니다. 특히, 일부 MHC I-제한 에피토프는 종양 세포를 소거하기 위해 효과적인 세포독성 T 림프구 활성을 유도할 수 있다. 또한, 비강 투여는 편의성과 향상된 환자 순응도로 인해 종양 백신에 대한 효과적이고 안전한 전달 기술입니다. 그러나, 에피토프 펩티드는 이들의 면역원성이 낮고 전달 효율이 부족하기 때문에 비강 전달에 적합하지 않다. 나노 에멀젼 (NE)은 항원을 적재하고 비강 점막 표면으로 직접 전달할 수있는 열역학적으로 안정한 시스템입니다. IKVAV(Ile-Lys-Val-Ala-Val)는 인간 호흡기 상피 세포에서 발현되는 인테그린 결합 펩타이드인 라미닌의 핵심 펜타펩타이드입니다. 본 연구에서는 합성 펩타이드 IKVAV-OVA257-264 (I-OVA )를 함유하는 비강내 자가조립 펩타이드 NE 종양 백신을 저에너지 유화법으로 제조하였다. IKVAV와 OVA257-264 의 조합은 비강 점막 상피 세포에 의한 항원 흡수를 향상시킬 수 있습니다. 여기에서 우리는 투과 전자 현미경 (TEM), 원자력 현미경 (AFM) 및 동적 광 산란 (DLS)에 의한 물리 화학적 특성을 연구하는 프로토콜을 수립합니다. 뮤신 단백질의 존재 하에서의 안정성; BEAS-2B 세포와 C57BL/6 마우스의 비강 및 폐 조직의 세포 생존율을 조사하여 독성; 공초점 레이저 스캐닝 현미경(CLSM)에 의한 세포 흡수; 생체 내에서 작은 동물을 이미징하여 프로파일을 방출합니다. E.G7 종양 보유 모델을 사용하여 백신의 보호 및 치료 효과. 우리는 이 프로토콜이 새로운 T 세포 에피토프 펩타이드 점막 백신의 미래 개발을 위한 기술적, 이론적 단서를 제공할 것으로 기대합니다.
Introduction
가장 중요한 공중 보건 혁신 중 하나인 백신은 전 세계적인 인간 질병 부담과 싸우는 데 핵심적인 역할을 합니다1. 예를 들어, 현재 COVID-19 질병에 대한 120개 이상의 후보 백신이 테스트되고 있으며 그 중 일부는 많은 국가에서 승인되었습니다2. 최근 보고에 따르면 암 백신은 암 환자의 면역체계가 항원을 체내에 이물질로 인식하도록 지시하기 때문에 임상 암 치료의 진행을 효과적으로 개선했다고한다 3. 더욱이, 종양 세포 내부 또는 외부에 위치한 다중 T 세포 에피토프는 펩티드 백신을 설계하는 데 사용될 수 있으며, 이는 방사선 요법 및 화학 요법과 관련된 상당한 독성이 없기 때문에 전이성 암 치료에 이점을 보여주었습니다 4,5. 1990년대 중반 이래로 종양 치료를 위한 전임상 및 임상 시험이 주로 항원 펩티드 백신을 사용하여 수행되었으나 암 환자에게 적절한 치료 효과를 나타내는 백신은 거의 없다6. 또한, 펩타이드 에피토프를 이용한 암 백신은 면역원성이 낮고 전달 효율이 불충분한데, 이는 투여 부위에서 빠르게 확산되는 세포외 펩타이드의 급속한 분해로 인해 면역세포에 의한 항원 흡수가 불충분하기 때문일 수 있다7. 따라서 백신 전달 기술로 이러한 장애물을 극복할 필요가 있다.
융합 단백질로서 발현되는 MHC 클래스 I-결합 257-264 에피토프인 OVA257-264는 빈번하게 사용되는 모델 에피토프8이다. 또한, OVA257-264는 세포독성 T 림프구 (CTL) 반응에 의존하는 종양에 대한 적응 면역 반응에 결정적이다. OVA257-264 펩타이드에 의해 유도되는 종양의 항원 특이적 CD8+ T 세포에 의해 매개됩니다. 이는 세포독성 T 세포에 의해 방출되는 불충분한 그랜자임 B가 특징이며, 표적 세포의 세포자멸사를 유발한다8. 그러나 유리 OVA257-264 펩티드 투여는 이러한 항원의 흡수가 항원 제시 세포(APC)가 아닌 비특이적 세포에서 발생하기 때문에 CTL 활성을 거의 유도하지 않을 수 있습니다. 적절한 면역 자극의 결핍은 CTL 활성을 초래한다5. 그러므로, 효과적인 CTL 활성의 유도는 상당한 진전을 요구한다.
상피 세포에 의해 제공되는 장벽과 점액의 지속적인 분비로 인해 백신 항원은 비강 점액에서 빠르게 제거됩니다 9,10. 점막 조직을 통과할 수 있는 효율적인 백신 벡터를 개발하는 것은 항원 제시 세포가 점막 상피 아래에 위치하기 때문에 매우 중요합니다9. 백신의 비강 주사는 이론적으로 점막 감염과 싸우기 위해 점막 면역을 유도한다11. 또한, 비강 전달은 편리함, 장내 투여 회피, 환자 순응도 향상 7로 인해 효과적이고 안전한 백신 투여 방법이다. 그러므로, 비강 전달은 신규한 펩타이드 에피토프 나노백신에 대한 좋은 투여 수단이다.
