Waiting
Login-Verarbeitung ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

विट्रो और विवो में नाक स्व-इकट्ठे नैनोइमल्शन ट्यूमर वैक्सीन की तैयारी, विशेषताएं, विषाक्तता और प्रभावकारिता मूल्यांकन

Published: September 28, 2022 doi: 10.3791/64299
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1National Engineering Research Centre of Immunological Products, Department of Microbiology and Biochemical Pharmacy, College of Pharmacy, Third Military Medical University of Chinese PLA

Summary

यहां, हम विट्रो और विवो में नाक स्व-इकट्ठे नैनोइमल्शन ट्यूमर वैक्सीन की तैयारी और मूल्यांकन के लिए विस्तृत तरीके प्रस्तुत करते हैं।

Abstract

एपिटोप पेप्टाइड्स ने अपनी सुरक्षा, उच्च विशिष्टता और सुविधाजनक उत्पादन के कारण ट्यूमर टीकों के क्षेत्र में व्यापक ध्यान आकर्षित किया है; विशेष रूप से, कुछ एमएचसी आई-प्रतिबंधित एपिटोप ट्यूमर कोशिकाओं को साफ करने के लिए प्रभावी साइटोटॉक्सिक टी लिम्फोसाइट गतिविधि को प्रेरित कर सकते हैं। इसके अतिरिक्त, नाक प्रशासन अपनी सुविधा और बेहतर रोगी अनुपालन के कारण ट्यूमर टीकों के लिए एक प्रभावी और सुरक्षित वितरण तकनीक है। हालांकि, एपिटोप पेप्टाइड्स उनकी खराब इम्युनोजेनेसिटी और प्रसव दक्षता की कमी के कारण नाक वितरण के लिए अनुपयुक्त हैं। नैनोइमल्शन (एनई) थर्मोडायनामिक रूप से स्थिर प्रणालियां हैं जिन्हें एंटीजन के साथ लोड किया जा सकता है और सीधे नाक की श्लैष्मिक सतह पर पहुंचाया जा सकता है। Ile-Lys-Val-Ala-Val (IKVAV) लैमिनिन का कोर पेंटापेप्टाइड है, जो मानव श्वसन उपकला कोशिकाओं द्वारा व्यक्त एक इंटीग्रिन-बाइंडिंग पेप्टाइड है। इस अध्ययन में, सिंथेटिक पेप्टाइड आईकेवीएवी-ओवीए257-264 (आई-ओवीए) युक्त एक इंट्रानेसल स्व-इकट्ठे एपिटोप पेप्टाइड एनई ट्यूमर वैक्सीन को कम ऊर्जा पायसीकरण विधि द्वारा तैयार किया गया था। आईकेवीएवी और ओवीए257-264 का संयोजन नाक म्यूकोसल उपकला कोशिकाओं द्वारा एंटीजन अपटेक को बढ़ा सकता है। यहां, हम ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (टीईएम), परमाणु बल माइक्रोस्कोपी (एएफएम), और गतिशील प्रकाश प्रकीर्णन (डीएलएस) द्वारा भौतिक रासायनिक विशेषताओं का अध्ययन करने के लिए एक प्रोटोकॉल स्थापित करते हैं; म्यूसिन प्रोटीन की उपस्थिति में स्थिरता; बीईएएस -2 बी कोशिकाओं और सी 57बीएल / 6 चूहों के नाक और फेफड़ों के ऊतकों की कोशिका व्यवहार्यता की जांच करके विषाक्तता; कॉन्फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी (सीएलएसएम) द्वारा सेलुलर अपटेक; विवो में छोटे जानवरों की इमेजिंग द्वारा प्रोफाइल जारी करें; और ई.जी.7 ट्यूमर-असर मॉडल का उपयोग करके वैक्सीन का सुरक्षात्मक और चिकित्सीय प्रभाव। हम उम्मीद करते हैं कि प्रोटोकॉल नोवेल टी सेल एपिटोप पेप्टाइड म्यूकोसल टीकों के भविष्य के विकास के लिए तकनीकी और सैद्धांतिक सुराग प्रदान करेगा।

Introduction

सबसे महत्वपूर्ण सार्वजनिक स्वास्थ्य नवाचारों में से एक के रूप में, टीकेमानव रोग के वैश्विक बोझ से लड़ने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। उदाहरण के लिए, वर्तमान में, कोविड-19 रोगों के लिए 120 से अधिक उम्मीदवार टीकों का परीक्षण किया जा रहा है, जिनमें से कुछ कोकई देशों में अनुमोदित किया गया है। हाल की रिपोर्टों में कहा गया है कि कैंसर के टीकों ने नैदानिक कैंसर उपचार की प्रगति में प्रभावी ढंग से सुधार किया है क्योंकि वे कैंसर रोगियों की प्रतिरक्षा प्रणालीको शरीर के लिए विदेशी के रूप में एंटीजन को पहचानने के लिए निर्देशित करते हैं। इसके अलावा, ट्यूमर कोशिकाओं के अंदर या बाहर स्थित कई टी सेल एपिटोप्स का उपयोग पेप्टाइड टीकों को डिजाइन करने के लिए किया जा सकता है, जिन्होंने रेडियोथेरेपी और कीमोथेरेपी 4,5 से जुड़े महत्वपूर्ण विषाक्तता की कमी के कारण मेटास्टैटिक कैंसर के उपचार में फायदे दिखाए हैं। 1990 के दशक के मध्य से, ट्यूमर उपचार के लिए प्रीक्लिनिकल और नैदानिक परीक्षण मुख्य रूप से एंटीजन पेप्टाइड टीकों का उपयोग करके आयोजित किए गए हैं, लेकिन कुछ टीकेकैंसर रोगियों पर पर्याप्त चिकित्सीय प्रभाव प्रदर्शित करते हैं। इसके अलावा, पेप्टाइड एपिटोप्स के साथ कैंसर के टीकों में खराब इम्युनोजेनेसिटी और अपर्याप्त वितरण दक्षता होती है, जो बाह्य पेप्टाइड्स के तेजी से क्षरण के कारण हो सकती है जो प्रशासन की साइट से तेजी से फैलती है, जिससेप्रतिरक्षा कोशिकाओं द्वारा अपर्याप्त एंटीजन अपटेक होता है। इसलिए वैक्सीन डिलीवरी तकनीक से इन बाधाओं को दूर करना जरूरी है।

ओवीए 257-264, एमएचसी वर्ग I-बाइंडिंग257-264 एपिटोप को संलयन प्रोटीन के रूप में व्यक्त किया जाता है, एक अक्सर इस्तेमाल किया जाने वाला मॉडल एपिटोप8 है। इसके अलावा, ओवीए257-264 ट्यूमर के खिलाफ अनुकूली प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के लिए महत्वपूर्ण है, जो साइटोटोक्सिक टी लिम्फोसाइट (सीटीएल) प्रतिक्रिया पर निर्भर करता है। यह ट्यूमर में एंटीजन-विशिष्ट सीडी 8 + टी कोशिकाओं द्वारा मध्यस्थ है, जो ओवीए257-264 पेप्टाइड द्वारा प्रेरित होते हैं। यह अपर्याप्त ग्रैनजाइम बी की विशेषता है, जो साइटोटोक्सिक टी कोशिकाओं द्वारा जारी किया जाता है, जिससे लक्ष्य कोशिकाओं8 के एपोप्टोसिस होते हैं। हालांकि, मुक्त ओवीए257-264 पेप्टाइड प्रशासन कम सीटीएल गतिविधि को प्रेरित कर सकता है क्योंकि इन एंटीजन का उत्थान एंटीजन-प्रेजेंटिंग कोशिकाओं (एपीसी) के बजाय निरर्थक कोशिकाओं में होता है। उचित प्रतिरक्षा उत्तेजना की कमी के परिणामस्वरूप सीटीएल गतिविधि5 होती है। इसलिए, प्रभावोत्पादक सीटीएल गतिविधि का प्रेरण काफी प्रगति की मांग करता है।

उपकला कोशिकाओं द्वारा प्रदान की गई बाधा और बलगम के निरंतर स्राव के कारण, वैक्सीन एंटीजन नाक श्लेष्म 9,10 से तेजी से हटा दिए जाते हैं। एक कुशल वैक्सीन वेक्टर विकसित करना जो म्यूकोसल ऊतक से गुजर सकता है, महत्वपूर्ण है क्योंकि एंटीजन-प्रेजेंटिंग कोशिकाएं म्यूकोसल एपिथेलियम9 के नीचे स्थित हैं। टीकों का इंट्रानेजल इंजेक्शन सैद्धांतिक रूप से म्यूकोसलसंक्रमण से लड़ने के लिए म्यूकोसल प्रतिरक्षा को प्रेरित करता है। इसके अलावा, नाक वितरण इसकी सुविधा, आंतों के प्रशासन से बचने और बेहतर रोगी अनुपालन के कारण टीकों के लिए एक प्रभावी और सुरक्षित प्रशासन विधिहै। इसलिए, नोवेल पेप्टाइड एपिटोप नैनोवैक्सीन के लिए नाक वितरण प्रशासन का एक अच्छा साधन है।

सेल-ऊतक और सेल-सेल इंटरैक्शन के एपिटोप्स को संयोजित करने के लिए कई सिंथेटिक बायोमैटेरियल्स तैयार किए गए हैं। कुछ बायोएक्टिव प्रोटीन, जैसे कि इले-लिस-वैल-अला-वैल (आईकेवीएवी), को बायोएक्टिविटीप्रदान करने के लिए हाइड्रोगेल की संरचना के हिस्से के रूप में पेश किया गया है। यह पेप्टाइड संभवतः सेल अटैचमेंट, माइग्रेशन और आउटग्रोथ13 में योगदान देता है और विभिन्न कैंसर सेल प्रकारों के साथ बातचीत करने के लिए इंटीग्रिन α 3 : 1 और α6 : 1 को बांधता है। आईकेवीएवी एक सेल आसंजन पेप्टाइड है जो लैमिनिन बेसमेंट झिल्ली प्रोटीन α1 श्रृंखला से प्राप्त होता है जिसका उपयोग मूल रूप से तंत्रिका माइक्रोएन्वायरमेंट को मॉडल करने और न्यूरोनल भेदभाव14 का कारण बनने के लिए किया जाता था। इसलिए, इस नोवेल वैक्सीन के लिए एक कुशल वितरण वाहन खोजना रोग नियंत्रण के लिए महत्वपूर्ण है।

हाल ही में रिपोर्ट किए गए इमल्शन सिस्टम, जैसे कि W805EC और MF59, को निष्क्रिय इन्फ्लूएंजा वैक्सीन या पुनः संयोजक हेपेटाइटिस बी सतह एंटीजन के नाक गुहा वितरण के लिए भी जोड़ा गया है और म्यूकोसल और प्रणालीगत प्रतिरक्षादोनों को ट्रिगर करने के लिए चित्रित किया गया है। नैनोइमल्शन (एनई) में पार्टिकुलेट म्यूकोसलडिलीवरी सिस्टम की तुलना में प्रभावी सहायक दवाओं के साथ आसान प्रशासन और सुविधाजनक सह-गठन के फायदे हैं। नैनोइमल्शन टीकों को पारंपरिक डिसेन्सिटाइजेशन से अलग निरंतर तरीके से एलर्जी फेनोटाइप को बदलने की सूचना दी गई है, जिसके परिणामस्वरूप दीर्घकालिक दमनकारी प्रभावहोते हैं। दूसरों ने बताया कि एमटीबी-विशिष्ट इम्यूनोडोमिनेंट एंटीजन के साथ संयुक्त नैनोइमल्शन शक्तिशाली म्यूकोसल सेल प्रतिक्रियाओं को प्रेरित कर सकते हैं औरमहत्वपूर्ण सुरक्षा प्रदान कर सकते हैं। इसलिए, सिंथेटिक पेप्टाइड आईकेवीएवी-ओवीए 257-264 (आई-ओवीए, ओवीए257-264 से बंधे आईकेवीएवी से युक्त पेप्टाइड) के साथ एक नया इंट्रानेजलस्व-इकट्ठे नैनोवैक्सीन डिजाइन किया गया था। इस नोवेल नैनोवैक्सीन का व्यवस्थित रूप से आकलन करना महत्वपूर्ण है।

इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य नैनोवैक्सीन की भौतिक रासायनिक विशेषताओं, विषाक्तता और स्थिरता का व्यवस्थित रूप से मूल्यांकन करना है, यह पता लगाना है कि क्या एंटीजन अपटेक और सुरक्षात्मक और चिकित्सीय प्रभाव तकनीकी साधनों का उपयोग करके बढ़ाया जाता है, और मुख्य प्रयोगात्मक सामग्री पर विस्तृत है। इस अध्ययन में, हमने भौतिक रासायनिक विशेषताओं और स्थिरता का अध्ययन करने के लिए प्रोटोकॉल की एक श्रृंखला स्थापित की, सीसीके -8 द्वारा आई-ओवीए एनई से बीईएएस -2 बी कोशिकाओं की विषाक्तता के परिमाण का निर्धारण किया, और कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके वैक्सीन के लिए बीईएएस -2 बी कोशिकाओं की एंटीजन-प्रस्तुत करने की क्षमता का निरीक्षण किया, विवो और इन विट्रो में इस नए नैनोवैक्सीन के रिलीज प्रोफाइल का मूल्यांकन किया।और ई.जी7-ओवीए ट्यूमर-असर माउस मॉडल का उपयोग करके इस वैक्सीन के सुरक्षात्मक और चिकित्सीय प्रभाव का पता लगाएं।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

पशु प्रयोगों को पशु कल्याण की नैतिक समीक्षा के लिए प्रयोगशाला पशु-दिशानिर्देश (जीबी / टी 35892-2018) के अनुसार आयोजित किया गया था और तीसरे सैन्य चिकित्सा विश्वविद्यालय की प्रयोगशाला पशु कल्याण और नैतिकता समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था। चूहों को 1% सोडियम पेंटोबार्बिटल के 100 मिलीग्राम / किग्रा के इंट्रापरिटोनियल इंजेक्शन द्वारा इच्छामृत्यु दी गई थी।

1. आई-ओवीए एनई की तैयारी

  1. 1 मिलीग्राम मोनोफॉस्फोराइल लिपिड ए (एमपीएलए) को डीएमएसओ के 100 μL, 5 मिनट के लिए भंवर के साथ मिलाएं, और इसे पूरी तरह से घुलने के लिए कमरे के तापमान (RT) पर 4 घंटे तक खड़े रहने की अनुमति दें।
  2. मात्रात्मक रूप से ट्वीन 80 और आई-ओवीए जोड़ें और मिलाएं।
    नोट: ट्वीन 80 और आई-ओवीए को 25: 119 के द्रव्यमान अनुपात में मिलाया गया था।
  3. चरण 1.2 (7: 3, स्मिक्स: स्क्वालेन) में तैयार मिश्रण में स्क्वालेन जोड़ें।
  4. चरण 1.3 में तैयार मिश्रण में 100 μL MPLA समाधान (10 mg / mL) जोड़ें।
  5. कम ऊर्जा पायसीकरण विधियों का उपयोग करके नैनोइमल्शन वैक्सीन तैयार करें19: कुल मात्रा के लगभग 70% पर पानी की बूंदों में मिश्रित घोल जोड़ें और पारदर्शी और आसानी से बहने वाले मिश्रण को प्राप्त करने के लिए धीरे से हिलाएं।
    नोट: बीएनई नियंत्रण (रिक्त इमल्शन) उसी विधि द्वारा तैयार किया गया था, पानी को आई-ओवीए के साथ बदल दिया गया था।

