Summary
Aquí, presentamos métodos detallados para la preparación y evaluación de la vacuna nasal autoensamblada para tumores de nanoemulsión in vitro e in vivo.
Abstract
Los péptidos epítopos han atraído una atención generalizada en el campo de las vacunas tumorales debido a su seguridad, alta especificidad y producción conveniente; en particular, algunos epítopos restringidos por MHC I pueden inducir una actividad efectiva de linfocitos T citotóxicos para eliminar las células tumorales. Además, la administración nasal es una técnica de administración efectiva y segura para las vacunas tumorales debido a su conveniencia y mejora el cumplimiento del paciente. Sin embargo, los péptidos de epítopos no son adecuados para la administración nasal debido a su pobre inmunogenicidad y falta de eficiencia de administración. Las nanoemulsiones (NE) son sistemas termodinámicamente estables que pueden cargarse con antígenos y administrarse directamente a la superficie de la mucosa nasal. Ile-Lys-Val-Ala-Val (IKVAV) es el pentapéptido central de la laminina, un péptido de unión a integrina expresado por las células epiteliales respiratorias humanas. En este estudio, se preparó una vacuna intranasal autoensamblada para el tumor NE del péptido epítopo que contiene el péptido sintético IKVAV-OVA257-264 (I-OVA ) mediante un método de emulsificación de baja energía. La combinación de IKVAV y OVA257-264 puede mejorar la captación de antígenos por las células epiteliales de la mucosa nasal. Aquí, establecemos un protocolo para estudiar las características fisicoquímicas mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM), microscopía de fuerza atómica (AFM) y dispersión dinámica de luz (DLS); estabilidad en presencia de proteína mucina; toxicidad mediante el examen de la viabilidad celular de las células BEAS-2B y los tejidos nasales y pulmonares de ratones C57BL/6; captación celular por microscopía de barrido láser confocal (CLSM); perfiles de liberación mediante imágenes de animales pequeños in vivo; y el efecto protector y terapéutico de la vacuna mediante el uso de un modelo portador de tumores E.G7. Anticipamos que el protocolo proporcionará pistas técnicas y teóricas para el desarrollo futuro de nuevas vacunas mucosas de péptidos de epítopos de células T.
Introduction
Como una de las innovaciones de salud pública más importantes, las vacunas desempeñan un papel clave en la lucha contra la carga mundial de enfermedades humanas1. Por ejemplo, en la actualidad, se están probando más de 120 vacunas candidatas para enfermedades COVID-19, algunas de las cuales han sido aprobadas en muchos países2. Informes recientes afirman que las vacunas contra el cáncer han mejorado efectivamente el progreso de los tratamientos clínicos contra el cáncer porque dirigen el sistema inmunológico de los pacientes con cáncer para reconocer los antígenos como extraños al cuerpo3. Además, múltiples epítopos de células T localizados dentro o fuera de las células tumorales pueden ser utilizados para diseñar vacunas peptídicas, que han mostrado ventajas en el tratamiento de cánceres metastásicos debido a la falta de toxicidad significativa asociada con la radioterapia y la quimioterapia 4,5. Desde mediados de la década de 1990, los ensayos preclínicos y clínicos para el tratamiento de tumores se han realizado principalmente utilizando vacunas de péptidos de antígeno, pero pocas vacunas exhiben un efecto terapéutico adecuado en pacientes con cáncer6. Además, las vacunas contra el cáncer con epítopos peptídicos tienen una inmunogenicidad deficiente y una eficiencia de administración insuficiente, lo que puede deberse a la rápida degradación de péptidos extracelulares que se difunden rápidamente desde el sitio de administración, lo que conduce a una absorción insuficiente de antígenos por las células inmunes7. Por lo tanto, es necesario superar estos obstáculos con la tecnología de administración de vacunas.
OVA 257-264, el epítopo MHC de unión a la clase I257-264 expresado como una proteína de fusión, es un epítopo modelo8 de uso frecuente. Además, OVA257-264 es crucial para la respuesta inmune adaptativa contra los tumores, que depende de la respuesta de los linfocitos T citotóxicos (CTL). Está mediada por células T CD8+ específicas de antígeno en el tumor, que son inducidas por el péptido OVA257-264 . Se caracteriza por una insuficiencia de granzima B, que es liberada por las células T citotóxicas, lo que lleva a la apoptosis de las células diana8. Sin embargo, la administración de péptidos OVA257-264 libres puede inducir poca actividad CTL porque la captación de estos antígenos ocurre en células no específicas en lugar de células presentadoras de antígeno (APC). La deficiencia de estimulación inmune adecuada resulta en actividad CTL5. Por lo tanto, la inducción de una actividad eficaz de CTL exige un avance considerable.
Debido a la barrera proporcionada por las células epiteliales y la secreción continua de moco, los antígenos de la vacuna se eliminan rápidamente de la mucosa nasal 9,10. El desarrollo de un vector vacunal eficiente que pueda pasar a través del tejido mucoso es crucial porque las células presentadoras de antígeno están situadas debajo del epitelio de la mucosa9. La inyección intranasal de vacunas teóricamente induce inmunidad mucosa para combatir la infección de la mucosa11. Además, la administración nasal es un método de administración eficaz y seguro para las vacunas debido a su conveniencia, la evitación de la administración intestinal y la mejora de la conformidad del paciente7. Por lo tanto, la administración nasal es un buen medio de administración para la nueva nanovacuna peptídica epitopo.
Se han ideado varios biomateriales sintéticos para combinar epítopos de tejido celular e interacciones célula-célula. Ciertas proteínas bioactivas, como Ile-Lys-Val-Ala-Val (IKVAV), han sido introducidas como parte de la estructura del hidrogel para conferir bioactividad12. Este péptido probablemente contribuye a la unión celular, la migración y el crecimiento13 y se une a las integrinas α 3β1 y α6β1 para interactuar con diferentes tipos de células cancerosas. IKVAV es un péptido de adhesión celular derivado de la proteína de la membrana basal de laminina αcadena 1 que se utilizó originalmente para modelar el microambiente neural y causar la diferenciación neuronal14. Por lo tanto, encontrar un vehículo de entrega eficiente para esta nueva vacuna es importante para el control de la enfermedad.
Los sistemas de emulsión recientemente reportados, como W805EC y MF59, también se han compuesto para la administración en la cavidad nasal de la vacuna inactivada contra la influenza o el antígeno de superficie de la hepatitis B recombinante y se ha demostrado que desencadenan la inmunidad mucosa y sistémica15. Las nanoemulsiones (NE) tienen las ventajas de una fácil administración y una coformación conveniente con adyuvantes efectivos en comparación con los sistemas de administración de partículasmucosas 16. Se ha informado que las vacunas de nanoemulsión alteran el fenotipo alérgico de una manera sostenida diferente de la desensibilización tradicional, lo que resulta en efectos supresores a largo plazo17. Otros informaron que las nanoemulsiones combinadas con antígenos inmunodominantes específicos de Mtb podrían inducir potentes respuestas de las células de la mucosa y conferir una protección significativa18. Por lo tanto, se diseñó una nueva nanovacuna intranasal autoensamblada con el péptido sintético IKVAV-OVA 257-264 (I-OVA, el péptido que consiste en IKVAV unido a OVA257-264). Es importante evaluar sistemáticamente esta nueva nanovacuna.
El objetivo de este protocolo es evaluar sistemáticamente las características fisicoquímicas, la toxicidad y la estabilidad de la nanovacuna, detectar si la captación de antígenos y los efectos protectores y terapéuticos se potencian utilizando medios técnicos, y elaborar los principales contenidos experimentales. En este estudio, establecimos una serie de protocolos para estudiar las características fisicoquímicas y la estabilidad, determinar la magnitud de la toxicidad de la I-OVA NE a las células BEAS-2B por CCK-8, y observar la capacidad de presentación de antígeno de las células BEAS-2B a la vacuna mediante microscopía confocal, evaluar los perfiles de liberación de esta nueva nanovacuna in vivo e in vitro., y detectar el efecto protector y terapéutico de esta vacuna mediante el uso de un modelo de ratón portador de tumores E.G7-OVA.
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Protocol
Los experimentos con animales se llevaron a cabo de acuerdo con la Guía para la revisión ética del bienestar animal (GB / T 35892-2018) y fueron aprobados por el Comité de Ética y Bienestar de los Animales de Laboratorio de la Tercera Universidad Médica Militar. Los ratones fueron sacrificados por una inyección intraperitoneal de 100 mg / kg de pentobarbital de sodio al 1%.
1. Preparación del I-OVA NE
- Mezcle 1 mg de monofosforilo lípido A (MPLA) con 100 μL de DMSO, vórtice durante 5 min, y deje reposar durante 4 h a temperatura ambiente (RT) para que se disuelva por completo.
- Agregue Tween 80 e I-OVA cuantitativamente y mezcle.
NOTA: Tween 80 e I-OVA se mezclaron en una relación de masa de 25:119. - Añadir escualeno a la mezcla preparada en el paso 1.2 (7:3, Smix: escualeno).
- Añadir 100 μL de solución MPLA (10 mg/ml) a la mezcla preparada en la etapa 1.3.
- Preparar la vacuna de nanoemulsión utilizando métodos de emulsificación de baja energía19: agregue la solución mezclada a las gotas de agua a aproximadamente el 70% del volumen total y revuelva suavemente para obtener una mezcla transparente y que fluya fácilmente.
NOTA: El control BNE (emulsión en blanco) se preparó por el mismo método, reemplazando el agua con I-OVA.
2. Caracterización fisicoquímica y estabilidad
NOTA: Evalúe la distribución del tamaño de las gotas, el potencial zeta y otros datos fisicoquímicos de la vacuna I-OVA NE siguiendo los pasos 2.1-2.3; realizar la caracterización morfológica de la vacuna I-OVA NE siguiendo los pasos 2.4-2.7; y examinar la estructura 3D de la vacuna I-OVA NE siguiendo los pasos 2.8-2.9.
- Mezcle 50 mg de proteína de mucina con 100 ml de agua para inyección para preparar una solución de mucina al 0,05%.
- Diluir 4 mg/mL I-OVA NE 200 veces con 0,05 mg/ml de proteína mucina o agua desionizada.
- Observe los tamaños de partícula, el potencial zeta, el índice de polidispersidad (PDI) y la movilidad electroforética a 25 °C utilizando un nanoanalizador19.
- Diluir 10 μL de I-OVA NE 200 veces con 2 ml de agua desionizada.
- Colocar 5 μL de vacuna I-OVA NE prediluida (paso 2.4) en una rejilla de cobre recubierta de carbono y cubrirla con 10 μL de ácido fosfotúngstico al 1% durante 3 min.
- Retire el exceso de ácido fosfotúngstico con papel de filtro.
- Obtenga imágenes usando TEM. Colocar una muestra de 10 μL diluida 50 veces en una rejilla de cobre al carbono de 100 mallas y dejar reposar a temperatura ambiente (RT) durante 5 minutos antes de añadir 10 μL de ácido fosfotúngstico (1%, pH 7,4). Examinar todas las muestras por TEM a una tensión de 120 kV.
- Caracterizar la morfología molecular del I-OVA NE utilizando un microscopio de fuerza atómica de alta resolución. Obtener las imágenes en color de I-OVA NE en las siguientes condiciones: para sondas de tungsteno (constante de fuerza: 0,06 N·m-1); rango de escaneo: 450 nm x 450 nm; Modo de pulsación: modo de imagen; y método de escaneo: escaneo punto por punto en RT.
3. Ensayos de toxicidad in vitro e in vivo
NOTA: La toxicidad in vitro de la vacuna I-OVA NE se evaluó siguiendo los pasos 3.1-3.9, y la toxicidad in vivo de la vacuna I-OVA NE se evaluó siguiendo los pasos 3.10-3.13.
- Revivir las células epiteliales humanas BEAS-2B siguiendo los pasos 3.1.1-3.1.4 y cultivarlas en un medio de crecimiento completo a 37 °C en una incubadora deCO2 al 5%.
NOTA: Para preparar el medio de crecimiento completo, agregue suero bovino fetal (FBS) y penicilina/estreptomicina al medio RPMI-1640 a concentraciones finales de 10% y 1%, respectivamente.- Encienda el baño maría y ajuste la temperatura a 37 °C. Retirar los viales celulares congelados en nitrógeno líquido y descongelar rápidamente en un baño maría a 37 °C.
- Después de la descongelación, pipetear rápidamente las células en un tubo de centrífuga estéril de 15 ml, agregar 2 ml del medio de crecimiento completo y centrifugar a 129 x g durante 5 min.
- Retire el sobrenadante, agregue 2 ml del medio de crecimiento completo para resuspender las células y centrifugue a 129 x g durante 5 min.
- Retirar el sobrenadante, añadir 6 ml de medio de crecimiento completo para resuspender las células y transferir las células a un matraz de cultivo T25 para cultivar las células a 37 °C en una incubadora deCO2 al 5%.
- Cuando la densidad celular alcance el 80%-90%, deseche el medio de cultivo y lave las células dos veces con 2 mL de PBS. Añadir 1 ml de tripsina al 0,25% para digerir las células durante 1-2 min. Cuando se observe el redondeo de las células, agregue inmediatamente 4 ml del medio de crecimiento completo para neutralizar la tripsina.
- Mezclar y aspirar las muestras en un tubo de centrífuga estéril de 15 ml y centrifugar a 129 x g durante 5 min.
- Retire el sobrenadante y resuspenda las células en 1 ml de medio completo RPMI-1640. Use 20 μL para el recuento de células y diluya las células a 1 x 105 células/ml.
- Colocar en placa las células BEAS-2B a una densidad de 1 x 104 células/pocillo en placas de 96 pocillos en 100 μL de medio completo RPMI-1640 y preincubar las placas durante 24 h a 37 °C en una incubadora deCO2 al 5%.
- Desechar el sobrenadante y añadir 100 μL de I-OVA NE, 100 μL de I-OVA+BNE (mezclado físicamente) y 100 μL de I-OVA prediluido con un medio de crecimiento completo a varias concentraciones finales (0,5 mg/ml, 1 mg/ml, 2 mg/ml, 4 mg/ml, 8 mg/ml), con BNE como control. Incubar durante 24 h a 37 °C.
NOTA: Añadir 100 μL de medio de crecimiento completo a los grupos de control negativo y 100 μL de suspensión celular (1 x 105/ml) a los grupos de control positivo. - Retire el medio y agregue 90 μL de medio de crecimiento completo y 10 μL de solución CCK-8 a cada pocillo de la placa.
- Incubar la placa durante 2 h a 37 °C en una incubadora deCO2 al 5%.
- Mida la absorbancia de cada pocillo a 450 nm utilizando un lector de placas marcado con enzimas.
- Calcule la relación de supervivencia de las células BEAS-2B como se indica en la siguiente ecuación:
(Muestra OD450− Control negativo OD450/Control positivo OD450− Control negativo OD450) × 100% - Divida aleatoriamente ratones C57BL/6 de 6 semanas de edad en cinco grupos (n = 5 en cada grupo) y anestesiarlos con isoflurano al 4% para la inducción. Mantener la anestesia con isoflurano al 2%. Use ungüento de sulfato de neomicina en los ojos de los ratones para prevenir la sequedad.
- Use puntas de pipeta de 10 μL para realizar la inmunización nasal de los ratones con 10 μL / fosa nasal de I-OVA, I-OVA + BNE e IOVA NE a 4 mg / ml durante los 3 días. Utilice BNE y PBS como control experimental.
NOTA: Proporcione soporte térmico hasta que el animal se recupere de la anestesia. - Eutanasia a todos los ratones mediante una inyección intraperitoneal de 100 mg/kg de pentobarbital sódico al 1% el día 4.
- Cortar muestras de aproximadamente 3 mm de espesor de tejidos nasales con tijeras y extraer los tejidos pulmonares.
- Fijar los tejidos nasales y todo el tejido pulmonar en paraformaldehído al 4% durante 24 h. Deshidratar los tejidos a través de un gradiente seriado de alcohol y xileno y luego incrustar en parafina. Cortar los bloques de cera terminados en una cortadora de parafina a un espesor de 4 μm.
- Manchar las secciones con hematoxilina y eosina (H&E). Luego, observe la toxicidad de la mucosa, incluyendo hiperemia, edema, infiltración de neutrófilos y daño estructural en la mucosa nasal y el tejido pulmonar, bajo un microscopio (100x y 200x)7.
4. Captación celular in vitro
- Placas BEAS-2B a una densidad de 5 x 10 5 células/pocillo en placas de 12 pocillos con cubreobjetos en 2 mL del medio de crecimiento completo y preincubar las placas durante la noche a 37 °C en una incubadora deCO2 al 5%.
- Añadir 100 μL de I-OVA NE marcado con FITC (pureza: 98,3%, producido por la empresa, 4 mg/ml) o I-OVA (4 mg/ml) a 900 μL de suspensión celular y colocar a 37 °C durante 90 min.
NOTA: Prepare I-OVA NE con la etiqueta FITC como se describe en el paso 4.1. Agregue 1 ml de medio de crecimiento completo a los grupos de control. - Lavar tres veces con PBS 0,1 M (1 ml/pocillo) durante 30 min a 37 °C después del tratamiento.
- Fijar estas muestras con paraformaldehído al 4% durante 20 minutos en la oscuridad. Después de la fijación, retirar el paraformaldehído y lavar 3 veces con 0,1 M PBS (1 ml/pocillo) durante 30 min a 37 °C.
- Preincubar las muestras con DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindol) a una concentración final de 10 μg/ml durante 10 min en la oscuridad, y luego lavar 5 veces con 0,1 M PBS (1 mL/pocillo) durante 30 min a 37 °C después del tratamiento.
- Obtenga la captación celular por CLSM con los siguientes ajustes de parámetros: Tamaño de cuadro: 512 px x 512 px, Velocidad de escaneo: 8; Paso de línea: 1; Promedio: 2.
5. Liberación in vivo
- Anestesiar ratones desnudos con gas isoflurano al 4% y mantener la anestesia con isoflurano al 2%. Inmunizar ratones desnudos por vía intranasal con 10 μL de I-OVA marcado con PE a 4 mg / ml o I-OVA NE marcado con PE a 4 mg / ml en cada fosa nasal.
- A las 0 h, 0,5 h, 1,5 h, 3, 6 h, 9 h, 12 h y 24 h, capturar todos los ratones bajo anestesia por el sistema IVIS.
- Realice una exploración de fondo inmediatamente antes de la administración intranasal para proporcionar un valor umbral (Min = 1.06 x 106) para ajustar las imágenes recopiladas en todos los puntos temporales.
- Haga clic en el software Living Image para iniciar la secuencia y haga clic en Inicializar para inicializar el sistema IVIS
- Cuando se inicializa, la luz de estado de temperatura en el panel de control de adquisición IVIS es roja. Cuando la luz de estado de temperatura cambia a verde, se pueden realizar imágenes.
- Haga clic en Asistente para imágenes y, a continuación, elija Fluorescencia en el cuadro de diálogo que aparece.
- Ajuste los siguientes parámetros: Tiempo de exposición: auto sec, Binning: 8, F/Stop: 2, Campo de visión: D.
- Seleccione el filtro de excitación de 620 nm y el filtro de emisión de 670 nm. Haga clic en Adquirir secuencia para adquirir la imagen.
- Procese las imágenes en vivo de todos los ratones y los datos de radiación con el software Living Image.
- Después de adquirir la imagen, haga clic en Herramientas de ROI en la paleta de herramientas, seleccione Círculo y haga un círculo de ROI .
- Haga clic en Medir ROI para obtener un valor cuantitativo para el área de ROI .
6. Eficacia antitumoral in vivo
- Refrescar y cultivar las células de Linfoma E.G7-OVA de ratón de EL4 con un medio de crecimiento completo siguiendo los pasos 2.1.1-2.1.4.
NOTA: Para preparar el medio de crecimiento completo de células E.G7-OVA, mezcle RPMI 1640 medio con 2 mM de L-glutamina ajustado para contener 1.5 g / L de bicarbonato de sodio, 4.5 g / L de glucosa, 10 mM HEPES y 1.0 mM de piruvato de sodio y suplementado con 0.05 mM de 2-mercaptoetanol y 0.4 mg / ml de G418, 90%, y suero fetal bovino, 10%. - Subcultivo de las células en una proporción de 1:2 cuando las células alcanzan una densidad entre 1 x 106 células/ml y 1 x 107 células/ml.
- Evaluar el efecto protector preventivo en ratones como se describe en los pasos 6.3.1-6.3.4..
- Divida aleatoriamente ratones C57BL/6 de 6 semanas de edad en cinco grupos (n = 8 en cada grupo). Anestesiar ratones desnudos con gas isoflurano al 4% y mantener la anestesia con isoflurano al 2%. Afeite parcialmente el pelo de la espalda y el ungüento de sulfato de neomicina en los ojos de los ratones para evitar la sequedad.
- Inmunizar intranasalmente a los ratones con 10 μL de 1 mg/mL I-OVA, BNO + I-OVA, o I-OVA NE en cada fosa nasal, BNE (diluido cuatro veces con PBS), o un control de PBS 3 veces con un intervalo de 7 días entre cada inmunización.
- Inocular a todos los ratones hipodérmicamente en la espalda derecha con 5 x 105 células E. G7-OVA el séptimo día después de la inmunización final.
- A los 0, 6, 9, 12, 15 y 18 días después de la inmunización final, monitoree los volúmenes del tumor midiendo dos ejes del tumor usando calibradores digitales y registre la supervivencia de 30 días (después de la inmunización final) de los ratones.
- Evaluar el efecto protector terapéutico en ratones después de inocular células E.G7-OVA como se describe en los pasos 6.4.1-6.4.3. Para la agrupación y el manejo de ratones, véase el paso 6.3.1.
- El día 0, inyecte los ratones C57BL / 6 por vía subcutánea en la espalda derecha con células E.G7-OVA (5 x 105 células / ratón).
- A los 0, 7 y 14 días después de la inyección, inmunizar a todos los ratones inmunizados por vía intranasal con 10 μL de I-OVA, BNE+I-OVA, I-OVA NE (todos a concentraciones de 1 mg/ml), BNE, o PBS tres veces en cada fosa nasal.
- A los 0, 6, 9, 12, 15 y 18 días después de la inyección, controle el volumen del tumor y registre la supervivencia a los 30 días de los ratones.
NOTA: Si el volumen del tumor excede los 3.000 mm3, los ratones deben ser sacrificados por razones humanitarias, y estos ratones se considerarán muertos en la curva de supervivencia. El volumen tumoral se calcula mediante una fórmula elipsoidal modificada como se indica en la siguiente ecuación:
Volumen = π/6 x L x W2
donde L representa la longitud del tumor y W representa el ancho del tumor (unidad de longitud: mm, unidad de volumen: mm3).
7. Análisis estadístico
- Analice las diferencias en los datos entre los diferentes grupos utilizando el software estadístico apropiado con ANOVA unidireccional, comparaciones múltiples de Tukey o una prueba t de Student. Utilice el método de Kaplan-Meier para estimar los resultados de supervivencia y comparar los grupos con las estadísticas de rango logarítmico. Expresar todos los resultados como media ± DE. La significación de los valores de P P < 0,05, P < 0,01 y P < 0,001 se representa utilizando *, ** y ***, respectivamente, en las gráficas.
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Representative Results
De acuerdo con el protocolo, completamos la preparación y la evaluación experimental in vitro e in vivo de la administración de la nanovacuna tumoral nasal. TEM, AFM y DLS son medios eficaces para la evaluación de las características básicas del potencial zeta superficial y el tamaño de partícula de la nanovacuna (Figura 1). Las células epiteliales BEAS-2B son un modelo de cribado útil para las pruebas de toxicidad in vitro de vacunas nasales (Figura 2A). Las microfotografías teñidas con H&E ilustran que I-OVA NE no tenía toxicidad mucosa obvia, incluyendo daño tisular, sangrado o infiltración celular inflamatoria (Figura 2B). La absorción eficiente del antígeno por las células BEAS-2B en la cavidad nasal es un requisito previo para que la presentación del antígeno provoque respuestas inmunes posteriores (Figura 3). El sistema IVIS ayuda a dilucidar el efecto de liberación sostenida de I-OVA NE in vitro y sugiere que esta nanovacuna puede retrasar la liberación rápida, prolongar el tiempo en el área nasal y mejorar la absorción de péptidos en las células (Figura 4). Los modelos de protección preventiva y los modelos de protección terapéutica reflejan directamente el efecto protector de la vacuna I-OVA NE y la capacidad de la vacuna I-OVA NE para inhibir el crecimiento tumoral y prolongar el tiempo medio de supervivencia de los ratones (Figura 5). Los resultados experimentales anteriores han sido publicados por Yang et al.7.
Figura 1: Características físicas y estabilidad de I-OVA NE . (A) Micrografía electrónica de transmisión (TEM), barra de escala = 100 nm. (B) Microscopía de fuerza atómica (AFM) micrografía. Los ejes X e Y tienen una longitud total de 450 nm. (C) Tamaño diámetro y distribución. (D) Análisis de potencial zeta y distribución de I-OVA NE realizados utilizando Nano ZS. (E) Tamaños de partícula, (F) índices de polidispersidad, (G) potenciales zeta, y (H) movilidad de electroforesis de I-OVA NE en análisis de estabilidad de mucina realizados utilizando Nano ZS. Esta figura ha sido adaptada con permiso de Yang et al.7. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Toxicidad in vitro e in vivo de I-OVA NE. (A) Viabilidad relativa de células BEAS-2B en cultivo expuestas a diferentes concentraciones peptídicas de I-OVA, BNE+I-OVA, e I-OVA NE durante 24 h. Se utilizó BNE como control. Los datos se expresan como la media ± DE (n = 3). (B) Examen microscópico de secciones patológicas de la mucosa nasal y tejidos pulmonares fijadas 5 h después del desafío. Las imágenes fueron capturadas con un aumento de 100x y 200x. Esta figura ha sido adaptada con permiso de Yang et al.7. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Captación celular del I-OVA NE. Imágenes de fluorescencia confocal in vitro de células BEAS-2B tratadas durante 1 h con I-OVA o I-OVA NE. PBS se utilizó como control, I-OVA se marcó con FITC (fluorescencia verde) y los núcleos se tiñeron con DAPI (fluorescencia azul) (barra de escala = 50 μm). Esta figura ha sido adaptada con permiso de Yang et al.7. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Liberación in vitro de I-OVA NE . (A) Imágenes de fluorescencia in vivo de I-OVA marcado con PE en la cavidad nasal del ratón. Intensidad relativa de fluorescencia registrada a las 0 h, 0,5 h, 1,5 h, 3 h, 6 h, 9 h, 12 h y 24 h después de la administración nasal de I-OVA o I-OVA NE. (B) Cuantificación de la intensidad de fluorescencia. Los datos se expresan como la media ± DE (n = 5). *: P < 0,05; **: P <0,01; y ***: P < 0,001. Esta figura ha sido adaptada con permiso de Yang et al.7. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Eficacia antitumoral in vivo de I-OVA NE . (A) Curvas medias de crecimiento tumoral de los ratones vacunados en los modelos de protección preventiva. (B) Porcentaje de supervivencia de los ratones vacunados en los modelos de protección preventiva. (C) Curvas medias de crecimiento tumoral de los ratones vacunados en los modelos terapéuticos de protección. (D) Porcentaje de supervivencia de los ratones vacunados en los modelos terapéuticos de protección. *: P < 0,05; **: P < 0,01; y ***: P < 0,001. Esta figura ha sido adaptada con permiso de Yang et al.7. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Las nanovacunas funcionalizadas con membranas de inmunocitos tienen grandes ventajas en la terapia dirigida a la enfermedad, y los efectos secundarios se minimizan por propiedades tales como tropismo tumoral único, la identificación de objetivos específicos, circulación prolongada, interacciones intercelulares mejoradas y baja toxicidad sistémica. También se pueden integrar fácilmente con otros módulos de tratamiento para tratar cánceres de forma cooperativa16,20. Los atributos deseables se pueden obtener controlando propiedades físicas y químicas como la medición, la forma y la carga eléctrica. Por lo tanto, las nanovacunas se han vuelto importantes en una amplia gama de aplicaciones21. Estas propiedades son factores decisivos importantes en cuanto a la absorción y toxicidad, y las nanovacunas sólo pueden volverse no tóxicas mediante manipulación22. Por lo tanto, este protocolo para el estudio de las características fisicoquímicas, incluyendo la forma, el tamaño y la carga, es vital. TEM es un instrumento de alta precisión que ha sido ampliamente utilizado en la comunidad científica durante muchos años23. Se ha convertido en una herramienta esencial para comprender las propiedades de los materiales nanoestructurados y manipular sus comportamientos. Además, la microscopía de fuerza atómica (AFM) ha surgido como una técnica poderosa para la caracterización nanomecánica de muestras biológicas24. Puede proporcionar información 3D y nanoescala de alta resolución al tiempo que analiza los detalles de la superficie a nivel atómico. Además de determinar los cambios en la distribución del tamaño de partícula, DLS puede medir tanto el tamaño como la carga para proporcionar información sobre el estado de agregación de las nanopartículas en la solución25.
Se ha relatado que los valores altos de potencial zeta son esenciales para la buena estabilidad de las suspensiones coloidales26. En este estudio, utilizamos estos protocolos para evaluar las características fisicoquímicas de las nanovacunas con TEM, AFM y DLS. Además, la superficie de la mucosa nasal contiene una gran cantidad de moco, que proporciona lubricación, humedad y una barrera protectora química. Esto puede deberse a la interacción entre el moco y algunos antígenos o sistemas de entrega, resultando en la acumulación y "captura" de antígenos o sistemas de entrega y su posterior eliminación, reduciendo enormemente la eficiencia de entrega7. Es bien sabido que la estabilidad de las nanovacunas es vital para la administración nasal. Por lo tanto, utilizamos Nano ZS para determinar una serie de parámetros de estabilidad, incluyendo el tamaño de partícula, los índices de polidispersidad, los potenciales zeta y la movilidad de la electroforesis, después del tratamiento con proteína mucina al 0,5%.
Los ensayos de histocompatibilidad in vivo y viabilidad celular in vitro mostraron que esta nueva nanovacuna no era tóxica en el rango de las concentraciones probadas27. Las células epiteliales bronquiales normales humanas (BEAS-2B) son líneas celulares estándar utilizadas para estudiar el tracto respiratorio humano28. Debido a su menor costo, rapidez y preocupaciones éticas mínimas, la evaluación de toxicidad in vitro es un método importante. En este estudio, el ensayo de viabilidad celular in vitro se determinó mediante un ensayo CCK8. Además, la evaluación de la toxicidad in vivo generalmente se realiza en modelos animales como ratones y ratas. El examen histopatológico a menudo se realiza en tejidos expuestos a nanopartículas, como el corazón, el ojo, el cerebro, el hígado, el riñón, el pulmón y el bazo29. Por lo tanto, utilizamos estos métodos para evaluar la toxicidad de esta nueva nanovacuna in vitro e in vivo.
La captación y prolongación del antígeno son requisitos previos para que la presentación del antígeno desencadene una respuesta inmune posterior30. Es necesario determinar la captación celular de BEAS-2B y los perfiles de liberación de la nueva nanovacuna in vivo e in vitro. CLSM es la implementación comercial más común de la tecnología relevante, que se puede encontrar en la gran mayoría de los laboratorios de imagen y tiene una amplia gama de aplicaciones. Estos instrumentos son ampliamente utilizados y relativamente fáciles de usar; sin embargo, generalmente no son óptimos para la recopilación de datos cuantitativos.
En nuestro protocolo, la captación celular fue detectada por CLSM debido a la resolución clara, la capacidad de sección óptica y la versatilidad con imágenes3D 31. Además, se utilizó IVIS para obtener los perfiles de liberación in vivo del nuevo nanomaterial, ya que puede proporcionar una cámara de imagen con luz exterior excluida para imágenes cuantitativas de bioluminiscencia y fluorescencia in vivo e in vitro. Por lo tanto, en este protocolo, utilizamos estos métodos para determinar los perfiles de captación y liberación celular de nuevas nanovacunas in vivo e in vitro.
También es importante evaluar la eficacia tumoral de la nueva nanovacuna. En nuestro estudio, se utilizó el modelo portador de tumores E.G7 para determinar los efectos terapéuticos y protectores de la vacuna. Las células EL4 se derivan de los linfocitos T de ratones C57BL / 6 con malignidad de alto grado. Las células E.G7 se derivan de células de linfoma EL4 transfectadas por electroporación32. En nuestro estudio, esta nanovacuna indujo inmunidad protectora en ratones portadores de tumores E.G7-OVA. En resumen, es necesario establecer una serie de protocolos para estudiar las características fisicoquímicas, estabilidad, toxicidad, perfiles de liberación, captación celular y efectos antitumorales de las nanovacunas in vitro e in vivo. Estos protocolos proporcionarán resultados útiles para la nueva nanovacuna nasal.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses financieros o relaciones personales contradictorias conocidos que podrían haber parecido influir en el trabajo reportado en este documento.
Acknowledgments
Este estudio fue apoyado por el No. 31670938, 32070924, 32000651 del Programa de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China, No. 2014jcyjA0107 y No. 2019jcyjA-msxmx0159 del Programa de Proyectos de la Fundación de Ciencias Naturales de Chongqing, No. 2020XBK24 y No. 2020XBK26 de los proyectos especiales de la Universidad Médica del Ejército, y No. 202090031021 y No. 202090031035 del Programa Nacional de Innovación y Emprendimiento para estudiantes universitarios.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well plates | Corning Incorporated, USA | CLS3922 | |
| Bio-Rad 6.0 microplate reader | Bio-Rad Laboratories Incorporated Limited Co., CA, USA | Bio-Rad 6.0 | |
| CCK-8 kits | Dojindo, Japan | CK04 | |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf, Germany | 5811000398 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | D9542 | |
| fetal bovine serum (FBS) | Hyclone (Life Technology, USA) | SH30088.03 | |
| FITC-labeled I-OVA | Shanghai Botai Biotechnology Co., Ltd. |
NA | |
| HF 90/240 Incubator | Heal Force, Switzerland | NA | |
| HPLC | Shanghai Botai Biotechology Co., Ltd. | E2695 | |
| Inverted Microscope | Nikon,Japan | DSZ5000X | |
| IPC-208 | Chong Qing University, China | NA | |
| IVIS system | Caliper Life Science Limited Company | NA | |
| JEM-1230 TEM | JEOL Limited Company of Japan | 1230 TEM | |
| Malvern NANO ZS | Malvern Instruments Ltd., UK | NA | |
| MPLA | Invivogen Lit. Co. |
tlrl-mpla | |
| Neomycin Sulfate Ointment | Shanghai CP General Pharmaceutical Co. , Ltd. | H31022262 | |
| OVA257–264 | Shanghai Botai Biotechnology Co., Ltd. |
NA | |
| RPMI 1640 medium | Hyclone (Life Technology, USA) | SH30809.01 | |
| Synthetic peptide (I-OVA) conjugation of IKVAV-PA | Shanghai Botai Biotechnology Co., Ltd. |
NA | |
| Zeiss LSM800 laser scanning confocal fluorescence microscope | Zeiss, Germany | Zeiss LSM800 |
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