Summary
Il presente protocollo descrive come utilizzare una lesione mediata da FeCl3 per indurre trombosi arteriosa e come raccogliere e preparare campioni di lesioni arteriose nelle varie fasi della trombosi per l'analisi al microscopio elettronico.
Abstract
Le malattie cardiovascolari sono una delle principali cause di mortalità e morbilità in tutto il mondo. La trombosi aberrante è una caratteristica comune di condizioni sistemiche come il diabete e l'obesità e malattie infiammatorie croniche come l'aterosclerosi, il cancro e le malattie autoimmuni. In caso di lesione vascolare, di solito il sistema di coagulazione, le piastrine e l'endotelio agiscono in modo orchestrato per prevenire il sanguinamento formando un coagulo nel sito della lesione. Le anomalie in questo processo portano a sanguinamento eccessivo o trombosi incontrollata / insufficiente attività antitrombotica, che si traduce in occlusione dei vasi e sue sequele. Il modello di danno carotidea indotto da FeCl3 è uno strumento prezioso per sondare come la trombosi inizia e progredisce in vivo. Questo modello comporta danni endoteliali / denudazione e successiva formazione di coaguli nel sito danneggiato. Fornisce un test quantitativo altamente sensibile per monitorare il danno vascolare e la formazione di coaguli in risposta a diversi gradi di danno vascolare. Una volta ottimizzata, questa tecnica standard può essere utilizzata per studiare i meccanismi molecolari alla base della trombosi, nonché i cambiamenti ultrastrutturali nelle piastrine in un trombo in crescita. Questo test è utile anche per studiare l'efficacia degli agenti antitrombotici e antipiastrinici. Questo articolo spiega come avviare e monitorare la trombosi arteriosa indotta da FeCl3 e come raccogliere campioni per l'analisi mediante microscopia elettronica.
Introduction
La trombosi è la formazione di un coagulo di sangue che blocca parzialmente o completamente un vaso sanguigno, impedendo il flusso naturale del sangue. Ciò porta a eventi cardiovascolari gravi e fatali, come cardiopatia ischemica e ictus. Le malattie cardiovascolari sono la principale causa di morbilità e mortalità e causano un decesso su quattro in tutto il mondo 1,2,3. Sebbene la trombosi si manifesti come un malfunzionamento del sistema vascolare, potrebbe essere il risultato di un'infezione microbica o virale sottostante, di un disturbo immunitario, di un tumore maligno o di una condizione metabolica. Il flusso di sangue è mantenuto dalla complessa interazione tra diversi componenti del sistema vascolare, tra cui cellule endoteliali, globuli rossi / bianchi, piastrine e fattori della coagulazione4. In caso di danno vascolare, le piastrine interagiscono con le proteine adesive sulla matrice subendoteliale e rilasciano il loro contenuto granulare, che recluta più piastrine5. Contemporaneamente, viene attivata la cascata della coagulazione, portando alla formazione e alla deposizione di fibrina. In definitiva, si forma un coagulo, contenente piastrine e globuli rossi intrappolati all'interno di una maglia di fibrina6. Sebbene siano disponibili farmaci antiaggreganti piastrinici e anticoagulanti per modulare la trombosi, il sanguinamento spurio rimane una delle principali preoccupazioni con queste terapie, che richiedono la messa a punto dei dosaggi e delle combinazioni di questi farmaci. Pertanto, vi è ancora un urgente bisogno di scoprire nuovi farmaci antitrombotici7.
La trombosi viene studiata utilizzando diversi metodi per infliggere lesioni vascolari: lesioni meccaniche (legatura dei vasi), termiche (lesioni laser) e chimiche (applicazione FeCl3 / Rose Bengal). La natura della trombosi varia a seconda della posizione (arteriosa vs venosa), del metodo o dell'estensione della lesione. Tra tutti questi tipi, il danno vascolare indotto da FeCl3 è il metodo più utilizzato. È stato impiegato in topi, ratti, conigli, porcellini d'India e cani 8,9,10,11,12. Il metodo è relativamente semplice, facile da usare e, se i parametri principali sono standardizzati, è sensibile e riproducibile in vari sistemi vascolari (ad esempio, arterie [carotide e femorale], vene [giugulare] e arteriole [cremaster e mesenterico]) (Tabella supplementare 1).
Questo modello può anche essere utilizzato per approfondire la nostra comprensione della meccanica e della morfologia della formazione dei coaguli. Questa tecnica offre unicamente il vantaggio di fermare la trombosi in vari punti di portata, per studiare le fasi intermedie del processo prima che diventi occlusivo. I recenti progressi nella ricerca sulla trombosi hanno utilizzato questo modello per focalizzare l'attenzione su metodi non farmacologici di trombolisi13 o somministrazione non invasiva di agenti antitrombotici e/o fibrinolitici14,15. Diversi gruppi hanno dimostrato che, quando le membrane piastriniche sono rivestite con queste terapie, i farmaci possono essere attivati dopo stimolazione termica per colpire i coaguli16. Le tecniche qui descritte possono essere utili per studi come la convalida dei loro risultati a livello piastrinico singolo. In questo manoscritto, il Protocollo 1 descrive la procedura di base di danno vascolare mediata da FeCl3, mentre il Protocollo 2 descrive il metodo per raccogliere e fissare il campione di danno vascolare per ulteriori analisi mediante microscopia elettronica.
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Protocol
Tutti gli esperimenti discussi qui sono stati esaminati e approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) presso l'Università del Kentucky.
NOTA: Gli strumenti chirurgici sono elencati nella Figura 1 e nella Tabella dei materiali. Sono stati utilizzati topi C57BL/6J, di 8-10 settimane, ceppi maschi/femmine o rilevanti geneticamente manipolati (Knockout o Knockin).
1. Lesione dell'arteria carotide indotta da FeCl3
- Induzione dell'anestesia del topo
- Pesare il mouse.
- Anestetizzare il topo iniettando 0,2 g/kg di soluzione di tribromoetanolo per via intraperitoneale (i.p.). Assicurarsi che la soluzione anestetica sia a temperatura ambiente (RT) prima di iniettarla. Questa dose è sufficiente per sedare il topo per circa 1 ora.
- Controllare il riflesso della punta pizzicando la punta 5 minuti dopo l'iniezione per assicurarsi che il mouse sia sedato. Se il topo non è sedato, tirerà via la punta del piede. Se ciò accade, attendere 5 minuti e controllare di nuovo.
- Se il topo non è ancora completamente sedato, somministrare 1/4 della dose iniziale e attendere 5 minuti.
- Durante la procedura, monitorare periodicamente il piano anestetico del mouse tramite un pizzico di punta. Inoltre, la frequenza respiratoria e la temperatura corporea potrebbero anche essere monitorate per mantenere un'anestesia ottimale.
- Immobilizzare il mouse
- Appoggiare il mouse sul termoforo (37 °C) in posizione supina e utilizzare del nastro adesivo per immobilizzare le estremità.
- Utilizzare un filo chirurgico (0,1 mm) per tirare delicatamente i denti anteriori superiori del mouse per estendere la regione cervicale / collo. Questo è importante per una migliore visualizzazione dell'area chirurgica e la stabilità della sonda Doppler. La dimensione del filo non è importante, in quanto viene utilizzata solo per tirare i denti anteriori dell'animale per estendere il collo.
- Incisione
- Spruzzare l'area chirurgica con etanolo al 70% o pulirla con una salvietta imbevuta di alcool.
- Utilizzando un batuffolo di cotone, applicare una piccola quantità di crema depilatoria sulla zona chirurgica. Attendere 1-2 minuti e quindi utilizzare un tovagliolo di carta bagnato o un fazzoletto per rimuovere la crema.
NOTA: questo passaggio è importante per un'area chirurgica pulita. - Usando forbici e pinze (Figura 1B11,1B13), praticare un'incisione mediana dalla mandibola alla tacca soprasternale. Ritrarre la pelle per ottenere una migliore visualizzazione dell'area (Figura 2A).
- Esposizione all'arteria carotide
- Utilizzando una pinza chirurgica e una pinza micro dissecante, sezionare la fascia superficiale sovrapposta e rimuoverla per esporre l'arteria carotide sinistra (Figura 1B12,1B13). Assicurati di non usare le forbici in questa fase per evitare di ferire altre vascolarizzature in quest'area.
- Rimuovere il tessuto extra che circonda l'arteria carotide. Evitare un'eccessiva dissezione del tessuto circostante, poiché quest'area ospita il nervo vago e l'arteria vertebrale.
- Separare l'arteria carotide dal tessuto circostante sezionandola con pinze chirurgiche e di sutura (Figura 1B12,1B15,2C). Assicurarsi di non estendere o tirare l'arteria per evitare lesioni meccaniche all'arteria o alla vascolarizzazione circostante.
- Posizionare un pezzo di plastica sotto l'arteria per contrassegnare la posizione della lesione (Figura 2D). Utilizzare un foglio di trasparenza colorato per rendere più facile la visione in campo chirurgico.
- Posizionamento della sonda di flusso
- Posizionare la sonda a flusso transonico Doppler in soluzione salina (0,9% NaCl in dH2O) per circa 10 minuti prima dell'intervento. Inserire l'altra estremità della sonda in un attacco nel flussometro per facilitare la lettura del flusso. Collegare il misuratore di portata a un computer.
NOTA: Tra un intervento chirurgico e l'altro, la sonda a flusso transonico Doppler deve essere in soluzione salina. Assicurarsi di mantenere la sonda umida e pulita durante tutta la procedura. - Posizionare la sonda a flusso transonico Doppler ad ultrasuoni attorno all'arteria a monte della plastica (Figura 2D). Assicurarsi che la regione del portavasi della sonda non sia troppo estesa (Figura 1C, freccia rossa).
NOTA: Se necessario, sostenere la sonda con garze pad (Figura 1B1) per ottenere un'altezza appropriata della sonda, facilitando la posizione di lettura ottimale. - Se l'area chirurgica è asciutta a questo punto, aggiungere alcune gocce di soluzione salina RT per mantenere l'area umida. Monitorare la lettura della sonda di flusso. La lettura ottimale varia per ogni animale e potrebbe essere compresa tra 0,6-1,2 ml / min. Se è inferiore o non stabile, modificare la posizione della sonda di flusso per ottenere una lettura ottimale.
NOTA: Assicurarsi che il collo del mouse non sia troppo esteso e che l'area chirurgica sia pulita.
- Posizionare la sonda a flusso transonico Doppler in soluzione salina (0,9% NaCl in dH2O) per circa 10 minuti prima dell'intervento. Inserire l'altra estremità della sonda in un attacco nel flussometro per facilitare la lettura del flusso. Collegare il misuratore di portata a un computer.
- Registrare la linea di base del flusso
- Dopo aver posizionato la sonda, monitorare il flusso sanguigno per 2 minuti per assicurarsi che il flusso sia costante. Quindi, registrare il flusso per 2 minuti (Figura 3B) come linea di base. Per una descrizione dettagliata del flussometro, fare riferimento a Subramaniam et al.17.
- Per registrare il flusso sanguigno, avviare il software WinDAQ. Fare clic sull'opzione File e quindi fare clic su Registra. Crea una nuova cartella e un nuovo file e inizia a registrare. Per interrompere la registrazione, fare clic su Stop nella sezione file.
NOTA: il software WinDAQ è disponibile gratuitamente presso l'editore: https://www.dataq.com/products/windaq/.
- Ferita
- Interrompere la registrazione del flusso. Assicurarsi di non alterare la posizione della sonda in modo che le letture rimangano coerenti dopo l'infortunio.
- Asciugare accuratamente l'area con una salvietta/tovagliolo di carta.
NOTA: Anche un piccolo volume di liquido residuo può alterare la concentrazione della soluzione di FeCl3 utilizzata per infliggere lesioni vascolari. Ciò porta a risultati variabili e influisce sulla riproducibilità. Quando l'area è completamente asciutta, la sonda non è in grado di misurare il flusso. - In una barca di pesatura di plastica, mettere una carta da filtro circolare (diametro 1 mm, tagliata con un pugno auricolare di 1 mm di diametro). Aggiungere 1 μL di soluzione al 6% di FeCl3 (prodotta in dH2O) sulla carta da filtro.
NOTA: Assicurarsi di aggiungere la soluzione FeCl3 appena prima di utilizzare la carta da filtro. Immergere la carta troppo presto può portare all'evaporazione della soluzione di FeCl3 e modificare la gravità della lesione. - Utilizzando una pinza fine, raccogliere la carta da filtro e metterla sull'arteria a monte della sonda, sulla parte dell'arteria segnata dalla plastica (Figura 2D,E). Questa plastica funge da marcatore e distanziatore. Segna l'area lesa e previene la diluizione accidentale del FeCl3 evitando il contatto con l'area umida circostante.
NOTA: assicurarsi che la carta da filtro sia dritta, non pizzicata o piegata in altro modo. Una volta posizionato sull'arteria, non modificare la posizione della carta da filtro; Ciò modifica l'entità della lesione. - Dopo aver posizionato la carta da filtro, avviare il timer e registrare il flusso sanguigno. Dopo 3 minuti, rimuovere la carta e aggiungere soluzione salina nel sito della lesione per rimuovere il FeCl3 e interrompere il processo di lesione. Rende anche l'area umida. In questa fase, il flusso sanguigno dovrebbe tornare al livello basale, come registrato prima dell'infortunio.
- Monitora e registra il flusso fino a quando non si riduce al 10% della registrazione originale o raggiunge lo zero. C'è una diminuzione costante una volta che il trombo inizia a formarsi nel sito della lesione (Figura 3C). Notare eventuali fluttuazioni significative nel flusso durante questo periodo.
- Per studiare la stabilità del trombo, registrare il rapido aumento del flusso sanguigno dopo ogni diminuzione significativa e coerente. Questi eventi sono classificati come embolizzazione dovuta a trombosi instabile (Figura 4D). Dopo la costante diminuzione del flusso, l'operatore è in grado di vedere la lesione sull'arteria al termine dell'esperimento (Figura 2F, freccia blu / ovale tratteggiato).
- Il tempo di occlusione vascolare è definito come la completa cessazione del flusso sanguigno per almeno 1 minuto. Registrare il momento in cui si forma un trombo occlusivo, come mostrato dalla lettura zero o da una significativa diminuzione del flusso.
- Terminare l'esperimento a 30 min. Se il trombo non si forma entro 30 minuti dal monitoraggio, registrare il flusso, interrompere la registrazione e rimuovere la sonda.
- Pulire la sonda con etanolo al 70% e una spazzola per rimuovere eventuali residui di tessuto / capelli o detriti. Asciugare completamente la sonda prima di riporla nella confezione. Asciugare completamente la sonda prima di riporla nella scatola per la conservazione a lungo termine.
- Eutanasia del topo per dislocazione cervicale. Posizionare la carcassa nel sacchetto di smaltimento della carcassa, etichettato con il nome del laboratorio e la data.
2. Raccolta e preparazione di campioni per studi di microscopia elettronica a scansione facciale a blocchi seriali (SBF-SEM) dopo la lesione indotta da FeCl3
NOTA: Il protocollo EM presentato è appropriato per la preparazione del campione per SBF-SEM. Questa tecnica di imaging offre una capacità senza precedenti di studiare la struttura tridimensionale delle piastrine in un coagulo. Con questa tecnica, il campione viene visualizzato come una serie di immagini SEM a blocchi sequenziali, generate man mano che si procede attraverso il campione. I punti chiave per questa preparazione sono: 1) il campione deve essere colorato con metalli pesanti pre-incorporati; e 2) il campione incorporato in plastica deve essere tagliato in modo appropriato per il montaggio all'interno del SEM (vedere la Figura 6 per una visualizzazione dei campioni rifilati). La colorazione post-incorporamento non è possibile all'interno del SEM. Quando si raccoglie un campione da una lesione vascolare indotta da FeCl3 per l'analisi EM, è necessario apportare le seguenti modifiche durante l'esecuzione dell'intervento chirurgico. Le modifiche nel protocollo chirurgico FeCl3 presentato sono applicabili anche a qualsiasi forma di microscopia elettronica. Le condizioni di anestesia e i passaggi per fare un'incisione ed esporre l'arteria carotide sono gli stessi del protocollo 1.
- Dopo aver esposto l'arteria carotide, contrassegnare il sito della lesione circondando liberamente la regione tra due fili chirurgici (dimensioni: 0,1 mm) (Figura 5A,B).
- Posizionare la sonda sotto l'arteria, distale dal filo inferiore (Figura 5C).
- Inserire il pezzo di plastica sotto l'arteria tra i due fili per contrassegnare il sito per la lesione FeCl3 (Figura 5C).
- Effettuare misurazioni del flusso prima di eseguire lesioni per annotare il flusso basale. Queste misurazioni vengono utilizzate per decidere in quale fase verrà raccolto il campione.
NOTA: Assicurarsi che il fissativo (3% paraformaldeide / PFA + 0,1% glutaraldeide, entrambi realizzati in 1x PBS) sia pronto e a RT. In alternativa, potrebbe essere utilizzata anche la fissazione con glutaraldeide al 2,5% in uno sfondo salino.
ATTENZIONE: Sia la paraformaldeide che la glutaraldeide sono altamente tossiche e irritanti. Durante la manipolazione, guanti, una visiera e maschere devono essere utilizzati per proteggere dall'esposizione. Tutte le soluzioni fissative sono tossiche e le fasi di fissazione devono essere eseguite in una cappa aspirante. - Eseguire la lesione posizionando carta da filtro imbevuta di FeCl 3 sull'arteria (viene utilizzato l'8% di FeCl 3) per3 minuti (anche questa volta potrebbe variare). Dopo 3 minuti, rimuovere la carta da filtro e aggiungere soluzione salina nel sito della lesione per rimuovere eventuali residui di FeCl3 in eccesso. Questo passaggio è necessario per prevenire l'entità variabile della lesione e per facilitare il conteggio del flusso da parte della sonda (Figura 5D).
- Monitorare la lettura del flusso. Quando il flusso scende al di sotto del 50% del valore iniziale, rimuovere la sonda. Asciugare rapidamente l'area e aggiungere il fissativo nell'area per fissare esternamente l'area della lesione.
- Tenere prontamente l'arteria vicino all'area della lesione con una pinza e tagliare a valle del filo inferiore e a monte del filo superiore. Se necessario, chiedi a un'altra persona di aiutarti a tagliare un'estremità. Metti il tessuto sul piatto di coltura di tessuto di plastica nello stesso orientamento in cui è stato raccolto e aggiungi alcune gocce del fissativo.
NOTA: Il taglio dell'arteria provoca un sanguinamento esteso immediato, quindi assicurati di tenere l'arteria prima di tagliarla la prima volta. In questo scenario, il mouse è dissanguato. Il topo viene eutanasia per dissanguamento e dislocazione cervicale. - Usando un bisturi, pulire il tessuto extra intorno all'arteria. Fai attenzione a registrare l'orientamento del flusso sanguigno. Per marcare ciò, tagliare un'estremità orizzontalmente e l'altra affusolata/obliqua (Figura 5E).
- Conservare il campione in fissativo (3% PFA e 0,1% glutaraldeide) per 1 ora a RT. Quindi, conservare il campione in PFA all'1% a 4 °C fino a inviarlo su ghiaccio umido al laboratorio di lavorazione del campione per l'analisi EM.
NOTA: i campioni non devono essere congelati. Le sfide per questo metodo di raccolta dei campioni sono:- La lettura iniziale potrebbe non essere ottimale o potrebbe fluttuare dopo l'infortunio. Ciò può influire sull'entità della lesione che viene scelta per l'arresto per l'analisi EM. Per risolvere questo problema, assicurarsi di registrare la lettura della linea di base per alcuni minuti, dopo aver provato varie posizioni di posizionamento della sonda per decidere quale posizione è ottimale.
- Il tempo per arrestare la lesione aggiungendo fissativo esterno e taglio effettivo della sezione arteriosa per l'analisi può aggiungere variabilità all'estensione della trombosi. Sii veloce durante la raccolta del campione dopo il fissaggio esterno.
- Ricevi i campioni per l'elaborazione per l'analisi EM in PFA all'1% su ghiaccio umido. Risciacquare i campioni per 3 minuti, su ghiaccio, con tampone di cacodilato da 0,1 M per avviare ulteriori elaborazioni.
- Fissare i campioni per 1 h su ghiaccio in tampone cacodilato 0,1 M + 2,5% glutaraldeide + 2 mM CaCl2.
- Eliminare il fissativo e lavare i campioni con tampone freddo di cacodilato di sodio 0,1 M contenente 2 mM CaCl2 (5 x 3 min) (Figura 6A).
- Fissare i campioni con soluzione di osmio (ferrocianuro di potassio al 3% [K 4 C 6 N6Fe] +tampone cacodilato 0,3 M + 4 mM CaCl 2 miscelato con un volume uguale di tetrossido acquoso di osmio al 4% [OsO4; in ddH2 O]) per 1 ora su ghiaccio.
- Mentre i campioni si fissano, preparare una soluzione fresca di tricloroacetaldeide idrato (TCH) all'1% in ddH2O. Incubare la soluzione a 60 °C per 1 ora mescolando delicatamente.
- Dopo il fissaggio, lavare i campioni con ddH2O a RT per 5 x 3 minuti.
- Incubare i campioni in soluzione filtrata all'1% di TCH (prodotta in ddH2O) per 20 minuti a RT.
- Lavare i campioni con ddH2O a RT (5 x 3 min).
- Fissare i campioni in tetrossido di osmio al 2% in ddH2O per 30 minuti a RT.
- Lavare i campioni con ddH2O a RT per 5 x 3 minuti ciascuno.
- Porre i campioni in acetato di uranile all'1% (acquoso) e incubare per una notte a 4 °C.
- Lavare i campioni con ddH2O a RT per 5 x 3 minuti ciascuno e lavorarli con la colorazione in blocco dell'aspartato di piombo di Walton.
- In blocco Colorazione dell'aspartato di piombo di Walton3:
- Produrre 30 mM di soluzione di acido L-aspartico in ddH2O.
NOTA: L'acido aspartico si dissolve più rapidamente se il pH viene aumentato a 3,8. Questa soluzione madre è stabile per 1-2 mesi se refrigerata. - Produrre 20 mM di soluzione di nitrato di piombo in 10 mL di acido aspartico e regolare il pH a 5,5 con 1 N KOH.
- Porre i campioni in una soluzione di aspartato di piombo a 60 °C per 30 minuti, dopo cinque lavaggi con ddH2O a RT, ciascuno per 3 minuti.
- Produrre 30 mM di soluzione di acido L-aspartico in ddH2O.
- Disidratare i campioni con una serie di etanolo graduato. Utilizzare la disidratazione chimica secondo il protocollo Valdivia18.
- Lavare i campioni in ciascuna delle seguenti soluzioni per disidratare progressivamente il campione (Figura 6B):
Alcool etilico al 25% per 3 min
50% di alcol etilico per 3 min
Alcool etilico al 75% per 3 min
Alcool etilico al 95% per 3 min
Alcool etilico al 100% per 10 minuti e ripetere il passaggio due volte (totale di tre lavaggi).
- Lavare i campioni in ciascuna delle seguenti soluzioni per disidratare progressivamente il campione (Figura 6B):
- Lavare i campioni in ossido di propilene (PO) al 100% per 10 minuti e ripetere il passaggio due volte (totale di tre lavaggi).
- Incubare in 50%/50% PO/resina con attivatore DMP 30 durante la notte a RT e incorporare in Araldite 502/incorporare 100% Araldite 502/embed 812/DDSA con attivatore DMP30 per 48 ore.
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Representative Results
I dati sono generalmente presentati come tempo di occlusione, o tempo necessario per formare un trombo completamente occlusivo. Questi dati possono essere tracciati come una curva di sopravvivenza di Kaplan-Meier (Figura 4A)19, un dot plot con barre che mostrano il flusso sanguigno terminale al momento della cessazione del flusso sanguigno o della fine di un esperimento (Figura 4B), o come un grafico a linee (Figura 4C). La stabilità del trombo può essere studiata usando questa tecnica. Nella maggior parte dei casi, dopo la lesione FeCl3, il trombo si forma gradualmente, e man mano che cresce, il flusso sanguigno diminuisce progressivamente, raggiungendo lo zero dopo la completa occlusione del vaso. In alcuni casi, il flusso sanguigno aumenta improvvisamente dopo una graduale diminuzione per alcuni minuti. Questo è interpretato come spargimento parziale del trombo in crescita e può essere considerato come un evento di embolizzazione (Figura 4D). Anche la morfologia occlusiva dei trombo (Figura 7A) può essere studiata utilizzando questo metodo.
Tabella 1: Potenziali sfide tecniche nel modello e nelle soluzioni di trombosi indotta da FeCl3. Clicca qui per scaricare questa tabella.
Figura 1: Strumenti chirurgici necessari per eseguire la trombosi dell'arteria carotide indotta da FeCl3 nei topi. (A) 1: microscopio e supporto LEICA S8AP0. 2: Piccolo animale riscaldato pad coperto in foglio di alluminio. (B) 1: Spugne di garza. 2: 26 G x 3/8 ago. 3: siringa da 1 ml. 4: Applicatori sterili con punta in cotone. 5: Sutura di seta intrecciata nera. 6: Lama chirurgica. 7: Manico del coltello in acciaio inossidabile. 8: Crema depilatoria commerciale. 9: Pugno all'orecchio. 10: Dissezione delle forbici. 11: Forbici fini. 12: Pinza chirurgica. 13: Pinza da micro dissezione. 14: Pinza per la medicazione degli occhi. 15: Pinza per sutura. (C) Sonda di flusso transonica con la regione flessibile (freccia rossa) e una tacca che contiene un recipiente (freccia nera). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Fasi chirurgiche per preparare l'arteria carotide alla lesione e misurare l'occlusione dei vasi. Usando forbici e pinze chirurgiche, fare una sezione mediana e tirare delicatamente via il tessuto (A) per esporre l'arteria carotide sottostante (B). La freccia nera mostra la direzione del flusso sanguigno (B). Pulire il tessuto circostante che circonda l'arteria carotide (C) e posizionare un pezzo di carta di plastica (plastica gialla indicata da una freccia nera) e la sonda (D). Ferire la nave posizionando carta da filtro imbevuta di FeCl3 (mostrata da una freccia rossa) sull'arteria (E). Rimuovere la carta e monitorare la lesione. Alla fine, la ferita è visibile come una striscia giallo-bianca, indicata dalla punta della freccia blu (F). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Lettura del flusso sanguigno utilizzando il flussometro. Il flusso sanguigno nell'arteria carotide viene misurato utilizzando un misuratore di portata (A). Il flusso viene registrato utilizzando una funzione di registrazione nella scheda file (B). Il flusso basale deve essere relativamente costante prima di condurre la lesione (circa 0,8 ml/min, mostrato da una freccia nera) (B). Dopo l'infortunio, il flusso sanguigno diminuisce uniformemente (circa una diminuzione del 50% rispetto al valore iniziale, circa 0,4 ml / min), mostrato da una freccia nera (C). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Presentazioni di dati rappresentativi dal modello di danno carotidea indotto da FeCl3. Vengono mostrati vari metodi disponibili per presentare i dati del danno vascolare indotto da FeCl3. Le curve di sopravvivenza di Kaplan-Meier mostrano il tempo di occlusione per ogni topo. Viene eseguito un test log-rank per l'analisi statistica. p ≤ 0,001 (A). Il flusso sanguigno alla fine dell'esperimento potrebbe anche essere rappresentato in un grafico a barre (B). Per i dati rappresentati in B, è stato eseguito un test t non accoppiato *** p ≤ 0,001. La barra di errore rappresenta la media ± SD. I dati sul flusso Doppler raccolti dopo l'infortunio da un singolo animale potrebbero essere presentati in un grafico a linee (C). Esempio di un potenziale evento di embolizzazione dovuto all'improvviso aumento del flusso sanguigno dopo una diminuzione graduale sostenuta del flusso in un singolo topo in vari punti temporali (D). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 5: Raccolta di coaguli di lesioni indotte da FeCl3 per studi di microscopia elettronica. Dopo aver esposto un'arteria (A), contrassegnare il sito della lesione legando liberamente i fili (B) e posizionare la carta di plastica sotto l'arteria e la sonda a valle di essa (C). Eseguire la lesione e monitorare il danno (D). Raccogliere il tessuto come spiegato nel testo, pulire e tagliare il campione dritto su un lato e obliquo sull'altro lato per mostrare la direzione del flusso sanguigno (la freccia nera mostra la direzione del flusso sanguigno e il contorno rosso indica la regione lesa) (E). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 6: Elaborazione post-fissazione e montaggio di campioni per microscopia elettronica. I campioni vengono lavati in provette di microcentrifuga tra le fasi di lavorazione (A) e disidratati in serie con una maggiore concentrazione di etanolo (B). Dopo la lavorazione, vengono incorporati in resina (C) e i blocchi vengono contrassegnati con la direzione del flusso sanguigno (D) e quindi tagliati a fette per l'imaging. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 7: Micrografie elettroniche rappresentative delle regioni prossimali e distali di un trombo completamente occlusivo dopo lesione carotidea mediata da FeCl3. (A) Una sezione trasversale completa di un'arteria occlusa, prossimale al sito della lesione, con inserti sottostanti, che mostrano strutture a maggiore ingrandimento (a: 2x e a': 4x). L'area lesa è indicata con una freccia in A. Barra della scala: 100 μm. (B) Una sezione trasversale completa di un'arteria occlusa, distale al sito della lesione, con inserti sottostanti, che mostrano strutture a maggiore ingrandimento (b: 2x, e b': 4x). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Tabella supplementare 1: Una breve indagine delle variazioni nei modelli animali, nel sito di lesione FeCl 3, nella concentrazione di FeCl3, nel metodo di lesione e nei tempi di trombosi. Clicca qui per scaricare questo file.
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Discussion
L'applicazione topica di FeCl3 al sistema vascolare per indurre trombosi è una tecnica ampiamente utilizzata ed è stata determinante nello stabilire ruoli per vari recettori piastrinici, vie di segnalazione del ligando e loro inibitori20,21,22,23. Il meccanismo attraverso il quale FeCl3 provoca trombosi è sfaccettato; In precedenza, la denudazione endoteliale era considerata una causa di trombosi, tuttavia negli ultimi anni, più rapporti hanno suggerito il ruolo dei globuli rossi e delle proteine plasmatiche in questo processo24,25,26,27.
I passaggi più critici in questo protocollo sono: il posizionamento della sonda Doppler per ottenere un flusso ottimale, il posizionamento della carta da filtro e la pronta cessazione della lesione per recuperare e fissare immediatamente il campione. Le conseguenze degli incidenti in questi passaggi e come affrontarli sono descritti nella Tabella 1. Sebbene semplice e sensibile, questa tecnica può essere difficile da impiegare, a seconda del modello animale, del background animale, del sito di danno vascolare, della concentrazione di FeCl 3, del metodo di applicazione FeCl3, della durata dell'applicazione, dell'età e del sesso degli animali e del tipo di anestesia utilizzata. Queste differenze possono spiegare la gamma relativamente ampia di tempi di trombosi in C57BL/6J riportati in letteratura (Tabella supplementare 1)27,28,29,30,31,32. Questo protocollo propone di utilizzare topi di 8-10 settimane per l'esperimento, poiché la dimensione della vascolarizzazione è più facile da visualizzare e chirurgizzare. Alcuni gruppi hanno usato topi di 6 settimane33. È imperativo abbinare l'età dei topi per un confronto coerente e riproducibile tra i vari gruppi di animali. L'anestesia descritta, il tribromoetanolo, è preferita perché è facilmente disponibile, è più facile da somministrare, mantiene un piano anestetico per la durata richiesta e il dosaggio richiesto è riproducibile. Sono disponibili molte altre opzioni anestetiche, tra cui isoflurano e varie combinazioni di tribromoetanolo con alcol amilico terziario con xilazina e / o acepromazina. È imperativo utilizzare una dose ottimale per ottenere la sedazione senza influire negativamente sulla frequenza cardiaca o sulla pressione sanguigna dell'animale. L'uso dello stesso metodo di anestesia durante l'esperimento previene potenziali effetti composti sul tempo di trombosi.
Questo manoscritto presenta una procedura dettagliata per ridurre al minimo le variazioni dei dati e aumentare la riproducibilità. Viene fornita una tabella per risolvere alcuni problemi che possono sorgere durante questo intervento chirurgico (Tabella 1). Inoltre, questo manoscritto propone un metodo per raccogliere campioni alla fine della lesione per studiare la struttura e la morfologia di un trombo occlusivo (Figura 7). La risoluzione di EM offre una visualizzazione migliore di quanto fosse possibile in precedenza25 piastrine in un thombus in crescita, e come interagiscono con altre piastrine e l'endotelio sia prossimale che distale del danno vascolare. Può anche essere usato per studiare varie fasi di attivazione delle piastrine nel sito della lesione.
Un altro importante vantaggio di questa tecnica è che l'operatore può utilizzare le letture di base per decidere in quale fase viene raccolto il campione di trombo. Va notato che questi sono tempi approssimativi e non indicano l'esatta entità della lesione / trombosi. Le letture basali dipendono dal posizionamento ottimale della sonda e, se non posizionate correttamente, le letture possono registrare solo un flusso parziale. Ciò porta a un'interpretazione errata del tempo di terminazione e quindi della morfologia del campione raccolto. La rapida cessazione del processo di lesione e la fissazione immediata dei campioni sono necessarie per ottenere risultati coerenti e riproducibili.
Questo protocollo presenta le impostazioni minime richieste per la valutazione della trombosi occlusiva. Con i progressi della microscopia, diversi gruppi hanno utilizzato questa tecnica per marcare fluorescentmente le piastrine / cellule endoteliali e / o il relaasate piastrinico, come PF4 e P-Selectina e fibrina, per visualizzare aspetti specifici della trombosi in vivo e per determinarne la cinetica34,35. Come descritto, il metodo qui può riferire sugli eventi di embolizzazione, che indicano l'instabilità del trombo (Figura 4D).
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Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse relativi a questo studio.
Profili ORCID: S.J.: 0000-0001-6925-2116; S.W.W.: 00000-0001-5577-0473.
Acknowledgments
Gli autori ringraziano i membri del Whiteheart Laboratory per la loro attenta lettura di questo manoscritto. Il lavoro è stato supportato da sovvenzioni del NIH, NHLBI (HL56652, HL138179 e HL150818) e un Department of Veterans Affairs Merit Award a S.W.W., R01 HL 155519 a BS e NIBIB intramural program grant a R.D.L.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% Saline | Fisher Scientific | BP358-212 | NaCl used to make a solution of 0.9% saline |
| 1 mL Syringe | Becton, Dickinson and Company | 309659 | |
| 190 Proof Ethanol | KOPTEC | V1101 | Used to make a 70% ethanol solution to use for prepping the mouse for surgery |
| 2,2,2 Tribromoethanol | Sigma Aldrich | 48402 | |
| 25 Yard Black Braided Silk Suture (5-0) | DEKNATEL | 136082-1204 | |
| 26G x 3/8 Needle | Becton, Dickinson and Company | 305110 | |
| 2-methyl-2-butanol | Sigma Aldrich | 240486 | |
| 7.5 mL Transfer Pipet, Graduated to 3 mL | Globe Scientific Inc. | 135010 | |
| Alcohol Prep Pads (70% Isopropyl Alcohol) | Medline | MDS090735 | |
| Araldite GY 502 | Electron microscopy Services | 10900 | |
| Cell Culture Dish 35mm X 10mm | Corning Incorporated | 430165 | |
| Compact Scale | Ward's Science | 470314-390 | |
| Dissecting Scissors, 12.5 cm long | World Precision Instrument | 15922-G | |
| DMP-30 activator | Electron microscopy Services | 13600 | |
| Dodenyl Succinic Anhydride/ DDSA | Electron microscopy Services | 13700 | |
| Doggy Poo Bags/animal carcass disposal bag | Crown Products | PP-RB-200 | |
| Doppler FlowProbe | Transonic Systems Inc. | MA0.5PSB | |
| EMBED 812 resin | Electron microscopy Services | 14900 | |
| Ethyl Alcohol, anhydrous 200 proof | Electron microscopy Services | 15055 | |
| Eye Dressing Forceps, 4" Full Curved, Standard, 0.8mm Wide Tips | Integra Miltex | 18-784 | |
| Filter Paper | VWR | 28310-106 | |
| Fine Scissors - Sharp-Blunt | Fine Science Tools | 14028-10 | |
| Finger Loop Ear Punches | Fine Science Tools | 24212-01 | |
| Gauze Sponges 2” x 2” – 12 Ply | Dukal Corporation | 2128 | |
| Glutaraldehyde (10% solution) | Electron microscopy Services | 16120 | |
| Integra Miltex Carbon Steel Surgical Blade #10 | Integra® Miltex® | 4110 | |
| Iron (III) Chloride | SIGMA-ALDRICH | 157740-100G | |
| Knife Handle Miltex® Extra Fine Stainless Steel Size 3 | Integra Lifesciences | 157510 | |
| L-aspartic acid | Sigma Fisher | A93100 | |
| L-aspartic acid | Fisher Scientific | BP374-100 | |
| Lead Nitrate | Fisher Scientific | L-62 | |
| LEICA S8AP0 Microscope | LEICA | No longer available | No longer available from the company |
| LEICA S8AP0 Microscope Stand | LEICA | 10447255 | No longer available from the company |
| Light-Duty Tissue Wipers | VWR | 82003-822 | |
| Micro Dissecting Forceps; 1x2 Teeth, Full Curve; 0.8 mm Tip Width; 4" Length | Roboz Surgical Instrument Company | RS-5157 | |
| Osmium Tetroxide 4% aqueous solution | Electron microscopy Services | 19150 | |
| Paraformaldehyde (16% solution) | Electron microscopy Services | 15710 | |
| Potassium ferricyanide | SIGMA-ALDRICH | P-8131 | |
| Propylene Oxide, ACS reagent | Electron microscopy Services | 20401 | |
| Rainin Classic Pipette PR-10 | Rainin | 17008649 | |
| Research Flowmeter | Transonic Systems Inc. | T402B01481 | Model: T402 |
| Scotch Magic Invisible Tape, 3/4" x 1000", Clear | Scotch | 305289 | |
| Small Animal Heated Pad | K&H Manufacturing Inc. | Model: HM10 | |
| Sodium Cacodylate Buffer 0.2M, pH7.4 | Electron microscopy Services | 11623 | |
| Sterile Cotton Tipped Applicators | Puritan Medical Products | 25-806 1WC | |
| Steromaster Illuminator | Fisher Scientific | 12-562-21 | No longer available from the company |
| Surgical Dumont #7 Forceps | Fine Science Tools | 11271-30 | |
| Thiocarbohydrazide (TCH) | SIGMA-ALDRICH | 88535 | |
| Universal Low Retention Pipet Tip Reloads (0.1-10 µL) | VWR | 76323-394 | |
| Uranyl Acetate | Electron microscopy Services | 22400 | |
| Veet Gel Cream Hair Remover | Reckitt Benckiser | 3116875 | |
| White Antistatic Hexagonal Weigh Boats, Medium, 64 x 15 x 19 mm | Fisher Scientific | S38975 | |
| WinDAQ/100 Software for Windows | DATAQ Instruments, Inc. | Version 3.38 | Freely available to download. https://www.dataq.com/products/windaq/ |
| ZEISS AxioCam Icc 1 | ZEISS | 57615 |
References
- Lozano, R., et al. Global and regional mortality from 235 causes of death for 20 age groups in 1990 and 2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2010. Lancet. 380 (9859), 2095-2128 (2012).
- Raskob, G. E., et al. Thrombosis: a major contributor to global disease burden. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34 (11), 2363-2371 (2014).
- Walton, J. Lead aspartate, an en bloc contrast stain particularly useful for ultrastructural enzymology. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 27 (10), 1337-1342 (1979).
- Palta, S., Saroa, R., Palta, A.
- Joshi, S., Whiteheart, S. W. The nuts and bolts of the platelet release reaction. Platelets. 28 (2), 129-137 (2017).
- Periayah, M. H., Halim, A. S., Mat Saad, A. Z. Mechanism action of platelets and crucial blood coagulation pathways in hemostasis. International Journal of Hematology-Oncology and Stem Cell Research. 11 (4), 319-327 (2017).
- Alexopoulos, D., Katogiannis, K., Sfantou, D., Lekakis, J. Combination antiplatelet treatment in coronary artery disease patients: A necessary evil or an overzealous practice. Platelets. 29 (3), 228-237 (2018).
- Kurz, K. D., Main, B. W., Sandusky, G. E. Rat model of arterial thrombosis induced by ferric chloride. Thrombosis Research. 60 (4), 269-280 (1990).
- Denis, C. V., et al. Towards standardization of in vivo thrombosis studies in mice. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 9 (8), 1641-1644 (2011).
- Marsh Lyle, E., et al. Assessment of thrombin inhibitor efficacy in a novel rabbit model of simultaneous arterial and venous thrombosis. Thrombosis and Haemostasis. 79 (3), 656-662 (1998).
- Kato, Y., et al. Inhibition of arterial thrombosis by a protease-activated receptor 1 antagonist, FR171113, in the guinea pig. European Journal of Pharmacology. 473 (2-3), 163-169 (2003).
- Huttinger, A. L., et al. Ferric chloride-induced canine carotid artery thrombosis: a large animal model of vascular injury. Journal of Visualized Experiments. (139), e57981 (2018).
- Zhang, W., et al. Antithrombotic therapy by regulating the ROS-mediated thrombosis microenvironment and specific nonpharmaceutical thrombolysis Using Prussian blue nanodroplets. Small. 18 (15), 2106252 (2022).
- Liu, B., et al. Platelet membrane cloaked nanotubes to accelerate thrombolysis by thrombus clot-targeting and penetration. Small. , 2205260 (2022).
- Refaat, A., et al. Near-infrared light-responsive liposomes for protein delivery: Towards bleeding-free photothermally-assisted thrombolysis. Journal of Controlled Release. 337, 212-223 (2021).
- Li, S., et al. Biomimetic nanoplatelets to target delivery hirudin for site-specific photothermal/photodynamic thrombolysis and preventing venous thrombus formation. Small. 18 (51), 2203184 (2022).
- Subramaniam, S., Kanse, S. M. Ferric chloride-induced arterial thrombosis in mice. Current Protocols in Mouse Biology. 4 (4), 151-164 (2014).
- Cocchiaro, J. L., Kumar, Y., Fischer, E. R., Hackstadt, T., Valdivia, R. H. Cytoplasmic lipid droplets are translocated into the lumen of the Chlamydia trachomatis parasitophorous vacuole. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (27), 9379-9384 (2008).
- Kaplan, E. L., Meier, P.
- Chauhan, A. K., Kisucka, J., Lamb, C. B., Bergmeier, W., Wagner, D. D. von Willebrand factor and factor VIII are independently required to form stable occlusive thrombi in injured veins. Blood. 109 (6), 2424-2429 (2007).
- Andre, P., et al. CD40L stabilizes arterial thrombi by a beta3 integrin--dependent mechanism. Nature Medicine. 8 (3), 247-252 (2002).
- Ni, H., et al. Persistence of platelet thrombus formation in arterioles of mice lacking both von Willebrand factor and fibrinogen. Journal of Clinical Investigation. 106 (3), 385-392 (2000).
- Bergmeier, W., et al. The role of platelet adhesion receptor GPIbalpha far exceeds that of its main ligand, von Willebrand factor, in arterial thrombosis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (45), 16900-16905 (2006).
- Ciciliano, J. C., et al. Resolving the multifaceted mechanisms of the ferric chloride thrombosis model using an interdisciplinary microfluidic approach. Blood. 126 (6), 817-824 (2015).
- Eckly, A., et al. Mechanisms underlying FeCl3-induced arterial thrombosis. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 9 (4), 779-789 (2011).
- Woollard, K. J., Sturgeon, S., Chin-Dusting, J. P. F., Salem, H. H., Jackson, S. P. Erythrocyte hemolysis and hemoglobin oxidation promote ferric chloride-induced vascular injury. Journal of Biological Chemistry. 284 (19), 13110-13118 (2009).
- Shim, Y., et al. Characterization of ferric chloride-induced arterial thrombosis model of mice and the role of red blood cells in thrombosis acceleration. Yonsei Medical Journal. 62 (11), 1032-1041 (2021).
- Ghosh, S., et al. Evaluation of the prothrombotic potential of four-factor prothrombin complex concentrate (4F-PCC) in animal models. PLoS One. 16 (10), 0258192 (2021).
- Wilbs, J., et al. Cyclic peptide FXII inhibitor provides safe anticoagulation in a thrombosis model and in artificial lungs. Nature Communications. 11 (1), 3890 (2020).
- Wei, Y., Deng, X., Sheng, G., Guo, X. B. A rabbit model of cerebral venous sinus thrombosis established by ferric chloride and thrombin injection. Neuroscience Letters. 662, 205-212 (2018).
- Jacob-Ferreira, A. L., et al. Antithrombotic activity of Batroxase, a metalloprotease from Bothrops atrox venom, in a model of venous thrombosis. International Journal of Biological Macromolecules. 95, 263-267 (2017).
- Zhou, X., et al. A rabbit model of cerebral microembolic signals for translational research: preclinical validation for aspirin and clopidogrel. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 14 (9), 1855-1866 (2016).
- Yang, X., et al. Effect of evodiamine on collagen-induced platelet activation and thrombosis. BioMed Research International. 2022, 4893859 (2022).
- Li, W., McIntyre, T. M., Silverstein, R. L. Ferric chloride-induced murine carotid arterial injury: A model of redox pathology. Redox Biology. 1 (1), 50-55 (2013).
- Li, W., Nieman, M., Sen Gupta, A. Ferric chloride-induced murine thrombosis models. Journal of Visualized Experiments. (115), e54479 (2016).
- Holly, S. P., et al. Ether lipid metabolism by AADACL1 regulates platelet function and thrombosis. Blood Advances. 3 (22), 3818-3828 (2019).
- Bird, J. E., et al. Prediction of the therapeutic index of marketed anti-coagulants and anti-platelet agents by guinea pig models of thrombosis and hemostasis. Thrombosis Research. 123 (1), 146-158 (2008).