2. भौतिक रासायनिक लक्षण वर्णन और स्थिरता

नोट: चरण 2.1-2.3 के बाद आई-ओवीए एनई वैक्सीन के बूंद आकार वितरण, जेटा क्षमता और अन्य भौतिक रासायनिक डेटा का आकलन करें; चरण 2.4-2.7 के बाद आई-ओवीए एनई वैक्सीन के रूपात्मक लक्षण वर्णन करें; और चरण 2.8-2.9 के बाद आई-ओवीए एनई वैक्सीन की 3 डी संरचना की जांच करें।

  1. 0.05% म्यूसिन घोल तैयार करने के लिए इंजेक्शन के लिए 100 मिलीलीटर पानी के साथ 50 मिलीग्राम म्यूसिन प्रोटीन मिलाएं।
  2. 0.05 मिलीग्राम/एमएल म्यूसिन प्रोटीन या विआयनीकृत पानी के साथ 4 मिलीग्राम / एमएल आई-ओवीए एनई 200 गुना पतला करें।
  3. नैनोएनालाइजर19 का उपयोग करके 25 डिग्री सेल्सियस पर कण आकार, ज़ेटा क्षमता, पॉलीडिस्पर्सिटी इंडेक्स (पीडीआई), और इलेक्ट्रोफोरेटिक गतिशीलता का निरीक्षण करें।
  4. 2 मिलीलीटर विआयनीकृत पानी के साथ आई-ओवीए एनई के 10 μL को 200 गुना पतला करें।
  5. कार्बन-लेपित कॉपर ग्रिड पर प्रीडाइल्यूटेड आई-ओवीए एनई वैक्सीन (चरण 2.4) के 5 μL रखें, और इसे 3 मिनट के लिए 1% फॉस्फोटुंगस्टिक एसिड के 10 μL के साथ कवर करें।
  6. फिल्टर पेपर के साथ अतिरिक्त फॉस्फोटुंगस्टिक एसिड को हटा दें।
  7. TEM का उपयोग कर छवियाँ प्राप्त करें. 100-जाल कार्बन कॉपर ग्रिड पर 50 बार पतला 10 μL नमूना रखें और इसे 10 μL फॉस्फोटुंगस्टिक एसिड (1%, पीएच 7.4) जोड़ने से पहले 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान (RT) पर खड़े होने की अनुमति दें। 120 केवी के वोल्टेज पर टीईएम द्वारा सभी नमूनों की जांच करें।
  8. उच्च-रिज़ॉल्यूशन परमाणु बल माइक्रोस्कोप का उपयोग करके आई-ओवीए एनई की आणविक आकृति विज्ञान को चिह्नित करें। निम्नलिखित शर्तों के तहत I-OVA NE की रंगीन छवियां प्राप्त करें: टंगस्टन जांच के लिए (बल स्थिरांक: 0.06 N.m-1); स्कैन रेंज: 450 एनएम x 450 एनएम; टैपिंग मोड: इमेजिंग मोड; और स्कैनिंग विधि: आरटी में बिंदु-दर-बिंदु स्कैनिंग।

3. इन विट्रो और विवो विषाक्तता परख

नोट: आई-ओवीए एनई वैक्सीन की इन विट्रो विषाक्तता का मूल्यांकन चरण 3.1-3.9 के बाद किया गया था, और आई-ओवीए एनई वैक्सीन की इनविवो विषाक्तता का मूल्यांकन चरण 3.10-3.13 के बाद किया गया था।

  1. चरण 3.1.1-3.1.4 का पालन करते हुए मानव बीईएएस -2 बी उपकला कोशिकाओं को पुनर्जीवित करें और उन्हें 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर एक पूर्ण विकास माध्यम में कल्चर करें।
    नोट: पूर्ण विकास माध्यम तैयार करने के लिए, भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) और पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन को क्रमशः 10% और 1% की अंतिम सांद्रता पर आरपीएमआई -1640 माध्यम में जोड़ें।
    1. पानी के स्नान को चालू करें और तापमान को 37 डिग्री सेल्सियस तक समायोजित करें। तरल नाइट्रोजन में जमे हुए सेल शीशियों को निकालें और 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में जल्दी से पिघलें।
    2. पिघलने के बाद, जल्दी से कोशिकाओं को 15 एमएल बाँझ सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में पिपेट करें, पूर्ण विकास माध्यम के 2 एमएल जोड़ें, और 5 मिनट के लिए 129 एक्स जी पर सेंट्रीफ्यूज करें।
    3. सतह पर तैरने वाला को हटा दें, कोशिकाओं को फिर से निलंबित करने के लिए पूर्ण विकास माध्यम के 2 मिलीलीटर जोड़ें, और 5 मिनट के लिए 129 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें।
    4. सतह पर तैरने वाले को हटा दें, कोशिकाओं को फिर से निलंबित करने के लिए 6 एमएल पूर्ण विकास माध्यम जोड़ें, और कोशिकाओं को 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को कल्चर करने के लिए टी 25 कल्चर फ्लास्क में स्थानांतरित करें।
  2. जब सेल घनत्व 80% -90% तक पहुंच जाता है, तो संस्कृति माध्यम को त्याग दें और पीबीएस के 2 एमएल के साथ कोशिकाओं को दो बार धोएं। 1-2 मिनट के लिए कोशिकाओं को पचाने के लिए 0.25% ट्रिप्सिन का 1 एमएल जोड़ें। जब कोशिकाओं की राउंडिंग देखी जाती है, तो ट्रिप्सिन को बेअसर करने के लिए तुरंत पूर्ण विकास माध्यम के 4 एमएल जोड़ें।
  3. नमूनों को 15 एमएल बाँझ सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में मिलाएं और 5 मिनट के लिए 129 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें।
  4. सतह पर तैरनेवाला को हटा दें और आरपीएमआई -1640 पूर्ण माध्यम के 1 एमएल में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें। सेल गिनती के लिए 20 μL का उपयोग करें, और कोशिकाओं को 1 x 105 कोशिकाओं / mL तक पतला करें।
  5. आरपीएमआई -1640 पूर्ण माध्यम के 100 μ L में 96-वेल प्लेटों में 1 x 104 कोशिकाओं / कुएं के घनत्व पर बीईएएस -2 बी कोशिकाओं को प्लेट करें और 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए प्लेटों को प्रीक्यूबेट करें।
  6. सतह पर तैरने वाला पदार्थ छोड़ दें, और 100 μL I-OVA NE, 100 μL I-OVA + BNE (शारीरिक रूप से मिश्रित), और I-OVA के 100 μL को विभिन्न अंतिम सांद्रता (0.5 mg/mL, 1 mg/mL, 2 mg/mL, 4 mg/mL, 8 mg/mL) पर पूर्ण विकास माध्यम के साथ एक नियंत्रण के रूप में BNE के साथ जोड़ें। 37 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
    नोट: नकारात्मक नियंत्रण समूहों में पूर्ण विकास माध्यम के 100 μL और सकारात्मक नियंत्रण समूहों में सेल निलंबन के 100 μL (1 x 105 / mL) जोड़ें।
  7. माध्यम को निकालें और प्लेट के प्रत्येक कुएं में 90 μL पूर्ण विकास माध्यम और 10 μL CCK-8 घोल जोड़ें।
  8. 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर2 घंटे के लिए प्लेट को इनक्यूबेट करें।
  9. एंजाइम-लेबल प्लेट रीडर का उपयोग करके 450 एनएम पर प्रत्येक कुएं के अवशोषण को मापें।
  10. निम्नलिखित समीकरण में दर्शाए अनुसार BEAS-2B कोशिकाओं के उत्तरजीविता अनुपात की गणना कीजिए:
    (OD450 नमूना− OD450 नकारात्मक नियंत्रण/OD450 सकारात्मक नियंत्रण−OD450 नकारात्मक नियंत्रण) × 100%
  11. यादृच्छिक रूप से 6 सप्ताह के सी 57बीएल / 6 चूहों को पांच समूहों (प्रत्येक समूह में एन = 5) में विभाजित करें और उन्हें प्रेरण के लिए 4% आइसोफ्लुरेन के साथ एनेस्थेटाइज करें। 2% आइसोफ्लुरेन के साथ संज्ञाहरण बनाए रखें। सूखापन को रोकने के लिए चूहों की आंखों पर नियोमाइसिन सल्फेट मरहम का उपयोग करें।
  12. सभी 3 दिनों के लिए 4 मिलीग्राम / एमएल पर आई-ओवीए, आई-ओवीए + बीएनई और आईओवीए एनई के 10 μL / नथुने के साथ चूहों के नाक टीकाकरण करने के लिए 10 μL पिपेट युक्तियों का उपयोग करें। प्रयोगात्मक नियंत्रण के रूप में BNE और PBS का उपयोग करें।
    नोट: एनेस्थीसिया से जानवर के ठीक होने तक थर्मल सहायता प्रदान करें।
  13. चौथे दिन 100 मिलीग्राम / किग्रा 1% सोडियम पेंटोबार्बिटल के इंट्रापरिटोनियल इंजेक्शन द्वारा सभी चूहों को इच्छामृत्यु दें।
  14. कैंची के साथ नाक के ऊतकों के लगभग 3 मिमी मोटे नमूने काटें, और फेफड़ों के ऊतकों को हटा दें।
  15. नाक के ऊतकों और पूरे फेफड़ों के ऊतकों को 24 घंटे के लिए 4% पैराफॉर्मलडिहाइड में ठीक करें। एक सीरियल अल्कोहल और जाइलीन ढाल के माध्यम से ऊतकों को निर्जलित करें और फिर पैराफिन में एम्बेड करें। तैयार मोम ब्लॉक को पैराफिन स्लाइसर पर 4 μm की मोटाई पर स्लाइस करें।
  16. हेमटोक्सीलिन और ईओसिन (एच एंड ई) के साथ अनुभागों को दाग दें। फिर, एक माइक्रोस्कोप (100x और 200x)7 के तहत नाक के श्लेष्म और फेफड़ों के ऊतकों में हाइपरमिया, एडिमा, न्यूट्रोफिल घुसपैठ और संरचनात्मक क्षति सहित म्यूकोसल विषाक्तता का निरीक्षण करें।

