Das vorliegende Protokoll beschreibt eine Methode zur Isolierung, Expansion und Reprogrammierung von humanen und nicht-humanen Zellen aus dem Urin von Primaten zu induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen) sowie Anweisungen zur feederfreien Aufrechterhaltung der neu erzeugten iPS-Zellen.
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Methodenartikel
Erzeugung und Erhaltung von Primaten-induzierten pluripotenten Stammzellen aus Urin
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Speziesübergreifende Ansätze zur Untersuchung pluripotenter Stammzellen von Primaten und ihrer Derivate sind von entscheidender Bedeutung, um die molekularen und zellulären Mechanismen von Krankheit, Entwicklung und Evolution besser zu verstehen. Um den Zugang zu Primaten-induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen) zu erleichtern, wird in dieser Arbeit eine nicht-invasive Methode zur Erzeugung von humanen und nicht-humanen Primaten-iPS-Zellen aus aus aus dem Urin gewonnenen Zellen und deren Erhaltung mit einer feederfreien Kultivierungsmethode vorgestellt.
Der Urin kann aus einer unsterilen Umgebung (z. B. dem Käfig des Tieres) entnommen und während der primären Zellkultur mit einem Breitband-Antibiotika-Cocktail behandelt werden, um die Kontamination effizient zu reduzieren. Nach der Vermehrung der aus dem Urin gewonnenen Zellen werden iPS-Zellen durch eine modifizierte Transduktionsmethode eines kommerziell erhältlichen Sendai-Virus-Vektorsystems erzeugt. Erste iPSC-Kolonien können bereits nach 5 Tagen sichtbar sein und frühestens nach 10 Tagen gepflückt werden. Die routinemäßige Klumpenpassage mit enzymfreiem Dissoziationspuffer unterstützt die Pluripotenz der erzeugten iPSCs für mehr als 50 Passagen.
Einleitung
Genomische Vergleiche von menschlichen und nicht-menschlichen Primaten (NHPs) sind entscheidend, um unsere Evolutionsgeschichte und die Evolution menschenspezifischer Merkmale zu verstehen1. Darüber hinaus ermöglichen diese Vergleiche den Rückschluss auf die Funktion durch die Identifizierung konservierter DNA-Sequenzen2, z. B. um krankheitsassoziierte Varianten3 zu priorisieren. Vergleiche von molekularen Phänotypen, wie z.B. Genexpressionsniveaus, sind entscheidend, um genomische Vergleiche besser interpretieren zu können und z.B. zelluläre phänotypische Unterschiede zu entdecken. Darüber hinaus....
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Protokoll
Dieses experimentelle Verfahren wurde von der zuständigen Ethikkommission für Menschenversuche (20-122, Ethikkommission LMU München) genehmigt. Alle Experimente wurden in Übereinstimmung mit den einschlägigen Richtlinien und Vorschriften durchgeführt.
HINWEIS: Vor Beginn von Experimenten, die sich mit menschlichen und NHP-Proben befassen, muss die Genehmigung der zuständigen Ethikkommission eingeholt werden. Alle experimentellen Verfahren müssen in Übereinstimmung mit den einschlägigen Richtlinien und Vorschriften durchgeführt werden. Jeder der folgenden Schritte sollte steril in einer biologischen Sicherheitswerkbank durchgeführt werden. Alle Puffer- und Medienzus....
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Ergebnisse
Bei der Isolierung von Zellen aus menschlichem und NHP-Urin können verschiedene Zelltypen direkt nach der Isolierung identifiziert werden. Plattenepithelzellen sowie verschiedene kleinere runde Zellen werden mit dem Urin ausgeschieden; Der weibliche Urin enthält weitaus mehr Plattenepithelzellen als der männliche Urin (Abbildung 1B - Tag 0; Ergänzende Abbildung S1). Nach 5-tägiger Kultivierung im primären Urinmedium sind die ersten adhärenten proliferierenden Zellen zu sehen.......
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Diskussion
iPS-Zellen sind wertvolle Zelltypen, da sie die Erzeugung von sonst unzugänglichen Zelltypen in vitro ermöglichen. Da die Ausgangsmaterialien für die Reprogrammierung, z.B. Fibroblasten, nicht von allen Primatenarten leicht verfügbar sind, wird in dieser Arbeit ein Protokoll für die Generierung von iPS-Zellen aus Urinzellen vorgestellt. Diese Zellen können nicht-invasiv gewonnen werden, auch aus unsterilen Urinproben von Primaten, indem das Nährmedium mit Breitbandantibiotika ergänzt wird.
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Offenlegungen
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde von der DFG EN 1093/5-1 (Projektnummer 458247426) gefördert. M.O. wurde durch das JSPS Overseas Research Fellowship unterstützt. Alle Figuren wurden mit BioRender.com erstellt. Die Durchflusszytometrie wurde mit Hilfe der Core Facility Durchflusszytometrie am Biomedizinischen Zentrum München durchgeführt. Wir bedanken uns bei Makoto Shida und Tomoyo Muto von der ASHBi, Kyoto University, für die Unterstützung der Videografie.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Accumax™ Zellablösungslösung (Ablösung) | Sigma-Aldrich | SCR006 | |
| Amphotericin B-Lösung | Merck | A2941-100ML | |
| Anti-Human TRA-1-60 Maus Antikörper | Stem Cell Technologies | 60064 | Verdünnung: 1/200 |
| Anti-Human TRA-1-60 PE-konjugierter Antikörper | Miltenyi Biotec | 130-122-965 | Verdünnung: 1/50 |
| Bambanker™ (Gefriermedium für Zellen) | Nippon Genetics | BB01 | |
| Rinderserumalbumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A3059-100G | |
| Zellkultur-Multiwell-Platte, 12-well CELLSTAR | Greiner BIO-ONE | 665180 | |
| Countess™ II automatisierter Zellzähler | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | |
| CryoKing® 1,5 mL Röhrchen mit 2D Barcode (Cryotubes) | Sued-Laborbedarf | 52 95-0213 | Zum Einfrieren können verschiedene Arten von Kryoröhrchen verwendet werden. Die 2D-Barcode-Röhrchen haben den Vorteil, dass die Probeninformationen in einer Datenbank mit eindeutigen Röhrcheninformationen gespeichert werden können. |
| CytoTune&Handel; EmGFP Sendai Fluorencence Reporter (GFP Sendai virus) | Thermo Fisher Scientific | A16519 | |
| CytoTune™-iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit (Sendai Virus Reprogramming Kit) | Thermo Fisher Scientific | A16518 | |
| DAPI 4',6-Diamidin-2'-phenylindole dihydrochloride | Sigma-Aldrich | 10236276001 | |
| DMEM High Glukose | TH. Geyer | L0102 | |
| DMEM/F12 w L-Glutamin | Fisher Scientific | 15373541 | |
| Esel Anti-Maus IgG (H+L) Hochgradig kreuzadsorbierter Sekundärantikörper, Alexa Fluor™ 488 | Thermo Fisher Scientific | A-21202 | Verdünnung: 1/500 |
| Esel Anti-Kaninchen IgG (H+L) Hochgradig kreuzadsorbierter Sekundärantikörper, Alexa Fluor&Trade; 594 | Thermo Fisher Scientific | A-21207 | Verdünnung: 1/500 |
| DPBS ohne Calcium ohne Magnesium | TH. Geyer | L0615-500 | |
| EpCAM Rekombinanter polyklonaler Kaninchen-Antikörper (22 HCLC) | Thermo Fisher Scientific | 710524 | Verdünnung: 1/500 |
| Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) | Carl Roth | CN06.3 | |
| Falcon Röhrchen 15 mL konischer Boden | Greiner BIO-ONE | 188271-N | |
| Falcon Röhrchen 50 mL konischer Boden | Greiner BIO-ONE 227261 | ||
| Fötales Rinderserum, qualifiziert, hitzeinaktiviert, Brasilien (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 10500064 | |
| FlowJo V10.8.2 | FlowJo | ||
| Gelatine aus Schweinehaut | Sigma-Aldrich | G1890-1KG | |
| Geltrex™ LDEV-freie, hESC-qualifizierte, basale Membranmatrix mit reduziertem Wachstumsfaktor | Thermo Fisher Scientific | A1413301 | |
| GlutaMAX™ Ergänzung | Thermo Fisher Scientific | 35050038 | |
| Heracell™ 240i CO2-Inkubator | Fisher Scientific | 16416639 | |
| Heraeus HeraSafe Sicherheitswerkbank | Kendro | 51017905 | |
| Human EGF, Premium-Qualität | Miltenyi Biotec | 130-097-749 | |
| BildJ | Fiji | Version 2.9.0 | |
| MEM Lösung für nicht-essentielle Aminosäuren (100X) | Thermo Fisher Scientific | 11140035 | |
| Mikrozentrifugationsröhrchen PP, 1,5 mL | Nerbe Plus | 04-212-1000 | |
| Mikroskop Nikon eclipse TE2000-S | Nikon | TE2000-S | |
| Maus Anti-Alpha-Fetoprotein-Antikörper | R& D Systems | MAB1368 | Verdünnung: 1/100 |
| Maus Anti-Alpha-Glattmuskel-Aktin-Antikörper | R& D Systems | MAB1420 | Verdünnung: 1/100 |
| Maus Anti-Beta-III Tubulin Antikörper | R& D Systems | MAB1195 | Verdünnung: 1/100 |
| mTeSR 1 | STAMMZELLEN-Technologien | 85850 | |
| Nanog (D73G4) XP Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | 4903S | Verdünnung: 1/400 |
| Normocure™ (Antimikrobielles Reagenz) | Invivogen | ant-noc | |
| Oct-4 Kaninchen Antikörper | Cell Signaling Technology | 2750S | Verdünnung: 1/400 |
| Paraformaldehyd (PFA) | Sigma-Aldrich | 441244-1KG | |
| Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml) (PS) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Penicillin-Streptomycin-Mix enthält 100 U/ml Penicillin und 100 μl; g/ml Streptomycin. |
| Rekombinante humane FGF-basic | PeproTech | 100-18B | |
| Rekombinante humane PDGF-AB | PeproTech | 100-00AB | |
| Tischzentrifuge | SIGMA | 4-16KS | |
| Basalmedium für Nierenepithelzellen | ATCC | PCS-400-030 | |
| Wachstumskit für Nierenepithelzellen | ATCC | PCS-400-040 | |
| Sox2 (L1D6A2) Maus mAb #4900 | Cell Signaling Technology | 4900S | Verdünnung: 1/400 |
| SSEA4 (MC813) Maus mAb | NEB | 4755S | Verdünnung: 1/500 |
| StemFit® Basic02 | Nippon Genetics | 3821.00 | Die Produktion dieses Mediums wurde eingestellt, verwenden Sie stattdessen StemFit Basic04CT für menschliche Zelllinien oder StemFit Basic03 für nicht-menschliche Primaten. |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787-50ML | |
| TrypLE & Handel Select Enzym (1x), kein Phenolrot (Dissoziationsenzym) | Thermo Fisher Scientific | 12563011 | |
| Wasserbad Precision GP 05 | Thermo Fisher Scientific | TSGP05 | |
| Y-27632, Dihydrochloridsalz (Rock Inhibitor) | Biozol | BYT-ORB153635 | |
| Antikörper-Verdünnungspuffer | Zur Zusammensetzung siehe Zusatz Tabelle S1 | ||
| Blockierungspuffer | Für die Zusammensetzung siehe die ergänzende Tabelle S1 | ||
| REMC-Medium | Für die Zusammensetzung siehe die ergänzende Tabelle S1 | ||
| Primärharnmedium | Für die Zusammensetzung siehe die ergänzende Tabelle S1 | ||
| PSC-Kulturmedium | Für die Zusammensetzung siehe die ergänzende Tabelle S1 | ||
| PSC-Erzeugungsmedium | Zur Zusammensetzung siehe ergänzende Tabelle S1 | ||
| Urinwaschpuffer | Zur Zusammensetzung siehe ergänzende Tabelle S1 |
Referenzen
- Pääbo, S. The human condition-a molecular approach. Cell. 157 (1), 216-226 (2014).
- Zoonomia Consortium, A comparative genomics multitool for scientific discovery and conservation. Nature. 587 (7833), 240-245 (2020).
- Kircher, M., et al.
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Nachdrucke und Genehmigungen