세포-조직 및 세포-세포 상호 작용의 에피토프를 결합하기 위해 여러 합성 생체 재료가 고안되었습니다. Ile-Lys-Val-Ala-Val (IKVAV)과 같은 특정 생리활성 단백질이 하이드로겔 구조의 일부로 도입되어 생체 활성을 부여한다12. 이 펩타이드는 세포 부착, 이동 및 성장에 기여할 가능성이 높으며13 인테그린α 3β1 및 α6β1에 결합하여 다른 암세포 유형과 상호 작용합니다. IKVAV는 라미닌 기저막 단백질α 1 사슬에서 유래한 세포 접착 펩타이드로, 원래 신경 미세 환경을 모델링하고 신경 분화를 유발하는 데 사용되었습니다14. 따라서 이 새로운 백신에 대한 효율적인 전달 수단을 찾는 것이 질병 통제에 중요합니다.
W805EC 및 MF59와 같이 최근에 보고된 에멀젼 시스템도 불활화 인플루엔자 백신 또는 재조합 B형 간염 표면 항원의 비강 전달을 위해 합성되었으며 점막 및 전신 면역을 모두 유발하는 것으로 설명되었다15. 나노에멀젼(NEs)은 미립자 점막 전달 시스템에 비해 투여가 용이하고 효과적인 보조제와의 편리한 공형성의 장점이 있다16. 나노에멀젼 백신은 기존의 탈감작과는 다른 지속적인 방식으로 알레르기 표현형을 변화시켜 장기적인 억제 효과를 가져오는 것으로 보고되었다17. 다른 연구에서는 MTB 특이적 면역우성 항원과 결합된 나노에멀젼이 강력한 점막 세포 반응을 유도하고 상당한 보호를 제공할 수 있다고 보고했다18. 따라서, 합성 펩타이드 IKVAV-OVA257-264(I-OVA ,OVA 257-264에 결합된 IKVAV로 구성된 펩타이드)를 이용한 신규한 비강내 자가조립 나노백신을 설계하였다. 이 새로운 나노백신을 체계적으로 평가하는 것이 중요합니다.
이 프로토콜의 목적은 나노백신의 물리화학적 특성, 독성, 안정성을 체계적으로 평가하고, 기술적 수단을 이용하여 항원 흡수 및 보호 및 치료 효과가 향상되는지 여부를 검출하고, 주요 실험 내용을 정교화하는 것이다. 이 연구에서 우리는 물리화학적 특성과 안정성을 연구하고, CCK-8에 의한 BEAS-2B 세포에 대한 I-OVA NE의 독성 크기를 결정하고, 공초점 현미경을 사용하여 백신에 대한 BEAS-2B 세포의 항원 제시 능력을 관찰하고, 이 새로운 나노백신의 생체 내 및 시험관 내 방출 프로파일을 평가하기 위한 일련의 프로토콜을 수립했습니다, 종양 보유 마우스 모델을 사용하여 E.G7-OVA 백신의 보호 및 치료 효과를 검출합니다.
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Protocol
동물 실험은 실험동물-동물복지 윤리적 검토 지침(GB/T 35892-2018)에 따라 수행되었으며 제3군의과대학 실험동물복지윤리위원회의 승인을 받았습니다. 마우스는 1% 펜토바르비탈 나트륨 100mg/kg을 복강내 주사하여 안락사시켰다.
1. I-OVA NE의 제조
- 1mg의 모노포스포릴 지질 A(MPLA)를 100μL의 DMSO와 혼합하고 5분 동안 와동시킨 다음 실온(RT)에서 4시간 동안 방치하여 완전히 용해시킵니다.
- Tween 80 및 I-OVA를 정량적으로 추가하고 혼합합니다.
참고: 트윈 80과 I-OVA는 25:119의 질량비로 혼합되었습니다. - 1.2 단계에서 준비한 혼합물에 스쿠알렌을 첨가합니다 (7 : 3, Smix : 스쿠알렌).
- 1.3단계에서 제조한 혼합물에 100μL의 MPLA 용액(10mg/mL)을 추가합니다.
- 저에너지 유화법을 이용하여 나노에멀젼 백신을 제조한다19: 혼합용액을 전체 부피의 약 70%의 물방울에 첨가하고 부드럽게 저어주어 투명하고 쉽게 유동하는 혼합물을 얻는다.
참고: BNE 대조군(블랭크 에멀젼)은 물을 I-OVA로 대체하여 동일한 방법으로 제조되었습니다.
2. 물리화학적 특성화 및 안정성
참고: 2.1-2.3단계에 따라 I-OVA NE 백신의 액적 크기 분포, 제타 전위 및 기타 물리화학적 데이터를 평가합니다. 2.4-2.7 단계에 따라 I-OVA NE 백신의 형태 학적 특성 분석을 수행한다. 2.8-2.9단계에 따라 I-OVA NE 백신의 3D 구조를 검사합니다.
- 점액 단백질 50mg과 주사용 물 100mL를 혼합하여 0.05% 점액 용액을 제조합니다.
- 4 mg/mL I-OVA NE 200배를 0.05 mg/mL 뮤신 단백질 또는 탈이온수로 희석합니다.
- 나노분석기(19)를 사용하여 25°C에서 입자 크기, 제타 전위, 다분산 지수(PDI) 및 전기영동 이동도를 관찰합니다.
- 10 μL의 I-OVA NE 200배를 2 mL의 탈이온수로 희석합니다.
- 미리 희석된 I-OVA NE 백신 5μL(단계 2.4)를 탄소 코팅된 구리 그리드에 놓고 10μL의 1% 포스포텅스텐산으로 3분 동안 덮습니다.