4. इन विट्रो सेलुलर अपटेक

  1. प्लेट BEAS-2B कोशिकाओं को 12-वेल प्लेटों में 5 x 10 5 कोशिकाओं / कुएं के घनत्व पर पूर्ण विकास माध्यम के 2 मिलीलीटर में कवरलिप्स के साथ और5 % सीओ2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर प्लेटों को प्रीक्यूबेट किया जाता है।
  2. एफआईटीसी-लेबल आई-ओवीए एनई (शुद्धता: 98.3%, कंपनी द्वारा उत्पादित, 4 मिलीग्राम / एमएल) या आई-ओवीए (4 मिलीग्राम / एमएल) के 100 μL को 900 μL सेल निलंबन में जोड़ें और 90 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
    नोट: चरण 4.1 में वर्णित एफआईटीसी-लेबल आई-ओवीए एनई तैयार करें। नियंत्रण समूहों में पूर्ण विकास माध्यम के 1 एमएल जोड़ें।
  3. उपचार के बाद 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 0.1 एम पीबीएस (1 एमएल / वेल) के साथ तीन बार धोएं।
  4. अंधेरे में 20 मिनट के लिए 4% पैराफॉर्मलडिहाइड के साथ इन नमूनों को ठीक करें। निर्धारण के बाद, पैराफॉर्मलडिहाइड को हटा दें और 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 0.1 एम पीबीएस (1 एमएल / वेल) के साथ 3 बार धोएं।
  5. अंधेरे में 10 मिनट के लिए 10 μg / mL की अंतिम सांद्रता पर DAPI (4',6-डायमिडिनो-2-फेनिलिडोल) के साथ नमूने को प्रीक्यूबेट करें, और फिर उपचार के बाद 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 0.1 M PBS (1 mL / well) के साथ 5 बार धोएं।
  6. निम्न पैरामीटर सेटिंग्स के साथ CLSM द्वारा सेलुलर अपटेक प्राप्त करें: फ़्रेम आकार: 512 px x 512 px, स्कैन गति: 8; लाइन चरण: 1; औसत: 2.

5. विवो रिलीज में

  1. 4% आइसोफ्लुरेन गैस के साथ नग्न चूहों को एनेस्थेटाइज्ड करें और 2% आइसोफ्लुरेन पर संज्ञाहरण बनाए रखें। नग्न चूहों को प्रत्येक नथुने में 4 मिलीग्राम / एमएल पर पीई-लेबल आई-ओवीए के 10 μL या प्रत्येक नथुने में 4 मिलीग्राम / एमएल पर पीई-लेबल आई-ओवीए एनई के साथ इंट्रानेजल रूप से प्रतिरक्षित करें।
  2. 0 घंटे, 0.5 घंटे, 1.5 घंटे, 3, 6 घंटे, 9 घंटे, 12 घंटे और 24 घंटे पर, आईवीआईएस प्रणाली द्वारा संज्ञाहरण के तहत सभी चूहों को पकड़ें।
  3. सभी समय बिंदुओं पर एकत्र की गई छवियों को समायोजित करने के लिए एक थ्रेशोल्ड मान (मिन = 1.06 x 106) प्रदान करने के लिए इंट्रानेसल प्रशासन से तुरंत पहले एक पृष्ठभूमि स्कैन करें।
  4. अनुक्रम शुरू करने के लिए लिविंग इमेज सॉफ़्टवेयर पर क्लिक करें और आईवीआईएस सिस्टम को प्रारंभ करने के लिए प्रारंभिक पर क्लिक करें।
  5. जब इसे प्रारंभ किया जाता है, तो आईवीआईएस अधिग्रहण नियंत्रण कक्ष में तापमान की स्थिति प्रकाश लाल होता है। जब तापमान की स्थिति प्रकाश हरे रंग में बदल जाती है, तो इमेजिंग की जा सकती है।
  6. इमेजिंग विज़ार्ड क्लिक करें, और तब प्रकट होने वाले संवाद बॉक्स में प्रतिदीप्ति चुनें.
  7. निम्नलिखित पैरामीटर समायोजित करें: एक्सपोज़र समय: ऑटो सेकंड, बिनिंग: 8, एफ / स्टॉप: 2, फील्ड ऑफ व्यू: डी।
  8. 620 एनएम उत्तेजना फ़िल्टर और 670 एनएम उत्सर्जन फ़िल्टर का चयन करें। छवि प्राप्त करने के लिए अनुक्रम प्राप्त करें पर क्लिक करें।
  9. लिविंग इमेज सॉफ्टवेयर के साथ सभी चूहों की लाइव छवियों और चमक डेटा को संसाधित करें।
    1. चित्र प्राप्त करने के बाद, टूल पैलेट में ROI टूल्स पर क्लिक करें, सर्कल का चयन करें, और ROI सर्कल बनाएं।
    2. ROI क्षेत्र के लिए मात्रात्मक मान प्राप्त करने के लिए ROI मापें पर क्लिक करें।

