Das vorliegende Protokoll beschreibt, wie eine FeCl3-vermittelte Verletzung verwendet werden kann, um eine arterielle Thrombose zu induzieren, und wie arterielle Verletzungsproben in verschiedenen Stadien der Thrombose für die elektronenmikroskopische Analyse gesammelt und vorbereitet werden.
Ein Abonnement von JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt anzuzeigen. Melden Sie sich an oder beginnen Sie noch heute mit einer kostenlosen Testphase.
Methodenartikel
Eisenchlorid-induzierte arterielle Thrombose und Probenentnahme für die 3D-Elektronenmikroskopie-Analyse
* These authors contributed equally
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Herz-Kreislauf-Erkrankungen sind weltweit eine der Hauptursachen für Mortalität und Morbidität. Aberrante Thrombosen sind ein häufiges Merkmal von systemischen Erkrankungen wie Diabetes und Fettleibigkeit sowie chronisch entzündlichen Erkrankungen wie Arteriosklerose, Krebs und Autoimmunerkrankungen. Bei einer Gefäßverletzung wirken in der Regel das Gerinnungssystem, die Blutplättchen und das Endothel orchestriert, um Blutungen zu verhindern, indem sie an der Stelle der Verletzung ein Gerinnsel bilden. Anomalien in diesem Prozess führen entweder zu übermäßigen Blutungen oder zu unkontrollierten Thrombosen/unzureichender antithrombotischer Aktivität, was sich in einem Gefäßverschluss und seinen Folgen niederschlägt. Das FeCl 3-induzierte Carotis-Verletzungsmodell ist ein wertvolles Werkzeug, um zu untersuchen, wie eine Thrombose in vivo beginnt und fortschreitet. Dieses Modell beinhaltet eine Endothelschädigung/Denudation und die anschließende Gerinnselbildung an der verletzten Stelle. Es bietet einen hochempfindlichen, quantitativen Assay zur Überwachung von Gefäßschäden und Gerinnselbildung als Reaktion auf unterschiedlich schwere Gefäßschäden. Nach der Optimierung kann diese Standardtechnik verwendet werden, um die molekularen Mechanismen zu untersuchen, die der Thrombose zugrunde liegen, sowie die ultrastrukturellen Veränderungen der Blutplättchen in einem wachsenden Thrombus. Dieser Assay ist auch nützlich, um die Wirksamkeit von Antithrombotika und Thrombozytenaggregationshemmern zu untersuchen. In diesem Artikel wird erläutert, wie eine FeCl 3-induzierte arterielle Thrombose initiiert und überwacht wird und wie Proben für die elektronenmikroskopische Analyse entnommen werden.
Einleitung
Thrombose ist die Bildung eines Blutgerinnsels, das ein Blutgefäß teilweise oder vollständig blockiert und den natürlichen Blutfluss behindert. Dies führt zu schweren und tödlichen kardiovaskulären Ereignissen wie ischämischen Herzerkrankungen und Schlaganfällen. Herz-Kreislauf-Erkrankungen sind die häufigste Ursache für Morbidität und Mortalität und verursachen weltweit jeden vierten Todesfall 1,2,3. Obwohl sich eine Thrombose als Fehlfunktion des Gefäßsystems manifestiert, kann sie auf eine zugrunde liegende mikrobielle oder virale Infektion, eine Immunstörung, eine Maligni....
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Protokoll
Alle hier besprochenen Experimente wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) an der University of Kentucky geprüft und genehmigt.
HINWEIS: Chirurgische Instrumente sind in Abbildung 1 und der Materialtabelle aufgeführt. Es wurden C57BL/6J-Mäuse, 8-10 Wochen alt, männlich/weiblich oder relevante genetisch manipulierte (Knockout oder Knockin) Stämme verwendet.
1. FeCl 3-induzierte Verletzung der Halsschlagader
- Induktion der Mausanästhesie
- Wiegen Sie die Maus.
- Anästhesieren Sie die Maus durch i....
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Ergebnisse
Die Daten werden im Allgemeinen als Zeit bis zum Verschluss oder als Zeit dargestellt, die benötigt wird, um einen vollständig okklusiven Thrombus zu bilden. Diese Daten können als Kaplan-Meier-Überlebenskurve (Abbildung 4A)19, als Punktdiagramm mit Balken, die den terminalen Blutfluss zum Zeitpunkt der Beendigung des Blutflusses oder der Beendigung eines Experiments (Abbildung 4B) zeigen, oder als Liniendiagramm (Abbildung 4C) dargestell.......
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Diskussion
Die topische Anwendung von FeCl3 auf das Gefäßsystem zur Induktion von Thrombosen ist eine weit verbreitete Technik und hat maßgeblich dazu beigetragen, Rollen für verschiedene Thrombozytenrezeptoren, Ligandensignalwege und ihre Inhibitorenzu etablieren 20,21,22,23. Der Mechanismus, durch den FeCl3 eine Thrombose verursacht, ist vielfältig; Früher wurde die endotheliale De.......
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Offenlegungen
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte im Zusammenhang mit dieser Studie.
ORCID-Profile: S.J.: 0000-0001-6925-2116; S.W.W.: 00000-0001-5577-0473.
Danksagungen
Die Autoren danken den Mitgliedern des Whiteheart Laboratory für die sorgfältige Durchsicht dieses Manuskripts. Die Arbeit wurde durch Zuschüsse des NIH, des NHLBI (HL56652, HL138179 und HL150818) sowie durch einen Verdienstpreis des Department of Veterans Affairs an S.W.W., R01 HL 155519 an BS und einen Zuschuss des NIBIB intramuralen Programms an R.D.L. unterstützt.
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 0,9% Salzlösung | Fisher Wissenschaftlich | BP358-212 | NaCl zur Herstellung einer Lösung von 0,9 % Kochsalzlösung |
| 1 mL Spritze | Becton, Dickinson und Co. | ||
| 190 Proof Ethanol | KOPTEC | V1101 | Wird verwendet, um eine 70%ige Ethanollösung herzustellen, die zur Vorbereitung der Maus für die Operation verwendet wird |
| 2,2,2 Tribromoethanol | Sigma Aldrich | 48402 | |
| 25 Yard Schwarz Geflochtenes Seidennaht (5-0) | DEKNATEL | 136082-1204 | |
| 26G x 3/8 Nadel | Becton, Dickinson und Co. | 305110 | |
| 2-Methyl-2-butanol | Sigma Aldrich | 240486 | |
| 7,5 mL Transferpipette, graduiert auf 3 mL | Globe Scientific Inc. | 135010 | |
| Alkohol-Vorbereitungspads (70% Isopropylalkohol) | Medline | MDS090735 | |
| Araldite GY 502 | Dienstleistungen in der Elektronenmikroskopie | 10900 | |
| Zellkulturschale 35 mm x 10 mm | Corning Incorporated | ||
| Kompakte Waage | Wards Wissenschaft | 470314-390 | |
| Präparierschere, 12,5 cm lang | World Precision Instrument | 15922-G | |
| DMP-30 Aktivator | Dienstleistungen in der Elektronenmikroskopie | 13600 | |
| Dodenyl Bernsteinsäureanhydrid / DDSA | Elektronenmikroskopie Dienstleistungen | 13700 | |
| Doggy Poo Bags/Tierkadaver Entsorgungsbeutel | Crown Products | PP-RB-200 | |
| Doppler-Durchflusssonde | Transonic Systems Inc. | MA0.5PSB | |
| EMBED 812 Harz | Dienstleistungen in der Elektronenmikroskopie | 14900 | |
| Ethylalkohol, wasserfrei 200 Proof | Dienstleistungen in der Elektronenmikroskopie | 15055 | |
| Augenzange, 4" voll gebogen, Standard, 0,8 mm breite Spitzen | Integra Miltex | 18-784 | |
| Filterpapier | VWR | 28310-106 | |
| Feine Schere - Scharf-stumpfe | feine wissenschaftliche Werkzeuge | 14028-10 | |
| Fingerschlaufe Ohrlocher | Feine wissenschaftliche Werkzeuge | 24212-01 | |
| Mullschwämme 2" x 2" – 12-lagig | Dukal Corporation | 2128 | |
| Glutaraldehyd (10%ige Lösung) | Elektronenmikroskopie Dienstleistungen | 16120 | |
| Integra Miltex Chirurgische Klinge aus Kohlenstoffstahl #10 | Integra® Miltex® | 4110 | |
| Eisen(III)-chlorid | SIGMA-ALDRICH | 157740-100G | |
| Messergriff Miltex® Extra feiner Edelstahl Größe 3 | Integra Lifesciences | 157510 | |
| L-Asparaginsäure | Sigma Fischer | A93100 | |
| L-Asparaginsäure | Fisher Scientific | BP374-100 | |
| Bleinitrat | Fisher Wissenschaftlich | L-62 | |
| LEICA S8AP0 Mikroskop | LEICA | Nicht mehr | lieferbar Nicht mehr lieferbar bei der Firma |
| LEICA S8AP0 Mikroskop Ständer | LEICA | 10447255 | bei der Firma |
| Light-Duty Tissue-Wischtücher nicht mehr erhältlich | VWR | 82003-822 | |
| Mikro-Präparierzange; 1x2 Zähne, volle Kurve; 0,8 mm Spitzenbreite; 4" Länge | Roboz Surgical Instrument Company | RS-5157 | |
| Osmiumtetroxid 4%ige wässrige Lösung | Dienstleistungen in der Elektronenmikroskopie | 19150 | |
| Paraformaldehyd (16%ige Lösung) | Elektronenmikroskopie Dienstleistungen | 15710 | |
| Kaliumferricyanid | SIGMA-ALDRICH | P-8131 | |
| Propylenoxid, ACS-Reagenz | Dienstleistungen in der Elektronenmikroskopie | 20401 | |
| Rainin Classic Pipette PR-10 | Rainin | 17008649 | |
| Forschung Durchflussmesser | Transonic Systems Inc. | T402B01481 | Modell: T402 |
| Scotch Magic Invisible Tape, 3/4" x 1000", Clear | Scotch | ||
| Heizkissen für Kleintiere | K& H Manufacturing Inc. | Modell: HM10 | |
| Natriumcacodylat-Puffer 0,2 m, pH7,4 | Elektronenmikroskopie Dienstleistungen | 11623 | |
| Sterile Applikatoren mit Baumwollspitze | Puritanische Medizinprodukte | 25-806 1WC | |
| Steromaster Beleuchtung | Fisher Wissenschaftlich | 12-562-21 | Nicht mehr lieferbar bei der Firma |
| Surgical Dumont #7 Pinzette | Feine wissenschaftliche Werkzeuge | 11271-30 | |
| Thiocarbohydrazid (TCH) | SIGMA-ALDRICH | 88535 | |
| Universal-Pipettenspitzen-Nachlader mit geringer Retention (0,1-10 &; Mikro; L) | VWR | 76323-394 | |
| Uranylacetat-Elektronenmikroskopie-Dienstleistungen | 22400 | ||
| Veet Gel Cream Haarentferner | Reckitt Benckiser | 3116875 | |
| Weiß Antistatisch Sechseckige Waage, Mittel, 64 x 15 x 19 mm | Fisher Scientific | S38975 | |
| WinDAQ/100 Software für Windows | DATAQ Instruments, Inc. | Version 3.38 | Kostenlos zum Download verfügbar. https://www.dataq.com/products/windaq/ |
| ZEISS AxioCam Icc 1 | ZEISS | 57615 |
Referenzen
- Lozano, R., et al. Global and regional mortality from 235 causes of death for 20 age groups in 1990 and 2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2010. Lancet. 380 (9859), 2095-2128 (2012).
- Raskob, G. E., et al.
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Nachdrucke und Genehmigungen