- 여과지로 과도한 포스 포 텅스텐 산을 제거하십시오.
- TEM을 사용하여 이미지를 가져옵니다. 100 메쉬 탄소 구리 그리드에 50 배 희석 된 10 μL 샘플을 놓고 실온 (RT)에서 5 분 동안 방치 한 후 10 μL의 포스 포 텅스텐 산 (1 %, pH 7.4)을 첨가하십시오. 120 kV의 전압에서 TEM으로 모든 샘플을 검사합니다.
- 고분해능 원자력 현미경을 사용하여 I-OVA NE의 분자 형태를 특성화합니다. 다음 조건에서 I-OVA NE의 컬러 이미지를 얻습니다 : 텅스텐 프로브 용 (힘 상수 : 0.06 N · m-1); 스캔 범위: 450 nm x 450 nm; 태핑 모드: 이미징 모드; 및 스캐닝 방법: RT에서 포인트별 스캐닝.
3. 시험관 내 및 생체 내 독성 분석
참고: I-OVA NE 백신의 체외 독성은 3.1-3.9 단계에 따라 평가되었고, I-OVA NE 백신의 생체 내 독성은 3.10-3.13 단계에 따라 평가되었습니다.
- 단계 3.1.1-3.1.4에 따라 인간 BEAS-2B 상피 세포를 소생시키고, 5%CO2 인큐베이터에서 37°C의 완전 성장 배지에서 이들을 배양한다.
참고: 완전한 성장 배지를 준비하려면 태아 소 혈청(FBS)과 페니실린/스트렙토마이신을 각각 10% 및 1%의 최종 농도로 RPMI-1640 배지에 추가합니다.- 수조를 켜고 온도를 37 °C로 조절합니다. 액체 질소에 동결된 세포 바이알을 제거하고 37°C 수조에서 빠르게 해동합니다.
- 해동 후, 세포를 15mL 멸균 원심분리기 튜브에 빠르게 피펫팅하고, 완전한 성장 배지 2mL를 추가하고, 129 x g 에서 5분 동안 원심분리합니다.
- 상층액을 제거하고, 완전한 성장 배지 2mL를 첨가하여 세포를 재현탁하고, 129 x g에서 5분 동안 원심분리한다.
- 상층액을 제거하고, 6 mL의 완전 성장 배지를 첨가하여 세포를 재현탁하고, 세포를 T25 배양 플라스크에 옮겨 5%CO2 배양기에서 37°C에서 세포를 배양하였다.
- 세포 밀도가 80%-90%에 도달하면 배양액을 버리고 2mL의 PBS로 세포를 두 번 세척합니다. 0.25% 트립신 1mL를 넣어 1-2분 동안 세포를 소화합니다. 세포의 반올림이 관찰되면 즉시 완전한 성장 배지 4mL를 첨가하여 트립신을 중화합니다.
- 샘플을 15mL 멸균 원심분리기 튜브에 넣고 129 x g 에서 5분 동안 원심분리기로 혼합하고 흡인합니다.
- 상층액을 제거하고 RPMI-1640 완전 배지 1mL에 세포를 재현탁합니다. 세포 계수에 20μL를 사용하고 세포를 1 x 105 cells/mL로 희석합니다.
- BEAS-2B 세포를 RPMI-100 완전 배지 100μL의 96웰 플레이트에서 1 x 104 세포/웰의 밀도로 플레이트하고 5%CO2 인큐베이터에서 37°C에서 24시간 동안 플레이트를 사전 배양합니다.
- 상층액을 버리고 I-OVA NE 100μL, I-OVA+BNE(물리적 혼합) 100μL, I-OVA 100μL를 다양한 최종 농도(0.5mg/mL, 1mg/mL, 2mg/mL, 4mg/mL, 8mg/mL)로 완전 성장 배지로 미리 희석하고 BNE를 대조군으로 사용합니다. 37°C에서 24시간 동안 배양한다.
참고: 음성 대조군에 100μL의 완전 성장 배지를 추가하고 양성 대조군에 100μL의 세포 현탁액(1 x 105/mL)을 추가합니다. - 배지를 제거하고 90 μL의 완전 성장 배지와 10 μL의 CCK-8 용액을 플레이트의 각 웰에 추가합니다.
- 플레이트를 5%CO2 인큐베이터에서 37°C에서 2시간 동안 인큐베이션한다.
- 효소 표지 플레이트 리더를 사용하여 450nm에서 각 웰의 흡광도를 측정합니다.
- 다음 방정식에 표시된 대로 BEAS-2B 세포의 생존율을 계산합니다.
(OD450 샘플 - OD450 음성 대조군 / OD450 양성 대조군 - OD450 음성 대조군) × 100% - 6주령 C57BL/6 마우스를 무작위로 5개 그룹(각 그룹에서 n = 5)으로 나누고 유도를 위해 4% 이소플루란으로 마취합니다. 2 % 이소 플루 란으로 마취를 유지하십시오. 건조를 예방하기 위해 생쥐의 눈에 네오 마이신 설페이트 연고를 사용하십시오.
- 10μL 피펫 팁을 사용하여 3일 동안 4mg/mL의 I-OVA, I-OVA+bne 및 IOVA NE의 10μL/콧구멍으로 마우스의 비강 면역을 수행합니다. BNE 및 PBS를 실험 대조군으로 사용합니다.
알림: 동물이 마취에서 회복될 때까지 열 지원을 제공하십시오. - 4일째에 100mg/kg 1% 펜토바르비탈 나트륨을 복강내 주사하여 모든 마우스를 안락사시킵니다.
