Waiting
Login-Verarbeitung ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

בידוד הלימפה המזנטרית הזורמת בעכברים לכימות קינטיקה של ספיגת שומנים תזונתיים והפרשת כילומיקרון

Published: November 30, 2022 doi: 10.3791/64338
Automatic Translation
1, 1, 1
1Division of Endocrinology and Metabolism, Department of Medicine, School of Medicine, University of Pittsburgh

Summary

הפרוטוקול הנוכחי מתאר פרוטוקול כירורגי מפורט לבידוד לימפה זורמת במעי בתגובה לעירויי חומרים מזינים תוך תריסריונים בעכברים. זה מאפשר קביעה פיזיולוגית של ספיגת שומנים כוללת במעי וסינתזה והפרשה של כילומיקרון בתגובה לחומרים מזינים ניסיוניים שונים.

Abstract

ליפופרוטאינים במעי, במיוחד כילומיקרונים עשירים בטריגליצרידים, הם גורם עיקרי לחילוף חומרים, דלקת ומחלות לב וכלי דם. עם זאת, בידוד ליפופרוטאינים במעיים קשה מאוד in vivo מכיוון שהם מופרשים לראשונה מהמעי הדק לתוך הלימפה המזנטרית. לאחר מכן הלימפה המכילה כילומיקרון מתרוקנת לתוך הווריד התת-קלאבי מצינור בית החזה כדי לספק רכיבים של הארוחה ללב, לריאות, ובסופו של דבר, למחזור הדם של כל הגוף. בידוד כילומיקרונים נאיביים אינו אפשרי מהדם, שכן טריגליצריד כילומיקרון עובר הידרוליזה מיד עם אינטראקציה עם ליפופרוטאין ליפאז וקולטני ליפופרוטאין אחרים במחזור. לכן, הליך פיסטולה הלימפה המקורי בן יומיים, שתואר על ידי בולמן ואחרים בחולדות, שימש היסטורית לבידוד לימפה מזנטרית טרייה לפני כניסתה לווריד בית החזה. פרוטוקול זה שופר והתמקצע על ידי מעבדתו של פטריק טסו במשך 45 השנים האחרונות, ומאפשר ניתוח של ליפופרוטאינים קריטיים אלה והפרשות מהמעיים. הליך פיסטולה לימפה Tso עודכן כעת ומוצג כאן באופן חזותי לראשונה. הליך מתוקן זה הוא טכניקה כירורגית של יום אחד להתקנת צינור הזנה לתריסריון, קנולציה של צינור הלימפה המזנטרי, ואיסוף לימפה לאחר ארוחה בעכברים מודעים. היתרונות העיקריים של טכניקות חדשות אלה כוללים את היכולת לשחזר לימפה מעכברים (אשר רותם את כוחם של מודלים גנטיים של עכברים); זמן ההרדמה המופחת לעכברים במהלך ההשתלה של צינור העירוי התריסריון וצינורית הלימפה; היכולת לדגום ברציפות לימפה לאורך כל תקופת האכלה ולאחר הלידה; היכולת למדוד כמותית הורמונים וציטוקינים לפני דילולם והידרוליזה אנזימטית בדם; ואת היכולת לאסוף כמויות גדולות של לימפה לבידוד ליפופרוטאינים במעי. טכניקה זו היא כלי רב עוצמה למדידה ישירה וכמותית של ספיגת חומרים מזינים בתזונה, סינתזת ליפופרוטאין במעי והפרשת כילומיקרון.

Introduction

החשיבות הפיזיולוגית של מערכת הלימפה המזנטרית
הלימפה המזנטרית תוארה בצורה כלשהי מאז ~ 300 לפנה"ס כאשר הרופילוס תיאר את מערכת פורטל הכבד ואת כל "ורידים סופגים במעיים"1,2,3,4,5. במשך יותר מ -1,700 שנים לאחר תיאור ראשוני זה, מאפיין מגדיר של לימפה במעיים היה נוכחות של נוזל חלבי בלימפה mesenteric זמן קצר לאחר ארוחה3. כיום ידוע כי לימפה חלבית, המכילה כילומיקרון (לימפה "כילוס") אינה מתנקזת לווריד הפורטלי ולכבד אלא עוברת דרך ציסטרנה צ'ילי לתוך צינור בית החזה, ובסופו של דבר מצטרפת לדם בווריד התת-קלאבי השמאלי6. בשל סידור אנטומי זה, הלימפה chylous הראשון נוסע דרך הלב והריאות לפני מחזור דרך שאר הגוף. משמעות הדבר היא כי הלב והריאות מקבלים "מעבר ראשון" על הפרשות לתוך הלימפה mesenteric7.

תפקיד מרכזי של לימפה mesenteric הוא הובלה של שומנים תזונתיים מן המעי הדק 8,9,10. אנטומית, כילומיקרונים, תאי מערכת החיסון של המעי 11,12,13,14, הורמוני מעיים 15,16,17,18, אנטיגנים 19,20,21, תרכובות ליפופיליות שאינן כילומיקרון 22,23 ונוזלים עודפים נכנסים לקטלים שמתחת לקרום מרתף האנטרוציטים ולאחר מכן מרוכזים דרך נימי הלימפה לבלוטות הלימפה המזנטריות., סביר להניח שישנם מרכיבים לימפטיים מזנטריים רבים שאינם ידועים, כולל מטבוליטים, אנטיגנים, מזהמים סביבתיים, חומרים מזינים ומולקולות איתות.

מרכיבי הלימפה המזנטרית לא זוהו באופן שיטתי, בעיקר בשל הקושי לבודד לימפה מזנטרית. הגישה ללימפה המזנטרית תמיד הייתה אתגר רציני מכיוון שצינורות הלימפה הם חסרי צבע, ולמעט לאחר ארוחה שומנית כאשר הם הופכים לכיליים וחלביים, הלימפה המזנטרית מכילה נוזל לימפה חסר צבע 6,8,9,10.

שיטות נוכחיות ונפוצות לבידוד לימפה במעי
לימפה מזנטרית אינה נגישה בבני אדם (למעט נסיבות נדירות וקיצוניות שבהן התרחשה טראומה חמורה במערכת העיכול)24. איסוף לימפה In vivo הוא מורכב ותובעני מבחינה כירורגית. הליך פיסטולה הלימפה המקורי בן יומיים תואר על ידי Bollman et al.25 ושופר והתמקצע על ידי מעבדתו של פטריק טסו במשך 45 השנים האחרונות26,27. הליך פיסטולה הלימפה מאפשר לחוקרים לאסוף לימפה זורמת מבעלי חיים מודעים במהלך 6 שעות עירוי שומנים בתריסריון.

מודל פיסטולה הלימפה שימש בעיקר בחולדות למדידת קצב זרימת הלימפה, תפוקת הטריגליצרידים והכולסטרול (או תרכובות אחרות המושרות בתריסריון), הרכב הכילומיקרון וריכוזי הורמוני המעי. במידה פחותה, טכניקה זו יכולה לשמש גם בעכברים, אם כי הישרדות כירורגית ונפח הלימפה סובלים. בשל הקשיים לראות צינורות לימפה מזנטריים, שיטות היסטוריות כללו קנולציה של לימפה מזנטרית בבעלי חיים גדולים יותר כמו מיני חזירים28, כבשים29, חזירים30, כלבים31 וחולדות17. העבודה עם מודלים גדולים אלה היא עתירת משאבים ואינה מאפשרת מחקרים במודלים של נוק-אין או נוק-אאוט.

נעשה שימוש גם בגישות חלופיות. ניתן לבודד כילומיקרונים מהדם במצב שלאחר הלידה (אם כי אלה יעברו הידרוליזה חלקית על ידי ליפופרוטאין ליפאז פלזמה)32,33,34,35. צינור החזה יכול גם להיות cannulated, אם כי הלימפה שנאספה שם מכיל תערובת של לימפה mesenteric וניקוז לימפה מחוץ למעיים26,36. במבחנה, תאי Caco-2 מפרישים חלקיק דמוי כילומיקרון בתגובה לטיפול בחומצות שומן, ותאים אלה יכולים להיות בתרבית משותפת עם תאי אנדותל לימפה או כלי דם רלוונטיים37,38. תרביות אורגנואידים במעיים של בני אדם ועכבר הוכחו כמעבדות שומנים אפיים ומפרישות כילומיקרונים 39,40,41,42. מודלים אלה הם בעלי יתרון רב ומאפשרים תובנות מכניסטיות על הפיזיולוגיה של המעי הדק, אך הם אינם יכולים לשכפל את המורכבות, השיפועים הפיזיו-כימיים או זרימת הלימפה הדינמית של לימפה מזנטרית באתרה.

היתרונות של מודל פיסטולה לימפה עכבר 1 יום המוצג כאן
ביחס לשיטות אחרות אלה לבידוד ליפופרוטאינים במעי, טכניקת פיסטולה הלימפה של מעבדת Tso נחשבה באופן מסורתי לטכניקה הסטנדרטית למדידת ספיגת חומרים מזינים תזונתיים ללימפה מזנטרית. לטכניקת in vivo זו יש יתרון של לכידת היבטים פיזיולוגיים מרכזיים של ספיגת שומנים תזונתיים - המראה הדינמי של תרכובות לאורך תקופת הספיגה, הדורש דגימה חוזרת ונשנית של לימפה מזנטרית זורמת בבעלי חיים עם חומרים מזינים בתריסריון. טכניקה כירורגית זו מודדת גם הורמוני מעיים וציטוקינים ישירות בתא הפיזיולוגי שלהם ולא בדם, שם הם מדוללים ומתפרקים אנזימטית17,43.

אם שאלת הניסוי דורשת הבנה של דינמיקה של הפרשת שומנים או של ספיגה ומטבוליזם דינמיים של כל תרכובת או תרופה הידרופובית במערכת העיכול, אז טכניקה זו היא לא רק מתאימה, אלא היא גם הגישה היחידה שמבצעת אינטרפולציה של התוכן הלומינלי מהמעי הפרוקסימלי למעי הדיסטלי (הקיבה למעי הגס) ומהאפיקלי למשטח הבזולטרלי (תוכן לומינלי דרך אנטרוציט ללקטלים ומחזור הדם הפורטלי). מכיוון שטכניקה זו משתמשת בהעברה לומינלית של חומרים מזינים דרך הצנתר התוך תריסריון, ומכיוון שהלימפה המזנטרית הזורמת מוסטת ונאספת, כל מנגנון הספיגה נמצא תחת בקרה ניסיונית וניתן להשתמש בו כדי להעריך באופן איכותי פרופילי ספיגה של מעי דק.

מוצג כאן לראשונה ויזואלית עדכון משמעותי למודל פיסטולה הלימפה של Tso Lab, אשר (1) מקצר את זמן הניסוי ליום אחד של השתלה כירורגית ותקופת איסוף ניסיוני; (2) שיפור הישרדות העכבר ושיקולי רווחת בעלי חיים; ו-(3) מגביר את יכולת השחזור של הגישה בעכברים כדי לרתום את כוחם של מודלים גנטיים של עכברים. טכניקה זו חייבת להיחשב תקן זהב לכל שאלות הניסוי של הפרשות מעיים, ליפופרוטאינים, או ספיגת שומנים תזונתיים והיא הטכניקה הטובה ביותר לקביעת נאמנות גבוהה של קינטיקה ספיגת שומנים וכילומיקרונים.

Protocol

כל ההליכים הכירורגיים אושרו על ידי הוועדה הפנימית לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת פיטסבורג [פרוטוקול # 20047008] ועומדים במדריך NIH לטיפול ושימוש בחיות מעבדה. C57BL6/J עכברים זכרים, בני 8-14 שבועות, שימשו במחקר הנוכחי. העכברים התקבלו ממקור מסחרי (ראו טבלת חומרים). כל העכברים שוכנו במחזור אור/חושך של 12 שעות עם גישה ל-ad libitum לצ'או ומים סטנדרטיים.

1. הכנת בעלי חיים

  1. בהתאם לתכנון הניסוי, האכילו את העכברים או אפשרו להם לצום.
    הערה: צום לילה הוא מיותר אלא אם כן יש חששות לגבי הבדלים בקצב ריקון הקיבה.
  2. יש להשרות הרדמה ב-5% גז איזופלורן ולהבטיח הרדמה נאותה על ידי צביטת זנב ובוהן. לאחר ההרדמה, יש לשמור את העכברים במישור הרדמה מתאים עם 2%-3% גז איזופלורן ולמקם אותם עם סרט הדבקה על משטח הניתוח.
  3. שמרו על חום העכברים על משטח כירורגי מחומם המשתמש במים חמים (ראו טבלת חומרים).

2. ניתוח ועיצוב ניסוי

  1. התחל את הניתוח על ידי מריחת משחה וטרינרית על העיניים, גילוח הבטן ומריחת פילינג כירורגי חיטוי (ראה טבלת חומרים) על אתר הניתוח. פעולה זו מעקרת את החתך ומפחיתה את ייצור הפרווה המוטסת במהלך החתך בקו האמצע.
  2. שמור על אזור עבודה סטרילי על ידי שימוש במכשירים סטריליים, וילונות וציוד ואספקה אחרים הדרושים.
  3. הזריקו את המנה הראשונה של קרפרופן (ראו טבלת חומרים) לשיכוך כאבים (כלומר) במינון של 5 מ"ג/ק"ג.
  4. תופסים את העור בפינצטה ומבצעים חתך בטני בקו האמצע עם מספריים קטנים. חותכים לכיוון עצם החזה (לעולם לא מעל) וחותכים לשומן המפשעה. לאחר מכן, לחתוך דרך שכבת השריר בנפרד באמצעות מספריים.
    הערה: יש לעקר את כל הציוד לפני השימוש.
  5. באמצעות retractor, להזיז את הקרביים הצפק מהדרך עד צינור הלימפה גלוי.
  6. בעזרת Q-tip ספוג במי מלח (ראו טבלת חומרים), הניעו את הכבד לכיוון הצד הימני העליון של הגוף ואת המעיים והקיבה משמאל לחיה.
  7. מתחו את התריסריון לכיוון שמאל לרוחב כדי לחשוף את העורק המזנטרי העליון ואת צינור הלימפה של המעי.
  8. הכינו צינורית צינורית באורך 30-40 ס"מ על ידי החדרת מחט קהה לצינורית (ראו טבלת חומרים) ושטפו כמות קטנה של הפרין (1,000 U/L) דרך הצינורית באמצעות מזרק 1 מ"ל.
    הערה: זרימת הלימפה נעזרת על ידי כוח הכבידה לזרום למטה לתוך צינורות איסוף מיקרוצנטריפוגות על קרח. בהתאם למיקום דלי הקרח בצמוד למערך הניתוחי, ייתכן שיהיה צורך להתאים את אורך צינורית הצינורית.
  9. השתמש מספריים כדי לחתוך שיפוע בקצה צינורית.
  10. בצע חתך רדוד עם מספריים הקשתית (ראה טבלת חומרים) בצינור הלימפה כ -5 מ"מ מהופעתו במעי הדק.
  11. החזיקו את צינורית הצינורית בעזרת זוג מלקחיים עדינים והכניסו בעדינות את קצה השיפוע לצינור.
    הערה: חשוב לא לדחוף את הצינורית רחוק מדי לתוך הצינור כי זה עלול למנוע זרימת הלימפה כאשר האיברים הנסוגים מוחזרים למקומם המקורי.
  12. צינור הלימפה שביר מדי עבור המניפולציות הקשורות לקשירת הצנתר בתפר. במקום זאת, השתמשו בטיפת דבק ציאנואקרילט (ראו טבלת חומרים) כדי להדביק את צינורית הלימפה לתוך צינורית הלימפה המזנטרית.
  13. בדוק את הלימפה החלבית, הלבנה (אם לפני הניתוח נעשה שימוש בשמן זית) או לימפה צלולה (אם עכברים צמו לפני הניתוח) שמתחילה לזרום מיד דרך צינורית פיסטולה הלימפה.
    הערה: בדוק כי צינורית הלימפה ממוקמת בהצלחה הלימפה זורמת; המשך עם מיקום צינורית תוך תריסריון.
  14. באמצעות מחט 18 גרם, לנקב חור דרך האזור הפילורי של הבטן האחורית אל הסוגר הפילורי.
  15. הכנס את צינור העירוי של התריסריון (ראה טבלת חומרים) דרך חור זה בקיבה לכ-1-2 מ"מ מעבר לסוגר הפילורי לתוך התריסריון.
  16. מאובטח על ידי רצועת חוט ארנק באמצעות תפר משי 5-0 (ראה טבלת חומרים) עם מחט לקיבה ואטם עם טיפה של דבק ציאנואקרילט למניעת דליפה.
  17. התחל עירוי תוך תריסריון של 5% גלוקוז-0.9% מלוחים ב 0.3 מ"ל / שעה.
    הערה: בעת שימוש בעכברים עם שונות קטנה במשקל הגוף שהם בערך 25 גרם (~ 8 שבועות בגיל), עירוי 0.3 מ"ל / שעה של גלוקוז / מלוחים מתאים. אם העכברים גדולים באופן דרמטי, יש להתאים את קצב העירוי כלפי מעלה כדי להסביר את השינוי במשקל הגוף ובנפח הדם.
  18. להחליף את האיברים בחלל הגוף ולתפור (5-0) את רקמות השריר והעור בנפרד.
    הערה: צינורית הלימפה וצינורית ההזנה התוך תריסריונית שניהם חיצוניים דרך אותו חתך. אין קדימות להפרדת הצינורות בתפר ואין העדפה לזווית היציאה של הצינורות.
  19. לאחר הניתוח אך לפני הפסקת חומר ההרדמה, הניחו את העכברים בעדינות במעצורי התכרבלות (ראו טבלת חומרים) כדי להגביל את תנועתיותם.
    הערה: מעצורי ההתכרבלות מונעים מהעכברים לאחוז או לסובב את הראש כדי ללעוס את התפרים והצינורות.
  20. לאחר מכן, הניחו את העכברים בקופסת פרספקס שקופה על מסובב עם נדנוד עדין, והתחממו באמצעות כרית חימום דו-חיים/זוחלים מבוקרת טמפרטורה מסחרית המודבקת לצד קופסת ההכלה. לספק לחות גם בצורה של מיכלי מים סטריליים deionized בפינות של תיבת ההכלה (ראה טבלה של חומרים).
  21. 30 דקות לפני הוצאת האיזופלורן, יש לתת לעכברים את מנת שיכוך הכאב השנייה שלהם (Buprenex, 0.1 מ"ג/ק"ג, i.p).
  22. בהתאם לניסוי, לספק לעכברים עירוי תוך תריסריון רציף של 5% גלוקוז -0.9% מלוחים בקצב של 0.3 מ"ל / שעה במשך 1 שעות.
    הערה: תמיסת המלח 5% גלוקוז-0.9% מיוצרת באמצעות שקית מלח סטרילית (לשימוש אנושי, pH 7.4) מבית המרקחת ובקבוק סטרילי לשימוש אנושי של 50% דקסטרוז, בהתאם להנחיות מחמירות לסטריליות. יש להכין את התמיסה טרייה ולהשליך אותה אם חלפו תאריכי התפוגה שסופקו על שקית המלח או בקבוק הדקסטרוז.
  23. יש לתת לעכברים עם אחד הליפידים הרשומים בטבלה 1 כשופיד ניסיוני באמצעות צינורית תוך תריסריון (ראו טבלת חומרים).
    הערה: עבור כל הנתונים המוצגים באיור 1, SMOFlipid (תחליב הזרקת שומנים 20%, USP, ראה טבלת חומרים) היה עירור תוך תריסריון. עירוי זה הן לפני ואחרי תריסריון שומנים בולוס מחליף נוזלים אבודים המתנקזים דרך צינור הלימפה והוא דרישה מוחלטת. העכברים מוכנים כעת להחדיר להם מנת שומנים ניסיונית.
  24. בצע את עירוי השומנים הקלאסי של בולוס תחליב שומנים 0.3 מ"ל (SMOFlipid 20% תחליב הזרקת שומנים, USP) באמצעות צינור עירוי תוך תריסריון (ראה טבלת חומרים).
  25. לאחר עירוי בולוס של שומנים תוך תריסריון, יש להחזיר את העירוי ל-5% גלוקוז-0.9% מלוחים ב-0.3 מ"ל/שעה ברציפות עד סוף הניסוי.
  26. אספו את דגימות הלימפה בצינורות מיקרוצנטריפוגות שנשקלו מראש למשך 60 דקות ושמרו את הלימפה על קרח. לשקול את הצינורות פעם שנייה כדי לקבוע את משקל הלימפה כי הוא מופרש כל 60 דקות תקופה.
    הערה: צפו לאסוף כ-50-300 מיקרוליטר לימפה לשעה, לכל עכבר ב~6 שעות לאחר בולוס שומנים של 0.3 מ"ל.
  27. הלימפה יכולה לזרום עד 6 שעות לאחר עירוי השומנים. בנקודת הזמן של 6 שעות, הרדימו את העכברים באמצעות איזופלורן ונקע צוואר הרחם.
    הערה: מנתח ו / או טכנאי מעבדה צריכים להיות נוכחים כדי לפקח על בעלי החיים במהלך הניסוי. במהלך התצפית יש לשים לב לקרישי דם בניקוז הלימפה ולשינויים בהתנהגות בעלי החיים המעידים על כאב/מצוקה. אם צינור הלימפה סתום בשלב כלשהו במהלך הניסוי, הניסוי מופסק, ובעל החיים מורדם. טכנית ניתן להחזיק את בעל החיים בחיים עד 24 שעות לאחר הניתוח (בהתאם לכללי ניתוח הישרדות IACUC). עם זאת, שיעורי ההישרדות יורדים עם הזמן, ו -6 שעות היא תקופת הישרדות הניתנת לשחזור שבה ספיגת השומנים עדיין מחקה את הפיזיולוגיה in vivo , והחיה אינה נאבקת בהישרדות.
  28. בצע איסוף רקמות מסוף לאחר המתת חסד (שלב 3.1).
    הערה: ההבדל בפרופילי ספיגת השומנים בתזונה בעכברים שנשמרו במשך 6 שעות או 24 שעות לאחר הניתוח נבדק לאחרונה44. מצאנו כי הליך של 24 שעות מפחית את שיעורי ההישרדות של בעלי חיים ואת הזרימה של שומנים תזונתיים לתוך הלימפה. מסיבות אלה, אנו ממליצים בחום על גישת 6 שעות. תכנון כירורגי מעודכן זה מפחית מוות מיותר של בעלי חיים ואת הפוטנציאל למצוקה של בעלי חיים בתקופה שלאחר הניתוח. זה תומך במטרה מרכזית של האגודה האמריקאית להסמכת טיפול בחיות מעבדה, שהיא "החלפה, הפחתה, עידון" של בעלי חיים [ref PMID: 21595115].

3. איסוף תוכן לומינלי ורקמת רירית

  1. בתום 6 שעות עירוי שומנים, להקריב את העכברים באמצעות איזופלורן ונקע צוואר הרחם. קשרו את שני קצוות הקיבה, המעי הדק והצקום ב-5-0 תפרים כדי למנוע דליפה של תכולת הלומינל.
  2. אספו את הקיבה, הצקום והמעי הגס, והכניסו כל אחד מהם לצינור זכוכית בנפח 15 מ"ל. מחלקים את המעי הדק לשלושה או ארבעה מקטעים, ואוספים את התוכן הלומינלי על ידי שטיפת הרקמה ב 2-3 מ"ל של PBS קר לאחר חיתוך פתוח לאורך.
  3. הסר את רירית המעי המורכבת מתאי אפיתל ולמינה פרופריה הקשורים מהשכבה השרירית על ידי גירוד כל קטע ב 2-3 מ"ל של PBS קר עם טוויטר מעוקל.
  4. מניחים את כל הרקמות, המבודדות הלומינליות והריריות ואת השכבה השרירית בצינורות זכוכית ומוסיפים 8 מ"ל של 2:1 vol/vol CHCl3:MeOH לכל צינור.
  5. לקבוע את הרדיואקטיביות ו/או ריכוזי השומנים על ידי ספירת נוזלים ו/או ערכת בדיקת טריגליצרידים (ראה טבלת חומרים) לאחר מיצוי פולץ'45.

4. כרומטוגרפיה בשכבה דקה (TLC)

  1. חלץ את סך השומנים של המבודד הלומינלי והרירית באמצעות מיצוי Folch שונה45.
  2. יבש את הליפידים שחולצו בממס תחת מאייד חנקן ולאחר מכן השהה אותם מחדש ב-2:1 vol/vol של CHCl3:MeOH לפני העמסתם על צלחת ג'ל סיליקה TLC (ראה טבלת חומרים).
  3. הפרידו את הליפידים באמצעות מערכת ממסים של אתר נפט, אתר אתילי וחומצה אצטית קרחונית (25:5:1 vol/vol/vol). השתמש אדי יוד עבור הדמיה של שומנים שונים, כולל סטנדרטים.
  4. יש לגרד את הכתמים על צלחת TLC המתאימים למונוגליצרידים/פוספוליפידים, דיגליצרידים, חומצות שומן, טריגליצרידים וכולסטרול אסטר לתוך בקבוקוני נצנוץ בודדים לפני הוספת 4 מ"ל של נוזל הנצנצים (ראה טבלת חומרים) לספירת נצנצים.
  5. בטא את הנתונים כאחוז ממינון השומנים הכולל של הבולוס או כשבריר מסך השומנים שזוהו עבור כל דגימה.

5. בידוד ואפיון כילומיקרון

  1. להעביר את דגימות הלימפה המשולבות מן 6 שעות post-lipid bolus (שלב 2.29) צינורות ultracentrifuge, מעורבב עם 0.9% NaCl (300-500 μL), ולאחר מכן בזהירות כיסוי עם נפח מתאים של 0.87% NaCl (300-500 μL).
    1. אולטרה-צנטריפוגה (ראה טבלת חומרים) הדגימות ב 110,000 x גרם ב 4 ° C במשך 16 שעות. אספו את החלק העליון המכיל כילומיקרונים מבודדים והעבירו אותם לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש.
  2. קבע ריכוזי טריגליצרידים כילומיקרון, כולסטרול ו- apoB לפי השלבים הבאים.
    1. קבע את ריכוזי הטריגליצרידים והכולסטרול באמצעות ערכת בדיקת טריגליצרידים וכולסטרול (ראה טבלת חומרים).
    2. בקצרה, לדגור 2 μL של הדגימות עם 200 μL של מגיב אנזים ב 37 ° C במשך 5 דקות בצלחת 96 באר. קרא את הצלחת באמצעות קורא צלחות ב 500 ננומטר עבור טריגליצרידים ו 600 ננומטר עבור כולסטרול.
      הערה: תקנים וחסר שימשו לחישוב ריכוזים. ריכוזי ApoB נקבעו באמצעות ערכת Mouse ApoB ELISA Kit (ראה טבלת חומרים).
  3. קבע את גודל חלקיקי chylomicron.
    1. השתמש בדגימות כילומיקרון טריות בריכוזי טריגליצרידים של כ -40 מ"ג / ד"ל להדמיית TEM. בקצרה, מניחים 5-10 μL מכל דגימה על רשת TEM ומייבשים.
    2. בחן את הרשת במיקרוסקופ אלקטרונים שידור וצלם תמונות. מדוד את גדלי חלקיקי הליפופרוטאין ונתח אותם באמצעות תוכנת ImageJ (ראה טבלת חומרים).

Representative Results

איור 2 מראה את הפרשת הטריגליצרידים בלימפה המזנטרית ואת קצבי זרימת הלימפה הממוצעים בעכברי n = 17 עכברי הבר האחרונים (WT) שעברו את הליך פיסטולה הלימפה החד-יומית המתוארת כאן. כפי שניתן לראות באיור 2A, ריכוז הטריגליצרידים בלימפה עולה בתגובה לבולוס תוך תריסריון של 300 μL של SMOFLipid. ריכוז שיא הטריגליצרידים מגיע ב~2-3 שעות לאחר הבולוס ויורד בהתמדה במהלך 6 שעות (מיד לפני המתת חסד). במקביל להפרשת טריגליצרידים, קצב זרימת הלימפה עולה מעירוי בולוס זמן 0 ועד סוף הניסוי (איור 2B).

תוצאות אלה מראות כי השתלה כירורגית הן של צינור הלימפה mesenteric והן צינורית intraduodenal התרחשו והם מייצגים של שליטה חיובית אשר תוכן לימפה אחרים (הורמונים, פפטידים, חומרים מזינים) יכול להיות benchmarked. אם אין שינוי בריכוז הטריגליצרידים בלימפה בתגובה לשומנים תוך תריסריים של בולוס, הדבר מאותת כי הניתוח גרם נזק משמעותי למעי הדק כך שיכולת ספיגת השומנים נעדרת, או, במודלים גנטיים שלא היו פנוטיפיים בעבר, הדבר מצביע על כך שלעכבר יש פגם בספיגת שומנים בעל משמעות פיזיולוגית.

Figure 1
איור 1: ציר הזמן המוצע עבור מודל עכבר פיסטולה לימפה. T-4, T-3, T-2: קנולציה כפולה אורכת כ-2-4 שעות, ולאחריה מיקום העכברים בתאי התאוששות. T-1: ברגע שהעכברים נמצאים בתקופת ההחלמה, הם מקבלים עירוי תריסריון רציף של 5% גלוקוז-0.9% מלוחים. T0: העירוי התוך-תריסריון הרציף עובר מ-5% גלוקוז-0.9% מלוחים לעירוי של חומרים מזינים ניסיוניים. T0-T6: עכברים מקבלים גלוקוז תוך תריסריון רציף של 5% במי מלח או לחילופין חומרים מזינים רציפים. הלימפה נאספת מדי שעה בתקופה זו. נקודת קצה: עכברים מורדמים, וניתן לאסוף רקמות. הדמות נוצרה עם BioRender.com. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: ריכוז טריגליצרידים של לימפה מזנטרית וקצב זרימה. עכברי בר צוידו בצינור הזנה תוך תריסריון וצינורית לימפה מזנטרית. עכברים קיבלו עירוי בולוס של 300 μL של שומנים. הלימפה נאספה במשך 6 שעות באליציטוטים לפי שעה ונשמרה על קרח. (A) תכולת הטריגליצרידים בלימפה נקבעה על ידי בדיקה כימית בכל אליציטוט של לימפה לשעה. (B) ב-6 השעות שלאחר עירוי הבולוס, זרימת הלימפה מסומנת כגרמים של לימפה המופרשים בשעה. נקודות הן אמצעים ± SEM. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

שיטות אספקת שומנים המלצות/הוראות
בולוס תחליב שומנים מעורב ניתן להשתמש במינון של 0.3 מ"ל של ( A ) Liposyn III 20% הזרקת שומנים או (B) תחליב הזרקת שומנים SMOFlipid 20%, USP, באמצעות צינור עירוי תוך תריסריון. שומנים מתחלבים אלה שימושיים מכיוון שאין צורך להכין אותם מראש, הם נוזליים בטמפרטורת החדר, הם סטריליים, ומכיוון שהם מכילים תערובת "קלה לעיכול" של חומצות שומן חופשיות, טריגליצרידים, פוספוליפידים ונתרן טאורוכולט. זהו עירוי התחלה טוב עבור עכברים שעשויים להיות אי ספיקת לבלב או מרה.
טריגליצרידים בולוס 0.3 מ"ל שמן זית מחומם בעדינות (או טריאולאין מטוהר) כשומני ניטרלי המשקף תזונה עשירה בשומן בלתי רווי, שומן חזיר (המשקף דיאטה עם תכולת שומן רווי גבוהה) או שמן קוקוס (המשקף דיאטה עם תכולת טריגליצרידים גבוהה בשרשרת בינונית) יכול להינתן על ידי צינור עירוי תוך תריסריון או גאוואז' אוראלי. אם הטריגליצרידים הניסיוניים רוויים, יש לחמם אותם כדי שיהיו נוזליים בטמפרטורת החדר.
בולוס ארוחה מעורבת 0.3 מ"ל ניתן לתת באמצעות עירוי תוך תריסריון את הנוסחה המכילה 0.075 גרם שומן (21.6%), 0.5 גרם פחמימות (64.0%) ו-0.1125 גרם חלבון (14.4%) ומשקפת ארוחה מעורבת דלת שומן.
בולוס שומנים רדיואקטיבי 5.0 μCi 3 H-labeled glycerol trioleate ו / או 1.0 μCi 14C- כולסטרול ב 0.3מ"ל של שמן זית ניתן לתת באמצעות עירוי תוך התריסריון. 14 C-כולסטרול: כולסטרול-[4-14C] עם פעילות ספציפית של 55Ci/mmol וריכוז של 0.1mCi/mL. 3 טריאולאין H-TG [9,10-3H(N)] (3H-TG) עם פעילות ספציפית של 60Ci/mmol וריכוז של 1mCi/mL
מינון רציף עירוי של כל אחד מתכשירים המזינים הניסיוניים הנ"ל בקצב של 0.3 מ"ל / שעה (במקום 0.3 מ"ל בולוס כולל), יביא לתפוקה קבועה של טריגליצרידים לתוך הלימפה. זה שונה מעירוי בולוס, שבו ריכוז הטריגליצרידים בלימפה מגיע לשיא של ~2-3 שעות, ואז חוזר לריכוזי הבסיס ב~6-8 שעות.

טבלה 1: טבלת חליטות שומנים.

Discussion

הליך פיסטולה לימפה המקורי 2 יום תואר על ידי Bollman et al.25 ומתורגל על ידי המעבדה של פטריק טסו במשך 45 השנים האחרונות26,27. הפרוטוקול המוצג כאן הוא תוספת רבת עוצמה לשיטה קלאסית זו, סטנדרטית זהב, לזיהוי, כימות והבנה של הפרשות כילוס ייחודיות של המעי הדק, כמו גם את הדינמיקה in vivo של ספיגת חומרים מזינים תזונתיים ומטבוליזם, הורמוני מעיים וחסינות מעיים.

היתרונות של מודל זה כוללים: (1) היכולת לדגום באופן רציף לימפה מזנטרית לאורך כל תקופת ההזנה והתקופה שלאחר הלידה במקום דגימה סטטית בנקודת זמן אחת במהלך ספיגה, עיכול או הפרשה; (2) מדידת הורמוני מעיים וציטוקינים ישירות בתא הפיזיולוגי שלהם ולא בדם, שם הם מדוללים ומתפרקים אנזימטית17,44; (3) היכולת לבודד, לכמת ולאפיין את הליפופרוטאינים המופרשים במעי הדק לאחר בליעת ארוחה ליפידית והיעדר ליפאזות אנדותל בלימפה המזנטרית, המשמרת ריכוזי טריגליצרידים כילומיקרונים ומבנה כילומיקרון טבעי46,47; (4) היכולת למדוד ישירות את קצב זרימת הלימפה, תפוקת הטריגליצרידים והכולסטרול (או תרכובות אחרות המושרות בתריסריון), הרכב הכילומיקרון וריכוזי הורמוני המעי. לבסוף, פרוטוקול זה מאפשר איסוף כמויות גדולות יחסית של >50 מיקרוליטר לימפה בכל שעה במשך תקופה של 6 שעות. ככל שהנוזל מתחדש במי מלח תוך תריסריון ובעירוי גלוקוז, מודל פיסטולה הלימפה משופר משמעותית על פני טכניקות דגימה לימפות אחרות ומביא לבריכות זורמות ולא סטטיות של לימפה מזנטרית. מכיוון שנפח הוא מכשול עיקרי עבור גישות ליפיומיות, פרוטאומיות ומטבוליות, זהו חוזק משמעותי.

לפרוטוקול פיסטולה לימפה של עכבר ליום אחד המתואר כאן יש מספר יתרונות על פני פרוטוקול פיסטולה הלימפה המקורי, כולל הפחתה במספר הכולל של בעלי חיים ניסיוניים מפרוטוקולי פיסטולה לימפה של יומיים שתוארו קודם לכן26,27 בגלל שיעור הישרדות גבוה יותר לאחר ניתוח; צמצום זמן הניסוי הכולל מיומיים ליום אחד; ולבסוף, קיצור תקופת ההחלמה של עכברים מלילה (>18 שעות), שם עלולים להתרחש כאבים פורצי דרך או תוצאות גרועות לאחר הניתוח, לתקופה קלה יותר לניהול ~6 שעות לאחר הניתוח.

מאפיין של פרוטוקול יום אחד זה הוא ההתמקדות בשיקולים אנושיים ובנקודות קצה. אלה חייבים לקבל את העדיפות הגבוהה ביותר: (1) בעלי חיים חייבים לקבל נוזלים חלופיים תוך תריסריון או IV; (2) הם חייבים להישמר חמים וללא כאב ככל האפשר (עם Buprenex לאחר הניתוח ו / או carprofen, בהתאם לתכנון הניסוי ואת הצורך להימנע השפעות אנטי דלקתיות); (3) דימום, רעד, שלשול או סימני מצוקה הם כולם סיבות משכנעות לנקודת קצה אנושית. על פי הנחיות IACUC קפדניות, איזופלורן ואחריו נקע צוואר הרחם הוא נקודת סיום טובה. שיעורי ההישרדות הכירורגיים הם ~70% ליום אחד (לעומת ~40% בניתוח המקורי בן היומיים), אך החוקרים לא צריכים להסס לסיים את הניסוי בסימן מצוקה. יש לקחת זאת בחשבון בעת תכנון מספרי בעלי חיים.

במונחים של פתרון בעיות בטכניקה זו, מיקום מוצלח של צינורית הלימפה הוא צוואר הבקבוק העיקרי בהליך כירורגי זה. בעת תרגול הניתוח, זה עוזר gavage העכבר עם 0.3 מ"ל שמן זית כ 2 שעות לפני הניתוח. זה יגרום להפרשת כילומיקרונים לתוך צינור הלימפה mesenteric, מה שהופך אותו נראה "חלבי" גלוי יותר. ניתן להשתמש גם במתילן כחול, אך לעתים קרובות הוא פחות ברור מצינור הלימפה החלבי. אם לאחר המיקום של צינורית הלימפה ואת המיקום שלה עם דבק הלימפה mesenteric זורם בהצלחה דרך צינורית לתוך כלי איסוף, אז אפשר להמשיך עם המיקום של צינור עירוי התריסריון. לעיתים, הלימפה עשויה שלא לזרום ברציפות אך עשויה להתחיל לזרום שוב כאשר החיה מונחת על השולחן המסתובב. באופן קריטי, היזהרו מקרישי דם בתוך צינורות הלימפה. אלה צריכים להיות עיסוי מתוך צינורות כדי למנוע לחץ backflow על צינור הלימפה.

בנוסף להפרשת טריגליצרידים וקצב זרימת הלימפה, ניתן להשתמש בטכניקה זו כדי לקבוע את קינטיקה ספיגת השומנים הבאה ואת מאפייני כילומיקרון:

הפרשת כילומיקרון45,48,49
מיד לאחר ארוחה המכילה שומן, יש עלייה חולפת בטריגליצריד פלזמה במחזור. כמו טריגליצרידים הם הידרופוביים מטבעם, הם חייבים להיות מתחלבים תחילה כדי להיות מסיסים בדם50. אנטרוציטים במעי הדק מבצעים תפקיד זה ואורזים טריגליצרידים תזונתיים לחלקיקי תחליב כילומיקרון51. כילומיקרונים מכילים כולסטרול וטריגליצרידים תזונתיים בליבתם, מוקפים בפוספוליפידים ואפוליפופרוטאינים, כולל apoB-48, apoA-I, apoA-IV ו-apoC-III52,53,54,55. ApoB-48 הוא החלבון המבני החיוני, ולאפוליפופרוטאינים האחרים יש תפקידים שונים הדרושים למטבוליזם של כילומיקרון ולפינוי מהדם. כדי לקבוע את המאפיינים העיקריים של chylomicrons, כולל התוכן טריגליצרידים אפוליפופרוטאין שלהם, 1 יום פיסטולה פיסטולה המוצג כאן יש להשתמש. שיעור הפרשת כילומיקרון הוא אחוז הטריגליצרידים 3H המופרשים ללימפה ונמדדים על ידי נצנוץ על ידי ספירת דגימות לימפה לפי שעה. ניתן לשלב זאת עם אפיון כילומיקרון מפורט 48,49,56,57,58. דגימות לימפה לפי שעה ניתן לשלב או לשמור בנפרד. הלימפה מועברת לצינורות אולטרה-צנטריפוגה, מעורבבת עם 0.9% NaCl, ולאחר מכן מכוסה בזהירות עם 300-500 μL של 0.87% NaCl. לאחר מכן הדגימות עוברות אולטרה-צנטריפוגה בטמפרטורה של 110,000 x גרם ב-4°C למשך 16 שעות. השברים העליונים המכילים כילומיקרונים מבודדים נאספים ונבדקים לריכוזי טריגליצרידים באמצעות ערכת בדיקת הטריגליצרידים. בקצרה, 2 μL של chylomicron (דילול 1: 10) הוא מודגר עם 200 μL של מגיב אנזים בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות בצלחת 96 באר. הצלחת נקראת על ידי קורא לוחות ב 500 ננומטר, ואת התקנים ואת החסר משמשים לחישוב ריכוזי טריגליצרידים. לאחר מכן ניתן לקבוע את גודל הכילומיקרון על ידי צביעה שלילית ומיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת (TEM)14,29. ניתן לכמת טריגליצרידים וכולסטרול על ידי בדיקות כימיות ותכולת אפוליפופרוטאין (apoB-48, A-I, C-II, C-III) על ידי ערכות ELISA או כתם מערבי.

קביעת האתר העיקרי של ספיגת שומנים48,59
על ידי בידוד תאי הלומינל והאפיתל של התריסריון, הג'ג'ונום והאילאום בשעה 6 שעות לאחר עירוי של 3 H-טריגליצרידים או ארוחה מעורבת המסומנת ברדיו, התוכן מופק כדי לקבוע כמה מ-3H-טריגליצרידים נספג על פני קרום תא האפיתל (נורמלי) או נשמר בלומן (לא תקין) לאורך המעי הדק48 . מחקרים אלה משפיעים במיוחד אם קיימים הבדלים פוטנציאליים בתנועתיות מערכת העיכול60,61,62, אם קיימת השערה לגבי חומצות מרה (פעילות מאוד לאורך ספיגת שומנים והן נספגות מחדש באילאום)63,64,65,66, או אם קיים חשש שחומרי מזון נספגים במיקום אנטומי לא נכון (אילאום או אפילו מעי גס)67 ,68,69,70.

זיהוי מנגנונים של 3 H-טריגליצרידים הנכנסים לתאי אפיתל סופגים48
זה מבוצע על ידי חישוב אחוז 3 H-טריגליצרידים הידרוליזה ל 3חומצת שומן ללא H בלומן המעי, נספג לתוך הרירית, ואסטרי מחדש לתוך תאית 3H-טריגליצרידים לפני הפרשה כמו chylomicrons. זהו סמן רב עוצמה של פגמים בספיגה/הפרשה, שכן ניתן לייחס אותו כדי להראות את התנועה של טריגליצרידים תזונתיים לתוך מוצרי הפירוק שלו ולאחר מכן אריזה לתוך כילומיקרון. ביטוי mRNA של מכונות ספיגת חומצות שומן (CD36, FABPs, ACSLs), מסלול אסטריפיקציה מחדש (MGAT, DGAT, MTTP, apoB) ואפוליפופרוטאינים (apoC-III, B-48, C-II, A-I, A-IV) ניתן לכימות נוסף על ידי RT-PCR.

יישומים עתידיים של טכניקה זו מוגבלים רק על ידי העניין בהצלבת איברי מעיים, חילוף חומרים, חסינות, ספיגת חומרים מזינים, מזהמים תזונתיים סביבתיים או כל מחלה אחרת בעלת תפקיד במערכת העיכול. סביר להניח כי ניסויים משכנעים רבים והשערות התעכבו בגלל הקושי לגשת למערכת הלימפה המזנטרית הקריטית, והמטרה של פרוטוקול חזותי זה היא להפוך טכניקה זו לזמינה יותר. בידוד כילומיקרונים והלימפה המזנטרית שבה הם שוכנים בתחילה הוא חלק קריטי בהבנת חילוף החומרים בגוף כולו; מודל פיסטולה לימפה של עכבר יום אחד הוא מודל פיזיולוגי רב עוצמה לחקר אירועים אלה.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

אנו אסירי תודה לקרן סיסטיק פיברוזיס (פרס פיילוט והיתכנות 1810, ל- ABK), לקרן ריינין (פרס סינרגיה, ל- PI GJ Randolph ו- Co-I ABK), ולמכונים הלאומיים לבריאות (R01DK118239, R03DK116011 ל- ABK) על תמיכתם במחקרים אלה.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.9% Sodium Chloride Injection, USP  sterile Hospira, Lake Forest, IL, US NDC 0409-4888-06
1.7 mL Eppendorf tubes Fisher Scientific, Waltham, MA, US 7200184
14C-cholesterol: Cholesterol-[4-14C] (0.1mCi/ mL) American Radiolabeled Chemicals Inc., St. Louis, MO, US ARC 0857
18 G needle Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, US 305199
2 Dumont micro-dissecting forceps Fine Science Tools, Foster City, CA, US 11251-35
2 Forceps ROBOZ Surgical Instrument Co., Gaithersburg, MD, US RS-5130
3H-TAG:  Triolein [9,10-3H(N)] (3H-TG) (1mCi/ mL) American Radiolabeled Chemicals Inc., St. Louis, MO, US ART0199
3H-TG Triolein [9,10-3H(N)] (3H-TG) American Radiolabeled Chemicals, INC. St. Louis MO 63146
50% Dextrode Injection, USP 25grams/50 mL  sterile Hospira, Lake Forest, IL, US NDC-0409-6648-16
Analtech TLC Uniplates: silica gel matrix Z265500-1PAK Fisher Scientific, Waltham, MA, US 11-101-0007
BD CareFusion ChloraPrep Swabstick Fisher Scientific, Waltham, MA, US 14-910-501
Betadine surgical scrub Dynarex Corp., Orangeburg, NY, US 1201
Bevel-cut cannula Braintree Scientific.,  Braintree , MA, US MRE025
Buprenorphine HCl Injection Carpuject PFS 0.3mg/mL 10/Bx (Buprenex) HenrySchein, Warrendale, PA, US 1278184
C57BL6/J male mice Jackson Laboratory, Bar Harbor, Maine
ChloraPrep Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, US 260100
Cholesterol Assay Kit FujiFilm Healthcare, Lexington, MA, US 99902601
Cholesterol-[4-14C] American Radiolabeled Chemicals, INC. St. Louis MO 63146
Clear plexiglass box L43cm X W26 X H 21 with temperature-controlled heating pad and humidification our own design and modifications
commercially available  amphibian/reptile heating pad ShenZhen XingHongChang Electric CO., LTD. ShenZhen, China XHC-F035D
Cotton tip applicators Fisher Scientific, Waltham, MA, US 22363156
Duodenal infusion tube - canuala Braintree Scientific, Braintree , MA, US MRE037
Ensure Abbott Nutrition, Columbus, OH
Heating pad surgical platform with circulating warm water pump combination Patterson Scientific, Waukesha, WI, US Gaymar T/Pump Classic
Hetarin Sodium Injection, USP 1,000 units/mL sterile Mylan, Morgantown, WV, US NDC-67457-384-31
Image J Software National Institute of Health, Bethesda, Maryland,
Iris scissors ROBOZ Surgical Instrument Co., Gaithersburg, MD, US RS-5602
Isoflurane Piramal Pharma Solutions, Riverview, MI, US NDC 66794-017-25
Isoflurane induction apparatus and Anesthesia Apparatus Patterson Scientific, Waukesha, WI, US mouse induction chamber
Krazy glue Elmer's products Inc., Columbus, OH, US KG484
Liposyn III 20% lipid injectable Hospira Inc. Lake Forest, Illinois, USA
LS 6500 Multi-Purpose Scintillation Counter Beckman Coulter, Brea, CA
Micro-dissecting Spring Scissors ROBOZ Surgical Instrument Co., Gaithersburg, MD, US RS-5602
Mouse apoB ELISA Kit ABCAM Inc., Waltham, MA, US ab230932-1
Needle Holder Fine Science Tools, Foster City, CA, US 12002-12
Retractors Kent Scientific Co., Torrington, CT, US SURGI-5001
Rimadyl (Carprofen) Zoetis Inc., Kalamazoo MI, US 4019449
Rotating table Barnstead Thermolyne Labquake, Zürich, Switzerland Barnstead Thermolyne
SMOFlipid 20% lipid injectable emulsion, USP Fresenius Kabi, Warrendale, PA, US NDC-63323-820-01
Snuggle Lomir Biomedical Inc., Notre-Dame-de-l'Île-Perrot, QC J7V 7M4, Canada MS 02.5PM
Surgical Scissors ROBOZ Surgical Instrument Co., Gaithersburg, MD, US RS-5912SC
Suture (5-0 silk with needle) DemeTECH, Miami Lakes, FL, US DT-719
Transmission Electron Microscope (JEOL 1400-FLASH 120KV ) JEOL, Peabody, MA
Triglyceride Assay Kit Randox Laboratories, Crumlin, United Kingdom TR210
ULTIMA GOLD XR Scintillation Fluid Perkin Elmer, Hebron, KY, US 6013119
Ultracentrifuge, rotor S100AT4-497 SORVALL RC M120 GX

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Natale, G., Bocci, G., Ribatti, D. Scholars and Scientists in the History of the Lymphatic System. Journal of Anatomy. 231 (3), 417-429 (2017).
  2. Loukas, M., et al. The lymphatic system: A historical perspective. Clinical Anatomy. 24 (7), 807-816 (2011).
  3. Suy, R., Thomis, S., Fourneau, I. The discovery of the lymphatic system in the seventeenth century. Part II: The discovery of Chyle vessels. Acta Chirurgica Belgica. 116 (5), 325-331 (2016).
  4. Azzali, G. Historical notes on the lymphatic vascular system. Acta Bio-medica de L'Ateneo Parmense. 61 (3-4), 113-125 (1990).
  5. Irschick, R., Siemon, C., Brenner, E. The history of anatomical research of lymphatics - From the ancient times to the end of the European Renaissance. Annals of Anatomy. 223, 49-69 (2019).
  6. Swartz, M. A. The physiology of the lymphatic system. Advanced Drug Delivery Reviews. 50 (1-2), 3-20 (2001).
  7. Deitch, E. A. Gut lymph and lymphatics: A source of factors leading to organ injury and dysfunction. Annals of the New York Academy of Sciences. 1207, 103-111 (2010).
  8. Tso, P., Gollamudi, S. R. Pluronic L-81: A potent inhibitor of the transport of intestinal chylomicrons. American Journal of Physiology. 247, 32-36 (1984).
  9. Tso, P., Karlstad, M. D., Bistrian, B. R., DeMichele, S. J. Intestinal digestion, absorption, and transport of structured triglycerides and cholesterol in rats. American Journal of Physiology. 268, 568-577 (1995).
  10. Mansbach, C. M., Dowell, R. F., Pritchett, D. Portal transport of absorbed lipids in rats. American Journal of Physiology. 261, 530-538 (1991).
  11. Bogunovic, M., et al. Origin of the lamina propria dendritic cell network. Immunity. 31 (3), 513-525 (2009).
  12. Balmer, M. L., et al. The liver may act as a firewall mediating mutualism between the host and its gut commensal microbiota. Science Translational Medicine. 6 (237), (2014).
  13. Ji, Y., Sakata, Y., Tso, P. Nutrient-induced inflammation in the intestine. Current Opinion in Clinical Nutrition & Metabolic Care. 14 (4), 315-321 (2011).
  14. Ji, Y., Sakata, Y., Yang, Q., Tso, P. Intestinal mucosal mast cells is activated by fat absorption. Gastroenterology. 140 (5), (2011).
  15. Wang, F., et al. Chronic high-fat feeding increases mixed meal-induced incretin secretion in Sprague-Dawley rats. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 309 (10), 807-815 (2015).
  16. Kindel, T. L., Yoder, S. M., D'Alessio, D. A., Tso, P. The effect of duodenal-jejunal bypass on glucose-dependent insulinotropic polypeptide secretion in Wistar rats. Obesity Surgery. 20 (6), 768-775 (2010).
  17. Kohan, A. B., Yoder, S. M., Tso, P. Using the lymphatics to study nutrient absorption and the secretion of gastrointestinal hormones. Physiology & Behavior. 105 (1), 82-88 (2011).
  18. Yoder, S. M., Yang, Q., Kindel, T. L., Tso, P. Stimulation of incretin secretion by dietary lipid: Is it dose dependent. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 297 (2), 299-305 (2009).
  19. Wang, Y., et al. Chylomicrons promote intestinal absorption and systemic dissemination of dietary antigen (ovalbumin) in mice. PLoS One. 4 (12), 8442 (2009).
  20. Vors, C., et al. Postprandial endotoxemia linked with chylomicrons and lipopolysaccharides handling in obese versus lean men: A lipid dose-effect trial. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 100 (9), 3427-3435 (2015).
  21. Ghoshal, S., Witta, J., Zhong, J., de Villiers, W., Eckhardt, E. Chylomicrons promote intestinal absorption of lipopolysaccharides. Journal of Lipid Research. 50 (1), 90-97 (2009).
  22. Jandacek, R. J., Rider, T., Keller, E. R., Tso, P. The effect of olestra on the absorption, excretion and storage of 2,2',5,5' tetrachlorobiphenyl; 3,3',4,4' tetrachlorobiphenyl; and perfluorooctanoic acid. Environment International. 36 (8), 880-883 (2010).
  23. Jandacek, R. J., Tso, P. Organochlorine compounds are absorbed via lymph and portal circulation. The FASEB Journal. 22, (2008).
  24. Utermann, G., Beisiegel, U. Apolipoprotein A-IV: A protein occurring in human mesenteric lymph chylomicrons and free in plasma. Isolation and quantification. European Journal of Biochemistry. 99 (2), 333-344 (1979).
  25. Bollman, J. L., Cain, J. C., Grindlay, J. H. Techniques for the collection of lymph from the liver, small intestine, or thoracic duct of the rat. Journal of Laboratory and Clinical Medicine. 33 (10), 1349-1352 (1948).
  26. Tso, P., Balint, J. A., Rodgers, J. B. Effect of hydrophobic surfactant (pluronic L-81) on lymphatic lipid transport in the rat. American Journal of Physiology. 239 (5), 348-353 (1980).
  27. Liu, M., et al. Sexual dimorphism in intestinal absorption and lymphatic transport of dietary lipids. Journal of Physiology. 599 (22), 5015-5030 (2021).
  28. Manolas, K. J., et al. Lymph, pancreatic and gastrointestinal hormones in response to feeding in the conscious pig. European Surgical Research. 17 (5), 324-332 (1985).
  29. Lascelles, A. K., Morris, B. Surgical techniques for the collection of lymph from unanaesthetized sheep. Quarterly Journal of Experimental Physiology and Cognate Medical Sciences. 46, 199-205 (1961).
  30. Jensen, L. T., Olesen, H. P., Risteli, J., Lorenzen, I. External thoracic duct-venous shunt in conscious pigs for long term studies of connective tissue metabolites in lymph. Laboratory Animal Science. 40 (6), 620-624 (1990).
  31. Edwards, G. A., Porter, C. J., Caliph, S. M., Khoo, S. M., Charman, W. N. Animal models for the study of intestinal lymphatic drug transport. Advanced Drug Delivery Reviews. 50 (1-2), 45-60 (2001).
  32. Yasunaga, K., Saito, S., Zhang, Y. -L., Hernandez-Ono, A., Ginsberg, H. N. Effects of triacylglycerol and diacylglycerol oils on blood clearance, tissue uptake, and hepatic apolipoprotein B secretion in mice. Journal of Lipid Research. 48 (5), 1108-1121 (2007).
  33. Curtin, A., et al. Elevated triglyceride-rich lipoproteins in diabetes. A study of apolipoprotein B-48. Acta Diabetologica. 33 (3), 205-210 (1996).
  34. Gordts, P. L. S. M., et al. ApoC-III inhibits clearance of triglyceride-rich lipoproteins through LDL family receptors. Journal of Clinical Investigation. 126 (8), 2855-2866 (2016).
  35. Ginsberg, H. N., et al. Apolipoprotein B metabolism in subjects with deficiency of apolipoproteins CIII and AI. Evidence that apolipoprotein CIII inhibits catabolism of triglyceride-rich lipoproteins by lipoprotein lipase in vivo. The Journal of Clinical Investigation. 78 (5), 1287-1295 (1986).
  36. Ormai, S., Palkovits, M. Size distribution of lymphocytes in the thoracic duct lymph in rat after lymphocyte mobilization induced by polymethacrylic acid. Blut Zeitschrift für die Gesamte Blutforschung. 24 (3), 161-165 (1972).
  37. Luchoomun, J., Hussain, M. M. Assembly and secretion of chylomicrons by differentiated Caco-2 cells. Nascent triglycerides and preformed phospholipids are preferentially used for lipoprotein assembly. Journal of Biological Chemistry. 274 (28), 19565-19572 (1999).
  38. Nollevaux, G., et al. Development of a serum-free co-culture of human intestinal epithelium cell-lines (Caco-2/HT29-5M21). BMC Cell Biology. 7 (1), 20 (2006).
  39. Li, D., Dong, H., Kohan, A. B. The Isolation, Culture, and Propagation of Murine Intestinal Enteroids for the Study of Dietary Lipid Metabolism. Organoids. Methods in Molecular Biology. 1576, Humana. New York, NY. 195-204 (2019).
  40. Jattan, J. J., et al. Using murine-derived primary intestinal enteroids for studies of dietary triglyceride absorption and lipoprotein synthesis, and to determine the role of intestine-specific ApoC-III in the intestine. Journal of Lipid Research. 58 (5), 853-865 (2017).
  41. Haring, E., et al. Bile acids regulate intestinal antigen presentation and reduce graft-versus-host disease without impairing the graft-versus-leukemia effect. Haematologica. 106 (8), 2131-2146 (2021).
  42. Date, S., Sato, T. Mini-gut organoids: Reconstitution of the stem cell niche. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 31 (1), 269-289 (2015).
  43. Deacon, C. F. Circulation and degradation of GIP and GLP-1. Hormone and Metabolic Research. 36 (11-12), 761-765 (2004).
  44. Dedousis, N., Teng, L., Kanshana, J. S., Kohan, A. B. A single-day mouse mesenteric lymph surgery in mice: an updated approach to study dietary lipid absorption, chylomicron secretion, and lymphocyte dynamics. J Lipid Res. 63 (11), 100284 (2022).
  45. Li, D., et al. Intestinal basolateral lipid substrate transport is linked to chylomicron secretion and is regulated by ApoC-III. Journal of Lipid Research. 60 (9), 1503-1515 (2019).
  46. Glatzle, J., et al. Chylomicron components mediate intestinal lipid-induced inhibition of gastric motor function. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 282 (1), 86-91 (2002).
  47. Huang, J., Sloop, C. H., Roheim, P. S., Wong, L. Lipoprotein lipase and hepatic triacylglycerol lipase activities in peripheral and skeletal muscle lymph. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 10 (5), 720-726 (1990).
  48. Wang, F., et al. Overexpression of apolipoprotein C-III decreases secretion of dietary triglyceride into lymph. Physiological Reports. 2 (3), 00247 (2014).
  49. Kohan, A. B., et al. Apolipoprotein A-IV regulates chylomicron metabolism-Mechanism and function. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 302 (6), 628-636 (2012).
  50. Hayashi, H., et al. Fat feeding increases size, but not number, of chylomicrons produced by small intestine. American Journal of Physiology. 259 (5), 709-719 (1990).
  51. Tso, P., Balint, J. A. Formation and transport of chylomicrons by enterocytes to the lymphatics. American Journal of Physiology. 250 (6), 715-726 (1986).
  52. Bhattacharya, S., Redgrave, T. G. The content of apolipoprotein B in chylomicron particles. Journal of Lipid Research. 22 (5), 820-828 (1981).
  53. Björkegren, J., Karpe, F., Milne, R. W., Hamsten, A. Differences in apolipoprotein and lipid composition between human chylomicron remnants and very low density lipoproteins isolated from fasting and postprandial plasma. Journal of Lipid Research. 39 (7), 1412-1420 (1998).
  54. Martins, I. J., Sainsbury, A. J., Mamo, J. C., Redgrave, T. G. Lipid and apolipoprotein B48 transport in mesenteric lymph and the effect of hyperphagia on the clearance of chylomicron-like emulsions in insulin-deficient rats. Diabetologia. 37 (3), 238-246 (1994).
  55. Mar, R., et al. Association of the APOLIPOPROTEIN A1/C3/A4/A5 gene cluster with triglyceride levels and LDL particle size in familial combined hyperlipidemia. Circulation Research. 94 (7), 993-999 (2004).
  56. Kassis, T., et al. Dual-channel in-situ optical imaging system for quantifying lipid uptake and lymphatic pump function. Journal of Biomedical Optics. 17 (8), 086005 (2012).
  57. Nauli, A. M., et al. Chylomicrons produced by Caco-2 cells contained ApoB-48 with diameter of 80-200 nm. Physiological Reports. 2 (6), 192-196 (2014).
  58. Drover, V. A., et al. CD36 deficiency impairs intestinal lipid secretion and clearance of chylomicrons from the blood. Journal of Clinical Investigation. 115 (5), 1290-1297 (2005).
  59. Kohan, A. B., et al. Is apolipoprotein A-IV rate limiting in the intestinal transport and absorption of triglyceride. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 304 (12), 1128-1135 (2013).
  60. De Lisle, R. C. Altered transit and bacterial overgrowth in the cystic fibrosis mouse small intestine. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 293 (1), 104-111 (2007).
  61. Debas, H. T., Farooq, O., Grossman, M. I. Inhibition of gastric emptying is a physiological action of cholecystokinin. Gastroenterology. 68 (5), 1211-1217 (1975).
  62. Spiller, R. C., et al. Further characterisation of the 'ileal brake' reflex in man--Effect of ileal infusion of partial digests of fat, protein, and starch on jejunal motility and release of neurotensin, enteroglucagon, and peptide YY. Gut. 29 (8), 1042-1051 (1988).
  63. Battle, M. A., et al. GATA4 is essential for jejunal function in mice. Gastroenterology. 135 (5), 1676-1686 (2008).
  64. Morgan, R. G., Borgström, B. The mechanism of fat absorption in the bile fistula rat. Quarterly Journal of Experimental Physiology and Cognate Medical Sciences. 54 (2), 228-243 (1969).
  65. Davidson, N. O., Kollmer, M. E., Glickman, R. M. Apolipoprotein B synthesis in rat small intestine: Regulation by dietary triglyceride and biliary lipid. Journal of Lipid Research. 27 (1), 30-39 (1986).
  66. Bouchi, R., et al. FOXO1 inhibition yields functional insulin-producing cells in human gut organoid cultures. Nature Communications. 5, 4242 (2014).
  67. Bijvelds, M. J. C., et al. Fat absorption in cystic fibrosis mice is impeded by defective lipolysis and post-lipolytic events. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 288 (4), 646-653 (2005).
  68. Struyvenberg, M. R., Martin, C. R., Freedman, S. D. Practical guide to exocrine pancreatic insufficiency - Breaking the myths. BMC Medicine. 15 (1), 29 (2017).
  69. Tickell, K. D., Atlas, H. E., Walson, J. L. Environmental enteric dysfunction: A review of potential mechanisms, consequences and management strategies. BMC Medicine. 17 (1), 181 (2019).
  70. Lo, C. M., et al. Cholecystokinin knockout mice are resistant to high-fat diet-induced obesity. Gastroenterology. 138 (5), 1997-2005 (2010).

Tags

ביולוגיה גיליון 189
בידוד הלימפה המזנטרית הזורמת בעכברים לכימות <em>קינטיקה של</em> ספיגת שומנים תזונתיים והפרשת כילומיקרון
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dedousis, N. L., Teng, L., Kohan, A. … More

Dedousis, N. L., Teng, L., Kohan, A. B. The Isolation of Flowing Mesenteric Lymph in Mice to Quantify In Vivo Kinetics of Dietary Lipid Absorption and Chylomicron Secretion. J. Vis. Exp. (189), e64338, doi:10.3791/64338 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter