Waiting
Login-Verarbeitung ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

عزل اللمف المساريقي المتدفق في الفئران لتحديد حركية امتصاص الدهون الغذائية وإفراز الكيلوميكرون في الجسم الحي

Published: November 30, 2022 doi: 10.3791/64338
Automatic Translation
1, 1, 1
1Division of Endocrinology and Metabolism, Department of Medicine, School of Medicine, University of Pittsburgh

Summary

يصف هذا البروتوكول بروتوكولا جراحيا مفصلا لعزل اللمف المعوي المتدفق استجابة لضخ المغذيات داخل الاثني عشر في الفئران. هذا يسمح بالتحديد الفسيولوجي لامتصاص الدهون المعوية الكلية وتوليف الكيلوميكرون وإفرازه استجابة لمختلف العناصر الغذائية التجريبية.

Abstract

البروتينات الدهنية المعوية ، وخاصة الكيلومكرونات الغنية بالدهون الثلاثية ، هي المحرك الرئيسي لعملية التمثيل الغذائي والالتهابات وأمراض القلب والأوعية الدموية. ومع ذلك ، فإن عزل البروتينات الدهنية المعوية أمر صعب للغاية في الجسم الحي لأنها تفرز أولا من الأمعاء الدقيقة إلى اللمفاويات المساريقي. ثم يفرغ اللمف المحتوي على الكيلوميكرون في الوريد تحت الترقوة من القناة الصدرية لتوصيل مكونات الوجبة إلى القلب والرئتين ، وفي النهاية الدورة الدموية للجسم بالكامل. من المستحيل عزل الكيلوميكرون الساذج عن الدم لأن الدهون الثلاثية كيلومكرون تخضع للتحلل المائي فور التفاعل مع ليباز البروتين الدهني ومستقبلات البروتين الدهني الأخرى في الدورة الدموية. لذلك ، فإن إجراء الناسور الليمفاوي الأصلي لمدة 2 يوم ، الذي وصفه Bollman et al. في الفئران ، قد استخدم تاريخيا لعزل الليمفاوية المساريقية الطازجة قبل دخولها إلى الوريد الصدري. تم تحسين هذا البروتوكول وإضفاء الطابع المهني عليه من قبل مختبر باتريك تسو على مدى السنوات ال 45 الماضية ، مما يسمح بتحليل هذه البروتينات الدهنية الحرجة والإفرازات من الأمعاء. تم الآن تحديث إجراء الناسور الليمفاوي Tso ويتم تقديمه هنا بصريا لأول مرة. هذا الإجراء المنقح هو تقنية جراحية ليوم واحد لتركيب أنبوب تغذية الاثني عشر ، وقنية القناة الليمفاوية المساريقية ، وجمع الليمفاوية بعد تناول وجبة في الفئران الواعية. تشمل الفوائد الرئيسية لهذه التقنيات الجديدة القدرة على جمع الليمفاوية بشكل متكرر من الفئران (التي تسخر قوة نماذج الفئران الجينية). انخفاض وقت التخدير للفئران أثناء زرع أنبوب ضخ الاثني عشر والقنية الليمفاوية ؛ القدرة على أخذ عينات من الليمفاوية باستمرار طوال فترة التغذية وما بعد الأكل ؛ القدرة على قياس الهرمونات والسيتوكينات كميا قبل تخفيفها والتحلل الأنزيمي في الدم ؛ والقدرة على جمع كميات كبيرة من الليمفاوية لعزل البروتينات الدهنية المعوية. هذه التقنية هي أداة قوية لقياس امتصاص المغذيات الغذائية بشكل مباشر وكمي ، وتخليق البروتين الدهني المعوي ، وإفراز الكيلوميكرون.

Introduction

الأهمية الفسيولوجية للجهاز اللمفاوي المساريقي
تم وصف اللمفاويات المساريقية بشكل ما منذ ~ 300 قبل الميلاد عندما وصف هيروفيلوس نظام البوابة الكبدية وجميع "الأوردة الامتصاصية في الأمعاء"1،2،3،4،5. لأكثر من 1700 عام بعد هذا الوصف الأولي ، كانت السمة المميزة لللمفاويات المعوية هي وجود سائل حليبي في اللمف المساريقي بعد وقت قصير من الوجبة3. من المعروف الآن أن اللمف اللبني المحتوي على الكيلوميكرون (اللمف "chylous") لا يصب في الوريد البابي والكبد ، ولكنه ينتقل بدلا من ذلك عبر cisterna chyli إلى القناة الصدرية ، وفي النهاية ، ينضم إلى الدم في الوريد تحت الترقوةالأيسر 6. بسبب هذا الترتيب التشريحي ، ينتقل اللمف الكيلوس أولا عبر القلب والرئتين قبل أن ينتشر عبر بقية الجسم. هذا يعني أن القلب والرئتين يحصلان على "تمريرة أولى" عند الإفرازات في اللمفالمساريقي 7.

يتمثل الدور الرئيسي لللمفاويات المساريقية في نقلها للدهون الغذائية من الأمعاء الدقيقة8،9،10. تشريحيا ، كيلوميكرون ، الخلايا المناعية المعوية 11،12،13،14 ، هرمونات الأمعاء 15،16،17،18 ، مستضدات 19،20،21 ، مركبات غير كيلوميكرون محبة للدهون22,23 ، ويدخل السائل الزائد إلى الأوعية اللبنية الكامنة تحت الغشاء القاعدي المعوي ثم يتركز عبر الشعيرات الدموية اللمفاوية إلى العقد الليمفاوية المساريقي. من المحتمل أن يكون هناك العديد من المكونات اللمفاوية المساريقية غير المعروفة ، بما في ذلك المستقلبات والمستضدات والملوثات البيئية والمغذيات وجزيئات الإشارة.

لم يتم تحديد مكونات الليمفاوية المساريقية بشكل منهجي ، ويرجع ذلك إلى حد كبير إلى صعوبة عزل الليمفاوية المساريقي. لطالما كان الوصول إلى اللمف المساريقي تحديا خطيرا لأن القنوات الليمفاوية عديمة اللون ، وباستثناء بعد تناول وجبة دهنية عندما تصبح شيلوس وحليبي ، تحتوي اللمفاويات المساريقية على سائل لمفاوي عديم اللون6،8،9،10.

الطرق الحالية والشائعة لعزل الليمفاوية المعوية
لا يمكن الوصول إلى الليمف المساريقي في البشر (باستثناء الظروف النادرة والقاسية التي حدثت فيها صدمة خطيرة في الجهاز الهضمي)24. في الجسم الحي جمع الليمفاوية معقدة جراحيا ومتطلبة. تم وصف إجراء الناسور الليمفاوي الأصلي لمدة يومين بواسطة Bollman et al.25 وتم تحسينه واحترافه من قبل مختبر باتريك تسو على مدار ال 45 عاماالماضية 26,27. يسمح إجراء الناسور الليمفاوي للمحققين بجمع الليمفاوية المتدفقة من الحيوانات الواعية خلال فترة ضخ الدهون في الاثني عشر لمدة 6 ساعات.

تم استخدام نموذج الناسور الليمفاوي بشكل أساسي في الفئران لقياس معدل تدفق الليمفاوية ، وإخراج الدهون الثلاثية والكوليسترول (أو غيرها من المركبات المشبعة بالاثني عشر) ، وتكوين الكيلوميكرون ، وتركيزات الهرمونات المعوية. إلى حد أقل ، يمكن أيضا استخدام هذه التقنية في الفئران ، على الرغم من أن البقاء الجراحي وحجم الليمفاوية يعانيان. بسبب الصعوبات في رؤية القنوات الليمفاوية المساريقية ، تضمنت الطرق التاريخية قنيات الليمف المساريقي في الحيوانات الكبيرة مثل الخنازير الصغيرة28 والأغنام29 والخنازير30 والكلاب31 والجرذان17. العمل مع هذه النماذج الأكبر يتطلب موارد كثيفة ولا يسمح بإجراء دراسات في نماذج الضربة القاضية أو الضربة القاضية.

كما استخدمت نهج بديلة. يمكن عزل الكيلوميكرونات من الدم في حالة ما بعد الأكل (على الرغم من أنها ستتحلل جزئيا بواسطة ليباز البروتين الدهني في البلازما)32،33،34،35. يمكن أيضا تقنية القناة الصدرية ، على الرغم من أن اللمف الذي تم جمعه هناك يحتوي على مزيج من اللمف المساريقي والتصريف اللمفاوي خارج الأمعاء26,36. في المختبر ، تفرز خلايا Caco-2 جسيما يشبه الكيلوميكرون استجابة لعلاج الأحماض الدهنية ، ويمكن زراعة هذه الخلايا مع الخلايا البطانية اللمفاوية أو الأوعية الدموية ذات الصلة37,38. لقد ثبت أن الثقافات العضوية المعوية البشرية والفأر تعالج الدهون القمية وتفرز الكيلوميكرون39،40،41،42. هذه النماذج مفيدة للغاية وتمكن من رؤى ميكانيكية في فسيولوجيا الأمعاء الدقيقة ، لكنها لا تستطيع تكرار التعقيد أو التدرجات الفيزيائية والكيميائية أو التدفق الليمفاوي الديناميكي للليمفاويات المساريقية في الموقع.

مزايا نموذج الناسور الليمفاوي للفأر 1 يوم المقدم هنا
فيما يتعلق بهذه الطرق الأخرى لعزل البروتينات الدهنية المعوية ، تعتبر تقنية الناسور الليمفاوي Tso Lab تقليديا التقنية القياسية الذهبية لقياس امتصاص العناصر الغذائية في الليمفاوية المساريقي. تتميز هذه التقنية في الجسم الحي بميزة التقاط الجوانب الفسيولوجية الرئيسية لامتصاص الدهون الغذائية - المظهر الديناميكي للمركبات خلال فترة الامتصاص ، الأمر الذي يتطلب أخذ عينات متكررة من الليمفاوية المساريقية المتدفقة في الحيوانات الحية مع مغذيات الاثني عشر. تقيس هذه التقنية الجراحية أيضا هرمونات الأمعاء والسيتوكينات مباشرة في حجرتها الفسيولوجية بدلا من الدم ، حيث يتم تخفيفها وتحللها إنزيميا 17,43.

إذا كان السؤال التجريبي يتطلب فهما لديناميكيات إفراز الدهون أو الامتصاص الديناميكي والتمثيل الغذائي لأي مركب أو دواء معدي معوي كاره للماء ، فإن هذه التقنية ليست مناسبة فحسب ، بل هي أيضا الطريقة الوحيدة التي تستوفي حركة المحتويات اللمعية من الأمعاء القريبة إلى الأمعاء البعيدة (المعدة إلى القولون) ومن السطح القمي إلى السطح القاعدي (المحتويات اللمعية من خلال الخلايا المعوية إلى الأوعية اللبنية والدورة الدموية البابية). نظرا لأن هذه التقنية تستخدم التوصيل اللمعي للمغذيات من خلال القسطرة داخل الاثني عشر ، ولأن اللمف المساريقي المتدفق يتم تحويله وجمعه ، فإن جهاز الامتصاص بأكمله يخضع للتحكم التجريبي ويمكن استخدامه لتقييم نوعي لملامح امتصاص الأمعاء الدقيقة.

تم تقديمه بصريا هنا لأول مرة وهو تحديث رئيسي لنموذج الناسور الليمفاوي Tso Lab ، والذي (1) يقلل من الوقت التجريبي إلى زرع جراحي لمدة يوم واحد وفترة جمع تجريبية. (2) يحسن بقاء الفئران واعتبارات رعاية الحيوان ؛ و (3) يزيد من قابلية استنساخ النهج في الفئران لتسخير قوة النماذج الوراثية للفئران. يجب اعتبار هذه التقنية معيارا ذهبيا لجميع الأسئلة التجريبية للإفرازات المعوية أو البروتينات الدهنية أو امتصاص الدهون الغذائية وهي أفضل تقنية لتحديد الدقة العالية لحركية امتصاص الدهون والكيلوميكرون.

Protocol

تمت الموافقة على جميع العمليات الجراحية من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوانات الداخلية بجامعة بيتسبرغ [البروتوكول # 20047008] وتتوافق مع دليل المعاهد الوطنية للصحة لرعاية واستخدام المختبر. تم استخدام ذكور الفئران C57BL6 / J ، من عمر 8-14 أسبوعا ، في هذه الدراسة. تم الحصول على الفئران من مصدر تجاري (انظر جدول المواد). تم إيواء جميع الفئران في دورة الضوء / الظلام لمدة 12 ساعة مع وصول ad libitum إلى الطعام القياسي والماء.

1. إعداد الحيوان

  1. اعتمادا على التصميم التجريبي ، قم بإطعام الفئران أو السماح لها بالصيام.
    ملاحظة: الصيام بين عشية وضحاها غير ضروري ما لم تكن هناك مخاوف بشأن الاختلافات في معدل إفراغ المعدة.
  2. حث التخدير بنسبة 5٪ من غاز الأيزوفلوران وضمان التخدير المناسب عن طريق قرصة الذيل وأخمص القدمين. بمجرد التخدير ، احتفظ بالفئران في مستوى مخدر مناسب مع 2٪ -3٪ من غاز الأيزوفلوران وضعها بشريط لاصق على المنصة الجراحية.
  3. حافظ على دفء الفئران على منصة جراحية ساخنة تستخدم الماء الدافئ المتداول (انظر جدول المواد).