- 가위로 약 3mm 두께의 비강 조직 샘플을 자르고 폐 조직을 제거합니다.
- 비강 조직과 전체 폐 조직을 4 % 파라 포름 알데히드에 24 시간 동안 고정시킵니다. 일련의 알코올과 크실렌 구배를 통해 조직을 탈수시킨 다음 파라핀에 삽입합니다. 완성 된 왁스 블록을 파라핀 슬라이서에서 4 μm 두께로 자릅니다.
- 헤마톡실린과 에오신(H&E)으로 절편을 얼룩지게 합니다. 그런 다음 비강 점막 및 폐 조직의 충혈, 부종, 호중구 침윤 및 구조적 손상을 포함한 점막 독성을 현미경(100x 및 200x)으로 관찰합니다7.
4. 체외 세포 흡수
- BEAS-2B 세포를 완전한 성장 배지 2mL에 커버슬립이 있는 12웰 플레이트에서 5 x 10 5 세포/웰의 밀도로 플레이트하고5 %CO2 인큐베이터에서 37°C에서 밤새 플레이트를 예비 배양합니다.
- 900μL의 세포 현탁액에 100μL의 FITC 표지 I-OVA NE(순도: 98.3%, 회사에서 생산, 4mg/mL) 또는 I-OVA(4mg/mL)를 추가하고 37°C에서 90분 동안 둡니다.
참고: 4.1단계에서 설명한 대로 FITC 라벨이 붙은 I-OVA NE를 준비합니다. 대조군에 1mL의 완전 성장 배지를 추가합니다. - 처리 후 37°C에서 30분 동안 0.1M PBS(1mL/well)로 3회 세척한다.
- 이 샘플을 어둠 속에서 20분 동안 4% 파라포름알데히드로 고정합니다. 고정 후 파라포름알데히드를 제거하고 37°C에서 30분 동안 0.1M PBS(1mL/웰)로 3회 세척한다.
- 시료를 DAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole)로 최종 농도 10μg/mL로 암실에서 10분간 예비배양한 후 0.1M PBS(1mL/well)로 5회 세척 후 37°C에서 30분간 처리한다.
- 다음 매개변수 설정을 사용하여 CLSM에 의한 세포 흡수를 얻습니다: 프레임 크기: 512 px x 512 px, 스캔 속도: 8; 라인 스텝 : 1; 평균: 2.
5. 생체 내 방출
- 누드 마우스를 4% 이소플루란 가스로 마취시키고 2% 이소플루란에서 마취를 유지합니다. 각 콧구멍에서 4mg/mL의 PE 표지 I-OVA 10μL 또는 4mg/mL의 PE 표지 I-OVA NE로 누드 마우스를 비강 내 면역합니다.
- 0시간, 0.5시간, 1.5시간, 3시간, 6시간, 9시간, 12시간 및 24시간에서 IVIS 시스템에 의해 마취 하에 있는 모든 마우스를 포획합니다.
- 비강내 투여 직전에 백그라운드 스캔을 수행하여 역치(최소 = 1.06 x 10:6)를 제공하여 모든 시점에서 수집된 이미지를 조정합니다.
- Living Image 소프트웨어를 클릭하여 시퀀스를 시작하고 초기화를 클릭하여 IVIS 시스템을 초기화합니다.
- 초기화되면 IVIS 수집 제어판의 온도 상태 표시등이 빨간색으로 바뀝니다. 온도 상태 표시등이 녹색으로 바뀌면 이미징을 수행할 수 있습니다.
- 이미징 마법사를 클릭한 다음 나타나는 대화 상자에서 형광을 선택합니다.
- 다음 매개변수를 조정합니다: 노출 시간: 자동 초, 비닝: 8, F/정지: 2, 시야: D.
- 620nm 여기 필터와 670nm 방출 필터를 선택합니다. Acquire Sequence(시퀀스 획득)를 클릭하여 이미지를 획득합니다.
- Living Image 소프트웨어를 사용하여 모든 마우스의 라이브 이미지와 방사도 데이터를 처리합니다.
- 그림을 얻은 후 도구 팔레트에서 ROI 도구를 클릭하고 원을 선택한 다음 ROI 원을 만듭니다.
- ROI 측정을 클릭하여 ROI 영역에 대한 정량적 값을 얻습니다.
6. 생체 내 항종양 효능
- 2.1.1-2.1.4 단계에 따라 EL4로부터의 마우스 림프종 E.G7-OVA 세포를 완전 성장 배지로 상쾌하게 배양한다.
참고: E.G7-OVA 세포 완전 성장 배지를 준비하려면 RPMI 1640 배지를 1.5g/L 중탄산나트륨, 4.5g/L 포도당, 10mM HEPES 및 1.0mM 피루브산나트륨을 포함하도록 조정된 2mM L-글루타민과 혼합하고 0.05mM 2-메르캅토에탄올 및 0.4mg/mL G418, 90% 및 소 태아 혈청, 10%. - 세포가 1 x 106 cells/mL와 1 x 107 cells/mL 사이의 밀도에 도달하면 1:2의 비율로 세포를 계대 배양합니다.
- 단계 6.3.1-6.3.4에 설명된 대로 마우스에 대한 예방적 보호 효과를 평가합니다.
- 6주령 C57BL/6 마우스를 무작위로 5개 그룹으로 나눕니다(각 그룹에서 n = 8). 누드 마우스를 4% 이소플루란 가스로 마취시키고 2% 이소플루란으로 마취를 유지합니다. 건조를 방지하기 위해 생쥐의 눈에 뒷머리와 네오 마이신 설페이트 연고를 부분적으로 면도하십시오.
- 각 콧구멍에 1mg/mL I-OVA, BNE+I-OVA 또는 I-OVA NE 10μL, BNE(PBS로 4회 희석) 또는 PBS 대조군으로 마우스를 비강 내 면역화합니다.
- 최종 면역화 후 7일째에 모든 마우스를 5 x 105 E. G7-OVA 세포로 우측 등에 피하 주사한다.
- 최종 면역화 후 0, 6, 9, 12, 15 및 18일에 디지털 캘리퍼를 사용하여 종양의 2축을 측정하여 종양 부피를 모니터링하고 마우스의 30일(최종 면역화 후) 생존을 기록합니다.
- 단계 6.4.1-6.4.3에 기재된 바와 같이 E.G7-OVA 세포를 접종한 후 마우스에 대한 치료 보호 효과를 평가하였다. 마우스의 그룹화 및 취급에 대해서는 6.3.1 단계를 참조하십시오.
- 0일째에 C57BL/6 마우스를 E.G7-OVA 세포(5 x 105 세포/마우스)로 오른쪽 등에 피하 주사합니다.
- 주사 후 0, 7 및 14일째에 I-OVA, BNE+I-OVA, I-OVA NE(모두 1mg/mL 농도), BNE 또는 PBS 10μL로 비강 내 면역화된 모든 마우스를 각 콧구멍에 3회 면역시킵니다.
- 주사 후 0, 6, 9, 12, 15 및 18 일째에 종양 부피를 모니터링하고 마우스의 30 일 생존을 기록하십시오.
참고: 종양 부피가 3,000mm3를 초과하는 경우 인도적인 이유로 마우스를 안락사시켜야 하며 이러한 마우스는 생존 곡선에서 죽은 것으로 간주됩니다. 종양 부피는 다음 방정식에 표시된 바와 같이 변형된 타원체 공식에 의해 계산됩니다.
부피 = π/6 x L x W2
여기서 L은 종양 길이를 나타내고, W는 종양 폭을 나타낸다(길이 단위: mm, 부피 단위: mm3).
7. 통계 분석
- 일원 분산 분석, Tukey의 다중 비교 또는 스튜던트 t-검정과 함께 적절한 통계 소프트웨어를 사용하여 여러 그룹 간의 데이터 차이를 분석합니다. Kaplan-Meier 방법을 사용하여 생존 결과를 추정하고 그룹을 로그 순위 통계량과 비교합니다. 모든 결과를 평균 ± SD로 표현합니다. P 값 P < 0.05, P < 0.01 및 P < 0.001 의 유의성은 플롯에서 각각 *, ** 및 ***를 사용하여 표시됩니다.
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Representative Results
상기 프로토콜에 따라, 비강 종양 나노백신 전달에 대한 in vitro 및 in vivo 실험 평가를 완료하였다. TEM, AFM 및 DLS는 나노백신의 표면 제타 전위와 입자 크기의 기본 특성을 평가하는 효과적인 수단입니다(그림 1). BEAS-2B 상피 세포는 비강 백신의 시험 관 내 독성 시험 에 유용한 스크리닝 모델입니다(그림 2A). H & E로 염색 된 현미경 사진은 I-OVA NE가 조직 손상, 출혈 또는 염증 세포 침윤을 포함한 명백한 점막 독성이 없음을 보여줍니다 (그림 2B). 비강 내 BEAS-2B 세포에 의한 항원의 효율적인 흡수는 후속 면역 반응을 유도하기 위한 항원 제시를 위한 전제 조건입니다(그림 3). IVIS 시스템은 시험관 내에서 I-OVA NE의 서방 효과를 밝히는 데 도움이 되며, 이 나노백신이 빠른 방출을 지연시키고 비강 영역의 시간을 연장하며 세포에서 펩타이드 흡수를 개선할 수 있음을 시사합니다(그림 4). 예방적 보호 모델 및 치료적 보호 모델은 I-OVA NE 백신의 보호 효과와 종양 성장을 억제하고 마우스의 평균 생존 시간을 연장하는 I-OVA NE 백신의 능력을 직접적으로 반영합니다(그림 5). 위의 실험 결과는 Yang et al.7에 의해 발표되었습니다.
그림 1: I-OVA NE의 물리적 특성 및 안정성 (A) 투과 전자 현미경 사진(TEM), 스케일 바 = 100nm. (B) 원자력 현미경(AFM) 현미경 사진. X축과 Y축의 총 길이는 모두 450nm입니다. (C) 크기, 직경 및 분포. (D) Nano ZS를 사용하여 수행된 I-OVA NE 분석의 제타 전위 및 분포. (E) 입자 크기, (F) 다분산 지수, (G) 제타 전위 및 (H) Nano ZS를 사용하여 수행된 점액 안정성 분석에서 I-OVA NE의 전기영동 이동도. 이 수치는 Yang et al.7의 허가를 받아 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: I-OVA NE의 시험관 내 및 생체 내 독성 . (A) 24시간 동안 I-OVA, BNE+I-OVA 및 I-OVA NE의 다양한 펩타이드 농도에 노출된 배양에서 BEAS-2B 세포의 상대적 생존율. BNE를 대조군으로 사용했습니다. 데이터는 평균 ± SD(n=3)로 표현된다. (B) 챌린지 후 5시간 후에 고정된 코 점막 및 폐 조직의 병리학적 부분에 대한 현미경 검사. 이미지는 100x 및 200x 배율로 캡처되었습니다. 이 수치는 Yang et al.7의 허가를 받아 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: I-OVA NE. I-OVA 또는 I-OVA NE로 1시간 동안 처리된 BEAS-2B 세포의 시험관 내 공초점 형광 이미징. PBS를 대조군으로 사용하였고, I-OVA를 FITC(녹색 형광)로 표지하고, 핵을 DAPI(청색 형광)(scale bar = 50 μm)로 염색하였다. 이 수치는 Yang et al.7의 허가를 받아 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: I-OVA NE의 시험관 내 방출. (A) 마우스 비강에서 PE 표지 I-OVA의 생체 내 형광 이미징. I-OVA 또는 I-OVA NE의 비강 투여 후 0시간, 0.5시간, 1.5시간, 3시간, 6시간, 9시간, 12시간 및 24시간에 기록된 상대 형광 강도. (B) 형광 강도의 정량화. 데이터는 평균 ± SD(n=5)로 표현된다. *: P < 0.05; **: 피<0.01; 및 ***: P < 0.001. 이 수치는 Yang et al.7의 허가를 받아 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 5: I-OVA NE의 생체내 항종양 효능 . (A) 예방적 보호 모델에서 백신접종된 마우스의 평균 종양 성장 곡선. (B) 예방적 보호 모델에서 백신접종된 마우스의 퍼센트 생존율. (c) 치료적 보호 모델에서 백신접종된 마우스의 평균 종양 성장 곡선. (d) 치료적 보호 모델에서 백신접종된 마우스의 퍼센트 생존율. *: P < 0.05; **: P < 0.01; 및 ***: P < 0.001. 이 수치는 Yang et al.7의 허가를 받아 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
면역세포막으로 기능화된 나노백신은 질병 표적 치료에 큰 이점이 있으며, 독특한 종양 친화성, 특정 표적 식별, 순환 연장, 세포간 상호작용 강화, 낮은 전신 독성 등의 특성으로 부작용이 최소화됩니다. 또한 다른 치료 모듈과 쉽게 통합되어 암을 협력적으로 치료할 수 있습니다16,20. 바람직한 속성은 측정, 모양 및 전하와 같은 물리적 및 화학적 특성을 제어하여 얻을 수 있습니다. 따라서 나노백신은 광범위한 응용 분야에서 중요해지고 있다21. 이러한 특성은 흡수 및 독성에 관한 주요 결정 요인이며, 나노 백신은 조작에 의해서만 무독성이 될 수 있다22. 따라서 모양, 크기 및 전하를 포함한 물리화학적 특성을 연구하기 위한 이 프로토콜은 매우 중요합니다. TEM은 수년 동안 과학계에서 널리 사용되어 온 고정밀 기기입니다23. 나노 구조 물질의 특성을 이해하고 그 거동을 조작하는 데 필수적인 도구가 되었습니다. 또한, 원자력 현미경(AFM)은 생물학적 샘플(24)의 나노기계적 특성화를 위한 강력한 기술로 부상했다. 고해상도 3D 및 나노 스케일 정보를 제공하는 동시에 원자 수준에서 표면 세부 사항을 분석할 수 있습니다. 입자 크기 분포의 변화를 결정하는 것 외에도 DLS는 크기와 전하를 모두 측정하여 용액25에서 나노 입자의 응집 상태에 대한 정보를 제공할 수 있습니다.
높은 제타 전위값은 콜로이드 현탁액의 양호한 안정성을 위해 필수적이라고 보고되었다26. 이 연구에서 우리는 이러한 프로토콜을 사용하여 TEM, AFM 및 DLS를 사용한 나노백신의 물리화학적 특성을 평가했습니다. 또한, 코 점막의 표면에는 윤활, 수분 및 화학적 보호 장벽을 제공하는 많은 양의 점액이 포함되어 있습니다. 이는 점액과 일부 항원 또는 전달 시스템 간의 상호 작용으로 인해 항원 또는 전달 시스템의 축적 및 "포획"과 그에 따른 제거로 인해 전달 효율이 크게 감소할 수 있습니다7. 나노 백신의 안정성이 비강 투여에 필수적이라는 것은 잘 알려져 있습니다. 따라서 Nano ZS를 사용하여 0.5% 뮤신 단백질로 처리한 후 입자 크기, 다분산 지수, 제타 전위 및 전기 영동 이동성을 포함한 일련의 안정성 매개변수를 결정했습니다.
생체 내 조직 적합성 및 시험관 내 세포 생존율 분석은 이 새로운 나노백신이 시험된 농도27의 범위에서 무독성임을 보여주었습니다. 인간 정상 기관지 상피 세포(BEAS-2B) 세포는 인간 호흡기 연구에 사용되는 표준 세포주이다28. 저렴한 비용, 신속성 및 최소한의 윤리적 문제로 인해 체외 독성 평가는 중요한 방법입니다. 본 연구에서, 시험관내 세포 생존율 분석은 CCK8 분석에 의해 결정되었다. 또한, 생체 내 독성 평가는 일반적으로 마우스 및 랫트와 같은 동물 모델에서 수행됩니다. 조직병리학적 검사는 종종 심장, 눈, 뇌, 간, 신장, 폐 및 비장과 같은 나노입자에 노출된 조직에서 수행된다29. 따라서 우리는 시험관 내 및 생체 내에서 이 새로운 나노백신의 독성을 평가하기 위해 이러한 방법을 사용했습니다.
항원 흡수 및 연장은 후속 면역 반응을 유발하기 위한 항원 제출을 위한 전제 조건이다30. BEAS-2B의 세포 흡수와 새로운 나노 백신의 생체 내 및 시험관 내 방출 프로파일을 결정할 필요가 있습니다. CLSM은 대부분의 이미징 실험실에서 찾을 수 있으며 광범위한 응용 분야를 가지고 있는 관련 기술의 가장 일반적인 상업적 구현입니다. 이 기기는 널리 사용되며 비교적 사용하기 쉽습니다. 그러나 일반적으로 정량적 데이터 수집에는 최적이 아닙니다.
우리의 프로토콜에서 CLSM은 명확한 해상도, 광학 절편 기능 및 3D 이미징31의 다양성으로 인해 세포 흡수를 감지했습니다. 또한, IVIS는 생체 내 및 시험관 내에서 정량적 생체 발광 및 형광 이미징을 위해 외부 광이 배제된 이미징 챔버를 제공할 수 있기 때문에 새로운 나노물질의 생체 내 방출 프로파일을 얻기 위해 사용되었다. 따라서 이 프로토콜에서 우리는 이러한 방법을 사용하여 생체 내 및 시험관 내에서 새로운 나노백신의 세포 흡수 및 방출 프로파일을 결정했습니다.
새로운 나노 백신의 종양 효능을 평가하는 것도 중요합니다. 본 연구에서는 E.G7 종양 보유 모델을 사용하여 백신의 치료 및 보호 효과를 결정했습니다. EL4 세포는 고급 악성 종양을 가진 C57BL/6 마우스의 T 림프구에서 유래합니다. E.G7 세포는 전기천공에 의해 형질감염된 EL4 림프종 세포로부터 유래된다32. 우리의 연구에서,이 나노 백신은 E.G7-OVA 종양을 가진 마우스에서 보호 면역을 유도했다. 요약하면, 시험 관 내 및 생체 내에서 나노 백신의 물리 화학적 특성, 안정성, 독성, 방출 프로파일, 세포 흡수 및 항 종양 효과를 연구하기위한 일련의 프로토콜을 수립 할 필요가있다. 이러한 프로토콜은 새로운 비강 나노백신에 유용한 결과를 제공할 것입니다.
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Disclosures
저자는 이 논문에 보고된 작업에 영향을 미칠 수 있는 경쟁적인 재정적 이해관계나 개인적인 관계가 없다고 선언합니다.
Acknowledgments
본 연구는 중국 국가자연과학재단 프로그램 제31670938호, 제32070924 32000651호, 충칭 자연과학재단 프로젝트 프로그램 제2014jcyjA0107호 및 제2019jcyjA-msxmx0159호, 육군 의과대학 특별사업 제2020XBK24호 및 제2020XBK26호, 대학생을 위한 국가혁신 및 기업가정신 프로그램 제202090031021호와 제202090031035호의 지원을 받았다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well plates | Corning Incorporated, USA | CLS3922 | |
| Bio-Rad 6.0 microplate reader | Bio-Rad Laboratories Incorporated Limited Co., CA, USA | Bio-Rad 6.0 | |
| CCK-8 kits | Dojindo, Japan | CK04 | |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf, Germany | 5811000398 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | D9542 | |
| fetal bovine serum (FBS) | Hyclone (Life Technology, USA) | SH30088.03 | |
| FITC-labeled I-OVA | Shanghai Botai Biotechnology Co., Ltd. |
NA | |
| HF 90/240 Incubator | Heal Force, Switzerland | NA | |
| HPLC | Shanghai Botai Biotechology Co., Ltd. | E2695 | |
| Inverted Microscope | Nikon,Japan | DSZ5000X | |
| IPC-208 | Chong Qing University, China | NA | |
| IVIS system | Caliper Life Science Limited Company | NA | |
| JEM-1230 TEM | JEOL Limited Company of Japan | 1230 TEM | |
| Malvern NANO ZS | Malvern Instruments Ltd., UK | NA | |
| MPLA | Invivogen Lit. Co. |
tlrl-mpla | |
| Neomycin Sulfate Ointment | Shanghai CP General Pharmaceutical Co. , Ltd. | H31022262 | |
| OVA257–264 | Shanghai Botai Biotechnology Co., Ltd. |
NA | |
| RPMI 1640 medium | Hyclone (Life Technology, USA) | SH30809.01 | |
| Synthetic peptide (I-OVA) conjugation of IKVAV-PA | Shanghai Botai Biotechnology Co., Ltd. |
NA | |
| Zeiss LSM800 laser scanning confocal fluorescence microscope | Zeiss, Germany | Zeiss LSM800 |
References
- Sung, H., et al. Global cancer statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 71 (3), 209-249 (2021).
- Mohammed, I., et al. The efficacy and effectiveness of the COVID-19 vaccines in reducing infection, severity, hospitalization, and mortality: A systematic review. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 18 (1), 2027160 (2022).
- Tsung, K., Norton, J. A. In situ vaccine, immunological memory and cancer cure. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 12 (1), 117-119 (2016).
- Abd-Aziz, N., Poh, C. L., Ding, X. Development of peptide-based vaccines for cancer. Journal of Oncology. 2022, 9749363 (2022).
- Mochizuki, S., et al. Immunization with antigenic peptides complexed with beta-glucan induces potent cytotoxic T-lymphocyte activity in combination with CpG-ODNs. Journal of Controlled Release. 220, 495-502 (2015).
- Kalita, P., Tripathi, T. Methodological advances in the design of peptide-based vaccines. Drug Discovery Today. 27 (5), 1367-1380 (2022).