6. विवो एंटीट्यूमर प्रभावकारिता में।

  1. चरण 2.1.1-2.1.4 के बाद एक पूर्ण विकास माध्यम के साथ ईएल 4 से माउस लिम्फोमा ई.जी.7-ओवीए कोशिकाओं को ताज़ा और कल्चर करें।
    नोट: ई.जी7-ओवीए सेल पूर्ण विकास माध्यम तैयार करने के लिए, आरपीएमआई 1640 माध्यम को 2 एमएम एल-ग्लूटामाइन के साथ मिलाएं जिसमें 1.5 ग्राम / एल सोडियम बाइकार्बोनेट, 4.5 ग्राम / एल ग्लूकोज, 10 एमएम एचईपीईएस और 1.0 एमएम सोडियम पाइरूवेट शामिल हैं और 0.05 एमएम 2-मर्कैप्टोइथेनॉल और 0.4 मिलीग्राम / एमएल जी 418, 90% और भ्रूण गोजातीय सीरम, 10% के साथ पूरक हैं।
  2. उपसंस्कृति कोशिकाओं को 1: 2 के अनुपात में तब बनाती है जब कोशिकाएं 1 x 106 कोशिकाओं / mL और 1 x 107 कोशिकाओं / mL के बीच घनत्व तक पहुंच जाती हैं।
  3. चरण 6.3.1-6.3.4 में वर्णित चूहों पर निवारक सुरक्षात्मक प्रभाव का मूल्यांकन करें।
    1. यादृच्छिक रूप से 6 सप्ताह के C57BL/6 चूहों को पांच समूहों (प्रत्येक समूह में n = 8) में विभाजित करें। 4% आइसोफ्लुरेन गैस के साथ नग्न चूहों को एनेस्थेटाइज्ड करें और 2% आइसोफ्लुरेन के साथ एनेस्थीसिया बनाए रखें। सूखापन को रोकने के लिए चूहों की आंखों पर आंशिक रूप से पीठ के बाल और नियोमाइसिन सल्फेट मरहम को शेव करें।
    2. इंट्रानेजल रूप से चूहों को प्रत्येक नासिका में 10 μL 1 मिलीग्राम / एमएल आई-ओवीए, बीएनई + आई-ओवीए, या आई-ओवीए एनई के साथ प्रतिरक्षित करें, बीएनई (पीबीएस के साथ चार बार पतला), या प्रत्येक टीकाकरण के बीच 7-दिन के अंतराल के साथ 3 बार पीबीएस नियंत्रण।
    3. अंतिम टीकाकरण के बाद 7 वें दिन सभी चूहों को 5 x 105 ई जी 7-ओवीए कोशिकाओं के साथ दाईं पीठ में हाइपोडर्मिक रूप से टीका लगाएं।
    4. अंतिम टीकाकरण के बाद 0, 6, 9, 12, 15 और 18 दिनों में, डिजिटल कैलिपर का उपयोग करके ट्यूमर के दो अक्षों को मापकर ट्यूमर की मात्रा की निगरानी करें, और चूहों के 30-दिन (अंतिम टीकाकरण के बाद) अस्तित्व को रिकॉर्ड करें।
  4. चरण 6.4.1-6.4.3 में वर्णित ई.जी7-ओवीए कोशिकाओं को संक्रमित करने के बाद चूहों पर चिकित्सीय सुरक्षात्मक प्रभाव का मूल्यांकन करें। चूहों के समूहीकरण और हैंडलिंग के लिए चरण 6.3.1 देखें।
    1. दिन 0 पर, C57BL/6 चूहों को E.G7-OVA कोशिकाओं (5 x 105 कोशिकाओं / माउस) के साथ दाईं पीठ में चमड़े के नीचे इंजेक्ट करें।
    2. इंजेक्शन के बाद 0, 7, और 14 दिनों में, सभी चूहों को आई-ओवीए, बीएनई + आई-ओवीए, आई-ओवीए एनई (सभी 1 मिलीग्राम / एमएल की सांद्रता पर), बीएनई, या पीबीएस के 10 μL के साथ इंट्रानेजल रूप से प्रतिरक्षित किया जाता है।
    3. इंजेक्शन के बाद 0, 6, 9, 12, 15 और 18 दिनों में, ट्यूमर की मात्रा की निगरानी करें और चूहों के 30 दिन के अस्तित्व को रिकॉर्ड करें।
      नोट: यदि ट्यूमर की मात्रा 3,000 मिमी3 से अधिक है, तो चूहों को मानवीय कारणों से इच्छामृत्यु दी जानी चाहिए, और इन चूहों को जीवित रहने की अवस्था में मृत माना जाएगा। ट्यूमर की मात्रा की गणना एक संशोधित दीर्घवृत्तसूत्र द्वारा की जाती है जैसा कि निम्नलिखित समीकरण में दर्शाया गया है:
      आयतन = π/6 x L x W2
      जहां एल ट्यूमर की लंबाई का प्रतिनिधित्व करता है, और डब्ल्यू ट्यूमर की चौड़ाई (लंबाई इकाई: मिमी, मात्रा इकाई: मिमी3) का प्रतिनिधित्व करता है।

7. सांख्यिकीय विश्लेषण

  1. एक-तरफ़ा एनोवा, टुकी की कई तुलनाओं, या एक छात्र के टी-टेस्ट के साथ उपयुक्त सांख्यिकीय सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके विभिन्न समूहों के बीच डेटा में अंतर का विश्लेषण करें। उत्तरजीविता परिणामों का अनुमान लगाने और लॉग-रैंक आंकड़ों के साथ समूहों की तुलना करने के लिए कपलान-मीयर विधि का उपयोग करें। सभी परिणामों को एसडी ± मतलब के रूप में व्यक्त करें। P मान P < 0.05, P < 0.01, और P < 0.001 का महत्व क्रमशः भूखंडों पर *, **, और *** का उपयोग करके दर्शाया गया है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

प्रोटोकॉल के अनुसार, हमने नाक ट्यूमर नैनोवैक्सीन डिलीवरी की तैयारी और इन विट्रो और विवो प्रयोगात्मक मूल्यांकन पूरा किया। टीईएम, एएफएम और डीएलएस सतह जेटा क्षमता की बुनियादी विशेषताओं और नैनोवैक्सीन के कण आकार के आकलन के लिए प्रभावी साधन हैं (चित्रा 1)। बीईएएस -2 बी उपकला कोशिकाएं नाक के टीकों के इन विट्रो विषाक्तता परीक्षण के लिए एक उपयोगी स्क्रीनिंग मॉडल हैं (चित्रा 2 ए)। एच एंड ई से सना माइक्रोफोटोग्राफ दर्शाता है कि आई-ओवीए एनई में ऊतक क्षति, रक्तस्राव या भड़काऊ सेल घुसपैठ सहित कोई स्पष्ट म्यूकोसल विषाक्तता नहीं थी (चित्रा 2 बी)। नाक गुहा में बीईएएस -2 बी कोशिकाओं द्वारा एंटीजन का कुशल उत्थान बाद की प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को प्राप्त करने के लिए एंटीजन प्रस्तुति के लिए एक शर्त है (चित्रा 3)। आईवीआईएस प्रणाली इन विट्रो में आई-ओवीए एनई के निरंतर-रिलीज प्रभाव को स्पष्ट करने में मदद करती है और सुझाव देती है कि यह नैनोवैक्सीन तेजी से रिलीज में देरी कर सकती है, नाक क्षेत्र में समय बढ़ा सकती है, और कोशिकाओं में पेप्टाइड्स के उत्थान में सुधार कर सकती है (चित्रा 4)। निवारक सुरक्षात्मक मॉडल और चिकित्सीय सुरक्षात्मक मॉडल सीधे आई-ओवीए एनई वैक्सीन के सुरक्षात्मक प्रभाव और ट्यूमर के विकास को रोकने और चूहों के औसत जीवित रहने के समय को बढ़ाने के लिए आई-ओवीए एनई वैक्सीन की क्षमता को दर्शाते हैं (चित्रा 5)। उपरोक्त प्रयोगात्मक परिणाम यांग एट अल.7 द्वारा प्रकाशित किए गए हैं।

Figure 1
चित्र 1: I-OVA NE की भौतिक विशेषताएं और स्थिरता (A) ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोग्राफ (TEM), स्केल बार = 100 nm। (बी) परमाणु बल माइक्रोस्कोपी (एएफएम) माइक्रोग्राफ। एक्स और वाई अक्षों दोनों की कुल लंबाई 450 एनएम है। (सी) आकार, व्यास और वितरण। (घ) नैनो जेडएस का उपयोग करके किए गए आई-ओवीए एनई विश्लेषणों की जीटा संभाव्यता और वितरण। (ई) नैनो जेडएस का उपयोग करके किए गए म्यूसिन स्थिरता विश्लेषण में आई-ओवीए एनई के कण आकार, (एफ) पॉलीडिस्पर्सिटी इंडेक्स, (जी) जेटा पोटेंशियल, और (एच) वैद्युतकणसंचलन गतिशीलता। इस आंकड़े को यांग एट अल.7 से अनुमति के साथ अनुकूलित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: आई-ओवीए एनई की इन विट्रो और विवो विषाक्तता में(ए) 24 घंटे के लिए आई-ओवीए, बीएनई + आई-ओवीए, और आई-ओवीए एनई की विभिन्न पेप्टाइड सांद्रता के संपर्क में आने वाली संस्कृति में बीईएएस -2 बी कोशिकाओं की सापेक्ष व्यवहार्यता। डेटा को एसडी (एन = 3) ± माध्य के रूप में व्यक्त किया जाता है। (बी) चुनौती के 5 घंटे बाद नाक के श्लेष्म और फेफड़ों के ऊतकों के पैथोलॉजिकल वर्गों की सूक्ष्म परीक्षा। छवियों को 100x और 200x आवर्धन पर कैप्चर किया गया था। इस आंकड़े को यांग एट अल.7 से अनुमति के साथ अनुकूलित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: I-OVA NE का सेलुलर उत्थान। BEAS-2B कोशिकाओं की इन विट्रो कॉन्फोकल फ्लोरेसेंस इमेजिंग को I-OVA या I-OVA NE के साथ 1 घंटे के लिए इलाज किया जाता है। PBS को नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था, I-OVA को FITC (हरे रंग की प्रतिदीप्ति) के साथ लेबल किया गया था, और नाभिक को DAPI (ब्लू फ्लोरेसेंस) (स्केल बार = 50 μm) के साथ दाग दिया गया था। इस आंकड़े को यांग एट अल.7 से अनुमति के साथ अनुकूलित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
(ए) माउस नाक गुहा में पीई-लेबल आई-ओवीए के विवो फ्लोरेसेंस इमेजिंग में। I-OVA या I-OVA NE के नाक प्रशासन के बाद 0 h, 0.5 h, 1.5 h, 3 h, 6 h, 9 h, 12 h और 24 घंटे पर दर्ज की गई सापेक्ष प्रतिदीप्ति तीव्रता। डेटा को एसडी (एन = 5) ± माध्य के रूप में व्यक्त किया जाता है। *: पी < 0.05; **: पी <0.01; और ***: पी < 0.001। इस आंकड़े को यांग एट अल.7 से अनुमति के साथ अनुकूलित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्र 5: आई-ओवीए एनई की विवो एंटी-ट्यूमर प्रभावकारिता में (ए) निवारक सुरक्षात्मक मॉडल में टीकाकरण चूहों के औसत ट्यूमर विकास वक्र। (बी) निवारक सुरक्षात्मक मॉडल में टीकाकरण चूहों की प्रतिशत जीवित रहने की दर। (सी) चिकित्सीय सुरक्षात्मक मॉडल में टीकाकरण किए गए चूहों के औसत ट्यूमर विकास वक्र। (डी) चिकित्सीय सुरक्षात्मक मॉडल में टीकाकरण किए गए चूहों की प्रतिशत जीवित रहने की दर। *: पी < 0.05; **: पी < 0.01; और ***: पी < 0.001। इस आंकड़े को यांग एट अल.7 से अनुमति के साथ अनुकूलित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

इम्यूनोसाइट झिल्ली के साथ कार्यात्मक नैनोवैक्सीन के रोग-लक्षित चिकित्सा में बहुत फायदे हैं, और साइड इफेक्ट्स को अद्वितीय ट्यूमर ट्रोपिज्म, विशिष्ट लक्ष्यों की पहचान, लंबे समय तक परिसंचरण, बढ़ी हुई इंटरसेलुलर इंटरैक्शन और कम प्रणालीगत विषाक्तता जैसे गुणों से कम किया जाता है। उन्हें सहकारी रूप सेकैंसर के इलाज के लिए अन्य उपचार मॉड्यूल के साथ आसानी से एकीकृत किया जा सकता है। वांछनीय विशेषताओं को भौतिक और रासायनिक गुणों जैसे माप, आकार और विद्युत आवेश को नियंत्रित करके प्राप्त किया जा सकता है। इसलिए, नैनोवैक्सीनअनुप्रयोगों की एक विस्तृत श्रृंखला में महत्वपूर्ण हो गए हैं। ये गुण अपटेक और विषाक्तता के संबंध में प्रमुख निर्णायक कारक हैं, और नैनोवैक्सीन को केवल हेरफेरकरके नॉनटॉक्सिक प्रदान किया जा सकता है। इसलिए, आकार, आकार और चार्ज सहित भौतिक रासायनिक विशेषताओं के अध्ययन के लिए यह प्रोटोकॉल महत्वपूर्ण है। टीईएम एक अत्यधिक सटीक उपकरण है जिसका व्यापक रूप से वैज्ञानिक समुदाय मेंकई वर्षों से उपयोग किया जाता है। यह नैनोस्ट्रक्चर्ड सामग्रियों के गुणों को समझने और उनके व्यवहार में हेरफेर करने के लिए एक आवश्यक उपकरण बन गया है। इसके अलावा, परमाणु बल माइक्रोस्कोपी (एएफएम)जैविक नमूनों के नैनोमैकेनिकल लक्षण वर्णन के लिए एक शक्तिशाली तकनीक के रूप में उभरा है। यह परमाणु स्तर पर सतह के विवरण का विश्लेषण करते हुए उच्च-रिज़ॉल्यूशन 3 डी और नैनोस्केल जानकारी प्रदान कर सकता है। कण आकार वितरण में परिवर्तन का निर्धारण करने के अलावा, डीएलएस समाधान25 में नैनोकणों की एकत्रीकरण स्थिति के बारे में जानकारी प्रदान करने के लिए आकार और चार्ज दोनों को माप सकता है।

यह बताया गया है कि कोलाइडल निलंबनकी अच्छी स्थिरता के लिए उच्च जेटा संभावित मूल्य आवश्यक हैं। इस अध्ययन में, हमने टीईएम, एएफएम और डीएलएस के साथ नैनोवैक्सीन की भौतिक रासायनिक विशेषताओं का आकलन करने के लिए इन प्रोटोकॉल का उपयोग किया। इसके अलावा, नाक के श्लेष्म की सतह में बड़ी मात्रा में बलगम होता है, जो स्नेहन, नमी और एक रासायनिक सुरक्षात्मक बाधा प्रदान करता है। यह बलगम और कुछ एंटीजन या वितरण प्रणालियों के बीच बातचीत के कारण हो सकता है, जिसके परिणामस्वरूप एंटीजन या डिलीवरी सिस्टम का संचय और "कैप्चर" होता है और उनके बाद के निष्कासन सेवितरण दक्षता बहुत कम हो जाती है। यह सर्वविदित है कि नाक प्रशासन के लिए नैनोवैक्सीन की स्थिरता महत्वपूर्ण है। इसलिए, हमने 0.5% म्यूसिन प्रोटीन के साथ उपचार के बाद कण आकार, पॉलीडिस्पर्सिटी इंडेक्स, ज़ेटा पोटेंशियल और वैद्युतकणसंचलन गतिशीलता सहित स्थिरता मापदंडों की एक श्रृंखला निर्धारित करने के लिए नैनो जेडएस का उपयोग किया।

विवो हिस्टोकम्पैटिबिलिटी और इन विट्रो सेल व्यवहार्यता परीक्षणों से पता चला है कि यह नया नैनोवैक्सीन परीक्षण किए गए सांद्रता27 की सीमा में नॉनटॉक्सिक था। मानव सामान्य ब्रोन्कियल उपकला (बीईएएस -2 बी) कोशिकाएं मानक सेल लाइनें हैं जिनका उपयोग मानव श्वसन पथ28 का अध्ययन करने के लिए किया जाता है। इसकी कम लागत, तेजी और न्यूनतम नैतिक चिंताओं के कारण, इन विट्रो विषाक्तता मूल्यांकन एक महत्वपूर्ण तरीका है। इस अध्ययन में, इन विट्रो सेल व्यवहार्यता परख एक सीसीके 8 परख द्वारा निर्धारित किया गया था। इसके अलावा, विवो विषाक्तता मूल्यांकन आमतौर पर चूहों और चूहों जैसे पशु मॉडल में किया जाता है। हिस्टोपैथोलॉजिकल परीक्षा अक्सर नैनोकणों के संपर्क में आने वाले ऊतकों पर की जाती है, जैसे कि हृदय, आंख, मस्तिष्क, यकृत, गुर्दे, फेफड़े और प्लीहा29। इसलिए, हमने इन तरीकों का उपयोग विट्रो और विवो में इस नोवेल नैनोवैक्सीन की विषाक्तता का आकलन करने के लिए किया।

एंटीजन अपटेक और लम्बाई एंटीजन सबमिशन के लिए बाद मेंप्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को ट्रिगर करने के लिए आवश्यक शर्तें हैं। यह आवश्यक है कि बीईएएस -2 बी के सेलुलर उत्थान और विवो और इन विट्रो में नोवेल नैनोवैक्सीन के रिलीज प्रोफाइल निर्धारित किए जाएं। सीएलएसएम प्रासंगिक तकनीक का सबसे आम वाणिज्यिक कार्यान्वयन है, जो इमेजिंग प्रयोगशालाओं के महान बहुमत में पाया जा सकता है और इसमें अनुप्रयोगों की एक विस्तृत श्रृंखला है। इन उपकरणों का व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है और उपयोग करने में अपेक्षाकृत आसान है; हालांकि, वे आमतौर पर मात्रात्मक डेटा संग्रह के लिए इष्टतम नहीं होते हैं।

हमारे प्रोटोकॉल में, 3 डी इमेजिंग31 के साथ स्पष्ट रिज़ॉल्यूशन, ऑप्टिकल सेक्शनिंग क्षमता और बहुमुखी प्रतिभा के कारण सीएलएसएम द्वारा सेलुलर अपटेक का पता लगाया गया था। इसके अलावा, आईवीआईएस का उपयोग नोवेल नैनोमटेरियल के इनविवो रिलीज प्रोफाइल प्राप्त करने के लिए किया गया था क्योंकि यह विवो और इन विट्रो में मात्रात्मक बायोल्यूमिनेसेंस और फ्लोरेसेंस इमेजिंग के लिए बाहरी प्रकाश के साथ एक इमेजिंग चैंबर प्रदान कर सकता है। इसलिए, इस प्रोटोकॉल में, हमने विवो और इन विट्रो में नोवेल नैनोवैक्सीन के सेलुलर अपटेक और रिलीज प्रोफाइल को निर्धारित करने के लिए इन तरीकों का उपयोग किया।

नोवेल नैनोवैक्सीन की ट्यूमर प्रभावकारिता का आकलन करना भी महत्वपूर्ण है। हमारे अध्ययन में, ई.जी7 ट्यूमर-असर मॉडल का उपयोग वैक्सीन के चिकित्सीय और सुरक्षात्मक प्रभावों को निर्धारित करने के लिए किया गया था। ईएल 4 कोशिकाएं सी 57बीएल / 6 चूहों के टी लिम्फोसाइटों से प्राप्त होती हैं, जिनमें उच्च श्रेणी की घातकता होती है। ई.जी.7 कोशिकाएं ईएल 4 लिम्फोमा कोशिकाओं से प्राप्त होती हैं जो इलेक्ट्रोपोरेशन32 द्वारा स्थानांतरित होती हैं। हमारे अध्ययन में, इस नैनोवैक्सीन ने ई.जी7-ओवीए ट्यूमर-असर चूहों में सुरक्षात्मक प्रतिरक्षा को प्रेरित किया। सारांश में, विट्रो और विवो में नैनोवैक्सीन के भौतिक रासायनिक विशेषताओं, स्थिरता, विषाक्तता, रिलीज प्रोफाइल, सेलुलर अपटेक और एंटीट्यूमर प्रभावों का अध्ययन करने के लिए प्रोटोकॉल की एक श्रृंखला स्थापित करना आवश्यक है। ये प्रोटोकॉल नोवेल नेजल नैनोवैक्सीन के लिए उपयोगी परिणाम प्रदान करेंगे।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखक घोषणा करते हैं कि उनके पास कोई ज्ञात प्रतिस्पर्धी वित्तीय हित या व्यक्तिगत संबंध नहीं हैं जो इस पेपर में रिपोर्ट किए गए काम को प्रभावित कर सकते थे।

Acknowledgments

इस अध्ययन को चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन कार्यक्रम के नंबर 31670938, 32070924, 32000651, नंबर 2014 jcyja0107 और नंबर 2019jcyja-msxmx0159 द्वारा समर्थित किया गया 202090031035 202090031021 था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96-well plates Corning Incorporated, USA CLS3922
Bio-Rad 6.0 microplate reader Bio-Rad Laboratories Incorporated Limited Co., CA, USA  Bio-Rad 6.0
CCK-8 kits Dojindo, Japan CK04
Centrifuge 5810 R Eppendorf, Germany  5811000398
DAPI Sigma-Aldrich, St. Louis, USA D9542
fetal bovine serum (FBS) Hyclone (Life Technology, USA) SH30088.03
FITC-labeled I-OVA Shanghai Botai
Biotechnology Co., Ltd.		 NA
HF 90/240 Incubator Heal Force, Switzerland NA
HPLC  Shanghai Botai Biotechology Co., Ltd. E2695
Inverted Microscope Nikon,Japan DSZ5000X
IPC-208 Chong Qing University, China NA
IVIS system  Caliper Life Science Limited Company NA
JEM-1230 TEM JEOL Limited Company of Japan 1230 TEM
Malvern NANO ZS Malvern Instruments Ltd., UK NA
MPLA  Invivogen
Lit. Co.		 tlrl-mpla
Neomycin Sulfate Ointment Shanghai CP General Pharmaceutical Co. , Ltd. H31022262
OVA257–264 Shanghai Botai
Biotechnology Co., Ltd.		 NA
RPMI 1640 medium Hyclone (Life Technology, USA) SH30809.01
Synthetic peptide (I-OVA) conjugation of IKVAV-PA Shanghai Botai
Biotechnology Co., Ltd.		 NA
Zeiss LSM800 laser scanning confocal fluorescence microscope Zeiss, Germany Zeiss LSM800

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sung, H., et al. Global cancer statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 71 (3), 209-249 (2021).
  2. Mohammed, I., et al. The efficacy and effectiveness of the COVID-19 vaccines in reducing infection, severity, hospitalization, and mortality: A systematic review. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 18 (1), 2027160 (2022).
  3. Tsung, K., Norton, J. A. In situ vaccine, immunological memory and cancer cure. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 12 (1), 117-119 (2016).
  4. Abd-Aziz, N., Poh, C. L., Ding, X. Development of peptide-based vaccines for cancer. Journal of Oncology. 2022, 9749363 (2022).
  5. Mochizuki, S., et al. Immunization with antigenic peptides complexed with beta-glucan induces potent cytotoxic T-lymphocyte activity in combination with CpG-ODNs. Journal of Controlled Release. 220, 495-502 (2015).
  6. Kalita, P., Tripathi, T. Methodological advances in the design of peptide-based vaccines. Drug Discovery Today. 27 (5), 1367-1380 (2022).
  7. Yang, Y., et al. A novel self-assembled epitope peptide nanoemulsion vaccine targeting nasal mucosal epithelial cell for reinvigorating CD8(+) T cell immune activity and inhibiting tumor progression. International Journal of Biological Macromolecules. 183, 1891-1902 (2021).
  8. Ren, Y., et al. OVA-specific CD8+ T cells do not express granzyme B during anterior chamber associated immune deviation. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 244 (10), 1315-1321 (2006).
  9. Suzuki, K., et al. Preparation of hyaluronic acid-coated polymeric micelles for nasal vaccine delivery. Biomaterials Science. 10 (8), 1920-1928 (2022).
  10. Georas, S. N., Rezaee, F. Epithelial barrier function: at the front line of asthma immunology and allergic airway inflammation. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 134 (3), 509-520 (2014).
  11. Lam, J. Y., et al. A nasal omicron vaccine booster elicits potent neutralizing antibody response against emerging SARS-CoV-2 variants. Emerging Microbes & Infections. 11 (1), 964-967 (2022).
  12. Chai, Y., et al. Improved functional recovery of rat transected spinal cord by peptide-grafted PNIPAM based hydrogel. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 210, 112220 (2022).
  13. Paiva Dos Santos, B., et al. Production, purification and characterization of an elastin-like polypeptide containing the Ile-Lys-Val-Ala-Val (IKVAV) peptide for tissue engineering applications. Journal of Biotechnology. 298, 35-44 (2019).
  14. Okur, A. C., Erkoc, P., Kizilel, S. Targeting cancer cells via tumor-homing peptide CREKA functional PEG nanoparticles. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 147, 191-200 (2016).
  15. Makidon, P. E., et al. Pre-clinical evaluation of a novel nanoemulsion-based hepatitis B mucosal vaccine. PLoS One. 3 (8), 2954 (2008).
  16. Lin, X., et al. Oil-in-ionic liquid nanoemulsion-based intranasal delivery system for influenza split-virus vaccine. Journal of Controlled Release. 346, 380-391 (2022).
  17. O'Konek, J. J., et al. Intranasal nanoemulsion vaccine confers long-lasting immunomodulation and sustained unresponsiveness in a murine model of milk allergy. Allergy. 75 (4), 872-881 (2020).
  18. Ahmed, M., et al. A novel nanoemulsion vaccine induces mucosal Interleukin-17 responses and confers protection upon Mycobacterium tuberculosis challenge in mice. Vaccine. 35 (37), 4983-4989 (2017).
  19. Sun, H., et al. Induction of systemic and mucosal immunity against methicillin-resistant Staphylococcus aureus infection by a novel nanoemulsion adjuvant vaccine. International Journal of Nanomedicine. 10, 7275-7290 (2015).
  20. Chen, C., et al. Tumor-associated-macrophage-membrane-coated nanoparticles for improved photodynamic immunotherapy. Nano Letters. 21 (13), 5522-5531 (2021).
  21. Prasanna, P., et al. Current status of nanoscale drug delivery and the future of nano-vaccine development for leishmaniasis - A review. Biomedicine & Pharmacotherapy. 141, 111920 (2021).
  22. George, S., et al. Surface defects on plate-shaped silver nanoparticles contribute to its hazard potential in a fish gill cell line and zebrafish embryos. ACS Nano. 6 (5), 3745-3759 (2012).
  23. Jafari Eskandari, M., Gostariani, R., Asadi Asadabad, M. Transmission Electron Microscopy of Nanomaterials. Electron Crystallography. Singh, D., Condurache-Bota, S. , IntechOpen. London, UK. (2020).
  24. Kontomaris, S. V., Stylianou, A., Malamou, A. Atomic force microscopy nanoindentation method on collagen fibrils. Materials. 15 (7), 2477 (2022).
  25. Zielinska, A., et al. Polymeric nanoparticles: Production, characterization, toxicology and ecotoxicology. Molecules. 25 (16), 3731 (2020).
  26. Doncom, K. E. B., Blackman, L. D., Wright, D. B., Gibson, M. I., O'Reilly, R. K. Dispersity effects in polymer self-assemblies: A matter of hierarchical control. Chemical Society Reviews. 46 (14), 4119-4134 (2017).
  27. Pei, M., Li, H., Zhu, Y., Lu, J., Zhang, C. In vitro evidence of oncofetal antigen and TLR-9 agonist co-delivery by alginate nanovaccines for liver cancer immunotherapy. Biomaterials Science. 10 (11), 2865-2876 (2022).
  28. Zhang, J., et al. Titanium dioxide nanoparticles induced reactive oxygen species (ROS) related changes of metabolomics signatures in human normal bronchial epithelial (BEAS-2B) cells. Toxicology and Applied Pharmacology. 444, 116020 (2022).
  29. Kumar, V., Sharma, N., Maitra, S. S. In vitro and in vivo toxicity assessment of nanoparticles. International Nano Letters. 7 (4), 243-256 (2017).
  30. Tong, Y. N., et al. An immunopotentiator, ophiopogonin D, encapsulated in a nanoemulsion as a robust adjuvant to improve vaccine efficacy. Acta Biomaterialia. 77, 255-267 (2018).
  31. Elliott, A. D. Confocal microscopy: Principles and modern practices. Current Protocols in Cytometry. 92 (1), 68 (2020).
  32. Huang, Y., Zou, Y., Lin, L., Zheng, R. Ginsenoside Rg1 activates dendritic cells and acts as a vaccine adjuvant inducing protective cellular responses against lymphomas. DNA and Cell Biology. 36 (12), 1168-1177 (2017).

Tags

इस महीने JoVE में अंक 187
<em>विट्रो</em> और <em>विवो में</em> नाक स्व-इकट्ठे नैनोइमल्शन ट्यूमर वैक्सीन की तैयारी, विशेषताएं, विषाक्तता और प्रभावकारिता मूल्यांकन
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhang, Z., Cai, D., Ge, S., Luo, X., … More

Zhang, Z., Cai, D., Ge, S., Luo, X., Zeng, X., Ye, Y., Song, Z., Peng, L., Li, H., Zou, Q., Zeng, H., Sun, H., Yang, Y. Preparation, Characteristics, Toxicity, and Efficacy Evaluation of the Nasal Self-Assembled Nanoemulsion Tumor Vaccine In Vitro and In Vivo. J. Vis. Exp. (187), e64299, doi:10.3791/64299 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter