Summary
본 프로토콜은 마우스에서 십이지장내 영양소 주입에 반응하여 흐르는 장 림프를 분리하기 위한 상세한 수술 프로토콜을 설명합니다. 이를 통해 다양한 실험 영양소에 대한 반응으로 총 장내 지질 흡수 및 유미미크론 합성 및 분비를 생리학적으로 측정할 수 있습니다.
Abstract
장 지단백질, 특히 트리글리세리드가 풍부한 유미미크론은 신진대사, 염증 및 심혈관 질환의 주요 원인입니다. 그러나 장내 지단백질을 분리하는 것은 소장에서 장간막 림프관으로 먼저 분비되기 때문에 생체 내에서 매우 어렵습니다. 그런 다음 유미미크론 함유 림프는 흉관에서 쇄골하 정맥으로 비워져 식사의 구성 요소를 심장, 폐 및 궁극적으로 전신 순환에 전달합니다. 순진한 유미미크론을 혈액에서 분리하는 것은 유미미크론 트리글리세리드가 순환하는 지단백질, 리파아제 및 기타 지단백질 수용체와 상호 작용하는 즉시 가수분해되기 때문에 불가능합니다. 따라서 Bollman et al. 쥐에서 역사적으로 흉부 정맥으로 들어가기 전에 신선한 장간막 림프를 분리하는 데 사용되었습니다. 이 프로토콜은 지난 45년 동안 Patrick Tso의 실험실에서 개선되고 전문화되어 이러한 중요한 지단백질과 장내 분비물을 분석할 수 있습니다. Tso 림프 누공 절차가 업데이트되어 처음으로 시각적으로 여기에 제시됩니다. 이 개정된 절차는 십이지장 영양관을 설치하고, 장간막 림프관을 캐뉼라로 삽입하고, 의식이 있는 생쥐에서 식후 림프를 채취하는 1일 수술 기법입니다. 이러한 새로운 기술의 주요 이점은 생쥐에서 림프를 재현 가능하게 수집하는 능력(유전자 마우스 모델의 힘을 활용함)을 포함합니다. 십이지장 주입 튜브와 림프 캐뉼라를 이식하는 동안 마우스의 마취 시간 감소; 수유 및 식후 기간 동안 지속적으로 림프를 샘플링하는 능력; 혈액에서 희석 및 효소 가수 분해 전에 호르몬과 사이토 카인을 정량적으로 측정하는 능력; 장내 지단백질을 분리하기 위해 다량의 림프를 수집하는 능력. 이 기술은 식이 영양소 흡수, 장 지단백질 합성 및 유미미크론 분비를 직접 정량적으로 측정하기 위한 강력한 도구입니다.
Introduction
장간막 림프계의 생리적 중요성
장간막 림프관은 기원전 ~300년 Herophilos가 간 문맥 시스템과 모든 "장의 흡수성 정맥"을 설명했을 때부터 어떤 형태로든 설명되었습니다.1,2,3,4,5. 이 초기 설명 이후 1,700년 이상 동안 장 림프관의 특징은 식사 직후 장간막 림프에 유백색의 액체가 존재한다는 것이었습니다3. 유백색의 유미미크론 함유 림프("chylous" 림프)는 문맥과 간으로 배출되지 않고 대신 수조를 통해 흉관으로 이동하여 궁극적으로 왼쪽 쇄골하 정맥에서 혈액과 합류하는 것으로 알려져있습니다 6. 이 해부학적 배열로 인해 유미성 림프는 신체의 나머지 부분을 순환하기 전에 먼저 심장과 폐를 통해 이동합니다. 이것은 심장과 폐가 장간막 림프로 분비되는 분비물에서 "첫 번째 통과"를 얻는다는것을 의미한다 7.
장간막 림프관의 주요 역할은 소장 8,9,10에서 식이 지질을 운반하는 것입니다. 해부학적으로 유미미크론, 장내 면역 세포 11,12,13,14, 장 호르몬 15,16,17,18, 항원 19,20,21, 비유미미크론 친유성 화합물22,23 , 과잉 체액은 장 세포 기저막 아래의 젖산으로 들어간 다음 림프 모세 혈관을 통해 장간막 림프절로 농축됩니다. 대사 산물, 항원, 환경 오염 물질, 영양소 및 신호 분자를 포함하여 알려지지 않은 장간막 림프 성분이 많이 있을 수 있습니다.
장간막 림프의 성분은 체계적으로 확인되지 않았는데, 이는 주로 장간막 림프를 분리하는 것이 어렵기 때문입니다. 장간막 림프관은 무색이기 때문에 장간막 림프에 접근하는 것은 항상 심각한 도전이었고, 지방이 많은 식사 후 유백색이 될 때를 제외하고는 장간막 림프관에는 무색 림프액이 포함되어 있습니다 6,8,9,10.
장 림프를 분리하기 위한 현재 및 일반적인 방법
장간막 림프는 인간에게 접근할 수 없습니다(심각한 위장관 외상이 발생한 드물고 극단적인 상황 제외)24. 생체 내 림프 채취는 수술적으로 복잡하고 까다롭습니다. 원래의 2일 림프 누공 절차는 Bollman et al.25에 의해 설명되었으며 지난 45년 동안 Patrick Tso의 실험실에서 개선되고 전문화되었습니다26,27. 림프 누공 절차를 통해 조사관은 6시간의 십이지장 지질 주입 기간 동안 의식이 있는 동물로부터 흐르는 림프를 수집할 수 있습니다.