2. الجراحة والتصميم التجريبي

  1. ابدأ الجراحة بتطبيق مرهم الطبيب البيطري على العينين ، وحلق البطن ، وتطبيق فرك جراحي مطهر (انظر جدول المواد) على موقع الجراحة. هذا يعقم الشق ويقلل من توليد الفراء المحمول جوا أثناء شق خط الوسط.
  2. الحفاظ على منطقة عمل معقمة من خلال استخدام الأدوات المعقمة والستائر وغيرها من المعدات واللوازم اللازمة.
  3. حقن الجرعة الأولى من كاربروفين (انظر جدول المواد) لتخفيف الألم (IP) بجرعة 5 ملغ / كغ.
  4. أمسك الجلد بملاقط وقم بعمل شق في منتصف البطن بمقص صغير. قطع نحو القص (أبدا فوق) وخفض إلى الدهون الأربية. ثم ، قطع من خلال طبقة العضلات بشكل منفصل باستخدام المقص.
    ملاحظة: تعقيم جميع المعدات قبل الاستخدام.
  5. باستخدام المبعدة ، حرك الأحشاء البريتونية بعيدا عن الطريق حتى تصبح القناة الليمفاوية مرئية.
  6. باستخدام Q-tip المنقوع بالمحلول الملحي (انظر جدول المواد) ، حرك الكبد نحو الجانب العلوي الأيمن من الجسم والأمعاء والمعدة إلى يسار الحيوان.
  7. قم بتمديد الاثني عشر باتجاه اليسار بشكل عرضي لكشف الشريان المساريقي العلوي والقناة الليمفاوية المعوية.
  8. قم بإعداد أنبوب قنية بطول 30-40 سم عن طريق إدخال إبرة حادة في أنبوب القنية (انظر جدول المواد) وشطف كمية صغيرة من الهيبارين (1000 وحدة / لتر) عبر الأنبوب باستخدام حقنة سعة 1 مل.
    ملاحظة: يتم مساعدة تدفق الليمفاوية عن طريق الجاذبية للتدفق إلى أسفل وإلى أنابيب جمع أجهزة الطرد المركزي الدقيقة على الجليد. اعتمادا على مكان وجود دلو الثلج المجمع بجوار الإعداد الجراحي ، قد يلزم تعديل طول أنبوب القنية.
  9. استخدم المقص لقطع شطبة عند طرف أنبوب القنية.
  10. قم بعمل شق ضحل بمقص القزحية (انظر جدول المواد) في القناة الليمفاوية على بعد حوالي 5 مم من ظهوره في الأمعاء الدقيقة.
  11. أمسك أنبوب القنية بزوج من الملقط الناعم وأدخل الطرف المائل برفق في القناة.
    ملاحظة: من المهم عدم دفع القنية بعيدا جدا في القناة لأن هذا قد يمنع تدفق الليمفاوية عند إعادة الأعضاء المنسحبة إلى وضعها الأصلي.
  12. القناة الليمفاوية هشة للغاية بالنسبة للتلاعبات المرتبطة بربط القسطرة بخياطة. بدلا من ذلك ، استخدم قطرة من غراء cyanoacrylate (انظر جدول المواد) للصق القنية الليمفاوية في القناة الليمفاوية المساريقي.
  13. تحقق من وجود اللمف الأبيض اللبني (إذا تم استخدام زيت الزيتون قبل الجراحة) أو الليمفاوية الصافية (إذا كانت الفئران قد صمت قبل الجراحة) التي تبدأ في التدفق على الفور عبر قنية الناسور الليمفاوي.
    ملاحظة: تأكد من وضع القنية الليمفاوية بنجاح وأن الليمفاوية تتدفق ؛ استمر في وضع القنية داخل الاثني عشر.
  14. باستخدام إبرة 18 G ، ثقب ثقب من خلال المنطقة البوابية من المعدة الخلفية إلى العضلة العاصرة البوابية.
  15. أدخل أنبوب ضخ الاثني عشر (انظر جدول المواد) من خلال هذا الثقب في المعدة إلى حوالي 1-2 مم خارج العضلة العاصرة البوابية في الاثني عشر.
  16. قم بتثبيته بواسطة رباط سلسلة محفظة باستخدام خياطة حريرية 5-0 (انظر جدول المواد) بإبرة على المعدة وختم بقطرة من غراء cyanoacrylate لمنع التسرب.
  17. ابدأ التسريب داخل الاثني عشر لمحلول ملحي 5٪ جلوكوز -0.9٪ عند 0.3 مل / ساعة.
    ملاحظة: عند استخدام الفئران ذات الاختلافات الصغيرة في وزن الجسم والتي يبلغ عمرها حوالي 25 جم (~ 8 أسابيع) ، يكون ضخ 0.3 مل / ساعة من الجلوكوز / المحلول الملحي مناسبا. إذا كانت الفئران أكبر بشكل كبير ، فيجب تعديل معدل التسريب لأعلى لمراعاة التغير في وزن الجسم وحجم الدم.
  18. استبدال الأعضاء في تجويف الجسم وخياطة (5-0) أنسجة العضلات والجلد بشكل منفصل.
    ملاحظة: يتم إخراج كل من القنية الليمفاوية وأنبوب التغذية داخل الاثني عشر من خلال نفس الشق. لا توجد أسبقية لفصل الأنابيب بخياطة ولا تفضيل لزاوية إضفاء الطابع الخارجي على الأنابيب.
  19. بعد الجراحة ولكن قبل سحب المخدر ، ضع الفئران برفق في قيود Snuggle (انظر جدول المواد) للحد من الحركة.
    ملاحظة: تمنع قيود التحاضن الفئران من الإمساك أو تدوير الرأس لمضغ الغرز والأنابيب.
  20. بعد ذلك ، ضع الفئران في صندوق زجاجي شفاف على دوار مع هزاز لطيف ، وقم بتدفئته باستخدام وسادة تسخين برمائية / زواحف متوفرة تجاريا يتم التحكم في درجة حرارتها وملتصقة بجانب صندوق الاحتواء. توفير الترطيب أيضا في شكل حاويات مياه معقمة منزوعة الأيونات في زوايا صندوق الاحتواء (انظر جدول المواد).
  21. في 30 دقيقة قبل سحب الأيزوفلوران، يتم تطبيق الجرعة الثانية لتخفيف الآلام لدى الفئران (Buprenex، 0.1 ملغ/كغ، أي p.).
  22. اعتمادا على التجربة ، زود الفئران بالتسريب المستمر داخل الاثني عشر بنسبة 5٪ جلوكوز -0.9٪ محلول ملحي بمعدل 0.3 مل / ساعة لمدة 1 ساعة.
    ملاحظة: يتم تحضير محلول ملحي 5٪ جلوكوز - 0.9٪ باستخدام كيس ملحي معقم (للاستخدام البشري ، درجة الحموضة 7.4) من الصيدلية وزجاجة معقمة للاستخدام البشري من سكر العنب بنسبة 50٪ ، باتباع إرشادات صارمة للعقم. يجب أن يكون المحلول طازجا ويتم التخلص منه إذا تجاوز تواريخ انتهاء الصلاحية الواردة على الكيس الملحي أو زجاجة سكر العنب.
  23. إدارة الفئران مع واحدة من الدهون المدرجة في الجدول 1 كدهون تجريبية عن طريق قنية داخل الاثني عشر (انظر جدول المواد).
    ملاحظة: بالنسبة لجميع البيانات الموضحة في الشكل 1 ، تم غرس SMOFlipid (مستحلب حقن الدهون بنسبة 20٪ ، USP ، انظر جدول المواد) داخل الاثني عشر. يحل هذا التسريب قبل وبعد بلعة الدهون داخل الاثني عشر محل تصريف السوائل المفقودة عبر القناة الليمفاوية وهو مطلب مطلق. الفئران جاهزة الآن للحقن بجرعة دهنية تجريبية.
  24. قم بإجراء ضخ الدهون الكلاسيكي لبلعة مستحلب دهني سعة 0.3 مل (مستحلب SMOFlipid 20٪ قابل للحقن بالدهون ، USP) عبر أنبوب التسريب داخل الاثني عشر (انظر جدول المواد).
  25. بعد ضخ بلعة الدهون داخل الاثني عشر ، قم بتبديل التسريب مرة أخرى إلى 5٪ جلوكوز -0.9٪ محلول ملحي عند 0.3 مل / ساعة باستمرار حتى نهاية التجربة.
  26. اجمع العينات الليمفاوية في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة التي تم وزنها مسبقا لمدة 60 دقيقة واحتفظ باللمف على الجليد. وزن الأنابيب مرة ثانية لتحديد وزن الليمفاوية التي تفرز كل فترة 60 دقيقة.
    ملاحظة: توقع جمع ما يقرب من 50-300 ميكرولتر من الليمفاوية في الساعة ، لكل فأر في ~ 6 ساعات بعد 0.3 مل من بلعة الدهون.
  27. يمكن أن يتدفق الليمفاوية لمدة تصل إلى 6 ساعات بعد ضخ الدهون. في النقطة الزمنية 6 ساعات ، القتل الرحيم للفئران عن طريق الأيزوفلوران وخلع عنق الرحم.
    ملاحظة: يجب أن يكون الجراح و / أو فني المختبر حاضرا لمراقبة الحيوانات طوال التجربة. أثناء الملاحظة ، ابحث عن الجلطات في التصريف اللمفاوي والتغيرات في سلوك الحيوان التي تشير إلى الألم / الضيق. إذا تم انسداد القناة الليمفاوية في أي وقت أثناء التجربة ، يتم إنهاء التجربة ، ويتم القتل الرحيم للحيوان. يمكن من الناحية الفنية إبقاء الحيوان على قيد الحياة لمدة تصل إلى 24 ساعة بعد الجراحة (وفقا لقواعد جراحة البقاء على قيد الحياة IACUC). ومع ذلك ، تنخفض معدلات البقاء على قيد الحياة بمرور الوقت ، و 6 ساعات هي فترة بقاء قابلة للتكرار حيث لا يزال امتصاص الدهون يحاكي علم وظائف الأعضاء في الجسم الحي ، ولا يكافح الحيوان من أجل البقاء.
  28. إجراء جمع الأنسجة الطرفية بعد القتل الرحيم (الخطوة 3.1).
    ملاحظة: تم اختبار الفرق في ملامح امتصاص الدهون الغذائية في الفئران التي تم الاحتفاظ بها لمدة 6 ساعات أو 24 ساعة بعد الجراحةمؤخرا 44. وجدنا أن الإجراء الذي يعمل على مدار 24 ساعة يقلل من معدلات بقاء الحيوانات ورحلة الدهون الغذائية إلى الليمفاوية. لهذه الأسباب ، نوصي بشدة بنهج 6-h. يقلل هذا التصميم الجراحي المحدث من موت الحيوانات غير الضروري واحتمال حدوث ضائقة حيوانية في فترة ما بعد الجراحة. هذا يدعم هدفا رئيسيا للجمعية الأمريكية لاعتماد رعاية المختبر ، وهو "استبدال الحيوان ، تقليله ، صقله" [المرجع PMID: 21595115].

3. جمع محتويات اللمعية والأنسجة المخاطية

  1. في نهاية فترة ضخ الدهون لمدة 6 ساعات ، التضحية بالفئران عن طريق الأيزوفلوران وخلع عنق الرحم. اربط طرفي المعدة والأمعاء الدقيقة والأعور بخيوط 5-0 لتجنب تسرب محتويات اللمعة.
  2. اجمع المعدة والأعور والقولون ، وضع كل منها في أنبوب زجاجي سعة 15 مل. قسم الأمعاء الدقيقة إلى ثلاثة أو أربعة أجزاء ، واجمع محتويات اللمعية عن طريق شطف الأنسجة في 2-3 مل من برنامج تلفزيوني بارد بعد فتحها طوليا.
  3. قم بإزالة الغشاء المخاطي المعوي الذي يتكون من الخلايا الظهارية والصفيحة المخصوصة المرتبطة بها من الطبقة العضلية عن طريق كشط كل قسم في 2-3 مل من برنامج تلفزيوني بارد باستخدام ملقط منحني.
  4. ضع جميع الأنسجة والعزلات اللمعية والمخاطية والطبقة العضلية في أنابيب زجاجية وأضف 8 مل من 2: 1 مجلد / مجلد CHCl3: MeOH إلى كل أنبوب.
  5. تحديد النشاط الإشعاعي و / أو تركيزات الدهون عن طريق حساب التلألؤ السائل و / أو مجموعة مقايسة الدهون الثلاثية (انظر جدول المواد) بعد استخراج فولش45.

4. كروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة (TLC)

  1. استخراج الدهون الكلية للعزلات اللمعية والمخاطية عن طريق استخراج فولش معدل45.
  2. جفف الدهون المستخرجة في المذيب تحت مبخر النيتروجين ثم أعد تعليقها في 2: 1 مجلد / مجلد من CHCl3: MeOH قبل تحميلها على لوحة هلام السيليكا TLC (انظر جدول المواد).
  3. افصل الدهون باستخدام نظام مذيب من الأثير البترولي وإيثيل الأثير وحمض الخليك الجليدي (25: 5: 1 مجلد / مجلد / مجلد). استخدم بخار اليود لتصور الدهون المختلفة ، بما في ذلك المعايير.
  4. اكشط البقع الموجودة على لوحة TLC المقابلة لأحادي الجليسريد / الفوسفوليبيد ، وثنائي الجليسريد ، والأحماض الدهنية ، والدهون الثلاثية ، وإستر الكوليسترول في قوارير التلألؤ الفردية قبل إضافة 4 مل من سائل التلألؤ (انظر جدول المواد) لحساب التلألؤ.
  5. عبر عن البيانات في صورة نسبة مئوية من إجمالي جرعة شحم البلعة أو في صورة كسر من إجمالي الليبيدات المكتشفة لكل عينة.

5. عزل الكيلوميكرون والتوصيف

  1. انقل العينات الليمفاوية المجمعة من بلعة ما بعد الدهون لمدة 6 ساعات (الخطوة 2.29) إلى أنابيب الطرد المركزي الفائقة ، ممزوجة ب 0.9٪ كلوريد الصوديوم (300-500 ميكرولتر) ، ثم تراكب بعناية بحجم مناسب من 0.87٪ كلوريد الصوديوم (300-500 ميكرولتر).
    1. أجهزة الطرد المركزي الفائقة (انظر جدول المواد) العينات عند 110000 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 16 ساعة. اجمع الجزء العلوي الذي يحتوي على كيلوميكرون معزول وانقله إلى أنبوب طرد مركزي جديد للميكرومتر.
  2. حدد تركيزات كيلوميكرون الثلاثية والكوليسترول و apoB باتباع الخطوات أدناه.
    1. حدد تركيزات الدهون الثلاثية والكوليسترول باستخدام مجموعة مقايسة الدهون الثلاثية والكوليسترول (انظر جدول المواد).
    2. باختصار ، احتضان 2 ميكرولتر من العينات مع 200 ميكرولتر من كاشف الإنزيم عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق في لوحة 96 بئرا. اقرأ اللوحة باستخدام قارئ لوحة عند 500 نانومتر للدهون الثلاثية و 600 نانومتر للكوليسترول.
      ملاحظة: استخدمت المعايير والفراغات لحساب التركيزات. تم تحديد تركيزات ApoB باستخدام مجموعة Mouse ApoB ELISA (انظر جدول المواد).
  3. أوجد حجم جسيمات الكيلوميكرون.
    1. استخدم عينات كيلوميكرون طازجة بتركيزات الدهون الثلاثية حوالي 40 مجم / ديسيلتر للتصوير TEM. باختصار ، ضع 5-10 ميكرولتر من كل عينة على شبكة TEM وجففها.
    2. افحص الشبكة باستخدام المجهر الإلكتروني النافذ والتقط الصور. قم بقياس أحجام جزيئات البروتين الدهني وتحليلها باستخدام برنامج ImageJ (انظر جدول المواد).

Representative Results

يوضح الشكل 2 إفراز الدهون الثلاثية في اللمف المساريقي ومتوسط معدلات تدفق الليمفاوية في أحدث n = 17 فأرا من النوع البري (WT) خضعوا لإجراء الناسور الليمفاوي في يوم واحد الموصوف هنا. كما هو موضح في الشكل 2 أ ، يزداد تركيز ثلاثي الجليسريد في الليمفاوية استجابة لبلعة داخل الاثني عشر تبلغ 300 ميكرولتر من SMOFLipid. يتم الوصول إلى ذروة تركيز الدهون الثلاثية في ~ 2-3 ساعات بعد البلعة وينخفض بشكل مطرد خلال وقت 6 ساعات (مباشرة قبل القتل الرحيم). بالتوازي مع إفراز الدهون الثلاثية ، يزداد معدل تدفق الليمفاوية من الوقت 0 ضخ البلعة حتى نهاية التجربة (الشكل 2 ب).

تظهر هذه النتائج أن الزرع الجراحي لكل من القناة الليمفاوية المساريقية والقنية داخل الاثني عشر قد حدث ويمثل سيطرة إيجابية يمكن من خلالها قياس المحتويات اللمفاوية الأخرى (الهرمونات والببتيدات والمغذيات). إذا لم يكن هناك تغيير في تركيز الدهون الثلاثية في الليمفاوية استجابة للدهون داخل الاثني عشر ، فهذا يشير إلى أن الجراحة قد تسببت في أضرار كبيرة للأمعاء الدقيقة بحيث تكون قدرة امتصاص الدهون غائبة ، أو في النماذج الجينية غير المظهرية سابقا ، قد يشير هذا إلى أن الفأر لديه عيب في امتصاص الدهون ذات مغزى من الناحية الفسيولوجية.

Figure 1
الشكل 1: الجدول الزمني المقترح لنموذج فأر الناسور الليمفاوي. T-4 ، T-3 ، T-2: يستغرق القنية المزدوجة حوالي 2-4 ساعات ، يليها وضع الفئران في غرف الإنعاش. T-1: بمجرد أن تكون الفئران في فترة الشفاء ، فإنها تتلقى ضخ الاثني عشر المستمر بنسبة 5٪ جلوكوز -0.9٪ محلول ملحي. T0: يتم تحويل التسريب المستمر داخل الاثني عشر من 5٪ جلوكوز -0.9٪ ملحي إلى ضخ مغذيات تجريبية. T0-T6: تتلقى الفئران الجلوكوز المستمر داخل الاثني عشر بنسبة 5٪ في محلول ملحي أو ، بدلا من ذلك ، مغذيات مستمرة. يتم جمع الليمفاوية كل ساعة خلال هذه الفترة. نقطة النهاية: يتم القتل الرحيم للفئران، ويمكن جمع الأنسجة. تم إنشاء الرقم مع BioRender.com. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: تركيز ثلاثي الجليسريد الليمفاوي المساريقي ومعدل تدفقه. تم تزويد الفئران من النوع البري بأنبوب تغذية داخل الاثني عشر وقنية ليمفاوية مساريقية. تلقت الفئران ضخ بلعة من 300 ميكرولتر من الدهون. تم جمع الليمفاوية لمدة 6 ساعات في القسامات كل ساعة والاحتفاظ بها على الجليد. (أ) تم تحديد محتوى الدهون الثلاثية الليمفاوية بواسطة مقايسة كيميائية في كل حصة من اللمف كل ساعة. (ب) في 6 ساعات بعد ضخ البلعة، يرسم السريان الليمفاوي على صورة جرامات من الليمف تفرز في الساعة. النقاط هي وسائل ± التسويق عبر محرك البحث. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

طرق توصيل الدهون التوصيات / التعليمات
بلعة مستحلب الدهون المختلطة يمكن استخدام جرعة 0.3 مل إما من ( أ ) ليبوسين III 20٪ دهون قابلة للحقن أو (ب) مستحلب SMOFlipid 20٪ دهون قابل للحقن ، USP ، عبر أنبوب التسريب داخل الاثني عشر. هذه الليبيدات المستحلبة مفيدة لأنها لا تحتاج إلى تحضير مسبق ، فهي سائلة في درجة حرارة الغرفة ، ومعقمة ، ولأنها تحتوي على مزيج "سهل الهضم" من الأحماض الدهنية الحرة ، والدهون الثلاثية ، والفوسفوليبيدات ، وتوروكولات الصوديوم. هذا هو ضخ بداية جيدة للفئران التي قد يكون قصور البنكرياس أو الصفراوية.
بلعة الدهون الثلاثية 0.3 مل من زيت الزيتون الدافئ بلطف (أو التريولين المنقى) كدهون محايدة تعكس نظاما غذائيا غنيا بالدهون غير المشبعة أو شحم الخنزير (يعكس نظاما غذائيا يحتوي على نسبة عالية من الدهون المشبعة) أو زيت جوز الهند (يعكس نظاما غذائيا يحتوي على نسبة عالية من الدهون الثلاثية متوسطة السلسلة) يمكن إعطاؤه جميعا عن طريق أنبوب التسريب داخل الاثني عشر أو التجويف الفموي. إذا كانت الدهون الثلاثية التجريبية مشبعة ، فيجب تسخينها لتكون سائلة في درجة حرارة الغرفة.
بلعة وجبة مختلطة 0.3 مل تأكد من أن التركيبة التي تحتوي على 0.075 جم من الدهون (21.6٪) و 0.5 جم من الكربوهيدرات (64.0٪) و 0.1125 جم من البروتين (14.4٪) وتعكس وجبة مختلطة قليلة الدسم ، يمكن إعطاؤها عن طريق التسريب داخل الاثني عشر.
بلعة دهنية موسومة إشعاعيا 5.0 μCi 3 يمكن إعطاء ثلاثي يولات الجلسرين المسمى H و / أو 1.0 μCi 14C-cholesterol في 0.3مل من زيت الزيتون عن طريق التسريب داخل الاثني عشر. 14 C-الكولسترول: الكولسترول [4-14C] مع نشاط محدد من 55Ci / مليمول وتركيز 0.1mCi / مل. 3 H-TG Triolein [9،10-3H (N)] (3H-TG) مع نشاط محدد يبلغ 60Ci / mmol وتركيز 1mCi / mL
جرعة مستمرة سيؤدي ضخ أي من تركيبات المغذيات التجريبية المذكورة أعلاه بمعدل 0.3 مل / ساعة (بدلا من 0.3 مل من إجمالي البلعة) إلى إنتاج ثابت للدهون الثلاثية في الليمفاوية. هذا يختلف عن ضخ البلعة ، حيث يبلغ تركيز الدهون الثلاثية في الليمفاوية ذروته عند ~ 2-3 ساعات ، ثم يعود إلى تركيزات خط الأساس عند ~ 6-8 ساعات.

الجدول 1: جدول ضخ الدهون.

Discussion

تم وصف إجراء الناسور الليمفاوي الأصلي لمدة يومين بواسطة Bollman et al.25 ومارسه مختبر باتريك تسو على مدار ال 45 عاماالماضية 26,27. يعد البروتوكول المقدم هنا إضافة قوية لهذه الطريقة الكلاسيكية القياسية الذهبية لتحديد وقياس وفهم إفرازات الكيلوس الفريدة للأمعاء الدقيقة ، بالإضافة إلى ديناميكيات الجسم الحي لامتصاص العناصر الغذائية والتمثيل الغذائي وهرمونات الأمعاء والمناعة المعوية.

تشمل مزايا هذا النموذج (1) القدرة على أخذ عينات مستمرة من الليمفاوية المساريقية طوال فترة التغذية وما بعد الأكل بدلا من أخذ العينات الثابتة في نقطة زمنية واحدة أثناء الامتصاص أو الهضم أو الإفراز. (2) قياس هرمونات الأمعاء والسيتوكينات مباشرة في حجرتها الفسيولوجية بدلا من الدم ، حيث يتم تخفيفها وتحللها إنزيميا17,44 ؛ (3) القدرة على عزل وقياس وتوصيف البروتينات الدهنية التي تفرزها الأمعاء الدقيقة بعد تناول وجبة دهنية وغياب الليباز البطاني في اللمف المساريقي ، والذي يحافظ على تركيزات الدهون الثلاثية الكيلوميكرون وبنية الكيلوميكرون الأصلية46,47 ؛ (4) القدرة على قياس معدل تدفق الليمفاوية مباشرة ، وإخراج الدهون الثلاثية والكوليسترول (أو غيرها من المركبات المشبعة بالاثني عشر) ، وتكوين الكيلوميكرون ، وتركيزات الهرمونات المعوية. أخيرا ، يسمح هذا البروتوكول بجمع كميات كبيرة نسبيا من >50 ميكرولتر من الليمفاوية كل ساعة على مدار 6 ساعات. نظرا لأن السائل يتم تجديده بمحلول ملحي داخل الاثني عشر وتسريب الجلوكوز ، فقد تحسن نموذج الناسور الليمفاوي بشكل كبير مقارنة بتقنيات أخذ العينات الليمفاوية الأخرى ويؤدي إلى تدفق بدلا من تجمعات ثابتة من الليمفاوية المساريقي. نظرا لأن الحجم يمثل عقبة رئيسية أمام النهج الدهنية والبروتينية والأيضية ، فهذه نقطة قوة رئيسية.

يحتوي بروتوكول الناسور الليمفاوي للفأر 1 يوم الموصوف هنا على العديد من المزايا على بروتوكول الناسور الليمفاوي الأصلي ، بما في ذلك انخفاض إجمالي عدد الحيوانات التجريبية من بروتوكولات الناسور الليمفاوي الموصوفة سابقا لمدة يومين26,27 بسبب ارتفاع معدل البقاء على قيد الحياة بعد الجراحة. تخفيض في الوقت التجريبي الكلي من 2 أيام إلى يوم واحد ؛ وأخيرا ، انخفاض في فترة الشفاء للفئران من ليلة وضحاها (>18 ساعة) ، حيث قد يحدث ألم اختراق أو نتائج سيئة بعد الجراحة ، إلى فترة أكثر قابلية للإدارة ~ 6 ساعات بعد الجراحة.

ميزة هذا البروتوكول يوم 1 هو التركيز على الاعتبارات الإنسانية ونقاط النهاية. يجب أن تأخذ هذه الأولوية القصوى: (1) يجب أن تتلقى الحيوانات سوائل بديلة داخل الاثني عشر أو IV ؛ (2) يجب أن تبقى دافئة وخالية من الألم قدر الإمكان (مع البوبرينكس بعد الجراحة و / أو كاربروفين ، اعتمادا على التصميم التجريبي والحاجة إلى تجنب التأثيرات المضادة للالتهابات) ؛ (3) النزيف أو الاهتزاز أو الإسهال أو علامات الضيق كلها أسباب مقنعة لنقطة نهاية إنسانية. وفقا لإرشادات IACUC الصارمة ، فإن الأيزوفلوران متبوعا بخلع عنق الرحم هو نقطة نهاية جيدة. معدلات البقاء على قيد الحياة الجراحية هي ~ 70 ٪ ليوم واحد (مقارنة مع ~ 40 ٪ للجراحة الأصلية 2 يوم) ، ولكن يجب على الباحثين ألا يترددوا في إنهاء التجربة عند علامة على الضيق. يجب أن يؤخذ ذلك في الاعتبار عند التخطيط لأعداد الحيوانات.

فيما يتعلق باستكشاف هذه التقنية وإصلاحها ، فإن وضع القنية الليمفاوية بنجاح هو عنق الزجاجة الرئيسي في هذا الإجراء الجراحي. أثناء ممارسة الجراحة ، يساعد على إعطاء الفأر ب 0.3 مل من زيت الزيتون قبل حوالي 2 ساعة من الجراحة. سيؤدي ذلك إلى إفراز الكيلوميكرون في القناة الليمفاوية المساريقية ، مما يجعلها تبدو "حليبي" وأكثر وضوحا. يمكن أيضا استخدام الميثيلين الأزرق ولكنه غالبا ما يكون أقل وضوحا من القناة الليمفاوية اللبنية. إذا كان اللمف المساريقي يتدفق بنجاح عبر القنية إلى وعاء تجميع بعد وضع القنية الليمفاوية ووضعها بالغراء ، فيمكن للمرء المضي قدما في وضع أنبوب ضخ الاثني عشر. في بعض الأحيان ، قد لا يتدفق اللمف بشكل مستمر ولكن قد يبدأ في التدفق مرة أخرى عند وضع الحيوان على الطاولة الدوارة. بشكل حاسم ، احترس من الجلطات داخل الأنبوب الليمفاوي. يجب تدليك هذه الأنابيب لمنع ضغط التدفق العكسي على القناة الليمفاوية.

بالإضافة إلى إفراز الدهون الثلاثية ومعدل تدفق الليمفاوية ، يمكن استخدام هذه التقنية لتحديد حركية امتصاص الدهون التالية وخصائص الكيلوميكرون:

إفراز الكيلوميكرون45،48،49
مباشرة بعد وجبة تحتوي على الدهون ، هناك ارتفاع عابر في الدهون الثلاثية البلازما المتداولة. نظرا لأن الدهون الثلاثية كارهة للماء بطبيعتها ، فيجب أولا استحلابها لتكون قابلة للذوبان في الدم50. تقوم الخلايا المعوية المعوية الدقيقة بهذا الدور وتعبئ الدهون الثلاثية الغذائية في جزيئات مستحلب الكيلوميكرون51. تحتوي الكيلومكرونات على الكوليسترول والدهون الثلاثية الغذائية في قلبها ، وتحيط بها الدهون الفوسفاتية والبروتينات الدهنية ، بما في ذلك apoB-48 و apoA-I و apoA-IV و apoC-III52،53،54،55. ApoB-48 هو البروتين الهيكلي الأساسي ، والبروتينات الدهنية الأخرى لها وظائف مختلفة مطلوبة لاستقلاب الكيلوميكرون وإزالته من الدم. لتحديد الخصائص الرئيسية للكيلومكرونات ، بما في ذلك محتواها من الدهون الثلاثية والبروتين الشحمي ، يجب استخدام تقنية الناسور الليمفاوي لمدة 1 يوم الموضحة هنا. معدل إفراز الكيلوميكرون هو النسبة المئوية للدهون الثلاثية Hالتي يتم ضخها في اللمف والتي يتم إفرازها في اللمف وقياسها عن طريق التلألؤ عن طريق حساب العينات الليمفاوية كل ساعة. يمكن دمج هذا مع توصيف الكيلوميكرون التفصيلي 48،49،56،57،58. يمكن دمج العينات الليمفاوية كل ساعة أو الاحتفاظ بها بشكل منفصل. يتم نقل الليمفاوية إلى أنابيب الطرد المركزي ، مختلطة مع 0.9 ٪ كلوريد الصوديوم ، ثم تراكب بعناية مع 300-500 ميكرولتر من 0.87 ٪ كلوريد الصوديوم. ثم يتم طرد العينات بالطرد المركزي الفائق عند 110000 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 16 ساعة. يتم جمع الأجزاء العلوية التي تحتوي على كيلومكرونات معزولة واختبارها لتركيزات الدهون الثلاثية باستخدام مجموعة مقايسة الدهون الثلاثية. باختصار ، يتم تحضين 2 ميكرولتر من الكيلوميكرون (تخفيف 1:10) ب 200 ميكرولتر من كاشف الإنزيم في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق في صفيحة 96 بئرا. تتم قراءة اللوحة بواسطة قارئ لوحة عند 500 نانومتر ، وتستخدم المعايير والفراغات لحساب تركيزات الدهون الثلاثية. يمكن بعد ذلك تحديد حجم Chylomicron عن طريق التلوين السلبي والمجهر الإلكتروني (TEM)14,29. يمكن قياس الدهون الثلاثية والكوليسترول عن طريق الفحص الكيميائي ومحتوى البروتين الشحمي (apoB-48 ، A-I ، C-II ، C-III) بواسطة مجموعات ELISA أو اللطخة الغربية.

تحديد الموقع الأساسي لامتصاص الدهون48,59
عن طريق عزل مقصورات الخلايا اللمعية والظهارية للاثني عشر والصائم والدقاق عند 6 ساعات بعد ضخ 3 H-triglyceride أو وجبة مختلطة تحمل علامة الراديو ، يتم استخراج المحتويات لتحديد مقدار الدهون الثلاثية 3H التي يتم امتصاصها عبر غشاء الخلية الظهارية (طبيعي) أو يتم الاحتفاظ بها في التجويف (غير طبيعي) على طول الأمعاء الدقيقة48 . هذه الدراسات مؤثرة بشكل خاص إذا كانت هناك اختلافات محتملة في حركية الجهاز الهضمي60،61،62 ، إذا كانت هناك فرضية تتعلق بالأحماض الصفراوية (نشطة للغاية طوال امتصاص الدهون ويعاد امتصاصها في الدقاق)63،64،65،66 ، أو إذا كان هناك قلق من امتصاص العناصر الغذائية في الموقع التشريحي الخاطئ (الدقاق أو حتى القولون)67 ، 68،69،70.

تحديد آليات تهريب 3H-triglyceride إلى الخلايا الظهارية الامتصاصية48
يتم إجراء ذلك عن طريق حساب النسبة المئوية ل3 H-triglyceride المتحلل بالماء إلى 3 أحماض دهنية خالية من H في تجويف الأمعاء ، ويتم امتصاصه في الغشاء المخاطي ، وإعادة أسترة إلى 3H-triglyceride داخل الخلايا قبل الإفراز على شكل chylomicrons. هذه علامة قوية على عيوب الامتصاص / الإفراز حيث يمكن تتبعها لإظهار حركة الدهون الثلاثية الغذائية في منتجات الانهيار والتعبئة اللاحقة في الكيلوميكرون. يمكن قياس تعبير mRNA لآلية امتصاص الأحماض الدهنية (CD36 ، FABPs ، ACSLs) ، مسار إعادة الأسترة (MGAT ، DGAT، MTTP ، apoB) ، والبروتينات الدهنية (apoC-III ، B-48 ، C-II ، A-I ، A-IV) بواسطة RT-PCR.

تقتصر التطبيقات المستقبلية لهذه التقنية فقط على الاهتمام بالحديث المتبادل بين الأمعاء والأعضاء ، أو التمثيل الغذائي ، أو المناعة ، أو امتصاص العناصر الغذائية ، أو الملوثات الغذائية البيئية ، أو أي مرض آخر له دور في نظام الجهاز الهضمي. من المحتمل أن العديد من التجارب والفرضيات المقنعة قد توقفت بسبب صعوبة الوصول إلى الجهاز الليمفاوي المساريقي الحرج ، والهدف من هذا البروتوكول المرئي هو جعل هذه التقنية متاحة بسهولة أكبر. يعد عزل الكيلومكرونات والليمفاوية المساريقية التي يقيمون فيها في البداية جزءا مهما من فهم عملية التمثيل الغذائي للجسم بالكامل. نموذج الناسور الليمفاوي للفأر 1 يوم هو نموذج فسيولوجي قوي لدراسة هذه الأحداث.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

نحن ممتنون للغاية لمؤسسة التليف الكيسي (جائزة الطيار والجدوى 1810 ، إلى البنك الأهلي الكويتي) ، ومؤسسة رينين (جائزة سينرجي ، إلى PI GJ Randolph و Co-I ABK) ، والمعاهد الوطنية للصحة (R01DK118239 ، R03DK116011 إلى ABK) لدعمهم لهذه الدراسات.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.9% Sodium Chloride Injection, USP  sterile Hospira, Lake Forest, IL, US NDC 0409-4888-06
1.7 mL Eppendorf tubes Fisher Scientific, Waltham, MA, US 7200184
14C-cholesterol: Cholesterol-[4-14C] (0.1mCi/ mL) American Radiolabeled Chemicals Inc., St. Louis, MO, US ARC 0857
18 G needle Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, US 305199
2 Dumont micro-dissecting forceps Fine Science Tools, Foster City, CA, US 11251-35
2 Forceps ROBOZ Surgical Instrument Co., Gaithersburg, MD, US RS-5130
3H-TAG:  Triolein [9,10-3H(N)] (3H-TG) (1mCi/ mL) American Radiolabeled Chemicals Inc., St. Louis, MO, US ART0199
3H-TG Triolein [9,10-3H(N)] (3H-TG) American Radiolabeled Chemicals, INC. St. Louis MO 63146
50% Dextrode Injection, USP 25grams/50 mL  sterile Hospira, Lake Forest, IL, US NDC-0409-6648-16
Analtech TLC Uniplates: silica gel matrix Z265500-1PAK Fisher Scientific, Waltham, MA, US 11-101-0007
BD CareFusion ChloraPrep Swabstick Fisher Scientific, Waltham, MA, US 14-910-501
Betadine surgical scrub Dynarex Corp., Orangeburg, NY, US 1201
Bevel-cut cannula Braintree Scientific.,  Braintree , MA, US MRE025
Buprenorphine HCl Injection Carpuject PFS 0.3mg/mL 10/Bx (Buprenex) HenrySchein, Warrendale, PA, US 1278184
C57BL6/J male mice Jackson Laboratory, Bar Harbor, Maine
ChloraPrep Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, US 260100
Cholesterol Assay Kit FujiFilm Healthcare, Lexington, MA, US 99902601
Cholesterol-[4-14C] American Radiolabeled Chemicals, INC. St. Louis MO 63146
Clear plexiglass box L43cm X W26 X H 21 with temperature-controlled heating pad and humidification our own design and modifications
commercially available  amphibian/reptile heating pad ShenZhen XingHongChang Electric CO., LTD. ShenZhen, China XHC-F035D
Cotton tip applicators Fisher Scientific, Waltham, MA, US 22363156
Duodenal infusion tube - canuala Braintree Scientific, Braintree , MA, US MRE037
Ensure Abbott Nutrition, Columbus, OH
Heating pad surgical platform with circulating warm water pump combination Patterson Scientific, Waukesha, WI, US Gaymar T/Pump Classic
Hetarin Sodium Injection, USP 1,000 units/mL sterile Mylan, Morgantown, WV, US NDC-67457-384-31
Image J Software National Institute of Health, Bethesda, Maryland,
Iris scissors ROBOZ Surgical Instrument Co., Gaithersburg, MD, US RS-5602
Isoflurane Piramal Pharma Solutions, Riverview, MI, US NDC 66794-017-25
Isoflurane induction apparatus and Anesthesia Apparatus Patterson Scientific, Waukesha, WI, US mouse induction chamber
Krazy glue Elmer's products Inc., Columbus, OH, US KG484
Liposyn III 20% lipid injectable Hospira Inc. Lake Forest, Illinois, USA
LS 6500 Multi-Purpose Scintillation Counter Beckman Coulter, Brea, CA
Micro-dissecting Spring Scissors ROBOZ Surgical Instrument Co., Gaithersburg, MD, US RS-5602
Mouse apoB ELISA Kit ABCAM Inc., Waltham, MA, US ab230932-1
Needle Holder Fine Science Tools, Foster City, CA, US 12002-12
Retractors Kent Scientific Co., Torrington, CT, US SURGI-5001
Rimadyl (Carprofen) Zoetis Inc., Kalamazoo MI, US 4019449
Rotating table Barnstead Thermolyne Labquake, Zürich, Switzerland Barnstead Thermolyne
SMOFlipid 20% lipid injectable emulsion, USP Fresenius Kabi, Warrendale, PA, US NDC-63323-820-01
Snuggle Lomir Biomedical Inc., Notre-Dame-de-l'Île-Perrot, QC J7V 7M4, Canada MS 02.5PM
Surgical Scissors ROBOZ Surgical Instrument Co., Gaithersburg, MD, US RS-5912SC
Suture (5-0 silk with needle) DemeTECH, Miami Lakes, FL, US DT-719
Transmission Electron Microscope (JEOL 1400-FLASH 120KV ) JEOL, Peabody, MA
Triglyceride Assay Kit Randox Laboratories, Crumlin, United Kingdom TR210
ULTIMA GOLD XR Scintillation Fluid Perkin Elmer, Hebron, KY, US 6013119
Ultracentrifuge, rotor S100AT4-497 SORVALL RC M120 GX

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Natale, G., Bocci, G., Ribatti, D. Scholars and Scientists in the History of the Lymphatic System. Journal of Anatomy. 231 (3), 417-429 (2017).
  2. Loukas, M., et al. The lymphatic system: A historical perspective. Clinical Anatomy. 24 (7), 807-816 (2011).
  3. Suy, R., Thomis, S., Fourneau, I. The discovery of the lymphatic system in the seventeenth century. Part II: The discovery of Chyle vessels. Acta Chirurgica Belgica. 116 (5), 325-331 (2016).
  4. Azzali, G. Historical notes on the lymphatic vascular system. Acta Bio-medica de L'Ateneo Parmense. 61 (3-4), 113-125 (1990).
  5. Irschick, R., Siemon, C., Brenner, E. The history of anatomical research of lymphatics - From the ancient times to the end of the European Renaissance. Annals of Anatomy. 223, 49-69 (2019).
  6. Swartz, M. A. The physiology of the lymphatic system. Advanced Drug Delivery Reviews. 50 (1-2), 3-20 (2001).
  7. Deitch, E. A. Gut lymph and lymphatics: A source of factors leading to organ injury and dysfunction. Annals of the New York Academy of Sciences. 1207, 103-111 (2010).
  8. Tso, P., Gollamudi, S. R. Pluronic L-81: A potent inhibitor of the transport of intestinal chylomicrons. American Journal of Physiology. 247, 32-36 (1984).
  9. Tso, P., Karlstad, M. D., Bistrian, B. R., DeMichele, S. J. Intestinal digestion, absorption, and transport of structured triglycerides and cholesterol in rats. American Journal of Physiology. 268, 568-577 (1995).
  10. Mansbach, C. M., Dowell, R. F., Pritchett, D. Portal transport of absorbed lipids in rats. American Journal of Physiology. 261, 530-538 (1991).
  11. Bogunovic, M., et al. Origin of the lamina propria dendritic cell network. Immunity. 31 (3), 513-525 (2009).
  12. Balmer, M. L., et al. The liver may act as a firewall mediating mutualism between the host and its gut commensal microbiota. Science Translational Medicine. 6 (237), (2014).
  13. Ji, Y., Sakata, Y., Tso, P. Nutrient-induced inflammation in the intestine. Current Opinion in Clinical Nutrition & Metabolic Care. 14 (4), 315-321 (2011).
  14. Ji, Y., Sakata, Y., Yang, Q., Tso, P. Intestinal mucosal mast cells is activated by fat absorption. Gastroenterology. 140 (5), (2011).
  15. Wang, F., et al. Chronic high-fat feeding increases mixed meal-induced incretin secretion in Sprague-Dawley rats. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 309 (10), 807-815 (2015).
  16. Kindel, T. L., Yoder, S. M., D'Alessio, D. A., Tso, P. The effect of duodenal-jejunal bypass on glucose-dependent insulinotropic polypeptide secretion in Wistar rats. Obesity Surgery. 20 (6), 768-775 (2010).
  17. Kohan, A. B., Yoder, S. M., Tso, P. Using the lymphatics to study nutrient absorption and the secretion of gastrointestinal hormones. Physiology & Behavior. 105 (1), 82-88 (2011).
  18. Yoder, S. M., Yang, Q., Kindel, T. L., Tso, P. Stimulation of incretin secretion by dietary lipid: Is it dose dependent. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 297 (2), 299-305 (2009).
  19. Wang, Y., et al. Chylomicrons promote intestinal absorption and systemic dissemination of dietary antigen (ovalbumin) in mice. PLoS One. 4 (12), 8442 (2009).
  20. Vors, C., et al. Postprandial endotoxemia linked with chylomicrons and lipopolysaccharides handling in obese versus lean men: A lipid dose-effect trial. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 100 (9), 3427-3435 (2015).
  21. Ghoshal, S., Witta, J., Zhong, J., de Villiers, W., Eckhardt, E. Chylomicrons promote intestinal absorption of lipopolysaccharides. Journal of Lipid Research. 50 (1), 90-97 (2009).
  22. Jandacek, R. J., Rider, T., Keller, E. R., Tso, P. The effect of olestra on the absorption, excretion and storage of 2,2',5,5' tetrachlorobiphenyl; 3,3',4,4' tetrachlorobiphenyl; and perfluorooctanoic acid. Environment International. 36 (8), 880-883 (2010).
  23. Jandacek, R. J., Tso, P. Organochlorine compounds are absorbed via lymph and portal circulation. The FASEB Journal. 22, (2008).
  24. Utermann, G., Beisiegel, U. Apolipoprotein A-IV: A protein occurring in human mesenteric lymph chylomicrons and free in plasma. Isolation and quantification. European Journal of Biochemistry. 99 (2), 333-344 (1979).
  25. Bollman, J. L., Cain, J. C., Grindlay, J. H. Techniques for the collection of lymph from the liver, small intestine, or thoracic duct of the rat. Journal of Laboratory and Clinical Medicine. 33 (10), 1349-1352 (1948).
  26. Tso, P., Balint, J. A., Rodgers, J. B. Effect of hydrophobic surfactant (pluronic L-81) on lymphatic lipid transport in the rat. American Journal of Physiology. 239 (5), 348-353 (1980).
  27. Liu, M., et al. Sexual dimorphism in intestinal absorption and lymphatic transport of dietary lipids. Journal of Physiology. 599 (22), 5015-5030 (2021).
  28. Manolas, K. J., et al. Lymph, pancreatic and gastrointestinal hormones in response to feeding in the conscious pig. European Surgical Research. 17 (5), 324-332 (1985).
  29. Lascelles, A. K., Morris, B. Surgical techniques for the collection of lymph from unanaesthetized sheep. Quarterly Journal of Experimental Physiology and Cognate Medical Sciences. 46, 199-205 (1961).
  30. Jensen, L. T., Olesen, H. P., Risteli, J., Lorenzen, I. External thoracic duct-venous shunt in conscious pigs for long term studies of connective tissue metabolites in lymph. Laboratory Animal Science. 40 (6), 620-624 (1990).
  31. Edwards, G. A., Porter, C. J., Caliph, S. M., Khoo, S. M., Charman, W. N. Animal models for the study of intestinal lymphatic drug transport. Advanced Drug Delivery Reviews. 50 (1-2), 45-60 (2001).
  32. Yasunaga, K., Saito, S., Zhang, Y. -L., Hernandez-Ono, A., Ginsberg, H. N. Effects of triacylglycerol and diacylglycerol oils on blood clearance, tissue uptake, and hepatic apolipoprotein B secretion in mice. Journal of Lipid Research. 48 (5), 1108-1121 (2007).
  33. Curtin, A., et al. Elevated triglyceride-rich lipoproteins in diabetes. A study of apolipoprotein B-48. Acta Diabetologica. 33 (3), 205-210 (1996).
  34. Gordts, P. L. S. M., et al. ApoC-III inhibits clearance of triglyceride-rich lipoproteins through LDL family receptors. Journal of Clinical Investigation. 126 (8), 2855-2866 (2016).
  35. Ginsberg, H. N., et al. Apolipoprotein B metabolism in subjects with deficiency of apolipoproteins CIII and AI. Evidence that apolipoprotein CIII inhibits catabolism of triglyceride-rich lipoproteins by lipoprotein lipase in vivo. The Journal of Clinical Investigation. 78 (5), 1287-1295 (1986).
  36. Ormai, S., Palkovits, M. Size distribution of lymphocytes in the thoracic duct lymph in rat after lymphocyte mobilization induced by polymethacrylic acid. Blut Zeitschrift für die Gesamte Blutforschung. 24 (3), 161-165 (1972).
  37. Luchoomun, J., Hussain, M. M. Assembly and secretion of chylomicrons by differentiated Caco-2 cells. Nascent triglycerides and preformed phospholipids are preferentially used for lipoprotein assembly. Journal of Biological Chemistry. 274 (28), 19565-19572 (1999).
  38. Nollevaux, G., et al. Development of a serum-free co-culture of human intestinal epithelium cell-lines (Caco-2/HT29-5M21). BMC Cell Biology. 7 (1), 20 (2006).
  39. Li, D., Dong, H., Kohan, A. B. The Isolation, Culture, and Propagation of Murine Intestinal Enteroids for the Study of Dietary Lipid Metabolism. Organoids. Methods in Molecular Biology. 1576, Humana. New York, NY. 195-204 (2019).
  40. Jattan, J. J., et al. Using murine-derived primary intestinal enteroids for studies of dietary triglyceride absorption and lipoprotein synthesis, and to determine the role of intestine-specific ApoC-III in the intestine. Journal of Lipid Research. 58 (5), 853-865 (2017).
  41. Haring, E., et al. Bile acids regulate intestinal antigen presentation and reduce graft-versus-host disease without impairing the graft-versus-leukemia effect. Haematologica. 106 (8), 2131-2146 (2021).
  42. Date, S., Sato, T. Mini-gut organoids: Reconstitution of the stem cell niche. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 31 (1), 269-289 (2015).
  43. Deacon, C. F. Circulation and degradation of GIP and GLP-1. Hormone and Metabolic Research. 36 (11-12), 761-765 (2004).
  44. Dedousis, N., Teng, L., Kanshana, J. S., Kohan, A. B. A single-day mouse mesenteric lymph surgery in mice: an updated approach to study dietary lipid absorption, chylomicron secretion, and lymphocyte dynamics. J Lipid Res. 63 (11), 100284 (2022).
  45. Li, D., et al. Intestinal basolateral lipid substrate transport is linked to chylomicron secretion and is regulated by ApoC-III. Journal of Lipid Research. 60 (9), 1503-1515 (2019).
  46. Glatzle, J., et al. Chylomicron components mediate intestinal lipid-induced inhibition of gastric motor function. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 282 (1), 86-91 (2002).
  47. Huang, J., Sloop, C. H., Roheim, P. S., Wong, L. Lipoprotein lipase and hepatic triacylglycerol lipase activities in peripheral and skeletal muscle lymph. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 10 (5), 720-726 (1990).
  48. Wang, F., et al. Overexpression of apolipoprotein C-III decreases secretion of dietary triglyceride into lymph. Physiological Reports. 2 (3), 00247 (2014).
  49. Kohan, A. B., et al. Apolipoprotein A-IV regulates chylomicron metabolism-Mechanism and function. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 302 (6), 628-636 (2012).
  50. Hayashi, H., et al. Fat feeding increases size, but not number, of chylomicrons produced by small intestine. American Journal of Physiology. 259 (5), 709-719 (1990).
  51. Tso, P., Balint, J. A. Formation and transport of chylomicrons by enterocytes to the lymphatics. American Journal of Physiology. 250 (6), 715-726 (1986).
  52. Bhattacharya, S., Redgrave, T. G. The content of apolipoprotein B in chylomicron particles. Journal of Lipid Research. 22 (5), 820-828 (1981).
  53. Björkegren, J., Karpe, F., Milne, R. W., Hamsten, A. Differences in apolipoprotein and lipid composition between human chylomicron remnants and very low density lipoproteins isolated from fasting and postprandial plasma. Journal of Lipid Research. 39 (7), 1412-1420 (1998).
  54. Martins, I. J., Sainsbury, A. J., Mamo, J. C., Redgrave, T. G. Lipid and apolipoprotein B48 transport in mesenteric lymph and the effect of hyperphagia on the clearance of chylomicron-like emulsions in insulin-deficient rats. Diabetologia. 37 (3), 238-246 (1994).
  55. Mar, R., et al. Association of the APOLIPOPROTEIN A1/C3/A4/A5 gene cluster with triglyceride levels and LDL particle size in familial combined hyperlipidemia. Circulation Research. 94 (7), 993-999 (2004).
  56. Kassis, T., et al. Dual-channel in-situ optical imaging system for quantifying lipid uptake and lymphatic pump function. Journal of Biomedical Optics. 17 (8), 086005 (2012).
  57. Nauli, A. M., et al. Chylomicrons produced by Caco-2 cells contained ApoB-48 with diameter of 80-200 nm. Physiological Reports. 2 (6), 192-196 (2014).
  58. Drover, V. A., et al. CD36 deficiency impairs intestinal lipid secretion and clearance of chylomicrons from the blood. Journal of Clinical Investigation. 115 (5), 1290-1297 (2005).
  59. Kohan, A. B., et al. Is apolipoprotein A-IV rate limiting in the intestinal transport and absorption of triglyceride. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 304 (12), 1128-1135 (2013).
  60. De Lisle, R. C. Altered transit and bacterial overgrowth in the cystic fibrosis mouse small intestine. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 293 (1), 104-111 (2007).
  61. Debas, H. T., Farooq, O., Grossman, M. I. Inhibition of gastric emptying is a physiological action of cholecystokinin. Gastroenterology. 68 (5), 1211-1217 (1975).
  62. Spiller, R. C., et al. Further characterisation of the 'ileal brake' reflex in man--Effect of ileal infusion of partial digests of fat, protein, and starch on jejunal motility and release of neurotensin, enteroglucagon, and peptide YY. Gut. 29 (8), 1042-1051 (1988).
  63. Battle, M. A., et al. GATA4 is essential for jejunal function in mice. Gastroenterology. 135 (5), 1676-1686 (2008).
  64. Morgan, R. G., Borgström, B. The mechanism of fat absorption in the bile fistula rat. Quarterly Journal of Experimental Physiology and Cognate Medical Sciences. 54 (2), 228-243 (1969).
  65. Davidson, N. O., Kollmer, M. E., Glickman, R. M. Apolipoprotein B synthesis in rat small intestine: Regulation by dietary triglyceride and biliary lipid. Journal of Lipid Research. 27 (1), 30-39 (1986).
  66. Bouchi, R., et al. FOXO1 inhibition yields functional insulin-producing cells in human gut organoid cultures. Nature Communications. 5, 4242 (2014).
  67. Bijvelds, M. J. C., et al. Fat absorption in cystic fibrosis mice is impeded by defective lipolysis and post-lipolytic events. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 288 (4), 646-653 (2005).
  68. Struyvenberg, M. R., Martin, C. R., Freedman, S. D. Practical guide to exocrine pancreatic insufficiency - Breaking the myths. BMC Medicine. 15 (1), 29 (2017).
  69. Tickell, K. D., Atlas, H. E., Walson, J. L. Environmental enteric dysfunction: A review of potential mechanisms, consequences and management strategies. BMC Medicine. 17 (1), 181 (2019).
  70. Lo, C. M., et al. Cholecystokinin knockout mice are resistant to high-fat diet-induced obesity. Gastroenterology. 138 (5), 1997-2005 (2010).

Tags

علم الأحياء، العدد 189،
عزل اللمف المساريقي المتدفق في الفئران لتحديد حركية امتصاص الدهون الغذائية وإفراز الكيلوميكرون <em>في الجسم الحي</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dedousis, N. L., Teng, L., Kohan, A. … More

Dedousis, N. L., Teng, L., Kohan, A. B. The Isolation of Flowing Mesenteric Lymph in Mice to Quantify In Vivo Kinetics of Dietary Lipid Absorption and Chylomicron Secretion. J. Vis. Exp. (189), e64338, doi:10.3791/64338 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter