Methodenartikel

Erzeugung und Erhaltung von Primaten-induzierten pluripotenten Stammzellen aus Urin

DOI:

10.3791/64922

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28. Juli 2023

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1Faculty of Biology, Ludwig Maximilian University of Munich, 2Institute for the Advanced Study of Human Biology, Kyoto University, 3Hakubi Center, Kyoto University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Das vorliegende Protokoll beschreibt eine Methode zur Isolierung, Expansion und Reprogrammierung von humanen und nicht-humanen Zellen aus dem Urin von Primaten zu induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen) sowie Anweisungen zur feederfreien Aufrechterhaltung der neu erzeugten iPS-Zellen.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Speziesübergreifende Ansätze zur Untersuchung pluripotenter Stammzellen von Primaten und ihrer Derivate sind von entscheidender Bedeutung, um die molekularen und zellulären Mechanismen von Krankheit, Entwicklung und Evolution besser zu verstehen. Um den Zugang zu Primaten-induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen) zu erleichtern, wird in dieser Arbeit eine nicht-invasive Methode zur Erzeugung von humanen und nicht-humanen Primaten-iPS-Zellen aus aus aus dem Urin gewonnenen Zellen und deren Erhaltung mit einer feederfreien Kultivierungsmethode vorgestellt.

Der Urin kann aus einer unsterilen Umgebung (z. B. dem Käfig des Tieres) entnommen und während der primären Zellkultur mit einem Breitband-Antibiotika-Cocktail behandelt werden, um die Kontamination effizient zu reduzieren. Nach der Vermehrung der aus dem Urin gewonnenen Zellen werden iPS-Zellen durch eine modifizierte Transduktionsmethode eines kommerziell erhältlichen Sendai-Virus-Vektorsystems erzeugt. Erste iPSC-Kolonien können bereits nach 5 Tagen sichtbar sein und frühestens nach 10 Tagen gepflückt werden. Die routinemäßige Klumpenpassage mit enzymfreiem Dissoziationspuffer unterstützt die Pluripotenz der erzeugten iPSCs für mehr als 50 Passagen.

Einleitung

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Genomische Vergleiche von menschlichen und nicht-menschlichen Primaten (NHPs) sind entscheidend, um unsere Evolutionsgeschichte und die Evolution menschenspezifischer Merkmale zu verstehen1. Darüber hinaus ermöglichen diese Vergleiche den Rückschluss auf die Funktion durch die Identifizierung konservierter DNA-Sequenzen2, z. B. um krankheitsassoziierte Varianten3 zu priorisieren. Vergleiche von molekularen Phänotypen, wie z.B. Genexpressionsniveaus, sind entscheidend, um genomische Vergleiche besser interpretieren zu können und z.B. zelluläre phänotypische Unterschiede zu entdecken. Darüber hinaus haben sie - ähnlich wie Vergleiche auf DNA-Ebene - das Potenzial, auf funktionelle Relevanz zu schließen und damit medizinisch relevante Variationen innerhalb des Menschen besser zu interpretieren4. Die Einbeziehung umfassender molekularphänotypischer Daten in diese Vergleichsstudien erfordert geeignete biologische Ressourcen (d.h. orthologe Zellen über Spezies hinweg). Ethische und praktische Gründe erschweren oder verunmöglichen jedoch den Zugang zu solchen vergleichbaren Zellen, insbesondere während der Entwicklung. Induzierte pluripotente Stammzellen (iPS-Zellen) ermöglichen die Generierung solcher unzugänglichen Zelltypen in vitro5,6, sind experimentell zugänglich und wurden für Primatenvergleicheverwendet 6,7,8,9,10,11,12,13,14.

Um iPS-Zellen zu erzeugen, muss man die Primärzellen erfassen, die neu programmiert werden sollen. Aus Urin isolierte Zellen haben den Vorteil, dass sie nicht-invasiv von Primaten entnommen werden können und dass sie leicht umprogrammiert werden können, wahrscheinlich aufgrund ihrer stammzellähnlichen molekularen Profile15. Die Kulturbedingungen für die Erhaltung von Primaten-iPS-Zellen sind ebenso wichtig wie die Reprogrammierung. Klassischerweise erforderte die Kultivierung menschlicher pluripotenter Stammzellen ein nicht definiertes, serumbasiertes Medium und eine Kokultur von embryonalen Fibroblasten der Maus - sogenannten Feederzellen -, die essentielle Nährstoffe und ein Gerüst für embryonale Stammzellen (ESCs) liefern16. Seit der Entwicklung chemisch definierter und feederfreier Kultursysteme17,18 gibt es heute verschiedene Optionen für kommerziell erhältliche iPSC-Nährmedien und -Matrices. Die meisten dieser Kulturbedingungen wurden jedoch für humane ES-Zellen und iPS-Zellen optimiert und funktionieren daher möglicherweise weniger gut in der NHP-iPSC-Kultur. In diesem Videoprotokoll geben wir Anweisungen zur Erzeugung und Pflege von humanen und NHP-iPS-Zellen, die aus Zellkulturen im Urin gewonnen werden.

Seit dem ersten Bericht über die Erzeugung von iPS-Zellen durch die erzwungene Expression definierter Faktoren in Fibroblasten im Jahr 2006 wurde diese Methode auf viele verschiedene Zelltypen unterschiedlicher Herkunft angewendet 19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31 ,32. Von ihnen können nur aus Urin gewonnene Zellen auf völlig nicht-invasive Weise gewonnen werden. Basierend auf dem zuvor beschriebenen Protokoll von Zhou et al.33 kann man Zellen aus Primatenurin auch aus unsterilen Proben isolieren und expandieren, indem man Breitbandantibiotika ergänzt15. Bemerkenswert ist, dass Urinzellen, die mit diesem Protokoll beprobt wurden, ein hohes Potenzial zur Produktion von iPS-Zellen aufweisen, und zwar innerhalb eines kürzeren Zeitraums (Kolonien werden in 5-15 Tagen sichtbar) als die herkömmliche Reprogrammierung von Fibroblasten (20-30 Tage, unserer Erfahrung nach) und mit einer ausreichend hohen Erfolgsrate. Diese aus dem Urin gewonnenen Zellen wurden als gemischte Population von mesenchymalen Stammzell-ähnlichen Zellen und Blasenepithelzellen klassifiziert, was die hohe Reprogrammierungseffizienz verursacht15.

Neben der Variation in den Primärzellen variieren auch die Reprogrammierungsmethoden zur Erzeugung von iPS-Zellen je nach Verwendungszweck. Konventionelle Reprogrammierungsverfahren für menschliche somatische Zellen wurden durch die Überexpression von Reprogrammierungsfaktoren mit Retrovirus- oder Lentivirus-Vektoren durchgeführt, was die Integration exogener DNA in das Genom ermöglichte 5,34,35. Um die erzeugten iPS-Zellen genomisch intakt zu halten, haben die Forscher eine Vielzahl von Nicht-Integrationssystemen entwickelt - den exzisierbaren PiggyBac-Vektor 36,37, den episomalen Vektor38,39, nicht-integrierende Virusvektoren wie das Sendai-Virus 40 und das Adenovirus 41, die mRNA-Transfektion 42, die Proteintransfektion 43,44 und die Behandlung mit chemischen Verbindungen 45. Aufgrund der Effizienz und einfachen Handhabung werden in diesem Protokoll die auf dem Sendai-Virus basierenden Reprogrammierungsvektoren verwendet. Die Infektion der Primärzellen erfolgt in einer 1-stündigen Suspensionskultur von Zellen und Viren bei einer Infektionsmultiplizität (MOI) von 5 vor der Plattierung. Dieser modifizierte Schritt könnte die Wahrscheinlichkeit eines Kontakts zwischen Zelloberflächen und Viren im Vergleich zu der herkömmlichen Methode, bei der die Viren direkt in die adhärente Zellkultur gegeben werden, erhöhen und so mehr iPSC-Kolonien ergeben15.

Die Passage von humanen und NHP-pluripotenten Stammzellen kann durch Klumpen- und Einzelzellpassage erfolgen. Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) ist ein kostengünstiger Chelatbildner, der Calcium- und Magnesiumionen bindet und so die Adhärentaktivität von Cadherin und Integrin verhindert. EDTA wird auch als mildes, selektives Dissoziationsreagenz verwendet, da sich undifferenzierte Zellen aufgrund ihrer unterschiedlichen Adhäsionsmoleküle vor differenzierten Zellen ablösen. Die vollständige Dissoziation induziert einen massiven Zelltod von Primaten-iPS-Zellen über die Rho/Rho-assoziierte Coiled-Coil-haltige Proteinkinase (Rho/Rock)-vermittelte Myosin-Hyperaktivierung. Daher ist die Ergänzung des Nährmediums mit einem Rho/Rock-Inhibitor für Experimente, die Einzelzellen in Suspension erfordern, unerlässlich46,47. In diesem Protokoll empfehlen wir die Klumpenpassage als routinemäßige Passaging-Methode und empfehlen die Einzelzell-Passage nur, wenn dies erforderlich ist, z. B. wenn das Seeding definierter Zellzahlen erforderlich ist, oder während der Subklonen.

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Protokoll

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Dieses experimentelle Verfahren wurde von der zuständigen Ethikkommission für Menschenversuche (20-122, Ethikkommission LMU München) genehmigt. Alle Experimente wurden in Übereinstimmung mit den einschlägigen Richtlinien und Vorschriften durchgeführt.
HINWEIS: Vor Beginn von Experimenten, die sich mit menschlichen und NHP-Proben befassen, muss die Genehmigung der zuständigen Ethikkommission eingeholt werden. Alle experimentellen Verfahren müssen in Übereinstimmung mit den einschlägigen Richtlinien und Vorschriften durchgeführt werden. Jeder der folgenden Schritte sollte steril in einer biologischen Sicherheitswerkbank durchgeführt werden. Alle Puffer- und Medienzusammensetzungen finden Sie in der Ergänzungstabelle S1. Stellen Sie sicher, dass alle Medien auf Raumtemperatur (22 °C) erwärmt sind, bevor Sie sie in die Zellen geben. Jeder Zentrifugationsschritt sollte bei Raumtemperatur durchgeführt werden, sofern nicht anders angegeben.

1. Isolierung von Zellen aus Urinproben

VORSICHT: Stellen Sie sicher, dass menschliche Spender frei von humanen Immundefizienzviren (HIV), Hepatitis-B-Viren (HBV) und Hepatitis-C-Viren (HCV) sind. Stellen Sie bei NHPs sicher, dass die möglichen Spender/Zellen frei von spezifischen Krankheitserregern sind - dem B-Virus (BV), dem Affen-Immundefizienz-Virus (SIV), dem Affen-Betaretrovirus (SRV) und dem Affen-T-Zell-Lymphotropen Virus (STLV).

  1. Bereiten Sie eine mit Gelatine beschichtete 12-Well-Platte vor, indem Sie 500 μl 0,2%ige Gelatine pro Well hinzufügen, und verteilen Sie die Flüssigkeit durch Bewegen der Platte. Vor der Einnahme bei 37 °C mindestens 30 Minuten einwirken lassen.
  2. Sammeln Sie menschliche Urinproben in konischen 50-ml-Röhrchen. Bei Primaten wird der Urin mit einer Spritze vom Boden der Tieranlage gesammelt.
    HINWEIS: Ein Volumen von 5 ml Urin erwies sich in 42 % der Versuche als ausreichend, um mindestens eine Kolonie zu isolieren. Es wird jedoch empfohlen, ein höheres Volumen von ~50 ml Urin zu verwenden, um die Wahrscheinlichkeit zu erhöhen, Kolonien zu isolieren. NHP-Urin sollte so frisch wie möglich entnommen werden, vorzugsweise unmittelbar nach dem Wasserlassen. Die Lagerung von Urinproben bei 4 °C für 4 h hatte keinen negativen Einfluss auf die Erfolgsrate des Protokolls, längere Lagerzeiten wurden jedoch nicht getestet.
  3. Zentrifugieren Sie das urinhaltige Röhrchen bei 400 × g für 10 Minuten und saugen Sie den Überstand vorsichtig ab, wobei ca. 1 ml im Röhrchen verbleibt.
  4. Resuspendieren Sie das Pellet in den verbleibenden 1 ml Flüssigkeit. Fassen Sie die Suspensionen in einem Röhrchen zusammen, wenn mehrere Röhrchen Urin gesammelt wurden.
  5. Waschen Sie die Zellen, indem Sie 10 ml Urinwaschpuffer (siehe Ergänzungstabelle S1) mit 2,5 μg/ml Amphotericin in das Röhrchen geben und die Suspension vorsichtig mit einer serologischen Pipette mischen.
  6. Zentrifugieren Sie das Röhrchen 10 Minuten lang bei 200 × g und saugen Sie den Überstand vorsichtig ab, so dass etwa <0,2 ml im Röhrchen verbleiben.
  7. Das Zellpellet wird in 1 ml primärem Urinmedium (siehe Ergänzungstabelle S1) mit 0,5 μg/ml Amphotericin pro 50 ml ursprünglich verarbeitetem Urin resuspendiert (Resuspendierung in 1 ml, auch wenn weniger als 50 ml Urin verarbeitet wurden).
  8. Abgesaugte Gelatine aus den Vertiefungen (hergestellt in Schritt 1.1) und 1 ml der Suspension aus Schritt 1.7 in eine Vertiefung einer 12-Well-Platte schichten. Wiederholen Sie dies für so viele Vertiefungen wie gewünscht oder für so viele Milliliter Suspension, die verfügbar sind.
    Optional: Um eine Kontamination durch unhygienische Probenentnahme zu vermeiden, fügen Sie den Zellen von nun an bis zum ersten Durchgang 100 μg/ml antimikrobielles Reagenz hinzu.
  9. Legen Sie die Platte in einen Inkubator mit 37 °C und 5 % CO2 .
  10. Fügen Sie täglich bis zum 5. Tag 1 ml primäres Urinmedium pro Vertiefung hinzu, ohne das vorhandene Medium zu entfernen.
  11. Saugen Sie am 5. Tag 4 ml Medium von der Platte ab, so dass etwa 1 ml Medium übrig bleibt. Fügen Sie 1 ml REMC-Medium (siehe Ergänzungstabelle S1) pro Well hinzu, um eine 1:1-Mischung mit dem neuen Nährmedium zu erhalten.
  12. Ersetzen Sie jeden Tag die Hälfte des Mediums durch REMC-Medium, bis die ersten Kolonien erscheinen (Abbildung 1A, B). Entfernen Sie daher 1 ml des alten Mediums und fügen Sie 1 ml frisches REMC-Medium pro Vertiefung hinzu.

2. Ausdehnung der Harnzellen

HINWEIS: Die Urinzellpassage sollte durchgeführt werden, bevor die Kultur eine Konfluenz von 90 % erreicht.

  1. Bereiten Sie die gewünschte Menge an gelatinebeschichteten 12-Well-Platten vor, wie in Schritt 1.1 angegeben.
  2. Saugen Sie das alte Medium ab und waschen Sie die Zellen, indem Sie 1 ml Dulbeccos phosphatgepufferte Kochsalzlösung (DPBS) hinzufügen.
  3. Saugen Sie das DPBS ab und fügen Sie 300 μl 0,5-faches Dissoziationsenzym hinzu, das mit DPBS verdünnt ist. Die Platte bei 37 °C 5 min inkubieren.
  4. Fügen Sie 700 μl REMC-Medium hinzu, um die enzymatische Reaktion zu stoppen. Pipettieren Sie die Suspension vorsichtig mit einer P1000-Pipette, bis die Zellen in einzelne Zellen dissoziiert sind.
  5. Übertragen Sie die Zellsuspension in ein 15-ml-Röhrchen und zentrifugieren Sie das Röhrchen 5 Minuten lang bei 200 × g .
  6. Saugen Sie den Überstand vorsichtig ab und resuspendieren Sie das Pellet in 1 ml REMC-Medium.
  7. Zählen Sie die Zellen mit einem Zellzähler (einem Hämozytometer oder einem automatisierten Zellzähler).
  8. Zur Expansion der Harnzellen werden 1,5 × 10 4 bis 3 × 104 Zellen in 1 ml REMC-Medium in eine mit 0,2 % Gelatine beschichtete 12-Well-Platte zerlegt.
  9. Führen Sie alle zwei Tage nachfolgende Medienwechsel durch, bis die Kultur eine Konfluenz von 80 % bis 90 % erreicht hat. Saugen Sie daher das alte Medium ab und fügen Sie 1 ml frisches REMC-Medium hinzu.

3. Generierung von iPS-Zellen durch Sendai-Virus-Vektorinfektion

HINWEIS: Den Arbeitsablauf des Neuprogrammierungsverfahrens finden Sie in Abbildung 2A. Harnzellen, die für die Reprogrammierung verwendet werden, sollten so jung wie möglich sein, aber ein bemerkenswerter Verlust der Reprogrammierungseffizienz wird vor Passage 4 nicht beobachtet. Das Sendai Virus Reprogramming Kit muss in einer BL-2-Anlage verwendet werden. Behandeln Sie Viren unter einer biologischen Sicherheitswerkbank mit laminarer Strömung und verwenden Sie immer geeignete Sicherheitsausrüstung, um eine Exposition gegenüber Schleimhäuten zu verhindern.

  1. Bereiten Sie eine mit Basalmembranmatrix beschichtete 12-Well-Platte vor, indem Sie 500 μl Basalmembranmatrix pro Well hinzufügen, und verteilen Sie die Flüssigkeit durch Bewegen der Platte. Inkubieren Sie die Platte bei 37 °C für mindestens 1 h und ersetzen Sie die Basalmembranmatrix durch 900 μl REMC-Medium. Lagern Sie die Platte bis zur Verwendung bei 37 °C.
  2. Tauen Sie die Komponenten des Sendai Reprogramming Kits schnell in einem 37 °C warmen Wasserbad auf. Mischen Sie die Sendai-Viren (polycistronische KLF4-OCT3/4-SOX2, cMYC und KLF4) mit einem MOI von 5 und fügen Sie REMC-Medium bis zu 100 μl hinzu. Verwenden Sie Gleichung (1):
    Berechnung der Virusvolumenformel, MOI-Methode, Gleichung für Zellstudienanwendungen.
    HINWEIS: Da sich die Virustiter von Charge zu Charge unterscheiden, überprüfen Sie den Titer immer im Analysezertifikat, das vom Hersteller zur Verfügung gestellt wird.
    Optional: Verwenden Sie zusätzlich grün fluoreszierendes Protein (GFP) Sendai-Virus als Positivkontrolle für die Transduktionseffizienz. Bereiten Sie dazu in Schritt 3.3 weitere 3,5 × 104 Zellen in einem separaten Röhrchen vor.
  3. Um die Harnzellen zu dissoziieren, befolgen Sie die Schritte 2.2-2.4. Zählen Sie die Zellen mit dem Zellzähler und übertragen Sie 7 × 104 Harnzellen in ein 1,5-ml-Röhrchen.
  4. Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 200 × g für 5 Minuten und entfernen Sie vorsichtig den Überstand, ohne das Zellpellet zu zerstören. Das Pellet wird in 100 μl der in Schritt 3.2 hergestellten SeV-Mischung resuspendiert. Inkubieren Sie das Röhrchen 1 h lang bei 37 °C für eine Suspensionsinfektion.
  5. Die Suspension wird auf die mit der Basalmembranmatrix beschichteten 12-Well-Platten aufgetragen, die in Schritt 3.1 hergestellt wurden. Routinemäßig werden Platte 1 × 104 und 2,5 × 104 Zellen pro Well in Duplikaten behandelt.
  6. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C und 5 % CO2. Ersetzen Sie das Medium 24 Stunden nach der Transduktion und an Tag 3 durch 1 ml frisches REMC-Medium.
  7. Am 5. Tag nach der Transduktion wird das Medium auf PSC-Erzeugungsmedium umgestellt (siehe Ergänzungstabelle S1), wobei das Medium jeden zweiten Tag gewechselt wird. Entfernen Sie daher das alte Medium und fügen Sie 1 ml PSC-Erzeugungsmedium pro Well hinzu.
    HINWEIS: Es kann bis zu 15 Tage dauern, bis die ersten Völker erscheinen.
  8. Wählen Sie einzelne iPSC-Kolonien aus, wenn die Größe der Kolonie 1 mm überschreitet. Kratzen Sie dazu eine einzelne Kolonie ab und sammeln Sie sie vorsichtig mit einer p10-Pipette unter dem Mikroskop. Die Kolonie wird in eine neue Vertiefung einer 12-Well-Platte überführt, die mit einer Basalmembranmatrix beschichtet ist, die 750 μl PSC-Nährmedium enthält.
    Optional: Das Spülen der Platte mit DPBS und das Behandeln für 1 min mit 0,5 mM EDTA vor der Kommissionierung könnte die robuste Kultur der weiteren Schritte unterstützen. Wenn die Zellen länger kultiviert werden sollen, um auf später schlüpfende Kolonien zu warten, führen Sie diesen EDTA-Behandlungsschritt nicht durch.
  9. Die Zellen werden bei 37 °C und 5 % CO2 gezüchtet, wobei das Medium jeden zweiten Tag gewechselt wird, wie in Abschnitt 4 des Protokolls angegeben. Wenn die gepflückte Kolonie einen Durchmesser von 2 mm erreicht hat, fahren Sie mit der routinemäßigen iPSC-Durchleitung fort, wie in Abschnitt 5 des Protokolls erläutert.

4. Mittlerer Wechsel

HINWEIS: Das Nährmedium sollte jeden zweiten Tag gewechselt werden, bis die Kolonien groß genug für die Durchreise sind.

  1. Saugen Sie das alte Medium ab und fügen Sie 750 μl des frischen Mediums pro 12-Well-Platte hinzu. Um zu einem anderen Medientyp zu wechseln, tauschen Sie das Medium mindestens 1 Tag nach dem Passieren aus.

5. Verabschiedung

HINWEIS: Die Zellen sollten durchquert werden, wenn die iPSC-Kolonien groß genug sind (Durchmesser > 2 mm) oder die Kolonien kurz davor sind, sich zu berühren. Routinemäßig können iPS-Zellen etwa alle 5 Tage geteilt werden. Verwenden Sie die Klumpenpassage (Schritt 5.1) für die routinemäßige Wartung und die Einzelzell-Passaging (Schritt 5.2) für Experimente, bei denen eine definierte Anzahl von Zellen benötigt wird. Falls sich die iPS-Zellen stark differenzieren, kann der Colony Picking (Schritt 5.3) dazu beitragen, die Reinheit der Kulturen zu verbessern.

  1. Klumpen-Passage
    1. Bereiten Sie eine mit Basalmembranmatrix beschichtete 12-Well-Platte vor, indem Sie 500 μl Basalmembranmatrix pro Well hinzufügen, und verteilen Sie die Flüssigkeit durch Bewegen der Platte. Die Platte bei 37 °C mindestens 1 h inkubieren. Ersetzen Sie die Basalmembranmatrix durch 500 μl PSC-Nährmedium und lagern Sie die Platte bis zur Verwendung bei 37 °C.
    2. Saugen Sie das Medium aus den kultivierten Zellen ab und waschen Sie die Zellen, indem Sie vorsichtig 500 μl DPBS hinzufügen. Entfernen Sie das DPBS und geben Sie 500 μl 0,5 mM EDTA in die Vertiefung.
    3. Inkubieren Sie die Platte bei RT für 2-5 Minuten, bis sich die Kolonien zu lösen beginnen. Beobachten Sie die Zellen sorgfältig unter dem Mikroskop.
    4. Wenn sich die Ränder der Kolonien abzulösen beginnen und Lücken zwischen den Zellen sichtbar werden (Abbildung 3A), entfernen Sie das EDTA und fügen Sie vorsichtig 500 μl DPBS hinzu.
      Anmerkungen: Pipettieren Sie immer gegen die Seitenwand der Vertiefung und niemals direkt auf die Zellen, um die Zellen nicht von der Platte zu lösen.
    5. Saugen Sie das DPBS ab und spülen Sie die Vertiefung mit 500 μl PSC-Nährmedium mit einer p1000-Pipette. Pipettieren Sie 1x-5x auf und ab, um die Kolonien in Klumpen geeigneter Größe zu verteilen (Abbildung 3A). Pipettieren Sie nicht zu viel.
      Anmerkungen: Wenn die iPS-Zellen versehentlich zu stark pipettiert werden, geben Sie 10 μM Rock-Inhibitor Y-27632 in das Medium. Dies kann das Überleben verbessern, da iPS-Zellen nicht in der Lage sind, als Einzelzellen zu überleben.
    6. Übertragen Sie 1/10-1/50 der Zellklumpensuspension in die neuen Vertiefungen. Das Verhältnis hängt von der Konfluenz der Vertiefung vor der Spaltung, der gewünschten Dichte der ausgesäten Zellen und der klonalen Präferenz des iPSC ab.
    7. Verteilen Sie die Klumpen gleichmäßig in der Vertiefung, indem Sie die Platte mehrmals vorsichtig hin und her bewegen. Inkubieren Sie die Platte mindestens 30 Minuten lang bei 37 °C, damit sich die Klumpen festsetzen können.
    8. Ersetzen Sie das Medium durch 750 μl PSC-Nährmedium, wenn viele schwimmende tote Zellen beobachtet werden. Andernfalls fügen Sie 250 μl PSC-Nährmedium hinzu. Stellen Sie die Platte bei 37 °C und 5 % CO2 in einen Inkubator.
      HINWEIS: Ein Mediumersatz nach 30 Minuten ist kritisch, insbesondere bei instabilen Zelllinien (z. B. NHPs).
    9. Wechseln Sie das Medium alle 2-3 Tage, bis die Kolonien groß genug sind, um durchzugehen. Befolgen Sie für mittlere Änderungen Schritt 4 des Protokolls.
  2. Einzelzell-Passaging
    1. Die mit der Basalmembranmatrix beschichtete Kulturplatte wird wie in Schritt 5.1.1 beschrieben unter Zugabe von 10 μM Y-27632 zum PSC-Nährmedium vorbereitet.
      Optional: 10 μM Y-27632 1-3 h vor der Passage in die Zellen geben, um das Überleben empfindlicher Zelllinien zu verbessern.
    2. Saugen Sie das Medium an und waschen Sie die Zellen durch Zugabe von 500 μl DPBS. Entfernen Sie das DPBS und geben Sie 300 μl Ablöselösung in die Vertiefungen.
    3. Die Platte bei 37 °C 5-10 min inkubieren. Wenn eine ausreichende Ablösung der Zellen unter dem Mikroskop beobachtet wird, fügen Sie 700 μl PSC-Nährmedium oder DPBS hinzu.
    4. Pipettieren Sie mit einer p1000-Pipette 5-10x auf und ab, bis die Zellen in einzelne Zellen zerfallen sind. Pipettieren Sie nicht zu viel, um Zellschäden zu vermeiden.
    5. Übertragen Sie die Zellsuspension in ein 15-ml-Röhrchen, das mindestens 2 ml DPBS enthält, um die Ablöselösung zu verdünnen.
    6. Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 200 × g für 5 Minuten und saugen Sie die Lösung vollständig an, ohne das Zellpellet zu zerstören.
    7. Resuspendieren Sie das Pellet in 500 μl PSC-Nährmedium, ergänzt mit 10 μM Y-27632.
    8. Zählen Sie die Zellen und säen Sie 5.000-7.000 Zellen pro mit Basalmembranmatrix beschichteter 12-Well-Platte, die in Schritt 5.2.1 vorbereitet wurde.
      HINWEIS: Wenn eine andere Zellennummer benötigt wird, wechseln Sie entsprechend zu einer größeren oder kleineren Well.
    9. Inkubieren Sie die Platte mindestens 30 Minuten lang bei 37 °C und 5 % CO2 , damit sich die Zellen anlagern können.
    10. Ersetzen Sie das Medium durch 750 μl PSC-Nährmedium + 10 μM Y-27632, wenn viele tote Zellen beobachtet werden. Andernfalls fügen Sie 250 μL + 10 μM Y-27632 hinzu.
      HINWEIS: Dieser Schritt ist besonders für instabile Zelllinien (z. B. NHPs) von entscheidender Bedeutung.
    11. Stellen Sie die Platte bei 37 °C und 5 % CO2 in einen Inkubator.
    12. Wechseln Sie das Medium 1 bis 2 Tage nach der Teilung auf PSC-Nährmedium ohne Y-27632, damit die Zellen wieder die klassische Koloniemorphologie aufweisen können (Abbildung 3B).
    13. Wechsle das Medium alle 2 Tage, bis die Kolonien groß genug sind. Befolgen Sie für mittlere Änderungen Abschnitt 4 des Protokolls.
  3. Passage von iPS-Zellen durch Colony Picking
    1. Bereiten Sie die mit der Basalmembranmatrix beschichteten 12-Wells vor, wie in Schritt 5.1.1 beschrieben.
    2. Saugen Sie das Medium an und waschen Sie die Zellen, indem Sie vorsichtig 500 μl DPBS hinzufügen. Entfernen Sie das DPBS und geben Sie 500 μl 0,5 mM EDTA in die Vertiefung.
    3. Inkubieren Sie die Platte bei RT für 1-3 min und beobachten Sie die Zellen unter dem Mikroskop, bis die Ablösung der Kolonie an den Rändern sichtbar ist.
    4. Entfernen Sie das EDTA und fügen Sie vorsichtig 500 μl DPBS hinzu. Saugen Sie die Flüssigkeit ab, bevor Sie langsam 500 μl PSC-Nährmedium in die Vertiefung geben, ohne die Zellen abzulösen.
    5. Verwenden Sie eine p200-Pipette, um die gewünschte Kolonie unter dem Mikroskop auszuwählen, ohne die differenzierten Zellen zu sammeln. Kratzen Sie dazu vorsichtig über die Kolonie, während Sie das Medium mit den Zellen aufnehmen.
    6. Jede gepflückte Kolonie wird in eine mit Basalmembranmatrix beschichtete Vertiefung überführt, wie in Schritt 5.3.1 vorbereitet. Dissoziieren Sie die Zellen mit einer p1000-Pipette in kleine Klumpen, indem Sie die Zellen 2-5x pipettieren.
    7. Inkubieren Sie die Platte 30 Minuten lang bei 37 °C und 5 % CO2, damit sich die Klumpen anlagern können.
    8. Ersetzen Sie das Medium durch 750 μl PSC-Nährmedium, wenn viele schwimmende tote Zellen beobachtet werden. Andernfalls fügen Sie 250 μl PSC-Nährmedium hinzu.
      HINWEIS: Der Mediumersatz nach 30 Minuten ist kritisch, insbesondere für die instabilen Zelllinien (z. B. NHPs).
    9. Stellen Sie die Platte bei 37 °C und 5 % CO2 in einen Inkubator.
    10. Wechseln Sie das Medium alle 2-3 Tage, bis die Kolonien groß genug sind, um durchzugehen. Befolgen Sie dazu Abschnitt 4 des Protokolls.

6. Einfrieren von Harnzellen und iPS-Zellen zur Langzeitlagerung

HINWEIS: Routinemäßig werden iPS-Zellen als Klumpen in Zellgefriermedium eingefroren, ohne zu zählen. Das Pipettieren sollte minimal sein, um eine Dissoziation in einzelne Zellen zu vermeiden. Für Harnzellen werden routinemäßig 1,5 × 10 4 bis 3 × 104 Zellen pro Röhrchen eingefroren, so dass der Benutzer ein Röhrchen direkt in einer Vertiefung einer 12-Well-Platte auftauen kann, ohne dass ein weiterer Zählschritt erforderlich ist.

  1. Bereiten Sie 5 ml DPBS in einem 15-ml-Röhrchen vor.
  2. Befolgen Sie für das Einfrieren von Urinzellen die Schritte 2.2-2.4 des Protokolls. Befolgen Sie zum Einfrieren von iPS-Zellen die Schritte 5.1.2-5.1.5 aus dem Clump-Passaging-Protokoll.
  3. Übertragen Sie die Suspension in das in Schritt 6.1 vorbereitete 15-ml-Röhrchen. Für das Einfrieren von Harnzellen werden 10 μl der Zellsuspension mit einem Hämozytometer gezählt. Zentrifugieren Sie die Zellen 5 Minuten lang bei 200 × g und saugen Sie den Überstand vollständig ab.
  4. Resuspendieren Sie das Zellpellet in 400 μl Zellgefriermedium pro Röhrchen und verteilen Sie die Zellen auf die gewünschte Menge an Kryoröhrchen.
  5. Übertragen Sie die Kryoröhrchen sofort auf -80 °C. Übertragen Sie die gefrorenen Röhrchen 1 Tag nach dem Einfrieren bei -80 °C zur Langzeitlagerung in einen -150 °C Gefrierschrank oder flüssigen Stickstoff.

7. Auftauen von Harnzellen und iPS-Zellen

  1. Für das Auftauen von Harnzellen wird die gewünschte Menge an gelatinebeschichteten 12-Wells vorbereitet, wie in Schritt 1.1 des Protokolls angegeben. Für iPS-Zellen sind die mit der Basalmembranmatrix beschichteten 12-Well-Platten wie in Schritt 5.1.1 beschrieben vorzubereiten. Tauschen Sie in beiden Fällen die Matrix nicht gegen Medium aus.
  2. Bereiten Sie ein 15-ml-Röhrchen mit 4 ml DPBS vor und lagern Sie es bei 37 °C.
  3. Ein gefrorenes Fläschchen mit Zellen zum Auftauen schnell in ein 37 °C warmes Wasserbad stellen, bis ein Stück schwimmendes Eis sichtbar wird.
    Anmerkungen: Wischen Sie das Kryoröhrchen vor und nach der Inkubation im Wasserbad mit Ethanol ab, um Verunreinigungen zu vermeiden.
  4. 500 μl REMC-Medium für Harnzellen oder 500 μl PSC-Nährmedium für iPS-Zellen in die eishaltige Suspension geben und die Suspension sofort in das in Schritt 7.2 vorbereitete vorgewärmte 15-ml-Röhrchen überführen.
  5. Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 200 × g für 5 Minuten und entsorgen Sie den Überstand vollständig.
  6. Bei Harnzellen wird das Pellet in 1 ml REMC-Medium resuspendiert. Bei iPS-Zellen wird das Pellet vorsichtig in 750 μl PSC-Nährmedium resuspendiert. Vermeiden Sie es, zu viel zu pipettieren, um die Klumpen intakt zu halten.
    Optional: Die Ergänzung des Mediums mit 10 μM Y-27632 kann das Überleben von iPS-Zellen nach dem Auftauen unterstützen.
  7. Saugen Sie die Matrix von den in Schritt 7.1 hergestellten 12-Well-Platten ab und übertragen Sie die Zellsuspension vorsichtig in die Well.
  8. Stellen Sie die Platte über Nacht bei 37 °C und 5 % CO2 in einen Inkubator.
  9. Ersetzen Sie das Medium am nächsten Tag durch PSC-Nährmedium, ohne Y-27632 für iPS-Zellen und durch REMC für Harnzellen.
  10. Züchten Sie die Zellen bei 37 °C und 5 % CO2 in einem Inkubator.
  11. Wechsle das Medium alle 2-3 Tage, bis die Zellen groß genug sind, um durchzugehen. Befolgen Sie für mittlere Änderungen Abschnitt 4 des Protokolls.

8. Immunzytochemie

HINWEIS: Die Immunfärbung mit Antikörpern, die auf pluripotenzbezogene Marker wie NANOG, OCT3/4, SOX2, TRA-1-60 und EpCAM abzielen, ist eine der am weitesten verbreiteten Validierungen neu generierter iPS-Zellen. Weitere Informationen zu den Antikörpern und Verdünnungen finden Sie in der Materialtabelle.

  1. Platte iPS-Zellen 1-3 Tage vor der Anwendung in einer geeigneten Anzahl von 12-Well-Platten. Saugen Sie das Medium an, waschen Sie die Zellen durch Zugabe von 500 μl DPBS und entfernen Sie das DPBS. Fügen Sie 400 μl 4%iges Paraformaldehyd (PFA) pro Vertiefung hinzu und fixieren Sie die Zellen 15 Minuten lang bei RT.
  2. Entfernen Sie das 4%ige PFA und waschen Sie die Zellen 3x mit DPBS. Fügen Sie 400 μl Blockierungspuffer pro Well hinzu und inkubieren Sie die Platte 30 Minuten lang bei RT.
  3. Saugen Sie den Blockierungspuffer an und geben Sie die Antikörper, die in 400 μl Antikörperverdünnungspuffer (ADB) verdünnt sind, in jede Vertiefung. Die Platte über Nacht bei 4 °C inkubieren.
  4. Entfernen Sie das ADB mit den primären Antikörpern und waschen Sie die Zellen 3x mit DPBS.
  5. Saugen Sie das DPBS ab und fügen Sie 400 μl Sekundärantikörper, die in ADB verdünnt sind, pro Vertiefung hinzu. Inkubieren Sie die Platte für 1 h bei RT im Dunkeln.
  6. Entfernen Sie die ADB und waschen Sie die Zellen 3x mit DPBS. Fügen Sie 1 μg/ml 4',6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) verdünnt in DPBS pro Well hinzu und inkubieren Sie es 3 Minuten lang bei RT.
  7. Saugen Sie die DAPI-Lösung an und waschen Sie die Zelle 3x mit DPBS. Fügen Sie 500 μl DPBS für die Bildgebung hinzu.

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Ergebnisse

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Bei der Isolierung von Zellen aus menschlichem und NHP-Urin können verschiedene Zelltypen direkt nach der Isolierung identifiziert werden. Plattenepithelzellen sowie verschiedene kleinere runde Zellen werden mit dem Urin ausgeschieden; Der weibliche Urin enthält weitaus mehr Plattenepithelzellen als der männliche Urin (Abbildung 1B - Tag 0; Ergänzende Abbildung S1). Nach 5-tägiger Kultivierung im primären Urinmedium sind die ersten adhärenten proliferierenden Zellen zu sehen...

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Diskussion

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iPS-Zellen sind wertvolle Zelltypen, da sie die Erzeugung von sonst unzugänglichen Zelltypen in vitro ermöglichen. Da die Ausgangsmaterialien für die Reprogrammierung, z.B. Fibroblasten, nicht von allen Primatenarten leicht verfügbar sind, wird in dieser Arbeit ein Protokoll für die Generierung von iPS-Zellen aus Urinzellen vorgestellt. Diese Zellen können nicht-invasiv gewonnen werden, auch aus unsterilen Urinproben von Primaten, indem das Nährmedium mit Breitbandantibiotika ergänzt wird.

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Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Arbeit wurde von der DFG EN 1093/5-1 (Projektnummer 458247426) gefördert. M.O. wurde durch das JSPS Overseas Research Fellowship unterstützt. Alle Figuren wurden mit BioRender.com erstellt. Die Durchflusszytometrie wurde mit Hilfe der Core Facility Durchflusszytometrie am Biomedizinischen Zentrum München durchgeführt. Wir bedanken uns bei Makoto Shida und Tomoyo Muto von der ASHBi, Kyoto University, für die Unterstützung der Videografie.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Accumax™ Zellablösungslösung (Ablösung)Sigma-AldrichSCR006
Amphotericin B-LösungMerckA2941-100ML
Anti-Human TRA-1-60 Maus Antikörper Stem Cell Technologies60064Verdünnung: 1/200
Anti-Human TRA-1-60 PE-konjugierter AntikörperMiltenyi Biotec130-122-965Verdünnung: 1/50
Bambanker™ (Gefriermedium für Zellen)Nippon GeneticsBB01
Rinderserumalbumin (BSA)Sigma-AldrichA3059-100G
Zellkultur-Multiwell-Platte, 12-well CELLSTARGreiner BIO-ONE665180
Countess™ II automatisierter ZellzählerThermo Fisher ScientificAMQAX1000
CryoKing® 1,5 mL Röhrchen mit 2D Barcode (Cryotubes)Sued-Laborbedarf52 95-0213Zum Einfrieren können verschiedene Arten von Kryoröhrchen verwendet werden. Die 2D-Barcode-Röhrchen haben den Vorteil, dass die Probeninformationen in einer Datenbank mit eindeutigen Röhrcheninformationen gespeichert werden können.
CytoTune&Handel; EmGFP Sendai Fluorencence Reporter (GFP Sendai virus)Thermo Fisher ScientificA16519
CytoTune™-iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit (Sendai Virus Reprogramming Kit)Thermo Fisher ScientificA16518
DAPI 4',6-Diamidin-2'-phenylindole dihydrochlorideSigma-Aldrich10236276001
DMEM High GlukoseTH. GeyerL0102
DMEM/F12 w L-GlutaminFisher Scientific15373541
Esel Anti-Maus IgG (H+L) Hochgradig kreuzadsorbierter Sekundärantikörper, Alexa Fluor™ 488Thermo Fisher ScientificA-21202Verdünnung: 1/500
Esel Anti-Kaninchen IgG (H+L) Hochgradig kreuzadsorbierter Sekundärantikörper, Alexa Fluor&Trade; 594Thermo Fisher ScientificA-21207Verdünnung: 1/500
DPBS ohne Calcium ohne MagnesiumTH. GeyerL0615-500
EpCAM Rekombinanter polyklonaler Kaninchen-Antikörper (22 HCLC)Thermo Fisher Scientific710524Verdünnung: 1/500
Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)Carl RothCN06.3
Falcon Röhrchen 15 mL konischer BodenGreiner BIO-ONE188271-N
Falcon Röhrchen 50 mL konischer BodenGreiner BIO-ONE 227261
Fötales Rinderserum, qualifiziert, hitzeinaktiviert, Brasilien (FBS)Thermo Fisher Scientific10500064
FlowJo V10.8.2FlowJo 
Gelatine aus SchweinehautSigma-AldrichG1890-1KG
Geltrex™ LDEV-freie, hESC-qualifizierte, basale Membranmatrix mit reduziertem WachstumsfaktorThermo Fisher ScientificA1413301
GlutaMAX™ ErgänzungThermo Fisher Scientific35050038
Heracell™ 240i CO2-InkubatorFisher Scientific16416639
Heraeus HeraSafe SicherheitswerkbankKendro51017905
Human EGF, Premium-QualitätMiltenyi Biotec130-097-749
BildJ FijiVersion 2.9.0
MEM Lösung für nicht-essentielle Aminosäuren (100X)Thermo Fisher Scientific11140035
Mikrozentrifugationsröhrchen PP, 1,5 mLNerbe Plus04-212-1000
Mikroskop Nikon eclipse TE2000-SNikonTE2000-S
Maus Anti-Alpha-Fetoprotein-AntikörperR& D SystemsMAB1368Verdünnung: 1/100
Maus Anti-Alpha-Glattmuskel-Aktin-AntikörperR& D SystemsMAB1420Verdünnung: 1/100
Maus Anti-Beta-III Tubulin AntikörperR& D SystemsMAB1195Verdünnung: 1/100
mTeSR  1STAMMZELLEN-Technologien85850
Nanog (D73G4) XP Rabbit mAb Cell Signaling Technology4903SVerdünnung: 1/400
Normocure™ (Antimikrobielles Reagenz)Invivogenant-noc
Oct-4 Kaninchen Antikörper Cell Signaling Technology2750SVerdünnung: 1/400
Paraformaldehyd (PFA)Sigma-Aldrich441244-1KG
Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml) (PS)Thermo Fisher Scientific15140122Penicillin-Streptomycin-Mix enthält 100 U/ml Penicillin und 100 μl; g/ml Streptomycin.
Rekombinante humane FGF-basicPeproTech100-18B
Rekombinante humane PDGF-ABPeproTech100-00AB
TischzentrifugeSIGMA 4-16KS
Basalmedium für NierenepithelzellenATCCPCS-400-030
Wachstumskit für NierenepithelzellenATCCPCS-400-040
Sox2 (L1D6A2) Maus mAb #4900Cell Signaling Technology4900SVerdünnung: 1/400
SSEA4 (MC813) Maus mAbNEB4755SVerdünnung: 1/500
StemFit® Basic02Nippon Genetics3821.00Die Produktion dieses Mediums wurde eingestellt, verwenden Sie stattdessen StemFit Basic04CT für menschliche Zelllinien oder StemFit Basic03 für nicht-menschliche Primaten.
Triton X-100 Sigma-AldrichT8787-50ML
TrypLE & Handel Select Enzym (1x), kein Phenolrot (Dissoziationsenzym)Thermo Fisher Scientific12563011
Wasserbad Precision GP 05Thermo Fisher ScientificTSGP05
Y-27632, Dihydrochloridsalz (Rock Inhibitor)BiozolBYT-ORB153635
Antikörper-VerdünnungspufferZur Zusammensetzung siehe Zusatz Tabelle S1
BlockierungspufferFür die Zusammensetzung siehe die ergänzende Tabelle S1
REMC-MediumFür die Zusammensetzung siehe die ergänzende Tabelle S1
PrimärharnmediumFür die Zusammensetzung siehe die ergänzende Tabelle S1
PSC-KulturmediumFür die Zusammensetzung siehe die ergänzende Tabelle S1
PSC-ErzeugungsmediumZur Zusammensetzung siehe ergänzende Tabelle S1
UrinwaschpufferZur Zusammensetzung siehe ergänzende Tabelle S1
663441 gekühlte

Referenzen

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