Summary
Här presenterar vi detaljerade metoder för beredning och utvärdering av det nasala självmonterade nanoemulsionstumörvaccinet in vitro och in vivo.
Abstract
Epitoppeptider har väckt stor uppmärksamhet inom tumörvacciner på grund av deras säkerhet, höga specificitet och bekväm produktion; i synnerhet kan vissa MHC I-begränsade epitoper inducera effektiv cytotoxisk T-lymfocytaktivitet för att rensa tumörceller. Dessutom är nasal administrering en effektiv och säker leveransteknik för tumörvacciner på grund av dess bekvämlighet och förbättrad patientöverensstämmelse. Epitoppeptider är emellertid olämpliga för nasal leverans på grund av deras dåliga immunogenicitet och brist på leveranseffektivitet. Nanoemulsioner (NE) är termodynamiskt stabila system som kan laddas med antigener och levereras direkt till nässlemhinnans yta. Ile-Lys-Val-Ala-Val (IKVAV) är kärnpentapeptiden av laminin, en integrinbindande peptid som uttrycks av humana respiratoriska epitelceller. I denna studie framställdes ett intranasalt självmonterat epitoppeptid NE-tumörvaccin innehållande den syntetiska peptiden IKVAV-OVA257-264 (I-OVA ) med en lågenergiemulgeringsmetod. Kombinationen av IKVAV och OVA257-264 kan förbättra antigenupptaget av nasala mukosala epitelceller. Här upprättar vi ett protokoll för att studera de fysikalisk-kemiska egenskaperna genom transmissionselektronmikroskopi (TEM), atomkraftmikroskopi (AFM) och dynamisk ljusspridning (DLS); stabilitet i närvaro av mucinprotein; toxicitet genom undersökning av cellviabiliteten hos BEAS-2B-celler och näs- och lungvävnaderna hos C57BL/6-möss, cellulärt upptag genom konfokal laserskanningsmikroskopi (CLSM); frisläppa profiler genom att avbilda små djur in vivo; och vaccinets skyddande och terapeutiska effekt med hjälp av en E.G7-tumörbärande modell. Vi förväntar oss att protokollet kommer att ge tekniska och teoretiska ledtrådar för framtida utveckling av nya T-cellsepitoppeptidslemhinnevacciner.
Introduction
Som en av de mest kritiska folkhälsoinnovationerna spelar vacciner en nyckelroll i kampen mot den globala bördan av mänskliga sjukdomar1. För närvarande testas till exempel mer än 120 kandidatvacciner mot covid-19-sjukdomar, varav några har godkänts i många länder2. Nya rapporter säger att cancervacciner effektivt har förbättrat framstegen för kliniska cancerbehandlingar eftersom de leder immunsystemet hos cancerpatienter att känna igen antigener som främmande för kroppen3. Dessutom kan flera T-cellsepitoper belägna inuti eller utanför tumörceller användas för att utforma peptidvacciner, som har visat fördelar vid behandling av metastaserande cancer på grund av bristen på den signifikanta toxiciteten i samband med strålbehandling och kemoterapi 4,5. Sedan mitten av 1990-talet har prekliniska och kliniska prövningar för tumörbehandling huvudsakligen genomförts med antigenpeptidvacciner, men få vacciner uppvisar en adekvat terapeutisk effekt på cancerpatienter6. Vidare har cancervacciner med peptidepitoper dålig immunogenicitet och otillräcklig leveranseffektivitet, vilket kan bero på snabb nedbrytning av extracellulära peptider som diffunderar snabbt från administreringsstället, vilket leder till otillräckligt antigenupptag av immunceller7. Därför är det nödvändigt att övervinna dessa hinder med vaccinleveransteknik.
OVA 257-264, MHC klass I-bindande257-264 epitop uttryckt som ett fusionsprotein, är en ofta använd modell epitop8. Dessutom är OVA257-264 avgörande för det adaptiva immunsvaret mot tumörer, vilket beror på det cytotoxiska T-lymfocytsvaret (CTL). Det medieras av antigenspecifika CD8 + T-celler i tumören, som induceras av OVA257-264-peptiden . Det kännetecknas av otillräcklig granzym B, som frigörs av cytotoxiska T-celler, vilket leder till apoptos av målceller8. Administrering av fri OVA257-264-peptid kan dock inducera liten CTL-aktivitet eftersom upptaget av dessa antigener sker i icke-specifika celler snarare än antigenpresenterande celler (APC). Brist på lämplig immunstimulering resulterar i CTL-aktivitet5. Därför kräver induktionen av effektiv CTL-aktivitet betydande framsteg.
På grund av barriären från epitelceller och den kontinuerliga utsöndringen av slem avlägsnas vaccinantigener snabbt från nässlemhinnan 9,10. Att utveckla en effektiv vaccinvektor som kan passera genom slemhinnevävnaden är avgörande eftersom de antigenpresenterande cellerna ligger under slemhinnans epitel9. Intranasal injektion av vacciner inducerar teoretiskt slemhinneimmunitet för att bekämpa slemhinneinfektion11. Dessutom är nasal leverans en effektiv och säker administreringsmetod för vacciner på grund av dess bekvämlighet, undvikande av tarmadministration och förbättrad patientöverensstämmelse7. Därför är nasal leverans ett bra administreringssätt för den nya peptidepitopnanovaccinen.