- Yang, Y., et al. A novel self-assembled epitope peptide nanoemulsion vaccine targeting nasal mucosal epithelial cell for reinvigorating CD8(+) T cell immune activity and inhibiting tumor progression. International Journal of Biological Macromolecules. 183, 1891-1902 (2021).
- Ren, Y., et al. OVA-specific CD8+ T cells do not express granzyme B during anterior chamber associated immune deviation. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 244 (10), 1315-1321 (2006).
- Suzuki, K., et al. Preparation of hyaluronic acid-coated polymeric micelles for nasal vaccine delivery. Biomaterials Science. 10 (8), 1920-1928 (2022).
- Georas, S. N., Rezaee, F. Epithelial barrier function: at the front line of asthma immunology and allergic airway inflammation. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 134 (3), 509-520 (2014).
- Lam, J. Y., et al. A nasal omicron vaccine booster elicits potent neutralizing antibody response against emerging SARS-CoV-2 variants. Emerging Microbes & Infections. 11 (1), 964-967 (2022).
- Chai, Y., et al. Improved functional recovery of rat transected spinal cord by peptide-grafted PNIPAM based hydrogel. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 210, 112220 (2022).
- Paiva Dos Santos, B., et al. Production, purification and characterization of an elastin-like polypeptide containing the Ile-Lys-Val-Ala-Val (IKVAV) peptide for tissue engineering applications. Journal of Biotechnology. 298, 35-44 (2019).
- Okur, A. C., Erkoc, P., Kizilel, S. Targeting cancer cells via tumor-homing peptide CREKA functional PEG nanoparticles. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 147, 191-200 (2016).
- Makidon, P. E., et al. Pre-clinical evaluation of a novel nanoemulsion-based hepatitis B mucosal vaccine. PLoS One. 3 (8), 2954 (2008).
- Lin, X., et al. Oil-in-ionic liquid nanoemulsion-based intranasal delivery system for influenza split-virus vaccine. Journal of Controlled Release. 346, 380-391 (2022).
- O'Konek, J. J., et al. Intranasal nanoemulsion vaccine confers long-lasting immunomodulation and sustained unresponsiveness in a murine model of milk allergy. Allergy. 75 (4), 872-881 (2020).
- Ahmed, M., et al. A novel nanoemulsion vaccine induces mucosal Interleukin-17 responses and confers protection upon Mycobacterium tuberculosis challenge in mice. Vaccine. 35 (37), 4983-4989 (2017).
- Sun, H., et al. Induction of systemic and mucosal immunity against methicillin-resistant Staphylococcus aureus infection by a novel nanoemulsion adjuvant vaccine. International Journal of Nanomedicine. 10, 7275-7290 (2015).
- Chen, C., et al. Tumor-associated-macrophage-membrane-coated nanoparticles for improved photodynamic immunotherapy. Nano Letters. 21 (13), 5522-5531 (2021).
- Prasanna, P., et al. Current status of nanoscale drug delivery and the future of nano-vaccine development for leishmaniasis - A review. Biomedicine & Pharmacotherapy. 141, 111920 (2021).
- George, S., et al. Surface defects on plate-shaped silver nanoparticles contribute to its hazard potential in a fish gill cell line and zebrafish embryos. ACS Nano. 6 (5), 3745-3759 (2012).
- Jafari Eskandari, M., Gostariani, R., Asadi Asadabad, M. Transmission Electron Microscopy of Nanomaterials. Electron Crystallography. Singh, D., Condurache-Bota, S. , IntechOpen. London, UK. (2020).
- Kontomaris, S. V., Stylianou, A., Malamou, A. Atomic force microscopy nanoindentation method on collagen fibrils. Materials. 15 (7), 2477 (2022).
- Zielinska, A., et al. Polymeric nanoparticles: Production, characterization, toxicology and ecotoxicology. Molecules. 25 (16), 3731 (2020).
- Doncom, K. E. B., Blackman, L. D., Wright, D. B., Gibson, M. I., O'Reilly, R. K. Dispersity effects in polymer self-assemblies: A matter of hierarchical control. Chemical Society Reviews. 46 (14), 4119-4134 (2017).
- Pei, M., Li, H., Zhu, Y., Lu, J., Zhang, C. In vitro evidence of oncofetal antigen and TLR-9 agonist co-delivery by alginate nanovaccines for liver cancer immunotherapy. Biomaterials Science. 10 (11), 2865-2876 (2022).
- Zhang, J., et al. Titanium dioxide nanoparticles induced reactive oxygen species (ROS) related changes of metabolomics signatures in human normal bronchial epithelial (BEAS-2B) cells. Toxicology and Applied Pharmacology. 444, 116020 (2022).
- Kumar, V., Sharma, N., Maitra, S. S. In vitro and in vivo toxicity assessment of nanoparticles. International Nano Letters. 7 (4), 243-256 (2017).
- Tong, Y. N., et al. An immunopotentiator, ophiopogonin D, encapsulated in a nanoemulsion as a robust adjuvant to improve vaccine efficacy. Acta Biomaterialia. 77, 255-267 (2018).
- Elliott, A. D. Confocal microscopy: Principles and modern practices. Current Protocols in Cytometry. 92 (1), 68 (2020).
- Huang, Y., Zou, Y., Lin, L., Zheng, R. Ginsenoside Rg1 activates dendritic cells and acts as a vaccine adjuvant inducing protective cellular responses against lymphomas. DNA and Cell Biology. 36 (12), 1168-1177 (2017).