림프 누공 모델은 주로 쥐에서 림프 유속, 트리글리세리드 및 콜레스테롤(또는 기타 십이지장 주입 화합물)의 출력, 유미미크론 조성 및 장 호르몬 농도를 측정하는 데 사용되었습니다. 이 기술은 생쥐에서도 사용할 수 있지만 수술 생존율과 림프 용적이 저하됩니다. 장간막 림프관을 보는 데 어려움이 있기 때문에 역사적 방법에는 미니 돼지28, 양29, 돼지30, 개31, 쥐17과 같은 더 큰 동물에서 장간막 림프를 캐뉼라하는 것이 포함되었습니다. 이러한 더 큰 모델로 작업하는 것은 자원 집약적이며 녹인 또는 녹아웃 모델에 대한 연구를 허용하지 않습니다.
다른 접근법도 사용되었습니다. 유미미크론은 식후 상태에서 혈액에서 분리될 수 있습니다(혈장 지단백질 리파아제에 의해 부분적으로 가수분해됨)32,33,34,35. 흉관도 캐뉼러를 삽입할 수 있지만 거기에 수집된 림프에는 장간막 림프와 장외 림프 배액이 혼합되어 있습니다26,36. 시험관 내에서, Caco-2 세포는 지방산 처리에 반응하여 유미미크론 유사 입자를 분비하고, 이들 세포는 관련 림프 내피 또는 혈관 세포와 함께 배양될 수 있다37,38. 인간 및 마우스 장 오가노이드 배양은 정점 지질을 처리하고 유미미크론을 분비하는 것으로 나타났습니다 39,40,41,42. 이러한 모델은 매우 유리하고 소장 생리학에 대한 기계론적 통찰력을 가능하게 하지만 현장 장간막 림프관의 복잡성, 물리화학적 구배 또는 동적 림프 흐름을 복제할 수 없습니다.
여기에 제시된 1일 마우스 림프 누공 모델의 장점
장 지단백질을 분리하는 이러한 다른 방법과 관련하여 Tso Lab 림프관 기술은 전통적으로 식이 영양소가 장간막 림프로 흡수되는 것을 측정하기 위한 황금 표준 기술로 간주되어 왔습니다. 이 생체 내 기술은 식이 지질 흡수의 주요 생리학적 측면, 즉 흡수 기간 동안 화합물의 동적 외관을 포착할 수 있는 이점이 있으며, 이를 위해서는 십이지장 영양소가 있는 살아있는 동물에서 흐르는 장간막 림프의 반복 샘플링이 필요합니다. 이 수술 기법은 또한 장 호르몬과 사이토카인을 혈액이 아닌 생리학적 구획에서 직접 측정하여 희석되고 효소적으로 분해됩니다17,43.
실험적 질문에 지질 분비 역학 또는 소수성 GI 화합물 또는 약물의 동적 흡수 및 대사에 대한 이해가 필요한 경우 이 기술은 적절할 뿐만 아니라 근위부에서 원위부(위에서)로, 그리고 정점에서 기저외측 표면으로(장세포를 통해 유봉 및 문맥 순환으로) 내강 내용물의 이동을 보간하는 유일한 접근 방식이기도 합니다. 이 기술은 십이지장내 카테터를 통한 영양소의 내강 전달을 사용하고 흐르는 장간막 림프가 우회 및 수집되기 때문에 전체 흡수 장치가 실험적으로 제어되고 소장 흡수 프로파일을 정성적으로 평가하는 데 사용할 수 있습니다.
여기에서 처음으로 시각적으로 제시된 것은 Tso Lab 림프 누공 모델에 대한 주요 업데이트로, (1) 실험 시간을 1일의 외과적 이식 및 실험적 수집 기간으로 단축합니다. (2) 마우스 생존 및 동물 복지 고려 사항을 개선합니다. (3) 마우스 유전자 모델의 힘을 활용하기 위해 마우스에서 접근법의 재현성을 증가시킵니다. 이 기술은 장 분비물, 지단백질 또는 식이 지질 흡수에 대한 모든 실험적 질문에 대한 황금 표준으로 간주되어야 하며 지질 흡수 동역학 및 유미미크론의 고충실도 측정을 위한 최고의 기술입니다.
Protocol
모든 수술 절차는 피츠버그 대학 내부 동물 관리 및 사용 위원회[프로토콜 # 20047008]에 의해 승인되었으며 실험 동물의 관리 및 사용을 위한 NIH 가이드를 준수합니다. 8-14주령의 C57BL6/J 수컷 마우스를 본 연구에 사용하였다. 마우스는 상업적 공급원으로부터 입수하였다 ( 재료 표 참조). 모든 마우스는 표준 차우와 물에 대한 임의적 접근과 함께 12시간 명암주기로 사육되었습니다.
1. 동물 준비
- 실험 설계에 따라 생쥐에게 먹이를 주거나 금식하도록 하십시오.
알림: 위 배출 속도의 차이에 대한 우려가 없는 한 하룻밤 단식은 불필요합니다. - 5% 이소플루란 가스로 마취를 유도하고 꼬리와 발가락을 꼬집어 적절한 마취를 합니다. 마취가 끝나면 마우스를 2%-3% 이소플루란 가스가 있는 적절한 마취면에 유지하고 수술 플랫폼에 테이프로 배치합니다.
- 순환하는 따뜻한 물을 사용하는 가열된 수술 플랫폼에서 마우스를 따뜻하게 유지하십시오( 재료 표 참조).
2. 수술 및 실험 설계
- 수의사 연고를 눈에 바르고, 복부를 면도하고, 수술 부위에 소독 수술용 스크럽( 재료 표 참조)을 바르는 것으로 수술을 시작합니다. 이것은 절개 부위를 살균하고 정중선 절개 동안 공기 중 모피의 생성을 줄입니다.
- 멸균 기구, 커튼 및 기타 필요한 장비와 용품을 활용하여 멸균 작업 영역을 유지하십시오.
- 통증 완화(i.p.)를 위해 카르프로펜의 첫 번째 용량( 재료 표 참조)을 5mg/kg의 용량으로 주사합니다.
- 핀셋으로 피부를 잡고 작은 가위로 정중선 복부 절개를합니다. 흉골쪽으로 자르고 (위에는 없음) 사타구니 지방으로 자릅니다. 그런 다음 가위를 사용하여 근육층을 별도로 자릅니다.
알림: 사용하기 전에 모든 장비를 소독하십시오. - 견인기를 사용하여 림프관이 보일 때까지 복막 내장을 치우십시오.
- 식염수에 적신 Q-tip( 재료 표 참조)을 사용하여 간을 몸의 오른쪽 상단으로, 내장과 위를 동물의 왼쪽으로 옮깁니다.
- 십이지장을 왼쪽으로 가로로 늘려 상부 장간막 동맥과 장 림프관을 노출시킵니다.
- 캐뉼라 튜브에 뭉툭한 바늘을 삽입하여 30-40cm 길이의 캐뉼라 튜브를 준비하고( 재료 표 참조) 1,000mL 주사기를 사용하여 튜브를 통해 소량의 헤파린(1,000U/L)을 플러시합니다.
알림: 림프 흐름은 중력에 의해 얼음 위의 미세 원심분리기 수집 튜브로 흘러 들어갑니다. 수집 얼음 양동이가 수술 설정에 인접한 위치에 따라 캐뉼라 튜브의 길이를 조정해야 할 수도 있습니다. - 가위를 사용하여 캐뉼라 튜브 끝의 경사를 자릅니다.
- 홍채 가위 ( 재료 표 참조)로 림프관에서 소장에 나타나는 모습에서 약 5mm 떨어진 곳에 얕은 절개를하십시오.
- 한 쌍의 가는 집게로 캐뉼라 튜브를 잡고 팁 베벨을 덕트에 부드럽게 삽입합니다.
알림: 캐뉼라를 덕트 안으로 너무 멀리 밀어 넣지 않는 것이 중요한데, 이는 수축된 장기가 원래 위치로 돌아갈 때 림프 흐름을 방해할 수 있기 때문입니다. - 림프관은 카테터를 봉합사로 묶는 것과 관련된 조작에 너무 약합니다. 대신 시아노아크릴레이트 접착제 한 방울( 재료 표 참조)을 사용하여 림프 캐뉼라를 장간막 림프관에 붙입니다.
- 림프 누공 캐뉼라를 통해 즉시 흐르기 시작하는 유백색 림프(수술 전 올리브 오일 위관영양법을 사용한 경우) 또는 투명한 림프(수술 전 금식한 마우스가 있는 경우)를 확인하십시오.
알림: 림프 캐뉼라가 성공적으로 배치되고 림프가 흐르고 있는지 확인하십시오. 십이지장내 캐뉼라 배치를 계속합니다. - 18G 바늘을 사용하여 유문 괄약근 뒤쪽의 위 유문 부위에 구멍을 뚫습니다.
- 십이지장 주입 튜브( 재료 표 참조)를 위의 구멍을 통해 유문 괄약근을 지나 십이지장으로 약 1-2mm까지 삽입합니다.
- 실크 5-0 봉합사( 재료 표 참조)를 사용하여 지갑 끈 합자로 바늘을 위에 고정하고 누출을 방지하기 위해 시아노아크릴레이트 접착제 한 방울로 밀봉합니다.
- 0.3mL/h에서 5% 포도당-0.9% 식염수의 십이지장내 주입을 시작합니다.
참고: 체중이 약 25g(~8주령)인 마우스를 사용하는 경우 0.3mL/h의 포도당/식염수 주입이 적절합니다. 마우스가 극적으로 더 크면 체중과 혈액량의 변화를 고려하여 주입 속도를 상향 조정해야 합니다. - 체강 내의 장기를 교체하고 근육과 피부 조직을 별도로 봉합 (5-0)하십시오.
참고: 림프 캐뉼라와 십이지장내 영양관은 모두 동일한 절개를 통해 외부화됩니다. 봉합사로 튜브를 분리하는 우선 순위는 없으며 튜브의 외부 각도를 선호하지 않습니다. - 수술 후 마취제를 철회하기 전에 마우스를 Snuggle 구속 장치 ( 재료 표 참조)에 부드럽게 넣어 운동성을 제한하십시오.
알림: 껴안는 구속은 쥐가 바늘과 튜브를 씹기 위해 머리를 잡거나 회전하는 것을 방지합니다. - 그런 다음 생쥐를 회전자의 투명한 플렉시 유리 상자에 넣고 부드럽게 흔들고 격리 상자 측면에 부착된 온도 조절이 가능한 시중에서 판매되는 양서류/파충류 가열 패드를 사용하여 따뜻하게 합니다. 격리 상자의 모서리에 멸균 탈이온수 용기 형태로도 가습을 제공합니다( 재료 표 참조).
- 이소플루란을 회수하기 30분 전에 마우스에게 두 번째 통증 완화 용량(Buprenex, 0.1 mg/kg, ip)을 투여합니다.
- 실험에 따라 마우스에 5% 포도당-0.9% 식염수를 1시간 동안 0.3mL/h의 속도로 지속적으로 십이지장내 주입합니다.
참고: 5% 포도당-0.9% 식염수는 약국의 멸균 식염수 백(인체용, pH 7.4)과 멸균에 대한 엄격한 지침에 따라 50% 포도당의 인체용 멸균 병을 사용하여 준비됩니다. 용액은 신선하게 만들어야하며 식염수 백이나 포도당 병에 제공된 만료 날짜가 지난 경우 폐기해야합니다. - 실험용 지질로서 표 1 에 열거된 지질 중 하나를 갖는 마우스를 십이지장내 캐뉼라를 통해 투여한다( 표 재료 참조).
참고: 그림 1에 표시된 모든 데이터에 대해 SMOFlipid(20% 지질 주사 가능 에멀젼, USP, 재료 표 참조)를 십이지장에 주입했습니다. 이 주입은 십이지장내 지질 볼루스 전후에 모두 림프관을 통해 손실된 체액 배출을 대체하며 절대적인 요구 사항입니다. 마우스는 이제 실험용 지질 용량을 주입 할 준비가되었습니다. - 십이지장 내 주입 튜브를 통해 0.3mL 지질 에멀젼 볼루스(SMOFlipid 20% 지질 주사 가능 에멀젼, USP)의 고전적인 지질 주입을 수행합니다( 재료 표 참조).
- 십이지장내 지질의 일시 주입 후, 실험이 끝날 때까지 지속적으로 0.3mL/h에서 5% 포도당-0.9% 식염수로 주입을 다시 전환합니다.
- 림프 샘플을 미리 칭량된 미세 원심분리기 튜브에 60분 동안 수집하고 림프를 얼음 위에 유지합니다. 튜브의 무게를 두 번째로 측정하여 60분마다 분비되는 림프의 무게를 확인합니다.
참고: 50mL 지질 볼루스 후 ~300시간 동안 마우스당 시간당 약 300-0.3μL의 림프를 수집할 것으로 예상됩니다. - 림프는 지질 주입 후 최대 6 시간 동안 흐를 수 있습니다. 6시간 시점에서 이소플루란 및 자궁경부 탈구를 통해 마우스를 안락사시킵니다.
참고: 실험 내내 동물을 모니터링하기 위해 외과 의사 및/또는 실험실 기술자가 참석해야 합니다. 관찰하는 동안 림프 배액의 혈전과 통증/고통을 나타내는 동물 행동의 변화를 관찰하십시오. 실험 중 어느 시점에서든 림프관이 막히면 실험이 종료되고 동물은 안락사됩니다. 동물은 기술적으로 수술 후 최대 24시간 동안 생존할 수 있습니다(IACUC 생존 수술 규칙에 따름). 그러나 생존율은 시간이 지남에 따라 감소하고 6시간은 지질 흡수가 여전히 생체 내 생리학을 모방하고 동물이 생존에 어려움을 겪지 않는 재현 가능한 생존 기간입니다. - 안락사 후 말단 조직 채취를 수행합니다(3.1단계).
참고: 수술 후 6시간 또는 24시간 동안 보관된 마우스의 식이 지질 흡수 프로파일의 차이는 최근 테스트되었습니다44. 우리는 24시간 절차가 동물 생존율과 식이 지질이 림프로의 이동을 감소시킨다는 것을 발견했습니다. 이러한 이유로 6시간 접근 방식을 사용하는 것이 좋습니다. 이 업데이트된 수술 설계는 불필요한 동물 사망과 수술 후 동물 고통의 가능성을 줄입니다. 이는 미국 실험 동물 관리 인증 협회(American Association for Accreditation of Laboratory Animal Care)의 주요 목표인 동물 "대체, 감소, 정제"[ref PMID: 21595115]를 지원합니다.
3. 내강 내용물 및 점막 조직의 수집
- 6 시간 지질 주입 기간이 끝나면 이소 플루 란 및 자궁 경부 탈구를 통해 마우스를 희생시킵니다. 위, 소장, 맹장의 양쪽 끝을 5-0 봉합사로 묶어 내강 내용물의 누출을 방지합니다.
- 위, 맹장, 결장을 모아 각각 15mL 유리관에 넣습니다. 소장을 3개 또는 4개의 세그먼트로 나누고 세로로 절단한 후 2-3mL의 차가운 PBS로 조직을 헹구어 내강 내용물을 수집합니다.
- 곡선형 핀셋으로 2-3 mL의 차가운 PBS에서 각 섹션을 긁어내어 근육층으로부터 상피 세포 및 관련 고유판을 포함하는 장 점막을 제거한다.
- 모든 조직, 내강 및 점막 분리주, 근육층을 유리관에 넣고 8mL의 2:1 vol/vol CHCl3:MeOH를 각 튜브에 추가합니다.
- Folch 추출 후 액체 섬광 계수 및/또는 트리글리세리드 분석 키트( 재료 표 참조)로 방사능 및/또는 지질 농도를 결정합니다45.
4. 박층 크로마토그래피(TLC)
- 변형된 Folch 추출법을 통해 내강 및 점막 분리물의 총 지질을 추출한다(45).
- 추출된 지질을 질소 증발기 하에서 용매에서 건조시킨 다음 TLC 실리카겔 플레이트에 로드하기 전에 CHCl3:MeOH의 2:1 vol/vol로 재현탁합니다( 재료 표 참조).
- 석유 에테르, 에틸 에테르 및 빙초산(25:5:1 vol/vol/vol)의 용매 시스템을 사용하여 지질을 분리합니다. 표준물질을 포함한 다양한 지질의 시각화를 위해 요오드 증기를 사용합니다.
- 섬광 계수를 위해 섬광 유체 4mL( 재료 표 참조)를 추가하기 전에 모노글리세리드/인지질, 디글리세리드, 지방산, 트리글리세리드 및 콜레스테롤 에스테르에 해당하는 TLC 플레이트의 반점을 개별 섬광 바이알에 긁어냅니다.
- 데이터를 총 볼루스 지질 용량의 백분율 또는 각 샘플에 대해 검출된 총 지질의 분율로 표현합니다.
5. Chylomicron 분리 및 특성화
- 결합된 림프 샘플을 지질 볼루스 후 6시간(단계 2.29)에서 초원심분리기 튜브로 옮기고 0.9% NaCl(300-500μL)과 혼합한 다음 적절한 부피의 0.87% NaCl(300-500μL)로 조심스럽게 오버레이합니다.
- 초원심분리기( 재료 표 참조)를 110,000 x g 에서 4°C에서 16시간 동안 처리한다. 분리된 유미미크론이 포함된 상단 분획을 수집하여 새 미세 원심분리기 튜브로 옮깁니다.
- 아래 단계에 따라 유미미크론 트리글리세리드, 콜레스테롤 및 apoB 농도를 측정합니다.
- 트리글리세리드 및 콜레스테롤 분석 키트를 사용하여 트리글리세리드 및 콜레스테롤 농도를 결정합니다( 재료 표 참조).
- 간단히 말해서, 2μL의 샘플을 200μL의 효소 시약과 함께 37°C에서 5분 동안 96웰 플레이트에서 배양합니다. 트리글리세리드의 경우 500nm, 콜레스테롤의 경우 600nm에서 플레이트 리더를 사용하여 플레이트를 읽습니다.
참고: 표준물질과 블랭크는 농도 계산에 사용되었습니다. ApoB 농도는 Mouse ApoB ELISA 키트를 사용하여 결정하였다( 재료 표 참조).
- 유미미크론 입자 크기를 결정합니다.
- TEM 이미징을 위해 약 40mg/dL의 트리글리세리드 농도에서 신선한 유미미크론 샘플을 사용하십시오. 간단히 말해서 각 샘플 5-10 μL를 TEM 그리드에 놓고 건조시킵니다.
- 투과 전자 현미경으로 그리드를 검사하고 이미지를 캡처합니다. 지단백질 입자 크기를 측정하고 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 분석합니다( 재료 표 참조).
Representative Results
도 2 는 장간막 림프에서의 트리글리세라이드 분비 및 여기에 기재된 1일 림프 누공 시술을 받은 가장 최근의 n=17 야생형(WT) 마우스에서의 평균 림프 유속을 보여준다. 도 2A에 나타낸 바와 같이, 림프 내의 트리글리세라이드 농도는 SMOFLipid의 300 μL의 십이지장내 볼루스에 반응하여 증가한다. 피크 트리글리세리드 농도는 볼루스 후 ~2-3시간에 도달하고 6시간(안락사 직전)까지 꾸준히 감소합니다. 트리글리세리드 분비와 병행하여 림프 유속은 시간 0 일시 주입부터 실험 종료까지 증가합니다(그림 2B).
이러한 결과는 장간막 림프관과 십이지장내 캐뉼라의 외과적 이식이 모두 발생했음을 보여주며 다른 림프 함량(호르몬, 펩타이드, 영양소)을 벤치마킹할 수 있는 양성 대조군을 나타냅니다. 일시 십이지장 내 지질에 대한 반응으로 림프의 트리글리세리드 농도에 변화가 없다면, 이는 수술이 소장에 심각한 손상을 일으켜 지질 흡수 능력이 결여되어 있다는 신호이거나, 이전에 표현형이 밝혀지지 않은 유전 모델에서 마우스가 생리학적으로 의미 있는 지질 흡수에 결함이 있음을 시사합니다.
그림 1: 림프 누공 마우스 모델에 대해 제안된 타임라인. T-4, T-3, T-2 : 이중 캐뉼러 삽입에는 약 2-4 시간이 걸리고 마우스를 회수 챔버에 배치합니다. T-1: 마우스가 회복 기간에 들어가면 5% 포도당-0.9% 식염수를 지속적으로 십이지장에 주입합니다. T0: 지속적인 십이지장내 주입이 5% 포도당-0.9% 식염수에서 실험 영양소 주입으로 전환됩니다. T0-T6: 마우스는 식염수에서 지속적으로 십이지장내 5% 포도당을 섭취하거나 대안적으로 지속적인 영양소를 섭취합니다. 이 기간 동안 림프는 매시간 수집됩니다. 종점: 마우스를 안락사시키고 조직을 채취할 수 있습니다. 그림은 BioRender.com 로 만들어졌습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 장간막 림프 트리글리세라이드 농도 및 유속. 야생형 마우스에는 십이지장내 영양 튜브와 장간막 림프 캐뉼라가 장착되었습니다. 마우스는 300 μL의 지질을 일시 주입 받았다. 림프를 시간별 분취량으로 6시간 동안 수집하여 얼음 위에 보관했습니다. (A) 림프 트리글리세라이드 함량은 림프의 각 시간당 분취량에서 화학적 분석에 의해 결정되었습니다. (B) 볼루스 주입 후 6시간 동안 림프 흐름은 시간당 분비되는 림프의 그램으로 표시됩니다. 포인트는 SEM± 평균입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 지질 전달 방법 | 권장 사항/지침 | |||||
| 혼합 지질 에멀젼 볼루스 | 십이지장 내 주입 튜브를 통해 ( A ) Liposyn III 20% 지질 주사 가능 또는 (B) SMOFlipid 20% 지질 주사 에멀젼 (USP) 의 0.3mL 용량을 사용할 수 있습니다. 이러한 유화 지질은 미리 준비할 필요가 없고, 실온에서 액체이고, 멸균 상태이며, 유리 지방산, 트리글리세리드, 인지질 및 나트륨 타우로콜레이트의 "쉽게 소화할 수 있는" 혼합물을 함유하기 때문에 유용합니다. 이것은 췌장 또는 담즙 기능 부전을 가질 수있는 마우스에게 좋은 스타터 주입입니다. | |||||
| 트리글리세리드 볼루스 | 0.3mL 부드럽게 데운 올리브 오일(또는 정제된 트리올레인)은 불포화 지방이 풍부한 식단을 반영하는 중성 지질로, 라드(포화 지방 함량이 높은 식단을 반영) 또는 코코넛 오일(중쇄 트리글리세리드 함량이 높은 식단을 반영)은 모두 십이지장내 주입 튜브 또는 경구 위관영양법으로 투여할 수 있습니다. 실험용 트리글리세리드가 포화되면 실온에서 액체가 되도록 가열해야 합니다. | |||||
| 혼합 식사 덩어리 | 0.3 mL 0.075 g 지방(21.6%), 0.5 g 탄수화물(64.0%), 및 0.1125 g 단백질(14.4%)을 함유하는 제형으로 확인하고 저지방 혼합 식사를 반영하며, 십이지장내 주입을 통해 투여할 수 있습니다. | |||||
| 방사성 표지 된 지질 볼루스 | 0.3mL의 올리브 오일에 5.0μCi 3H표지된 글리세롤 트리올레에이트 및/또는 1.0μCi 14C-콜레스테롤을 십이지장내 주입을 통해 투여할 수 있습니다. 14 C-콜레스테롤: 콜레스테롤-[4-14C]의 비활성이 55Ci/mmol이고 농도가 0.1mCi/mL입니다. 3 H-TG 트리올레인 [9,10-3H(N)](3H-TG), 비활성은 60Ci/mmol이고 농도는 1mCi/mL입니다. | |||||
| 연속 투여 | 위의 실험 영양소 제제 중 하나를 0.3mL/h(총 볼루스 0.3mL가 아닌)의 속도로 주입하면 트리글리세리드가 림프로 꾸준히 출력됩니다. 이것은 림프의 트리글리세리드 농도가 ~2-3시간에 최고조에 달한 다음 ~6-8시간에 기준 농도로 돌아가는 일시 주입과 다릅니다. | |||||
표 1 : 지질 주입 표.
Discussion
원래의 2일 림프 누공 시술은 Bollman et al.25에 의해 기술되었으며 지난 45년 동안 Patrick Tso의 실험실에서 시행되었습니다26,27. 여기에 제시된 프로토콜은 소장의 고유한 유미성 분비물뿐만 아니라 식이 영양소 흡수 및 대사, 장 호르몬 및 장 면역의 생체 내 역학을 식별, 정량화 및 이해하기 위한 이 고전적인 황금 표준 방법에 강력한 추가 기능입니다.
이 모델의 장점은 (1) 흡수, 소화 또는 분비 중 한 시점에서 정적 샘플링이 아닌 수유 및 식후 기간 동안 장간막 림프를 지속적으로 샘플링하는 능력; (2) 장내 호르몬과 사이토카인이 희석되고 효소적으로 분해되는 혈액이 아닌 생리학적 구획에서 직접 측정17,44; (3) 유미미크론 트리글리세리드 농도 및 천연 유미미크론 구조를 보존하는 지질 식사 섭취 및 장간막 림프에서 내피 리파아제가 없는 후 소장에서 분비되는 지단백질을 분리, 정량화 및 특성화하는 능력46,47; (4) 림프 유속, 트리글리세리드 및 콜레스테롤(또는 기타 십이지장 주입 화합물)의 출력, 유미미크론 조성 및 장 호르몬 농도를 직접 측정하는 능력. 마지막으로, 이 프로토콜을 사용하면 6시간 동안 매시간 비교적 많은 양의 >50μL의 림프를 수집할 수 있습니다. 체액이 십이지장 내 식염수 및 포도당 주입으로 보충됨에 따라 림프 누공 모델은 다른 림프 샘플링 기술에 비해 크게 개선되어 장간막 림프의 정적 풀이 아닌 흐르는 결과를 낳습니다. 부피는 지질학, 단백질체 및 대사체학 접근법의 주요 장애물이기 때문에 이것이 주요 강점입니다.
여기에 기술된 1일 마우스 림프 누공 프로토콜은 수술 후 더 높은 생존율 때문에 이전에 기술된 2일 림프 누공 프로토콜(26,27)로부터의 총 실험 동물 수의 감소를 포함하여, 원래의 림프 누공 프로토콜에 비해 몇 가지 이점을 갖는다; 전체 실험 시간을 2일에서 1일로 단축합니다. 마지막으로, 돌발성 통증이나 수술 후 결과가 좋지 않을 수 있는 하룻밤(>18시간)에서 수술 후 보다 관리하기 쉬운 ~6시간 기간으로 생쥐의 회복 기간이 단축됩니다.
이 1일 프로토콜의 특징은 인도적 고려 사항과 종점에 초점을 맞춘다는 것입니다. 이들은 가장 높은 우선 순위를 가져야 합니다: (1) 동물은 십이지장내 또는 IV 대체 유체를 받아야 합니다. (2) 가능한 한 따뜻하고 통증이 없어야 합니다(실험 설계 및 항염증 효과 방지의 필요성에 따라 수술 후 Buprenex 및/또는 카프로펜 사용). (3) 출혈, 떨림, 설사 또는 고통의 징후는 모두 인도적 종말론에 대한 설득력 있는 이유입니다. 엄격한 IACUC 지침에 따라 이소플루란에 이어 경추 탈구가 좋은 종점입니다. 수술 생존율은 하루 동안 ~70%이지만(원래 2일 수술의 경우 ~40%와 비교), 조사관은 고통의 징후로 실험을 종료하는 것을 주저해서는 안 됩니다. 동물 수를 계획할 때 이를 고려해야 합니다.
이 기술의 문제 해결 측면에서 림프 캐뉼라를 성공적으로 배치하는 것이 이 수술 절차의 주요 병목 현상입니다. 수술을 연습하는 동안 수술 약 2시간 전에 0.3mL 올리브 오일로 마우스를 위관하는 것이 도움이 됩니다. 이것은 유미미크론이 장간막 림프관으로 분비되어 "유백색"으로 보이고 더 잘 보이게 합니다. 메틸렌 블루도 사용할 수 있지만 종종 유백색 림프관보다 덜 분명합니다. 림프 캐뉼라를 배치하고 접착제로 배치 한 후 장간막 림프가 캐뉼라를 통해 수집 용기로 성공적으로 흐르면 십이지장 주입 튜브를 배치 할 수 있습니다. 때때로 림프는 지속적으로 흐르지 않을 수 있지만 동물을 회전 테이블에 놓으면 다시 흐르기 시작할 수 있습니다. 비판적으로 림프관 내의 혈전을 조심하십시오. 림프관의 역류 압력을 방지하기 위해 튜브 밖으로 마사지해야 합니다.
트리글리세리드 분비 및 림프 유속 외에도 이 기술을 사용하여 다음과 같은 지질 흡수 동역학 및 유미미크론 특성을 결정할 수 있습니다.
유미미크론 분비45,48,49
지방을 함유 한 식사 직후에는 순환 혈장 트리글리세리드가 일시적으로 증가합니다. 트리글리세리드는 본질적으로 소수성이기 때문에 먼저 혈액에 용해되도록 유화되어야 합니다50. 소장 장세포는 이 역할을 수행하고 식이 트리글리세리드를 유미미크론 에멀젼 입자51로 포장합니다. 유미미크론은 코어에 콜레스테롤과 식이 중성지방을 함유하고 있으며 apoB-48, apoA-I, apoA-IV 및 apoC-III52,53,54,55를 포함한 인지질과 아포지단백질로 둘러싸여 있습니다. ApoB-48은 필수 구조 단백질이며, 다른 아포지단백질은 유미미크론 대사 및 혈액 제거에 필요한 다양한 기능을 가지고 있습니다. 트리글리세리드 및 아포지단백 함량을 포함한 유미미크론의 주요 특성을 확인하려면 여기에 표시된 1일 림프 누공 기술을 사용해야 합니다. 유미미크론 분비율은 주입된 3H-트리글리세리드의 백분율로 림프로 분비되고 시간당 림프 샘플을 계산하여 섬광으로 측정됩니다. 이것은 상세한 유미미크론 특성화 48,49,56,57,58과 결합될 수 있습니다. 시간별 림프 샘플은 결합하거나 별도로 보관할 수 있습니다. 림프를 초원심분리기 튜브로 옮기고 0.9% NaCl과 혼합한 다음 0.87% NaCl 300-500μL로 조심스럽게 겹칩니다. 그런 다음 샘플을 4°C에서 110,000 x g에서 16시간 동안 초원심분리합니다. 분리된 유미미크론을 포함하는 상위 분획을 수집하고 트리글리세리드 분석 키트를 사용하여 트리글리세리드 농도에 대해 테스트합니다. 간단히 말해서, 2μL의 유미미크론(1:10 희석)을 200μL의 효소 시약과 함께 실온에서 10분 동안 96웰 플레이트에서 배양합니다. 플레이트는 500 nm에서 플레이트 리더에 의해 판독되고, 표준물질 및 블랭크는 트리글리세리드 농도의 계산을 위해 사용된다. 그런 다음 유미미크론 크기는 음성 염색 및 투과 전자 현미경(TEM)으로 결정할 수 있습니다14,29. 트리글리세리드와 콜레스테롤은 ELISA 키트 또는 웨스턴 블롯에 의한 화학적 분석 및 아포지단백 함량(apoB-48, A-I, C-II, C-III)으로 정량화할 수 있습니다.
지질 흡수의 1차 부위 결정48,59
3H-트리글리세라이드 또는 방사성 표지된 혼합 식사의 주입 후 6시간에 십이지장, 공장 및 회장의 내강 및 상피 세포 구획을 분리함으로써, 내용물은 3H-트리글리세리드의 양이 상피 세포막을 가로질러 흡수되는지(정상) 또는 소장의 길이를 따라 내강에 유지되는지(비정상)를 결정하기 위해 Folch를 추출한다48 . 이러한 연구는 위장관 운동성60,61,62에 잠재적인 차이가 있는 경우, 담즙산(지질 흡수 전반에 걸쳐 매우 활성이고 회장에서 재흡수됨)에 대한 가설이 있는 경우63,64,65,66, 또는 영양소가 잘못된 해부학적 위치(회장 또는 결장)67에서 흡수되고 있다는 우려가 있는 경우 특히 영향을 미칩니다 ,68,69,70.
흡수성 상피 세포로의 3 H-트리글리세라이드 트래피킹의 메커니즘 확인 48
이것은 장 내강에서 3 H-유리 지방산으로 가수분해되고, 점막으로 흡수되고, 유미미크론으로 분비되기 전에 세포 내 3 H-트리글리세리드로 재에스테르화되는 3H-트리글리세리드의 백분율을 계산하여 수행됩니다. 이것은 식이 트리글리세리드가 분해 산물로 이동하고 후속 포장이 유미미크론으로 이동하는 것을 추적할 수 있기 때문에 흡수/분비 결함의 강력한 지표입니다. 지방산 흡수 기계(CD36, FAFAB, ACSL), 재에스테르화 경로(MGAT, DGAT, MTTP, apoB) 및 아포지단백질(apoC-III, B-48, C-II, A-I, A-IV)의 mRNA 발현은 RT-PCR에 의해 추가로 정량화할 수 있습니다.
이 기술의 향후 적용은 장-기관 누화, 신진대사, 면역, 영양소 흡수, 환경 식이 오염 물질 또는 GI 시스템에서 역할을 하는 기타 질병에 대한 관심에 의해서만 제한됩니다. 중요한 장간막 림프계에 접근하기 어렵기 때문에 많은 설득력 있는 실험과 가설이 지연되었을 가능성이 있으며, 이 시각화된 프로토콜의 목표는 이 기술을 보다 쉽게 사용할 수 있도록 하는 것입니다. 유미미크론과 이들이 처음에 상주하는 장간막 림프를 분리하는 것은 전신 대사를 이해하는 데 중요한 부분입니다. 1일 마우스 림프 누공 모델은 이러한 사건을 연구하기 위한 강력한 생리학적 모델입니다.
Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
낭포성 섬유증 재단(Cystic Fibrosis Foundation, Pilot and Feasibility Award 1810, ABK), Rainin Foundation(시너지 상, PI GJ Randolph 및 Co-I ABK) 및 국립 보건원(R01DK118239, R03DK116011 to ABK)에 이러한 연구를 지원해 주신 데 대해 매우 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% Sodium Chloride Injection, USP sterile | Hospira, Lake Forest, IL, US | NDC 0409-4888-06 | |
| 1.7 mL Eppendorf tubes | Fisher Scientific, Waltham, MA, US | 7200184 | |
| 14C-cholesterol: Cholesterol-[4-14C] (0.1mCi/ mL) | American Radiolabeled Chemicals Inc., St. Louis, MO, US | ARC 0857 | |
| 18 G needle | Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, US | 305199 | |
| 2 Dumont micro-dissecting forceps | Fine Science Tools, Foster City, CA, US | 11251-35 | |
| 2 Forceps | ROBOZ Surgical Instrument Co., Gaithersburg, MD, US | RS-5130 | |
| 3H-TAG: Triolein [9,10-3H(N)] (3H-TG) (1mCi/ mL) | American Radiolabeled Chemicals Inc., St. Louis, MO, US | ART0199 | |
| 3H-TG Triolein [9,10-3H(N)] (3H-TG) | American Radiolabeled Chemicals, INC. St. Louis | MO 63146 | |
| 50% Dextrode Injection, USP 25grams/50 mL sterile | Hospira, Lake Forest, IL, US | NDC-0409-6648-16 | |
| Analtech TLC Uniplates: silica gel matrix Z265500-1PAK | Fisher Scientific, Waltham, MA, US | 11-101-0007 | |
| BD CareFusion ChloraPrep Swabstick | Fisher Scientific, Waltham, MA, US | 14-910-501 | |
| Betadine surgical scrub | Dynarex Corp., Orangeburg, NY, US | 1201 | |
| Bevel-cut cannula | Braintree Scientific., Braintree , MA, US | MRE025 | |
| Buprenorphine HCl Injection Carpuject PFS 0.3mg/mL 10/Bx (Buprenex) | HenrySchein, Warrendale, PA, US | 1278184 | |
| C57BL6/J male mice | Jackson Laboratory, Bar Harbor, Maine | ||
| ChloraPrep | Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, US | 260100 | |
| Cholesterol Assay Kit | FujiFilm Healthcare, Lexington, MA, US | 99902601 | |
| Cholesterol-[4-14C] | American Radiolabeled Chemicals, INC. St. Louis | MO 63146 | |
| Clear plexiglass box L43cm X W26 X H 21 with temperature-controlled heating pad and humidification | our own design and modifications | ||
| commercially available amphibian/reptile heating pad | ShenZhen XingHongChang Electric CO., LTD. ShenZhen, China | XHC-F035D | |
| Cotton tip applicators | Fisher Scientific, Waltham, MA, US | 22363156 | |
| Duodenal infusion tube - canuala | Braintree Scientific, Braintree , MA, US | MRE037 | |
| Ensure | Abbott Nutrition, Columbus, OH | ||
| Heating pad surgical platform with circulating warm water pump combination | Patterson Scientific, Waukesha, WI, US | Gaymar T/Pump Classic | |
| Hetarin Sodium Injection, USP 1,000 units/mL sterile | Mylan, Morgantown, WV, US | NDC-67457-384-31 | |
| Image J Software | National Institute of Health, Bethesda, Maryland, | ||
| Iris scissors | ROBOZ Surgical Instrument Co., Gaithersburg, MD, US | RS-5602 | |
| Isoflurane | Piramal Pharma Solutions, Riverview, MI, US | NDC 66794-017-25 | |
| Isoflurane induction apparatus and Anesthesia Apparatus | Patterson Scientific, Waukesha, WI, US | mouse induction chamber | |
| Krazy glue | Elmer's products Inc., Columbus, OH, US | KG484 | |
| Liposyn III 20% lipid injectable | Hospira Inc. Lake Forest, Illinois, USA | ||
| LS 6500 Multi-Purpose Scintillation Counter | Beckman Coulter, Brea, CA | ||
| Micro-dissecting Spring Scissors | ROBOZ Surgical Instrument Co., Gaithersburg, MD, US | RS-5602 | |
| Mouse apoB ELISA Kit | ABCAM Inc., Waltham, MA, US | ab230932-1 | |
| Needle Holder | Fine Science Tools, Foster City, CA, US | 12002-12 | |
| Retractors | Kent Scientific Co., Torrington, CT, US | SURGI-5001 | |
| Rimadyl (Carprofen) | Zoetis Inc., Kalamazoo MI, US | 4019449 | |
| Rotating table Barnstead Thermolyne | Labquake, Zürich, Switzerland | Barnstead Thermolyne | |
| SMOFlipid 20% lipid injectable emulsion, USP | Fresenius Kabi, Warrendale, PA, US | NDC-63323-820-01 | |
| Snuggle | Lomir Biomedical Inc., Notre-Dame-de-l'Île-Perrot, QC J7V 7M4, Canada | MS 02.5PM | |
| Surgical Scissors | ROBOZ Surgical Instrument Co., Gaithersburg, MD, US | RS-5912SC | |
| Suture (5-0 silk with needle) | DemeTECH, Miami Lakes, FL, US | DT-719 | |
| Transmission Electron Microscope (JEOL 1400-FLASH 120KV ) | JEOL, Peabody, MA | ||
| Triglyceride Assay Kit | Randox Laboratories, Crumlin, United Kingdom | TR210 | |
| ULTIMA GOLD XR Scintillation Fluid | Perkin Elmer, Hebron, KY, US | 6013119 | |
| Ultracentrifuge, rotor S100AT4-497 | SORVALL RC M120 GX |
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