Flera syntetiska biomaterial har tagits fram för att kombinera epitoper av cell-vävnad och cell-cellinteraktioner. Vissa bioaktiva proteiner, såsom Ile-Lys-Val-Ala-Val (IKVAV), har införts som en del av hydrogelens struktur för att ge bioaktivitet12. Denna peptid bidrar sannolikt till cellbindning, migration och utväxt13 och binder integriner α 3β1 ochα 6β1 för att interagera med olika cancercelltyper. IKVAV är en celladhesionspeptid härledd från laminin basalmembranprotein α1-kedjan som ursprungligen användes för att modellera den neurala mikromiljön och orsaka neuronal differentiering14. Därför är det viktigt att hitta ett effektivt leveransfordon för detta nya vaccin för sjukdomsbekämpning.
Nyligen rapporterade emulsionssystem, såsom W805EC och MF59, har också blandats för leverans av inaktiverat influensavaccin eller rekombinant hepatit B-ytantigen och illustrerats för att utlösa både mukosal och systemisk immunitet15. Nanoemulsioner (NE) har fördelarna med enkel administrering och bekväm sambildning med effektiva adjuvans jämfört med partikelformiga slemhinneleveranssystem16. Nanoemulsionsvacciner har rapporterats förändra den allergiska fenotypen på ett varaktigt sätt som skiljer sig från traditionell desensibilisering, vilket resulterar i långsiktiga undertryckande effekter17. Andra rapporterade att nanoemulsioner i kombination med Mtb-specifika immunodominanta antigener kan inducera potenta slemhinnecellssvar och ge signifikant skydd18. Därför designades ett nytt intranasalt självmonterat nanovaccin med den syntetiska peptiden IKVAV-OVA 257-264 (I-OVA, peptiden bestående av IKVAV bunden till OVA257-264). Det är viktigt att bedöma detta nya nanovaccin systematiskt.
Syftet med detta protokoll är att systematiskt utvärdera nanovaccinets fysikalisk-kemiska egenskaper, toxicitet och stabilitet, upptäcka om antigenupptag och skyddande och terapeutiska effekter förbättras med hjälp av tekniska medel och utarbeta det huvudsakliga experimentella innehållet. I denna studie etablerade vi en serie protokoll för att studera de fysikalisk-kemiska egenskaperna och stabiliteten, bestämma storleken på toxiciteten hos I-OVA NE till BEAS-2B-celler med CCK-8 och observera BEAS-2B-cellernas antigenpresenterande förmåga till vaccinet med hjälp av konfokalmikroskopi, utvärdera frisättningsprofilerna för detta nya nanovaccin in vivo och in vitro, och detektera den skyddande och terapeutiska effekten av detta vaccin med hjälp av en E.G7-OVA-tumörbärande musmodell.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Djurförsöken utfördes i enlighet med Försöksdjur-Riktlinje för etisk granskning av djurskydd (GB / T 35892-2018) och godkändes av Laboratory Animal Welfare and Ethics Committee of the Third Military Medical University. Mössen avlivades genom en intraperitoneal injektion av 100 mg/kg 1% natriumpentobarbital.
1. Beredning av I-OVA NE
- Blanda 1 mg monofosforyllipid A (MPLA) med 100 μL DMSO, virvel i 5 minuter och låt den stå i 4 timmar vid rumstemperatur (RT) för att lösa sig helt.
- Tillsätt Tween 80 och I-OVA kvantitativt och blanda.
OBS: Tween 80 och I-OVA blandades med ett massförhållande på 25: 119. - Tillsätt skvalen i blandningen som beretts i steg 1.2 (7:3, Smix: skvalen).
- Tillsätt 100 μl MPLA-lösning (10 mg/ml) till blandningen som beretts i steg 1.3.
- Bered nanoemulsionsvaccinet med lågenergiemulgeringsmetoder19: tillsätt den blandade lösningen till vattendroppar vid cirka 70% av den totala volymen och rör om försiktigt för att få en transparent och lättflytande blandning.
OBS: BNE-kontrollen (blankemulsion) framställdes med samma metod och ersatte vatten med I-OVA.
2. Fysikalisk-kemisk karakterisering och stabilitet
OBS: Bedöm droppstorleksfördelningen, zetapotentialen och andra fysikalisk-kemiska data för I-OVA NE-vaccinet enligt steg 2.1-2.3; utföra morfologisk karakterisering av I-OVA NE-vaccinet enligt steg 2.4-2.7; och undersök 3D-strukturen för I-OVA NE-vaccinet enligt steg 2.8-2.9.
- Blanda 50 mg mucinprotein med 100 ml vatten för injektion för att förbereda en 0,05% mucinlösning.
- Späd 4 mg/mL I-OVA NE 200 gånger med 0,05 mg/ml mucinprotein eller avjoniserat vatten.
- Observera partikelstorlekar, zetapotential, polydispersitetsindex (PDI) och elektroforetisk rörlighet vid 25 °C med hjälp av en nanoanalysator19.
- Späd 10 μL I-OVA NE 200 gånger med 2 ml avjoniserat vatten.
- Placera 5 μl förspätt I-OVA NE-vaccin (steg 2.4) på ett kolbelagt koppargaller och täck det med 10 μl 1% fosfotungstiksyra i 3 minuter.
- Ta bort överskottet av fosfotungstiksyra med filterpapper.
- Hämta bilder med TEM. Placera ett prov på 10 μl utspätt 50 gånger på ett koppargaller med 100 maskor och låt det stå i rumstemperatur (RT) i 5 minuter innan du tillsätter 10 μL fosfotungstiksyra (1 %, pH 7,4). Undersök alla prover med TEM vid en spänning på 120 kV.
- Karakterisera den molekylära morfologin hos I-OVA NEmed hjälp av ett högupplöst atomkraftmikroskop. Hämta färgbilderna av I-OVA NE under följande förhållanden: för volframsonder (kraftkonstant: 0,06 N·m-1); skanningsområde: 450 nm x 450 nm; tappningsläge: bildläge; och skanningsmetod: punkt-för-punkt-skanning vid RT.
3. Tester av toxicitet in vitro och in vivo
OBS: Toxiciteten in vitro för I-OVA NE-vaccinet bedömdes enligt steg 3.1-3.9 och toxiciteten in vivo för I-OVA NE-vaccinet bedömdes enligt steg 3.10-3.13.
- Återuppliva humana BEAS-2B-epitelceller enligt steg 3.1.1-3.1.4 och odla dem i ett komplett tillväxtmedium vid 37 °C i en 5% CO2-inkubator .
OBS: För att förbereda hela tillväxtmediet, tillsätt fetalt bovint serum (FBS) och penicillin / streptomycin till RPMI-1640-mediet vid slutliga koncentrationer på 10% respektive 1%.- Sätt på vattenbadet och justera temperaturen till 37 °C. Ta bort cellflaskorna frusna i flytande kväve och tina snabbt i ett 37 °C vattenbad.
- Efter upptining, pipettera snabbt cellerna till ett 15 ml sterilt centrifugrör, tillsätt 2 ml av hela tillväxtmediet och centrifugera vid 129 x g i 5 minuter.
- Ta bort supernatanten, tillsätt 2 ml av hela odlingsmediet för att återsuspendera cellerna och centrifugera vid 129 x g i 5 minuter.
- Ta bort supernatanten, tillsätt 6 ml komplett odlingsmedium för att suspendera cellerna igen och överför cellerna till en T25-odlingskolv för att odla cellerna vid 37 °C i en 5 % CO2-inkubator .
- När celldensiteten når 80% -90%, kassera odlingsmediet och tvätta cellerna två gånger med 2 ml PBS. Tillsätt 1 ml 0,25% trypsin för att smälta cellerna i 1-2 minuter. När avrundning av cellerna observeras, tillsätt omedelbart 4 ml av det fullständiga tillväxtmediet för att neutralisera trypsinet.
- Blanda och aspirera proverna till ett 15 ml sterilt centrifugrör och centrifugera vid 129 x g i 5 minuter.
- Ta bort supernatanten och suspendera cellerna igen i 1 ml RPMI-1640 komplett medium. Använd 20 μL för cellräkning och späd cellerna till 1 x 105 celler/ml.
- Platta BEAS-2B-cellerna med en densitet av 1 x 104 celler/brunn i 96-brunnsplattor i 100 μL RPMI-1640 komplett medium och preinkubera plattorna i 24 timmar vid 37 °C i en 5% CO2-inkubator .
- Kassera supernatanten och tillsätt 100 μl I-OVA NE, 100 μL I-OVA+BNE (fysiskt blandat) och 100 μL I-OVA förspätt med ett komplett odlingsmedium vid olika slutliga koncentrationer (0,5 mg/ml, 1 mg/ml, 2 mg/ml, 4 mg/ml, 8 mg/ml) med BNE som kontroll. Inkubera i 24 timmar vid 37 °C.
Observera: Tillsätt 100 μl komplett tillväxtmedium till de negativa kontrollgrupperna och 100 μl cellsuspension (1 x 105/ml) till de positiva kontrollgrupperna. - Ta bort mediet och tillsätt 90 μL komplett odlingsmedium och 10 μL CCK-8-lösning till varje brunn på plattan.
- Inkubera plattan i 2 timmar vid 37 °C i en 5 % CO2-inkubator .
- Mät absorbansen hos varje brunn vid 450 nm med hjälp av en enzymmärkt plattläsare.
- Beräkna överlevnadsförhållandet för BEAS-2B-celler enligt följande ekvation:
(OD450-prov− OD450 negativ kontroll/OD450 positiv kontroll− OD450 negativ kontroll) × 100% - Dela slumpmässigt upp 6 veckor gamla C57BL/6 möss i fem grupper (n = 5 i varje grupp) och bedöva dem med 4% isofluran för induktion. Behåll anestesi med 2% isofluran. Använd neomycinsulfatsalva på mössens ögon för att förhindra torrhet.
- Använd 10 μL pipettspetsar för att utföra nasal immunisering av mössen med 10 μL / näsborre av I-OVA, I-OVA + BNE OCH IOVA NE VID 4 MG / ML UNDER ALLA 3 DAGARNA. Använd BNE och PBS som experimentell kontroll.
OBS: Ge termiskt stöd tills djuret återhämtar sig från anestesi. - Avliva alla möss genom en intraperitoneal injektion av 100 mg/kg 1% natriumpentobarbital dag 4.
- Skär ca 3 mm tjocka prover av näsvävnader med sax och ta bort lungvävnaderna.
- Fixa näsvävnaderna och hela lungvävnaderna i 4% paraformaldehyd i 24 timmar. Dehydrera vävnaderna genom en seriell alkohol- och xylengradient och bädda sedan in paraffin. Skiva de färdiga vaxblocken på en paraffinskivare med en tjocklek av 4 μm.
- Färga sektionerna med hematoxylin och eosin (H&E). Observera sedan slemhinnans toxicitet, inklusive hyperemi, ödem, neutrofilinfiltration och strukturell skada i nässlemhinnan och lungvävnaden, under ett mikroskop (100x och 200x)7.
4. Invitro cellulärt upptag
- Platta BEAS-2B-celler med en densitet av 5 x 10 5 celler/brunn i 12-brunnsplattor med täckglas i 2 ml av hela odlingsmediet och preinkubera plattorna över natten vid 37 °C i en5 % CO2-inkubator .
- Tillsätt 100 μL FITC-märkt I-OVA NE (renhet: 98,3%, producerad av företaget, 4 mg / ml) eller I-OVA (4 mg / ml) till 900 μL cellsuspension och placera vid 37 ° C i 90 min.
Förbered FITC-märkt I-OVA NE enligt beskrivningen i steg 4.1. Tillsätt 1 ml komplett tillväxtmedium till kontrollgrupperna. - Tvätta tre gånger med 0,1 M PBS (1 ml/brunn) i 30 min vid 37 °C efter behandlingen.
- Fixa dessa prover med 4% paraformaldehyd i 20 minuter i mörkret. Efter fixering, avlägsna paraformaldehyden och tvätta 3 gånger med 0,1 M PBS (1 ml/brunn) i 30 min vid 37 °C.
- Inkubera proverna med DAPI (4',6-diamidino-2-fenylindol) vid en slutlig koncentration på 10 μg/ml i 10 minuter i mörker och tvätta sedan 5 gånger med 0,1 M PBS (1 ml/brunn) i 30 minuter vid 37 °C efter behandlingen.
- Hämta cellulärt upptag av CLSM med följande parameterinställningar: Ramstorlek: 512 px x 512 px, Skanningshastighet: 8; Linje steg: 1; Medelvärde: 2.
5. Frisläppande in vivo
- Bedöva nakna möss med 4% isoflurangas och behåll anestesi vid 2% isofluran. Immunisera nakna möss intranasalt med 10 μL PE-märkt I-OVA vid 4 mg / ml eller PE-märkt I-OVA NE vid 4 mg / ml i varje näsborre.
- Vid 0 h, 0,5 h, 1,5 h, 3, 6 h, 9 h, 12 h och 24 h, fånga alla möss under anestesi av IVIS-systemet.
- Utför en bakgrundsskanning omedelbart före intranasal administrering för att ge ett tröskelvärde (Min = 1,06 x 106) för att justera bilderna som samlats in vid alla tidpunkter.
- Klicka på Living Image-programvaran för att initiera sekvensen och klicka på Initiera för att initiera IVIS-systemet
- När den initieras är temperaturstatuslampan i IVIS-förvärvskontrollpanelen röd. När temperaturstatuslampan ändras till grönt kan avbildning utföras.
- Klicka på Bildhanteringsguiden och välj sedan Fluorescens i dialogrutan som visas.
- Justera följande parametrar: Exponeringstid: automatisk sek, Binning: 8, F/stopp: 2, Synfält: D.
- Välj 620 nm excitationsfilter och 670 nm emissionsfilter. Klicka på Hämta sekvens för att hämta bilden.
- Bearbeta levande bilder av alla möss och strålningsdata med Living Image-programvaran.
- När du har hämtat bilden klickar du på ROI-verktyg i verktygspaletten, väljer Cirkel och gör en ROI-cirkel .
- Klicka på Mät ROI för att få ett kvantitativt värde för ROI-området .
6. Antitumöreffekt in vivo
- Uppdatera och odla muslymfom E.G7-OVA-celler från EL4 med ett komplett tillväxtmedium enligt steg 2.1.1-2.1.4.
OBS: För att förbereda E.G7-OVA-cellens kompletta tillväxtmedium, blanda RPMI 1640-medium med 2 mM L-glutamin justerat för att innehålla 1,5 g / L natriumbikarbonat, 4,5 g / L glukos, 10 mM HEPES och 1,0 mM natriumpyruvat och kompletterat med 0,05 mM 2-merkaptoetanol och 0,4 mg / ml G418, 90% och fetalt bovint serum, 10%. - Subkultur cellerna i förhållandet 1: 2 när cellerna når en densitet mellan 1 x 106 celler / ml och 1 x 107 celler / ml.
- Utvärdera den förebyggande skyddande effekten på möss enligt beskrivningen i steg 6.3.1-6.3.4.
- Dela slumpmässigt 6 veckor gamla C57BL / 6-möss i fem grupper (n = 8 i varje grupp). Bedöva nakna möss med 4% isoflurangas och behåll anestesi med 2% isofluran. Raka delvis rygghåret och neomycinsulfatsalvan på mössens ögon för att förhindra torrhet.
- Immunisera mössen intranasalt med 10 μL 1 mg / mL I-OVA, BNE + I-OVA eller I-OVA NE i varje näsborre, BNE (utspädd fyra gånger med PBS) eller en PBS-kontroll 3 gånger med ett 7-dagars intervall mellan varje immunisering.
- Inokulera alla möss hypodermiskt i höger rygg med 5 x 105 E. G7-OVA-celler den 7: e dagen efter den slutliga immuniseringen.
- Vid 0, 6, 9, 12, 15 och 18 dagar efter den slutliga immuniseringen, övervaka tumörvolymerna genom att mäta två axlar av tumören med hjälp av digitala bromsok och registrera 30-dagars (efter den slutliga immuniseringen) överlevnad av mössen.
- Utvärdera den terapeutiska skyddande effekten på möss efter inokulering av E.G7-OVA-celler enligt beskrivningen i steg 6.4.1-6.4.3. För gruppering och hantering av möss, se steg 6.3.1.
- På dag 0, injicera C57BL/6-mössen subkutant i höger rygg med E.G7-OVA-celler (5 x 105 celler/mus).
- Vid 0, 7 och 14 dagar efter injektion, immunisera alla möss intranasalt immuniserade med 10 μL I-OVA, BNE + I-OVA, I-OVA NE (alla i koncentrationer av 1 mg / ml), BNE eller PBS tre gånger i varje näsborre.
- Vid 0, 6, 9, 12, 15 och 18 dagar efter injektion, övervaka tumörvolymen och registrera mössens 30-dagars överlevnad.
OBS: Om tumörvolymen överstiger 3 000 mm3 bör mössen avlivas av humana skäl, och dessa möss kommer att betraktas som döda i överlevnadskurvan. Tumörvolymen beräknas med en modifierad ellipsoid formel som indikeras i följande ekvation:
Volym = π/6 x L x B2
där L representerar tumörlängden och W representerar tumörbredden (längdenhet: mm, volymenhet: mm 3).
7. Statistisk analys
- Analysera skillnaderna i data mellan de olika grupperna med hjälp av lämplig statistisk programvara med envägs ANOVA, Tukeys multipla jämförelser eller en elevs t-test. Använd Kaplan-Meier-metoden för att uppskatta överlevnadsresultaten och jämföra grupperna med log-rank-statistik. Uttryck alla resultat som medelvärde ± SD. Betydelsen av P-värdena P < 0,05, P < 0,01 och P < 0,001 representeras med *, ** respektive *** på tomterna.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Enligt protokollet slutförde vi beredningen och in vitro och in vivo experimentell utvärdering av nanovaccinleveransen för nästumören. TEM, AFM och DLS är effektiva medel för bedömning av de grundläggande egenskaperna hos ytzetapotentialen och nanovaccinets partikelstorlek (figur 1). BEAS-2B-epitelceller är en användbar screeningmodell för in vitro-toxicitetstestning av nasala vacciner (figur 2A). Mikrofotografierna färgade med H&E illustrerar att I-OVA NE inte hade någon uppenbar slemhinnetoxicitet, inklusive vävnadsskada, blödning eller inflammatorisk cellinfiltration (figur 2B). Effektivt upptag av antigenet av BEAS-2B-celler i näshålan är en förutsättning för att antigenpresentationen ska framkalla efterföljande immunsvar (figur 3). IVIS-systemet hjälper till att belysa effekten av fördröjd frisättning av I-OVA NE in vitro och föreslår att detta nanovaccin kan fördröja snabb frisättning, förlänga tiden i näsområdet och förbättra upptaget av peptider i celler (figur 4). De förebyggande skyddsmodellerna och de terapeutiska skyddsmodellerna återspeglar direkt skyddseffekten av I-OVA NE-vaccinet och förmågan hos I-OVA NE-vaccinet att hämma tumörtillväxt och förlänga medianöverlevnadstiden för möss (figur 5). Ovanstående experimentella resultat har publicerats av Yang et al.7.
Figur 1: Fysiska egenskaper och stabilitet hos I-OVA NE . (A) Transmissionselektronmikrografi (TEM), skalstång = 100 nm. (B) Atomkraftsmikroskopi (AFM) mikrograf. X- och Y-axlarna har båda en total längd på 450 nm. (C) Storlek, diameter och fördelning. (D) Zeta-potential och distribution av I-OVA NE-analyser utförda med Nano ZS. (E) Partikelstorlekar, (F) polydispersitetsindex, (G) zetapotentialer och (H) elektroforesmobilitet för I-OVA NE i mucinstabilitetsanalyser utförda med användning av Nano ZS. Denna siffra har anpassats med tillstånd från Yang et al.7. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Toxicitet in vitro och in vivo för I-OVA NE. A) Relativ viabilitet för BEAS-2B-celler i odling som exponerats för olika peptidkoncentrationer av I-OVA, BNE+I-OVA och I-OVA NE under 24 timmar. BNE användes som kontroll. Data uttrycks som medelvärdet ± SD (n = 3). (B) Mikroskopisk undersökning av patologiska sektioner av nässlemhinnan och lungvävnaderna fixerade 5 timmar efter provokationen. Bilder togs med 100x och 200x förstoring. Denna siffra har anpassats med tillstånd från Yang et al.7. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Cellulärt upptag av I-OVA NE. In vitro konfokal fluorescensavbildning av BEAS-2B-celler behandlade i 1 timme med I-OVA eller I-OVA NE. PBS användes som kontroll, I-OVA märktes med FITC (grön fluorescens) och kärnorna färgades med DAPI (blå fluorescens) (skalstång = 50 μm). Denna siffra har anpassats med tillstånd från Yang et al.7. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: In vitro-frisättning av I-OVA NE. (A) In vivo-fluorescensavbildning av PE-märkt I-OVA i musens näshåla. Relativ fluorescensintensitet registrerad vid 0 timmar, 0,5 timmar, 1,5 timmar, 3 timmar, 6 timmar, 9 timmar, 12 timmar och 24 timmar efter nasal administrering av I-OVA eller I-OVA NE. B) Kvantifiering av fluorescensintensiteten. Data uttrycks som medelvärdet ± SD (n = 5). *: P < 0,05; **: P <0,01; och ***: P < 0,001. Denna siffra har anpassats med tillstånd från Yang et al.7. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: In vivo antitumöreffekt av I-OVA NE . (A) Genomsnittliga tumörtillväxtkurvor hos de vaccinerade mössen i de förebyggande skyddsmodellerna. (B) Procentuell överlevnad för de vaccinerade mössen i de förebyggande skyddsmodellerna. (C) Genomsnittliga tumörtillväxtkurvor hos de vaccinerade mössen i de terapeutiska skyddsmodellerna. (D) Procentuell överlevnad för de vaccinerade mössen i de terapeutiska skyddsmodellerna. *: P < 0,05; **: P < 0,01; och ***: P < 0,001. Denna siffra har anpassats med tillstånd från Yang et al.7. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Nanovacciner funktionaliserade med immunocytmembran har stora fördelar vid sjukdomsriktad terapi, och biverkningarna minimeras av egenskaper som unik tumörtropism, identifiering av specifika mål, långvarig cirkulation, förbättrade intercellulära interaktioner och låg systemisk toxicitet. De kan också enkelt integreras med andra behandlingsmoduler för att behandla cancer tillsammans16,20. Önskvärda egenskaper kan erhållas genom att kontrollerafysiska och kemiska egenskaper såsom mätning, form och elektrisk laddning. Därför har nanovacciner blivit viktiga i ett brett spektrum av tillämpningar21. Dessa egenskaper är viktiga avgörande faktorer för upptag och toxicitet, och nanovacciner kan endast göras giftfria genom manipulation22. Därför är detta protokoll för studier av fysikalisk-kemiska egenskaper, inklusive form, storlek och laddning, avgörande. TEM är ett mycket exakt instrument som har använts i stor utsträckning i det vetenskapliga samfundet i många år23. Det har blivit ett viktigt verktyg för att förstå egenskaperna hos nanostrukturerade material och för att manipulera deras beteenden. Dessutom har atomkraftmikroskopi (AFM) framkommit som en kraftfull teknik för nanomekanisk karakterisering av biologiska prover24. Det kan ge högupplöst 3D- och nanoskala information samtidigt som man analyserar ytdetaljer på atomnivå. Förutom att bestämma förändringar i partikelstorleksfördelningen kan DLS mäta både storlek och laddning för att ge information om aggregeringstillståndet för nanopartiklar i lösning25.
Det har rapporterats att höga zetapotentialvärden är avgörande för god stabilitet hos kolloidala suspensioner26. I denna studie använde vi dessa protokoll för att bedöma de fysikalisk-kemiska egenskaperna hos nanovacciner med TEM, AFM och DLS. Dessutom innehåller ytan på nässlemhinnan en stor mängd slem, vilket ger smörjning, fukt och en kemisk skyddsbarriär. Detta kan bero på interaktionen mellan slem ochvissa antigener eller leveranssystem, vilket resulterar i ackumulering och "fångst" av antigener eller leveranssystem och deras efterföljande borttagning, vilket enormt minskar leveranseffektiviteten7. Det är välkänt att stabiliteten hos nanovacciner är avgörande för nasal administrering. Därför använde vi Nano ZS för att bestämma en serie stabilitetsparametrar, inklusive partikelstorlek, polydispersitetsindex, zetapotentialer och elektroforesmobilitet, efter behandling med 0,5% mucinprotein.
In vivo-histokompatibilitets- och in vitro-cellviabilitetsanalyserna visade att detta nya nanovaccin var icke-toxiskt i intervallet för de testade koncentrationerna27. Humana normala bronkialepitelceller (BEAS-2B) är standardcellinjer som används för att studera de mänskliga luftvägarna28. På grund av dess lägre kostnad, snabbhet och minimala etiska problem är in vitro-toxicitetsbedömning en viktig metod. I denna studie bestämdes in vitro cell viabilitetsanalysen med en CCK8-analys. Dessutom utförs toxicitetsbedömning in vivo vanligtvis i djurmodeller såsom möss och råttor. Histopatologisk undersökning utförs ofta på vävnader som utsätts för nanopartiklar, såsom hjärta, öga, hjärna, lever, njure, lunga och mjälte29. Därför använde vi dessa metoder för att bedöma toxiciteten hos detta nya nanovaccin in vitro och in vivo.
Upptag och förlängning av antigener är förutsättningar för att antigeninlämning ska utlösa ett efterföljande immunsvar30. Det är nödvändigt att fastställa det cellulära upptaget av BEAS-2B och frisättningsprofilerna för det nya nanovaccinet in vivo och in vitro. CLSM är den vanligaste kommersiella implementeringen av den relevanta tekniken, som finns i de allra flesta bildlaboratorier och har ett brett spektrum av applikationer. Dessa instrument används ofta och är relativt lätta att använda; De är dock vanligtvis inte optimala för kvantitativ datainsamling.
I vårt protokoll upptäcktes cellulärt upptag av CLSM på grund av den tydliga upplösningen, optisk sektionskapacitet och mångsidighet med 3D-avbildning31. Dessutom användes IVIS för att erhålla in vivo-frisättningsprofilerna för det nya nanomaterialet eftersom det kan tillhandahålla en bildkammare med yttre ljus uteslutet för kvantitativ bioluminiscens och fluorescensavbildning in vivo och in vitro. Därför använde vi i detta protokoll dessa metoder för att bestämma cellulära upptags- och frisättningsprofiler för nya nanovacciner in vivo och in vitro.
Det är också viktigt att bedöma tumöreffekten av det nya nanovaccinet. I vår studie användes E.G7-tumörbärande modell för att bestämma vaccinets terapeutiska och skyddande effekter. EL4-celler härrör från T-lymfocyterna hos C57BL / 6-möss med höggradig malignitet. E.G7-celler härrör från EL4-lymfomceller transfekterade genom elektroporering32. I vår studie inducerade detta nanovaccin skyddande immunitet hos E.G7-OVA-tumörbärande möss. Sammanfattningsvis är det nödvändigt att upprätta en serie protokoll för att studera fysikalisk-kemiska egenskaper, stabilitet, toxicitet, frisättningsprofiler, cellulärt upptag och antitumöreffekter av nanovacciner in vitro och in vivo. Dessa protokoll kommer att ge användbara resultat för det nya nasala nanovaccinet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några kända konkurrerande ekonomiska intressen eller personliga relationer som kan ha tyckts påverka det arbete som rapporteras i denna uppsats.
Acknowledgments
Denna studie stöddes av nr 31670938, 32070924, 32000651 av National Natural Science Foundation Program of China, nr 2014jcyjA0107 och nr 2019jcyjA-msxmx0159 av Natural Science Foundation Project Program of Chongqing, nr 2020XBK24 och nr 2020XBK26 av Army Medical University Special projekt, och nr 202090031021 och nr 202090031035 av National Innovation and Entrepreneurship Program för studenter.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well plates | Corning Incorporated, USA | CLS3922 | |
| Bio-Rad 6.0 microplate reader | Bio-Rad Laboratories Incorporated Limited Co., CA, USA | Bio-Rad 6.0 | |
| CCK-8 kits | Dojindo, Japan | CK04 | |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf, Germany | 5811000398 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | D9542 | |
| fetal bovine serum (FBS) | Hyclone (Life Technology, USA) | SH30088.03 | |
| FITC-labeled I-OVA | Shanghai Botai Biotechnology Co., Ltd. |
NA | |
| HF 90/240 Incubator | Heal Force, Switzerland | NA | |
| HPLC | Shanghai Botai Biotechology Co., Ltd. | E2695 | |
| Inverted Microscope | Nikon,Japan | DSZ5000X | |
| IPC-208 | Chong Qing University, China | NA | |
| IVIS system | Caliper Life Science Limited Company | NA | |
| JEM-1230 TEM | JEOL Limited Company of Japan | 1230 TEM | |
| Malvern NANO ZS | Malvern Instruments Ltd., UK | NA | |
| MPLA | Invivogen Lit. Co. |
tlrl-mpla | |
| Neomycin Sulfate Ointment | Shanghai CP General Pharmaceutical Co. , Ltd. | H31022262 | |
| OVA257–264 | Shanghai Botai Biotechnology Co., Ltd. |
NA | |
| RPMI 1640 medium | Hyclone (Life Technology, USA) | SH30809.01 | |
| Synthetic peptide (I-OVA) conjugation of IKVAV-PA | Shanghai Botai Biotechnology Co., Ltd. |
NA | |
| Zeiss LSM800 laser scanning confocal fluorescence microscope | Zeiss, Germany | Zeiss LSM800 |
References
- Sung, H., et al. Global cancer statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 71 (3), 209-249 (2021).
- Mohammed, I., et al. The efficacy and effectiveness of the COVID-19 vaccines in reducing infection, severity, hospitalization, and mortality: A systematic review. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 18 (1), 2027160 (2022).
- Tsung, K., Norton, J. A. In situ vaccine, immunological memory and cancer cure. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 12 (1), 117-119 (2016).
- Abd-Aziz, N., Poh, C. L., Ding, X. Development of peptide-based vaccines for cancer. Journal of Oncology. 2022, 9749363 (2022).
- Mochizuki, S., et al. Immunization with antigenic peptides complexed with beta-glucan induces potent cytotoxic T-lymphocyte activity in combination with CpG-ODNs. Journal of Controlled Release. 220, 495-502 (2015).
- Kalita, P., Tripathi, T. Methodological advances in the design of peptide-based vaccines. Drug Discovery Today. 27 (5), 1367-1380 (2022).
- Yang, Y., et al. A novel self-assembled epitope peptide nanoemulsion vaccine targeting nasal mucosal epithelial cell for reinvigorating CD8(+) T cell immune activity and inhibiting tumor progression. International Journal of Biological Macromolecules. 183, 1891-1902 (2021).
- Ren, Y., et al. OVA-specific CD8+ T cells do not express granzyme B during anterior chamber associated immune deviation. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 244 (10), 1315-1321 (2006).
- Suzuki, K., et al. Preparation of hyaluronic acid-coated polymeric micelles for nasal vaccine delivery. Biomaterials Science. 10 (8), 1920-1928 (2022).
- Georas, S. N., Rezaee, F. Epithelial barrier function: at the front line of asthma immunology and allergic airway inflammation. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 134 (3), 509-520 (2014).
- Lam, J. Y., et al. A nasal omicron vaccine booster elicits potent neutralizing antibody response against emerging SARS-CoV-2 variants. Emerging Microbes & Infections. 11 (1), 964-967 (2022).
- Chai, Y., et al. Improved functional recovery of rat transected spinal cord by peptide-grafted PNIPAM based hydrogel. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 210, 112220 (2022).
- Paiva Dos Santos, B., et al. Production, purification and characterization of an elastin-like polypeptide containing the Ile-Lys-Val-Ala-Val (IKVAV) peptide for tissue engineering applications. Journal of Biotechnology. 298, 35-44 (2019).
- Okur, A. C., Erkoc, P., Kizilel, S. Targeting cancer cells via tumor-homing peptide CREKA functional PEG nanoparticles. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 147, 191-200 (2016).
- Makidon, P. E., et al. Pre-clinical evaluation of a novel nanoemulsion-based hepatitis B mucosal vaccine. PLoS One. 3 (8), 2954 (2008).
- Lin, X., et al. Oil-in-ionic liquid nanoemulsion-based intranasal delivery system for influenza split-virus vaccine. Journal of Controlled Release. 346, 380-391 (2022).
- O'Konek, J. J., et al. Intranasal nanoemulsion vaccine confers long-lasting immunomodulation and sustained unresponsiveness in a murine model of milk allergy. Allergy. 75 (4), 872-881 (2020).
- Ahmed, M., et al. A novel nanoemulsion vaccine induces mucosal Interleukin-17 responses and confers protection upon Mycobacterium tuberculosis challenge in mice. Vaccine. 35 (37), 4983-4989 (2017).
- Sun, H., et al. Induction of systemic and mucosal immunity against methicillin-resistant Staphylococcus aureus infection by a novel nanoemulsion adjuvant vaccine. International Journal of Nanomedicine. 10, 7275-7290 (2015).
- Chen, C., et al. Tumor-associated-macrophage-membrane-coated nanoparticles for improved photodynamic immunotherapy. Nano Letters. 21 (13), 5522-5531 (2021).
- Prasanna, P., et al. Current status of nanoscale drug delivery and the future of nano-vaccine development for leishmaniasis - A review. Biomedicine & Pharmacotherapy. 141, 111920 (2021).
- George, S., et al. Surface defects on plate-shaped silver nanoparticles contribute to its hazard potential in a fish gill cell line and zebrafish embryos. ACS Nano. 6 (5), 3745-3759 (2012).
- Jafari Eskandari, M., Gostariani, R., Asadi Asadabad, M. Transmission Electron Microscopy of Nanomaterials. Electron Crystallography. Singh, D., Condurache-Bota, S. , IntechOpen. London, UK. (2020).
- Kontomaris, S. V., Stylianou, A., Malamou, A. Atomic force microscopy nanoindentation method on collagen fibrils. Materials. 15 (7), 2477 (2022).
- Zielinska, A., et al. Polymeric nanoparticles: Production, characterization, toxicology and ecotoxicology. Molecules. 25 (16), 3731 (2020).
- Doncom, K. E. B., Blackman, L. D., Wright, D. B., Gibson, M. I., O'Reilly, R. K. Dispersity effects in polymer self-assemblies: A matter of hierarchical control. Chemical Society Reviews. 46 (14), 4119-4134 (2017).
- Pei, M., Li, H., Zhu, Y., Lu, J., Zhang, C. In vitro evidence of oncofetal antigen and TLR-9 agonist co-delivery by alginate nanovaccines for liver cancer immunotherapy. Biomaterials Science. 10 (11), 2865-2876 (2022).
- Zhang, J., et al. Titanium dioxide nanoparticles induced reactive oxygen species (ROS) related changes of metabolomics signatures in human normal bronchial epithelial (BEAS-2B) cells. Toxicology and Applied Pharmacology. 444, 116020 (2022).
- Kumar, V., Sharma, N., Maitra, S. S. In vitro and in vivo toxicity assessment of nanoparticles. International Nano Letters. 7 (4), 243-256 (2017).
- Tong, Y. N., et al. An immunopotentiator, ophiopogonin D, encapsulated in a nanoemulsion as a robust adjuvant to improve vaccine efficacy. Acta Biomaterialia. 77, 255-267 (2018).
- Elliott, A. D. Confocal microscopy: Principles and modern practices. Current Protocols in Cytometry. 92 (1), 68 (2020).
- Huang, Y., Zou, Y., Lin, L., Zheng, R. Ginsenoside Rg1 activates dendritic cells and acts as a vaccine adjuvant inducing protective cellular responses against lymphomas. DNA and Cell Biology. 36 (12), 1168-1177 (2017).
