Summary
Le présent protocole décrit comment utiliser une lésion médiée par FeCl3 pour induire une thrombose artérielle, et comment collecter et préparer des échantillons de lésions artérielles à différents stades de la thrombose pour l’analyse en microscopie électronique.
Abstract
Les maladies cardiovasculaires sont l’une des principales causes de mortalité et de morbidité dans le monde. La thrombose aberrante est une caractéristique commune des affections systémiques comme le diabète et l’obésité, et des maladies inflammatoires chroniques comme l’athérosclérose, le cancer et les maladies auto-immunes. En cas de lésion vasculaire, le système de coagulation, les plaquettes et l’endothélium agissent généralement de manière orchestrée pour prévenir les saignements en formant un caillot sur le site de la blessure. Les anomalies de ce processus entraînent soit des saignements excessifs, soit une thrombose incontrôlée / une activité antithrombotique insuffisante, ce qui se traduit par une occlusion des vaisseaux et ses séquelles. Le modèle de lésion carotidienne induite par FeCl3 est un outil précieux pour sonder comment la thrombose commence et progresse in vivo. Ce modèle implique des dommages endothéliaux/dénudation et la formation subséquente de caillots sur le site blessé. Il fournit un test quantitatif très sensible pour surveiller les dommages vasculaires et la formation de caillots en réponse à différents degrés de dommages vasculaires. Une fois optimisée, cette technique standard peut être utilisée pour étudier les mécanismes moléculaires sous-jacents à la thrombose, ainsi que les changements ultrastructuraux dans les plaquettes dans un thrombus en croissance. Ce test est également utile pour étudier l’efficacité des agents antithrombotiques et antiplaquettaires. Cet article explique comment initier et surveiller la thrombose artérielle induite par FeCl3 et comment prélever des échantillons pour analyse par microscopie électronique.
Introduction
La thrombose est la formation d’un caillot sanguin qui bloque partiellement ou complètement un vaisseau sanguin, entravant la circulation naturelle du sang. Cela conduit à des événements cardiovasculaires graves et mortels, tels que les cardiopathies ischémiques et les accidents vasculaires cérébraux. Les maladies cardiovasculaires sont la principale cause de morbidité et de mortalité, et causent un décès sur quatre dans le monde 1,2,3. Bien que la thrombose se manifeste par un dysfonctionnement du système vasculaire, elle pourrait être le résultat d’une infection microbienne ou virale sous-jacente, d’un trouble immunitaire, d’une tumeur maligne ou d’une affection métabolique. La circulation sanguine est maintenue par l’interaction complexe entre divers composants du système vasculaire, y compris les cellules endothéliales, les globules rouges / blancs, les plaquettes et les facteurs de coagulation4. En cas de lésion vasculaire, les plaquettes interagissent avec les protéines adhésives de la matrice sous-endothéliale et libèrent leur contenu granulaire, ce qui recrute plus de plaquettes5. Parallèlement, la cascade de coagulation est activée, conduisant à la formation et au dépôt de fibrine. En fin de compte, un caillot se forme, contenant des plaquettes et des globules rouges piégés dans un maillage de fibrine6. Bien que des médicaments antiplaquettaires et anticoagulants soient disponibles pour moduler la thrombose, les saignements parasites demeurent une préoccupation majeure avec ces thérapies, nécessitant un réglage fin des dosages et des combinaisons de ces médicaments. Ainsi, il est toujours urgent de découvrir de nouveaux médicaments anti-thrombotiques7.
La thrombose est étudiée à l’aide de plusieurs méthodes pour infliger des lésions vasculaires: mécanique (ligature des vaisseaux), thermique (lésion au laser) et chimique (application FeCl3 / Rose Bengal). La nature de la thrombose varie en fonction de l’emplacement (artériel vs veineux), de la méthode ou de l’étendue de la blessure. Parmi tous ces types, les lésions vasculaires induites par FeCl3 sont la méthode la plus utilisée. Il a été employé chez les souris, les rats, les lapins, les cobayes et les chiens 8,9,10,11,12. La méthode est relativement simple, facile à utiliser et, si les principaux paramètres sont normalisés, elle est sensible et reproductible dans divers systèmes vasculaires (p. ex. artères [carotides et fémorales], veines [jugulaires] et artérioles [cremaster et mésentérique]) (tableau supplémentaire 1).
Ce modèle peut également être utilisé pour approfondir notre compréhension de la mécanique et de la morphologie de la formation des caillots. Cette technique offre uniquement l’avantage d’arrêter la thrombose à différents points de débit, pour étudier les étapes intermédiaires du processus avant qu’il ne devienne occlusif. Les progrès récents de la recherche sur la thrombose ont utilisé ce modèle pour attirer l’attention sur les méthodes non pharmacologiques de thrombolyse13 ou l’administration non invasive d’agents antithrombotiques et/ou fibrinolytiques14,15. Plusieurs groupes ont montré que, lorsque les membranes plaquettaires sont recouvertes de ces traitements, les médicaments peuvent être activés par stimulation thermique pour cibler les caillots16. Les techniques décrites ici peuvent être utiles à des études telles que la validation de leurs résultats au niveau plaquettaire unique. Dans ce manuscrit, le protocole 1 décrit la procédure de base de lésion vasculaire médiée par FeCl3, tandis que le protocole 2 décrit la méthode de collecte et de fixation de l’échantillon de lésion vasculaire pour une analyse plus approfondie par microscopie électronique.
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Protocol
Toutes les expériences discutées ici ont été examinées et approuvées par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux (IACUC) de l’Université du Kentucky.
REMARQUE : Les instruments chirurgicaux sont énumérés à la figure 1 et dans le tableau des matériaux. Des souris C57BL/6J, âgées de 8 à 10 semaines, mâles/femelles ou des souches génétiquement modifiées (Knockout ou Knockin) ont été utilisées.
1. Lésion de l’artère carotide induite par FeCl3
- Induction de l’anesthésie chez la souris
- Pesez la souris.
- Anesthésier la souris en injectant 0,2 g/kg de solution de tribromoéthanol par voie intrapéritonéale (i.p.). Assurez-vous que la solution anesthésique est à température ambiante (RT) avant de l’injecter. Cette dose est suffisante pour endormir la souris pendant environ 1 h.
- Vérifiez le réflexe de l’orteil en pinçant l’orteil 5 minutes après l’injection pour vous assurer que la souris est sous sédation. Si la souris n’est pas sous sédatif, elle retirera son orteil. Si cela se produit, attendez 5 minutes et vérifiez à nouveau.
- Si la souris n’est toujours pas complètement sous sédatif, administrez 1/4 de la dose initiale et attendez 5 minutes.
- Tout au long de la procédure, surveillez périodiquement le plan anesthésique de la souris via un pincement des orteils. De plus, la fréquence respiratoire et la température corporelle pourraient également être surveillées pour maintenir une anesthésie optimale.
- Immobiliser la souris
- Posez la souris sur le coussin chauffant (37 °C) en décubitus dorsal et utilisez du ruban adhésif pour immobiliser les extrémités.
- Utilisez un fil chirurgical (0,1 mm) pour tirer doucement les dents antérieures supérieures de la souris afin d’étendre la région cervicale / cou. Ceci est important pour une meilleure visualisation de la zone chirurgicale et la stabilité de la sonde Doppler. La taille du fil n’est pas importante, car elle n’est utilisée que pour tirer les dents de devant de l’animal afin d’étendre le cou.
- Incision
- Vaporisez la zone chirurgicale avec de l’éthanol à 70% ou essuyez-la avec une lingette imbibée d’alcool.
- À l’aide d’un coton-tige, appliquez une petite quantité de crème dépilatoire sur la zone chirurgicale. Attendez 1-2 minutes, puis utilisez une serviette en papier humide ou un mouchoir en papier pour enlever la crème.
REMARQUE: Cette étape est importante pour une zone chirurgicale propre. - À l’aide de ciseaux et de pinces (figure 1B11,1B13), faites une incision médiane de la mandibule à l’encoche suprasternale. Rétractez la peau pour obtenir une meilleure visualisation de la zone (Figure 2A).
- Exposition à l’artère carotide
- À l’aide de pinces chirurgicales et de pinces à microdissection, disséquez brutalement le fascia superficiel superposé et retirez-le pour exposer l’artère carotide gauche (Figure 1B12,1B13). Assurez-vous de ne pas utiliser de ciseaux à ce stade pour éviter de blesser d’autres systèmes vasculaires dans cette zone.
- Retirez le tissu supplémentaire entourant l’artère carotide. Évitez la dissection excessive des tissus environnants, car cette zone abrite le nerf vague et l’artère vertébrale.
- Séparez l’artère carotide des tissus environnants en la disséquant à l’aide d’une pince chirurgicale et d’une pince à suture (Figure 1B12,1B15,2C). Assurez-vous de ne pas étendre ou tirer l’artère pour éviter toute blessure mécanique à l’artère ou au système vasculaire environnant.
- Placez un morceau de plastique sous l’artère pour marquer l’emplacement de la blessure (figure 2D). Utilisez une feuille de transparence colorée pour faciliter la vision dans le domaine chirurgical.
- Emplacement de la sonde d’écoulement
- Placez la sonde d’écoulement transsonique Doppler dans une solution saline (0,9% de NaCl dansdH2O) pendant environ 10 minutes avant la chirurgie. Insérez l’autre extrémité de la sonde dans un accessoire dans le débitmètre pour faciliter la lecture du débit. Connectez le débitmètre à un ordinateur.
REMARQUE: Entre les chirurgies, la sonde de flux transsonique Doppler doit être dans une solution saline. Assurez-vous de garder la sonde humide et propre tout au long de la procédure. - Placez la sonde d’écoulement transsonique Doppler à ultrasons autour de l’artère en amont du plastique (Figure 2D). Assurez-vous que la région du porte-récipient de la sonde n’est pas trop étendue (figure 1C, flèche rouge).
NOTA : Si nécessaire, soutenir la sonde avec des compresses de gaze (Figure 1B1) pour obtenir une hauteur appropriée de la sonde, facilitant ainsi la position de lecture optimale. - Si la zone chirurgicale est sèche à ce stade, ajoutez quelques gouttes de solution saline RT pour garder la zone humide. Surveillez la lecture de la sonde de débit. La lecture optimale varie pour chaque animal et peut se situer entre 0,6 et 1,2 mL/min. S’il est moins ou pas stable, changez la position de la sonde de débit pour obtenir une lecture optimale.
REMARQUE: Assurez-vous que le cou de la souris n’est pas trop étendu et que la zone chirurgicale est propre.
- Placez la sonde d’écoulement transsonique Doppler dans une solution saline (0,9% de NaCl dansdH2O) pendant environ 10 minutes avant la chirurgie. Insérez l’autre extrémité de la sonde dans un accessoire dans le débitmètre pour faciliter la lecture du débit. Connectez le débitmètre à un ordinateur.
- Enregistrer la ligne de base du flux
- Après avoir placé la sonde, surveillez le flux sanguin pendant 2 minutes pour vous assurer que le débit est stable. Ensuite, notez le débit pendant 2 minutes (Figure 3B) comme référence. Pour une description détaillée du débitmètre, voir Subramaniam et coll.17.
- Pour enregistrer le flux sanguin, démarrez le logiciel WinDAQ. Cliquez sur l’option Fichier, puis sur Enregistrer. Créez un nouveau dossier et fichier, puis commencez l’enregistrement. Pour arrêter l’enregistrement, cliquez sur Arrêter dans la section fichier.
REMARQUE: Le logiciel WinDAQ est disponible gratuitement auprès de l’éditeur: https://www.dataq.com/products/windaq/.
- Blessure
- Arrêtez l’enregistrement du flux. Assurez-vous de ne pas modifier la position de la sonde afin que les lectures restent cohérentes après la blessure.
- Séchez soigneusement la zone avec une lingette / serviette en papier.
REMARQUE: Même un petit volume de liquide résiduel peut modifier la concentration de solution de FeCl3 utilisée pour infliger des lésions vasculaires. Cela conduit à des résultats variables et affecte la reproductibilité. Lorsque la zone est complètement sèche, la sonde n’est pas en mesure de mesurer le débit. - Dans un bateau de pesée en plastique, mettez un papier filtre circulaire (1 mm de diamètre, coupé avec un poinçon d’oreille de 1 mm de diamètre). Ajouter 1 μL de solution de FeCl3 à 6% (faite endH2O) sur le papier filtre.
REMARQUE: Assurez-vous d’ajouter la solution FeCl3 juste avant d’utiliser le papier filtre. Tremper le papier trop tôt peut entraîner l’évaporation de la solution de FeCl3 et modifier la gravité de la blessure. - À l’aide de pinces fines, ramasser le papier filtre et le placer sur l’artère en amont de la sonde, sur la partie de l’artère marquée par le plastique (figure 2D,E). Ce plastique agit comme un marqueur et un espaceur. Il marque la zone lésée et empêche la dilution accidentelle du FeCl3 en évitant le contact avec la zone humide environnante.
REMARQUE: Assurez-vous que le papier filtre est droit, pas pincé ou plié de quelque manière que ce soit. Une fois placé sur l’artère, ne changez pas la position du papier filtre; Cela modifie l’étendue de la blessure. - Après avoir placé le papier filtre, démarrez la minuterie et enregistrez le flux sanguin. Après 3 min, retirez le papier et ajoutez une solution saline sur le site de la blessure pour enlever le FeCl3 et arrêter le processus de blessure. Cela rend également la zone humide. À ce stade, le flux sanguin devrait revenir au niveau de base, tel qu’enregistré avant la blessure.
- Surveillez et enregistrez le flux jusqu’à ce qu’il se réduise à 10% de l’enregistrement d’origine ou atteigne zéro. Il y a une diminution constante une fois que le thrombus commence à se former sur le site de la blessure (figure 3C). Notez toute fluctuation significative du débit pendant cette période.
- Pour étudier la stabilité du thrombus, notez l’augmentation rapide du flux sanguin après chaque diminution significative et constante. Ces événements sont classés comme embolisation due à une thrombose instable (Figure 4D). Après la diminution constante du débit, l’opérateur est en mesure de voir la lésion sur l’artère à la fin de l’expérience (Figure 2F, flèche bleue/ovale pointillé).
- Le temps d’occlusion des vaisseaux est défini comme l’arrêt complet du flux sanguin pendant au moins 1 min. Enregistrer le moment auquel un thrombus occlusif se forme, comme le montre la lecture zéro ou la diminution significative du débit.
- Terminez l’expérience à 30 min. Si le thrombus ne se forme pas dans les 30 minutes suivant la surveillance, enregistrez le flux, arrêtez l’enregistrement et retirez la sonde.
- Nettoyez la sonde avec de l’éthanol à 70 % et une brosse pour enlever tout tissu / poils résiduels ou débris. Séchez complètement la sonde avant de la placer dans la boîte de rangement. Séchez complètement la sonde avant de la placer dans la boîte de rangement pour un stockage à long terme.
- Euthanasier la souris par luxation cervicale. Placez la carcasse dans le sac d’élimination de la carcasse, étiqueté avec le nom du laboratoire et la date.
2. Collecte et préparation d’échantillons pour les études de microscopie électronique à balayage de face en bloc en série (SBF-SEM) après une lésion induite par FeCl3
REMARQUE : Le protocole EM présenté est approprié pour la préparation des échantillons pour le SBF-SEM. Cette technique d’imagerie offre une capacité sans précédent à étudier la structure tridimensionnelle des plaquettes dans un caillot. Avec cette technique, l’échantillon est visualisé comme une série d’images SEM de blocs séquentiels, générées au fur et à mesure que l’on progresse dans l’échantillon. Les points clés de cette préparation sont les suivants: 1) l’échantillon doit être coloré avec des métaux lourds pré-enrobés; et 2) l’échantillon de plastique incorporé doit être coupé de manière appropriée pour être monté dans le MEB (voir la figure 6 pour un visuel des échantillons parés). La coloration post-encastrement n’est pas possible dans le SEM. Lors du prélèvement d’un échantillon d’une lésion vasculaire induite par FeCl3 pour l’analyse EM, les modifications suivantes doivent être apportées lors de la chirurgie. Les modifications du protocole chirurgical FeCl3 présentées sont également applicables à toute forme de microscopie électronique. Les conditions d’anesthésie et les étapes pour faire une incision et exposer l’artère carotide sont les mêmes que dans le protocole 1.
- Après avoir exposé l’artère carotide, marquer le site de la blessure en encerclant lâchement la région entre deux fils chirurgicaux (taille : 0,1 mm) (figure 5A,B).
- Placez la sonde sous l’artère, distale du filetage inférieur (Figure 5C).
- Insérez le morceau de plastique sous l’artère entre les deux fils pour marquer le site de lésion de FeCl3 (figure 5C).
- Prenez des mesures de débit avant d’effectuer une blessure pour noter l’écoulement basal. Ces mesures sont utilisées pour décider à quel stade l’échantillon sera prélevé.
REMARQUE: Assurez-vous que le fixateur (3% de paraformaldéhyde / PFA + 0,1% de glutaraldéhyde, tous deux fabriqués en 1x PBS) est prêt et à TA. Alternativement, la fixation avec 2,5% de glutaraldéhyde dans un fond salin pourrait également être utilisée.
ATTENTION: Le paraformaldéhyde et le glutaraldéhyde sont très toxiques et irritants. Lors de leur manipulation, des gants, un écran oculaire et des masques doivent être utilisés pour se protéger contre l’exposition. Toutes les solutions fixatrices sont toxiques et les étapes de fixation doivent être effectuées dans une hotte. - Effectuez la blessure en plaçant du papier filtre imbibé de FeCl 3 sur l’artère (8% de FeCl 3 est utilisé) pendant3 minutes (ce temps peut varier également). Après 3 min, retirer le papier filtre et ajouter une solution saline sur le site de la blessure pour éliminer tout excès de FeCl3 résiduel. Cette étape est nécessaire pour prévenir l’étendue variable de la blessure et faciliter le comptage du débit par la sonde (figure 5D).
- Surveillez la lecture du flux. Lorsque le débit tombe en dessous de 50 % de la valeur initiale, retirez la sonde. Séchez rapidement la zone et ajoutez le fixateur dans la zone pour fixer extérieurement la zone de blessure.
- Tenez rapidement l’artère près de la zone de blessure avec une pince et coupez en aval du fil inférieur et en amont du fil supérieur. Si nécessaire, demandez à une autre personne de vous aider à couper une extrémité. Placez le tissu sur le plat de culture de tissus en plastique dans la même orientation qu’il a été recueilli et ajoutez quelques gouttes du fixateur.
REMARQUE: Couper l’artère provoque un saignement important immédiat, alors assurez-vous de tenir l’artère avant de la couper la première fois. Dans ce scénario, la souris est exsanguinée. La souris est euthanasiée par exsanguination et luxation cervicale. - À l’aide d’un scalpel, nettoyez le tissu supplémentaire autour de l’artère. Soyez attentif à enregistrer l’orientation du flux sanguin. Pour marquer cela, coupez une extrémité horizontalement et l’autre effilée/oblique (figure 5E).
- Conserver l’échantillon dans un fixateur (3 % de PFA et 0,1 % de glutaraldéhyde) pendant 1 h à TA. Ensuite, conservez l’échantillon dans 1 % de PFA à 4 °C jusqu’à ce qu’il soit envoyé sur de la glace humide au laboratoire de traitement de l’échantillon pour analyse EM.
REMARQUE : Les échantillons ne doivent pas être congelés. Les défis de cette méthode de prélèvement d’échantillons sont les suivants :- La lecture initiale peut ne pas être optimale ou peut fluctuer après la blessure. Cela peut avoir une incidence sur l’étendue de la blessure choisie pour l’analyse de la ME. Pour résoudre ce problème, assurez-vous d’enregistrer la lecture de base pendant quelques minutes, après avoir essayé différentes positions de placement de la sonde pour décider quelle position est optimale.
- Le temps nécessaire pour arrêter la blessure en ajoutant un fixateur externe et une coupe réelle de la section artérielle pour analyse peut ajouter de la variabilité à l’étendue de la thrombose. Soyez rapide lors du prélèvement de l’échantillon après la fixation externe.
- Recevoir les échantillons pour traitement pour analyse EM dans 1% PFA sur glace humide. Rincer les échantillons pendant 3 min, sur glace, avec un tampon cacodylate de 0,1 M pour lancer le traitement ultérieur.
- Fixer les échantillons pendant 1 h sur glace dans un tampon cacodylate 0,1 M + 2,5% de glutaraldéhyde + 2 mM de CaCl2.
- Jeter le fixateur et laver les échantillons avec un tampon cacodylate de sodium froid de 0,1 M contenant 2 mM de CaCl2 (5 x 3 min) (figure 6A).
- Fixer les échantillons avec une solution d’osmium (3 % de ferrocyanure de potassium [K4C6N6Fe] + tampon cacodylate 0,3 M + 4 mMde CaCl2mélangé à un volume égal de tétroxyde d’osmium aqueux à 4 % [OsO4; dans ddH2O]) pendant 1 h surglace.
- Pendant la fixation des échantillons, préparer une solution fraîche d’hydrate de trichloroacétaldéhyde (TCH) à 1 % dans duddH2O. Incuber la solution à 60 °C pendant 1 h tout en mélangeant doucement.
- Après fixation, laver les échantillons avecddH2Oà TA pendant 5 x 3 min.
- Incuber les échantillons dans une solution filtrée de TCH à 1% (faite enddH2O) pendant 20 min à TA.
- Laver les échantillons avec ddH2Oà TA (5 x 3 min).
- Fixer les échantillons dans du tétroxyde d’osmium à 2% dans duddH2Opendant 30 min à TA.
- Laver les échantillons avec ddH2O à TA pendant 5 x 3 min chacun.
- Placer les échantillons dans de l’acétate d’uranyle à 1 % (aqueux) et incuber pendant la nuit à 4 °C.
- Lavez les échantillons avec ddH2O à TA pendant 5 x 3 min chacun et traitez-les avec la coloration en bloc à l’aspartate de plomb de Walton.
- En bloc Coloration à l’aspartate de Walton3:
- Préparer 30 mM de solution d’acide L-aspartique dansddH2O.
REMARQUE: L’acide aspartique se dissout plus rapidement si le pH est élevé à 3,8. Cette solution mère est stable pendant 1-2 mois si elle est réfrigérée. - Faire 20 mM de solution de nitrate de plomb dans 10 mL de stock d’acide aspartique et ajuster le pH à 5,5 avec 1 N KOH.
- Placer les échantillons dans une solution d’aspartate de plomb à 60 °C pendant 30 min, après cinq lavages avecddH2Oà TA, chacun pendant 3 min.
- Préparer 30 mM de solution d’acide L-aspartique dansddH2O.
- Déshydrater les échantillons avec une série d’éthanol gradué. Utilisez la déshydratation chimique par le protocoleValdivia 18.
- Laver les échantillons dans chacune des solutions suivantes pour déshydrater progressivement l’échantillon (Figure 6B) :
25% d’alcool éthylique pendant 3 min
50% d’alcool éthylique pendant 3 min
75% d’alcool éthylique pendant 3 min
95% d’alcool éthylique pendant 3 min
100% alcool éthylique pendant 10 min, et répéter l’étape deux fois (total de trois lavages).
- Laver les échantillons dans chacune des solutions suivantes pour déshydrater progressivement l’échantillon (Figure 6B) :
- Lavez les échantillons à 100% d’oxyde de propylène (PO) pendant 10 minutes et répétez l’étape deux fois (total de trois lavages).
- Incuber dans 50%/50% PO/résine avec l’activateur DMP 30 pendant la nuit à RT, et intégrer dans 100% Araldite 502/embed 812/DDSA avec l’activateur DMP30 pendant 48 h.
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Representative Results
Les données sont généralement présentées comme le temps jusqu’à l’occlusion, ou le temps nécessaire pour former un thrombus complètement occlusif. Ces données peuvent être tracées sous la forme d’une courbe de survie de Kaplan-Meier (Figure 4A)19, d’un diagramme à points avec des barres montrant le flux sanguin terminal au moment de l’arrêt du flux sanguin ou de la fin d’une expérience (Figure 4B), ou sous forme de graphique linéaire (Figure 4C). La stabilité du thrombus peut être étudiée en utilisant cette technique. Dans la plupart des cas, lors d’une blessure FeCl3, le thrombus se forme progressivement, et à mesure qu’il grandit, le flux sanguin diminue progressivement, atteignant zéro lors de l’occlusion complète du vaisseau. Dans certains cas, le flux sanguin augmente soudainement après une diminution progressive pendant quelques minutes. Ceci est interprété comme une excrétion partielle du thrombus en croissance et peut être considéré comme un événement d’embolisation (Figure 4D). La morphologie du thrombus occlusif (Figure 7A) peut également être étudiée à l’aide de cette méthode.
Tableau 1 : Défis techniques potentiels dans le modèle et les solutions de thrombose induite par FeCl3. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.
Figure 1 : Instruments chirurgicaux nécessaires pour effectuer une thrombose de l’artère carotide induite par FeCl3 chez la souris. (A) 1 : microscope et support LEICA S8AP0. 2: Coussin chauffant pour petit animal recouvert de papier d’aluminium. (B) 1: Éponges de gaze. 2: 26 G x 3/8 aiguille. 3: Seringue de 1 ml. 4: Applicateurs stériles à embout de coton. 5: Suture de soie tressée noire. 6: Lame chirurgicale. 7: Manche de couteau en acier inoxydable. 8: Crème dépilatoire commerciale. 9: Poinçon d’oreille. 10: Disséquer les ciseaux. 11: Ciseaux fins. 12: Pinces chirurgicales. 13: Micro pince à dissection. 14: Pinces pour les yeux. 15: Pinces attachantes de suture. (C) Sonde d’écoulement transsonique avec la région flexible (flèche rouge) et une encoche qui maintient un récipient (flèche noire). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Étapes chirurgicales pour préparer l’artère carotide aux blessures et mesurer l’occlusion des vaisseaux. À l’aide de ciseaux et de pinces chirurgicales, faites une section médiane et retirez doucement le tissu (A) pour exposer l’artère carotide située en dessous (B). La flèche noire indique la direction du flux sanguin (B). Nettoyez le tissu environnant entourant l’artère carotide (C) et placez un morceau de papier plastique (plastique jaune représenté par une flèche noire) et la sonde (D). Endommager le vaisseau en plaçant du papier filtre imbibé de FeCl3 (représenté par une flèche rouge) sur l’artère (E). Retirez le papier et surveillez la blessure. À la fin, la blessure est visible sous la forme d’une traînée jaune-blanc, indiquée par la pointe de flèche bleue (F). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Lecture du débit sanguin à l’aide du débitmètre. Le débit sanguin dans l’artère carotide est mesuré à l’aide d’un débitmètre (A). Le flux est enregistré à l’aide d’une fonction d’enregistrement dans l’onglet Fichier (B). Le débit de base doit être relativement constant avant de subir la blessure (environ 0,8 mL/min, indiqué par une flèche noire) (B). Après la blessure, le flux sanguin diminue uniformément (diminution d’environ 50% par rapport à la valeur initiale, environ 0,4 mL / min), indiquée par une flèche noire (C). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Présentations de données représentatives du modèle de lésion carotidienne induite par FeCl3. Diverses méthodes disponibles pour présenter les données sur les lésions vasculaires induites par FeCl3 sont présentées. Les courbes de survie de Kaplan-Meier montrent le temps d’occlusion pour chaque souris. Un test log-rank est effectué pour l’analyse statistique. p ≤ 0,001 (A). Le flux sanguin à la fin de l’expérience pourrait également être représenté dans un graphique à barres (B). Pour les données représentées en B, un test t non apparié a été effectué *** p ≤ 0,001. La barre d’erreur représente la moyenne ± écart-type. Les données de débit Doppler recueillies après une blessure sur un seul animal pourraient être présentées dans un graphique linéaire (C). Exemple d’un événement d’embolisation potentiel par l’augmentation soudaine du flux sanguin après une diminution progressive soutenue du débit chez une seule souris à différents points temporels (D). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Collecte de caillots de lésions induits par FeCl3 pour les études de microscopie électronique. Après avoir exposé une artère (A), marquer le site de la blessure en attachant lâchement les fils (B) et placer le papier plastique sous l’artère et la sonde en aval de celle-ci (C). Effectuer la blessure et surveiller les dommages (D). Prélevez le tissu comme expliqué dans le texte, et nettoyez et coupez l’échantillon directement d’un côté et oblique de l’autre côté pour montrer la direction du flux sanguin (la flèche noire indique la direction du flux sanguin et le contour rouge indique la région blessée) (E). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 6 : Traitement post-fixation et montage d’échantillons pour la microscopie électronique. Les échantillons sont lavés dans des tubes microcentrifugés entre les étapes de traitement (A) et déshydratés en série avec une concentration accrue d’éthanol (B). Après traitement, ils sont incorporés dans de la résine (C), et les blocs sont marqués avec la direction du flux sanguin (D), puis coupés en tranches pour l’imagerie. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 7 : Micrographies électroniques représentatives des régions proximales et distales d’un thrombus entièrement occlusif après une lésion carotidienne médiée par FeCl3. (A) Une coupe transversale complète d’une artère obstruée, proximale au site de la blessure, avec des encarts en dessous, montrant des structures à grossissement plus élevé (a: 2x et a': 4x). La zone blessée est indiquée par une flèche en A. Barre d’échelle: 100 μm. (B) Coupe transversale complète d’une artère obstruée, distale au site de la lésion, avec des encarts en dessous, montrant des structures à grossissement plus élevé (b: 2x et b': 4x). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Tableau supplémentaire 1 : Brève étude des variations dans les modèles animaux, le site de lésion de FeCl 3, la concentration de FeCl3, la méthode de blessure et les temps de thrombose. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
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Discussion
L’application topique de FeCl3 au système vasculaire pour induire la thrombose est une technique largement utilisée et a joué un rôle déterminant dans l’établissement des rôles de divers récepteurs plaquettaires, des voies de signalisation des ligands et de leurs inhibiteurs20,21,22,23. Le mécanisme par lequel FeCl3 provoque la thrombose est multiforme; Auparavant, la dénudation endothéliale était considérée comme une cause de thrombose, mais ces dernières années, de nombreux rapports ont suggéré le rôle des globules rouges et des protéines plasmatiques dans ce processus24,25,26,27.
Les étapes les plus critiques de ce protocole sont: le placement de la sonde Doppler pour obtenir un débit optimal, le placement du papier filtre et la fin rapide de la blessure pour récupérer et fixer immédiatement l’échantillon. Les conséquences des incidents survenus à ces étapes et la façon d’y remédier sont décrites dans le tableau 1. Bien que simple et sensible, cette technique peut être difficile à utiliser, selon le modèle animal, le contexte animal, le site de la lésion vasculaire, la concentration de FeCl 3, la méthode d’application de FeCl3, la durée d’application, l’âge et le sexe de l’animal et le type d’anesthésie utilisé. Ces différences peuvent expliquer la plage relativement large de temps de thrombose chez C57BL/6J rapportée dans la littérature (tableau supplémentaire 1)27,28,29,30,31,32. Ce protocole propose d’utiliser des souris âgées de 8 à 10 semaines pour l’expérience, car la taille du système vasculaire est plus facile à visualiser et à surgeriser. Certains groupes ont utilisé des souris aussi jeunes que 6 semaines33. Il est impératif de faire correspondre l’âge des souris pour une comparaison cohérente et reproductible entre divers groupes d’animaux. L’anesthésie décrite, le tribromoéthanol, est préférée parce qu’elle est facilement disponible, plus facile à administrer, elle maintient un plan anesthésique pendant la durée requise et la posologie requise est reproductible. De nombreuses autres options anesthésiques sont disponibles, y compris l’isoflurane et diverses combinaisons de tribromoéthanol avec de l’alcool amylique tertiaire avec de la xylazine et / ou de l’acépromazine. Il est impératif d’utiliser une dose optimale pour obtenir une sédation sans affecter négativement la fréquence cardiaque ou la pression artérielle de l’animal. L’utilisation de la même méthode d’anesthésie tout au long de l’expérience empêche les effets cumulatifs potentiels sur le temps de thrombose.
Ce manuscrit présente une procédure détaillée pour minimiser les variations de données et augmenter la reproductibilité. Un tableau est fourni pour résoudre quelques problèmes qui peuvent survenir lors de cette chirurgie (tableau 1). De plus, ce manuscrit propose une méthode pour prélever des échantillons à la fin d’une blessure afin d’étudier la structure et la morphologie d’un thrombus occlusif (Figure 7). La résolution de l’EM offre une meilleure visualisation que ce qui était auparavant possible25 des plaquettes dans un thombus en croissance, et comment elles interagissent avec d’autres plaquettes et l’endothélium à la fois proximal et distal de la lésion vasculaire. Il peut également être utilisé pour étudier divers stades d’activation des plaquettes sur le site de la blessure.
Un autre avantage important de cette technique est que l’opérateur peut utiliser les lectures de base pour décider à quel stade l’échantillon de thrombus est collecté. Il convient de noter qu’il s’agit de moments approximatifs et n’indiquent pas l’étendue exacte de la blessure / thrombose. Les lectures basales dépendent de l’emplacement optimal de la sonde et, si elles ne sont pas placées correctement, les lectures peuvent n’enregistrer qu’un flux partiel. Cela conduit à une mauvaise interprétation du temps de terminaison et donc de la morphologie de l’échantillon collecté. L’arrêt rapide du processus de blessure et la fixation immédiate des échantillons sont nécessaires pour obtenir des résultats cohérents et reproductibles.
Ce protocole présente les paramètres minimaux requis pour l’évaluation de la thrombose occlusive. Avec les progrès de la microscopie, plusieurs groupes ont utilisé cette technique pour marquer par fluorescence les plaquettes/cellules endothéliales et/ou le relâchement plaquettaire, comme PF4 et P-Sélectine et fibrine, pour visualiser des aspects spécifiques de la thrombose in vivo et pour déterminer sa cinétique34,35. Comme décrit, la méthode ici peut rendre compte des événements d’embolisation, qui indiquent une instabilité du thrombus (Figure 4D).
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Disclosures
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts lié à cette étude.
Profils ORCID : S.J. : 0000-0001-6925-2116; S.W.W.: 00000-0001-5577-0473.
Acknowledgments
Les auteurs remercient les membres du Laboratoire Whiteheart pour leur lecture attentive de ce manuscrit. Le travail a été soutenu par des subventions du NIH, NHLBI (HL56652, HL138179 et HL150818), et une bourse du mérite du ministère des Anciens Combattants à S.W.W., R01 HL 155519 à B.S., et une subvention du programme intra-muros NIBIB à R.D.L.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% Saline | Fisher Scientific | BP358-212 | NaCl used to make a solution of 0.9% saline |
| 1 mL Syringe | Becton, Dickinson and Company | 309659 | |
| 190 Proof Ethanol | KOPTEC | V1101 | Used to make a 70% ethanol solution to use for prepping the mouse for surgery |
| 2,2,2 Tribromoethanol | Sigma Aldrich | 48402 | |
| 25 Yard Black Braided Silk Suture (5-0) | DEKNATEL | 136082-1204 | |
| 26G x 3/8 Needle | Becton, Dickinson and Company | 305110 | |
| 2-methyl-2-butanol | Sigma Aldrich | 240486 | |
| 7.5 mL Transfer Pipet, Graduated to 3 mL | Globe Scientific Inc. | 135010 | |
| Alcohol Prep Pads (70% Isopropyl Alcohol) | Medline | MDS090735 | |
| Araldite GY 502 | Electron microscopy Services | 10900 | |
| Cell Culture Dish 35mm X 10mm | Corning Incorporated | 430165 | |
| Compact Scale | Ward's Science | 470314-390 | |
| Dissecting Scissors, 12.5 cm long | World Precision Instrument | 15922-G | |
| DMP-30 activator | Electron microscopy Services | 13600 | |
| Dodenyl Succinic Anhydride/ DDSA | Electron microscopy Services | 13700 | |
| Doggy Poo Bags/animal carcass disposal bag | Crown Products | PP-RB-200 | |
| Doppler FlowProbe | Transonic Systems Inc. | MA0.5PSB | |
| EMBED 812 resin | Electron microscopy Services | 14900 | |
| Ethyl Alcohol, anhydrous 200 proof | Electron microscopy Services | 15055 | |
| Eye Dressing Forceps, 4" Full Curved, Standard, 0.8mm Wide Tips | Integra Miltex | 18-784 | |
| Filter Paper | VWR | 28310-106 | |
| Fine Scissors - Sharp-Blunt | Fine Science Tools | 14028-10 | |
| Finger Loop Ear Punches | Fine Science Tools | 24212-01 | |
| Gauze Sponges 2” x 2” – 12 Ply | Dukal Corporation | 2128 | |
| Glutaraldehyde (10% solution) | Electron microscopy Services | 16120 | |
| Integra Miltex Carbon Steel Surgical Blade #10 | Integra® Miltex® | 4110 | |
| Iron (III) Chloride | SIGMA-ALDRICH | 157740-100G | |
| Knife Handle Miltex® Extra Fine Stainless Steel Size 3 | Integra Lifesciences | 157510 | |
| L-aspartic acid | Sigma Fisher | A93100 | |
| L-aspartic acid | Fisher Scientific | BP374-100 | |
| Lead Nitrate | Fisher Scientific | L-62 | |
| LEICA S8AP0 Microscope | LEICA | No longer available | No longer available from the company |
| LEICA S8AP0 Microscope Stand | LEICA | 10447255 | No longer available from the company |
| Light-Duty Tissue Wipers | VWR | 82003-822 | |
| Micro Dissecting Forceps; 1x2 Teeth, Full Curve; 0.8 mm Tip Width; 4" Length | Roboz Surgical Instrument Company | RS-5157 | |
| Osmium Tetroxide 4% aqueous solution | Electron microscopy Services | 19150 | |
| Paraformaldehyde (16% solution) | Electron microscopy Services | 15710 | |
| Potassium ferricyanide | SIGMA-ALDRICH | P-8131 | |
| Propylene Oxide, ACS reagent | Electron microscopy Services | 20401 | |
| Rainin Classic Pipette PR-10 | Rainin | 17008649 | |
| Research Flowmeter | Transonic Systems Inc. | T402B01481 | Model: T402 |
| Scotch Magic Invisible Tape, 3/4" x 1000", Clear | Scotch | 305289 | |
| Small Animal Heated Pad | K&H Manufacturing Inc. | Model: HM10 | |
| Sodium Cacodylate Buffer 0.2M, pH7.4 | Electron microscopy Services | 11623 | |
| Sterile Cotton Tipped Applicators | Puritan Medical Products | 25-806 1WC | |
| Steromaster Illuminator | Fisher Scientific | 12-562-21 | No longer available from the company |
| Surgical Dumont #7 Forceps | Fine Science Tools | 11271-30 | |
| Thiocarbohydrazide (TCH) | SIGMA-ALDRICH | 88535 | |
| Universal Low Retention Pipet Tip Reloads (0.1-10 µL) | VWR | 76323-394 | |
| Uranyl Acetate | Electron microscopy Services | 22400 | |
| Veet Gel Cream Hair Remover | Reckitt Benckiser | 3116875 | |
| White Antistatic Hexagonal Weigh Boats, Medium, 64 x 15 x 19 mm | Fisher Scientific | S38975 | |
| WinDAQ/100 Software for Windows | DATAQ Instruments, Inc. | Version 3.38 | Freely available to download. https://www.dataq.com/products/windaq/ |
| ZEISS AxioCam Icc 1 | ZEISS | 57615 |
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