Summary
本协议描述了如何使用FeCl3介导的损伤来诱导动脉血栓形成，以及如何在血栓形成的各个阶段收集和制备动脉损伤样品以进行电子显微镜分析。
Abstract
心血管疾病是全世界死亡和发病的主要原因。异常血栓形成是糖尿病和肥胖等全身性疾病以及动脉粥样硬化、癌症和自身免疫性疾病等慢性炎症性疾病的共同特征。血管损伤时，凝血系统、血小板和内皮通常以协调的方式发挥作用，通过在损伤部位形成凝块来防止出血。这一过程中的异常导致出血过多或血栓形成不受控制/抗血栓形成活性不足，这转化为血管闭塞及其后遗症。FeCl3诱导的颈动脉损伤模型是探索血栓形成如何在 体内启动和进展的宝贵工具。该模型涉及内皮损伤/剥落以及随后在受伤部位形成凝块。它提供了一种高度灵敏的定量测定，以监测不同程度的血管损伤和凝块形成。一旦优化，这种标准技术可用于研究血栓形成的分子机制，以及生长中的血栓中血小板的超微结构变化。该测定也可用于研究抗血栓形成和抗血小板药物的疗效。本文解释了如何启动和监测FeCl3诱导的动脉血栓形成，以及如何收集样品通过电子显微镜进行分析。
Introduction
血栓形成是部分或完全阻塞血管的血凝块的形成，阻碍血液的自然流动。这会导致严重和致命的心血管事件，如缺血性心脏病和中风。心血管疾病是发病和死亡的主要原因，导致全世界四分之一的死亡1，2，3。虽然血栓形成表现为血管系统功能障碍，但它可能是潜在的微生物或病毒感染、免疫紊乱、恶性肿瘤或代谢疾病的结果。血液流动由血管系统不同组成部分（包括内皮细胞、红/白细胞、血小板和凝血因子）之间的复杂相互作用维持4.血管损伤后，血小板与内皮下基质上的粘附蛋白相互作用并释放其颗粒内容物，从而募集更多的血小板5。同时，凝血级联反应被激活，导致纤维蛋白形成和沉积。最终，形成凝块，包含被困在纤维蛋白网内的血小板和红细胞6。虽然抗血小板和抗凝药物可用于调节血栓形成，但假性出血仍然是这些疗法的主要问题，需要微调这些药物的剂量和组合。因此，仍然迫切需要发现新的抗血栓药物7。
使用多种方法研究血栓形成以造成血管损伤：机械（血管结扎），热损伤（激光损伤）和化学损伤（FeCl3 / Rose Bengal应用）。血栓形成的性质因损伤部位（动脉与静脉）、损伤方法或程度而异。在所有这些类型中，FeCl3诱导的血管损伤是最广泛使用的方法。它已被用于小鼠，大鼠，兔子，豚鼠和狗8，9，10，11，12。该方法相对简单，易于使用，如果主要参数标准化，则在各种血管系统（例如动脉[颈动脉和股动脉]，静脉[颈动脉]和小动脉[提睾和肠系膜]）中具有敏感性和可重复性（补充表1）。
该模型也可用于进一步了解凝块形成的机制和形态。该技术独特地提供了在不同流速点阻止血栓形成的优势，以在过程闭塞之前研究该过程的中间阶段。血栓形成研究的最新进展使用该模型将注意力集中在溶栓的非药物方法13 或抗血栓和/或纤维蛋白溶解剂的非侵入性递送14，15上。一些研究小组已经表明，当血小板膜涂有这些疗法时，药物可以在热刺激下被激活以靶向凝块16。这里描述的技术可用于在单个血小板水平验证其发现等研究。在本手稿中，方案 1 描述了基本的 FeCl3 介导的血管损伤程序，而方案 2 描述了收集和固定血管损伤样本以通过电子显微镜进一步分析的方法。
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Protocol
这里讨论的所有实验都经过肯塔基大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）的审查和批准。
注：手术器械列于 图1 和 材料表中。使用C57BL / 6J小鼠，8-10周龄，雄性/雌性或相关的遗传操作（敲除或敲入）菌株。
1. 氯化铁3诱发的颈动脉损伤
- 小鼠麻醉诱导
- 称量鼠标。
- 通过腹膜内（ip）注射0.2g / kg三溴乙醇溶液来麻醉小鼠。注射前确保麻醉液处于室温（RT）。该剂量足以使小鼠镇静约1小时。
- 注射后5分钟通过捏住脚趾来检查脚趾反射，以确保小鼠镇静。如果鼠标没有镇静，它会把它的脚趾拉开。如果发生这种情况，请等待 5 分钟，然后再次检查。
- 如果小鼠仍未完全镇静，则给予初始剂量的1/4并等待5分钟。
- 在整个过程中，通过捏住脚趾定期监测鼠标的麻醉平面。此外，还可以监测呼吸频率和体温以维持最佳麻醉。
- 固定鼠标
- 将鼠标仰卧放在加热垫（37°C）上，并使用胶带固定四肢。
- 使用手术线（0.1毫米）轻轻拉动小鼠的上门牙以延长颈部/颈部区域。这对于更好地可视化手术区域和多普勒探头的稳定性非常重要。线的大小并不重要，因为它仅用于拉动动物的门牙以伸展颈部。
- 切口
- 用70%乙醇喷洒手术区域或用酒精湿巾擦拭。
- 使用棉签在手术部位涂抹少量脱毛霜。等待1-2分钟，然后用湿纸巾或纸巾去除奶油。
注意：此步骤对于清洁手术区域很重要。 - 使用剪刀和镊子（图1B11，1B13），从下颌骨到胸骨上切口做一个中线切口。缩回皮肤以获得该区域的更好可视化（图2A）。
- 颈动脉暴露
- 使用手术钳和显微解剖钳，钝性解剖覆盖的浅筋膜并将其移除以露出左颈动脉（图1B12，1B13）。确保在此阶段不要使用剪刀，以免伤害该区域的其他脉管系统。
- 去除颈动脉周围的多余组织。避免过度解剖周围组织，因为该区域藏有迷走神经和椎动脉。
- 用手术和缝合钳解剖颈动脉与周围组织分离（图1B12，1B15，2C）。确保不要伸展或拉动动脉，以避免对动脉或周围脉管系统造成任何机械损伤。
- 在动脉下放置一块塑料以标记损伤的位置（图2D）。使用彩色透明片，使其在手术区域更容易看到。
- 流动探头的放置
- 手术前将多普勒跨音速流动探头置于盐溶液（dH2O中的0.9%NaCl）中约10分钟。将探头的另一端插入流量计的附件中，以方便读取流量。将流量计连接到计算机。
注意：在手术之间，多普勒跨音速血流探头应处于生理盐水中。确保在整个过程中保持探头湿润和清洁。 - 将超声多普勒跨音速流探头放置在塑料上游的动脉周围（图2D）。确保探头的容器支架区域不会太长（图1C，红色箭头）。
注意：如果需要，用纱布垫支撑探头（图1B1），以实现探头的适当高度，从而促进最佳读取位置。 - 如果此时手术区域干燥，请添加几滴RT盐水以保持该区域湿润。监控流量探头读数。每种动物的最佳读数各不相同，可能在 0.6-1.2 mL/min 之间。如果不太稳定或不稳定，请更改流探头位置以获得最佳读数。
注意：确保鼠标的颈部不要太伸展，并且手术区域干净。
- 手术前将多普勒跨音速流动探头置于盐溶液（dH2O中的0.9%NaCl）中约10分钟。将探头的另一端插入流量计的附件中，以方便读取流量。将流量计连接到计算机。
- 记录流基线
- 放置探针后，监测血流2分钟，以确保血流稳定。然后，记录2分钟的流量（图3B）作为基线。有关流量计的详细说明，请参阅Subramaniam等人17。
- 要记录血流，请启动WinDAQ软件。单击“文件”选项，然后单击 “记录”。创建一个新文件夹和文件，然后开始录制。要停止录制，请单击文件部分中的 “停止 ”。
注意：WinDAQ 软件可从发行商处免费获得：https://www.dataq.com/products/windaq/。
- 损伤
- 停止流的记录。确保不要改变探头位置，以便在受伤后读数保持一致。
- 用湿巾/纸巾彻底擦干该区域。
注意：即使是少量残留液体也可能改变用于造成血管损伤的FeCl3溶液的浓度。这会导致结果不一并影响可重复性。当该区域完全干燥时，探头无法测量流量。 - 在塑料称重舟中，放入圆形滤纸（直径1毫米，用直径1毫米的耳孔切割）。将 1 μL 6% FeCl3 溶液（以 dH2O 制成）添加到滤纸上。
注意：确保在使用滤纸之前添加FeCl3溶液。过早浸泡纸张可能会导致FeCl3溶液蒸发并改变损伤的严重程度。 - 使用细镊子，拿起滤纸并将其放在探头上游的动脉上，在由塑料标记的动脉部分（图2D，E）。这种塑料充当标记和垫片。它标记受伤区域，并通过避免与周围潮湿区域接触来防止FeCl3 意外稀释。
注：确保滤纸笔直，没有被挤压或以其他方式折叠。一旦放在动脉上，不要改变滤纸的位置;这样做会改变伤害的程度。 - 放置滤纸后，启动计时器并记录血流。3分钟后，取出纸张并在受伤部位添加盐水以去除FeCl3 并停止损伤过程。它还使该地区湿润。在这个阶段，血流量应恢复到损伤前记录的基线水平。
- 监控并记录流量，直到它减少到原始记录的 10% 或达到零。一旦血栓开始在损伤部位形成，就会稳步减少（图3C）。请注意在此期间流量的任何显著波动。
- 为了研究血栓的稳定性，记录每次显着和一致的减少后血流量的快速增加。这些事件被归类为由于不稳定血栓形成引起的栓塞（图4D）。在流量持续下降后，操作员能够在实验结束时看到动脉上的损伤（图2F，蓝色箭头/虚线椭圆形）。
- 血管闭塞时间定义为血流完全停止至少1分钟。记录闭塞性血栓形成的时间，如零读数或流量显着减少所示。
- 在30分钟时终止实验。如果在监测后30分钟内血栓没有形成，则记录流量，停止记录并取出探头。
- 用70%乙醇和刷子清洁探头，以去除任何残留的组织/头发或碎屑。将探头完全干燥，然后再将其放入储物盒中。将探头完全干燥，然后将其放入存储盒中以便长期存放。
- 通过颈椎脱位对小鼠实施安乐死。将胴体放入胴体处理袋中，标有实验室名称和日期。
2. 收集和制备用于FeCl3诱导损伤后连续块面扫描电子显微镜（SBF-SEM）研究的样品
注意：所提供的EM方案适用于SBF-SEM的样品制备。这种成像技术提供了前所未有的能力来研究凝块中血小板的三维结构。使用这种技术，样品被可视化为一系列连续的块SEM图像，随着样品的进展而生成。该制备的关键点是：1）样品必须用重金属预包埋染色;2）必须适当地修剪塑料嵌入样品才能安装在SEM内（有关修剪样品的视觉效果，请参见 图6 ）。SEM内无法进行包埋后染色。从FeCl3诱导的血管损伤中收集样本进行EM分析时，在进行手术时需要进行以下更改。所介绍的FeCl3 手术方案中的修改也适用于任何形式的电子显微镜检查。麻醉条件和切开和暴露颈动脉的步骤与方案1相同。
- 暴露颈动脉后，通过松散地包围两条手术线之间的区域（尺寸：0.1 毫米）来标记损伤部位（图 5A，B）。
- 将探头放在动脉下方，下线远端（图5C）。
- 将塑料片插入两条线之间的动脉下方，以标记FeCl3 损伤的部位（图5C）。
- 在进行损伤之前进行流量测量，以注意基础血流。这些测量用于决定在哪个阶段收集样品。
注意：确保固定剂（3%多聚甲醛/ PFA + 0.1%戊二醛，均由1x PBS制成）已准备好并在室温下。 或者，也可以使用2.5%戊二醛在盐水背景中固定。
注意：多聚甲醛和戊二醛都具有剧毒和刺激性。在处理它们时，应使用手套、眼罩和口罩以防止暴露。所有固定液都是有毒的，固定步骤应在通风橱中进行。 - 通过将FeCl 3浸泡的滤纸放在动脉上（使用8%FeCl 3）3分钟（这个时间也可能有所不同）来执行损伤。3分钟后，取出滤纸并在损伤部位加入盐水，以去除任何多余的残留FeCl3。此步骤对于防止不同程度的伤害和促进探头的流量计数是必要的（图5D）。
- 监控流量读数。当流量降至初始值的 50% 以下时，取下探头。快速擦干该区域，并在该区域添加固定剂以在外部固定受伤区域。
- 及时用镊子夹住损伤区域附近的动脉，切下线下游和上线上游。如有必要，请另一个人帮助切割一端。将组织以与收集的方向相同的方向放在塑料组织培养皿上，并加入几滴固定剂。
注意：切断动脉会导致立即大量出血，因此请确保在第一次切割动脉之前握住动脉。在这种情况下，鼠标被放血。小鼠通过放血和颈椎脱位被安乐死。 - 使用手术刀清洁动脉周围的多余组织。注意记录血流的方向。要标记这一点，请水平切割一端，另一端逐渐变细/倾斜（图 5E）。
- 将样品在固定剂（3%PFA和0.1%戊二醛）中在室温下保持1小时。然后，将样品储存在4°C的1%PFA中，直到将其送入湿冰上进行EM分析。
注意：样品不应冷冻。 这种样本收集方法面临的挑战是：- 初始读数可能不是最佳的，或者在受伤后可能会波动。这可能会影响选择停止进行 EM 分析的损伤程度。要解决此问题，请确保在尝试放置探头的各种位置以确定哪个位置是最佳位置后，记录几分钟的基线读数。
- 通过添加外部固定剂和动脉切片的实际切割进行分析来阻止损伤的时间可能会增加血栓形成程度的可变性。外部固定后，在样品收集过程中要快速。
- 在湿冰上接收样品以在1%PFA中进行处理EM分析。在冰上用0.1M二甲胂酸盐缓冲液冲洗样品3分钟以开始进一步处理。
- 将样品在0.1M二甲胂酸盐缓冲液+ 2.5%戊二醛+ 2mM CaCl2中的冰上固定1小时。
- 弃去固定剂，并用含有2mM CaCl2 （5 x 3分钟）的冷0.1 M二甲胂酸钠缓冲液洗涤样品（图6A）。
- 用锇溶液（3%亚铁氰化钾[K 4 C 6 N6Fe] + 0.3 M二甲胂酸盐缓冲液+ 4 mM CaCl 2与等体积的4%四氧化锇水溶液[OsO4;在ddH2 O]中）固定样品在冰上1小时。
- 当样品固定时，在ddH2O中制作新鲜的1%三氯乙醛水合物（TCH）溶液，将溶液在60°C孵育1小时，同时轻轻混合。
- 固定后，在室温下用ddH2O洗涤样品5 x 3分钟。
- 将样品在过滤的1%TCH溶液（在ddH2O中制成）中在室温下孵育20分钟。
- 在室温下用ddH2O洗涤样品（5 x 3分钟）。
- 将样品固定在 ddH2O 中的 2% 四氧化锇中，在室温下 30 分钟。
- 用ddH2O在室温下洗涤样品5 x 3分钟。
- 将样品置于1%乙酸铀酰（水溶液）中，并在4°C下孵育过夜。
- 用ddH2O在室温下洗涤样品5 x 3分钟， 并用整体 沃尔顿铅天冬氨酸染色处理它们。
- En bloc 沃尔顿先导天冬氨酸染色3：
- 在ddH2O中制备30mM L-天冬氨酸溶液。
注意：如果pH值升高到3.8，天冬氨酸溶解得更快。如果冷藏，该储备溶液可稳定保存 1-2 个月。 - 在 10 mL 天冬氨酸储备液中制备 20 mM 硝酸铅溶液，并用 1 N KOH 将 pH 值调节至 5.5。
- 将样品置于60°C的天冬氨酸铅溶液中30分钟，在室温下用ddH2O洗涤五次，每次洗涤3分钟。
- 在ddH2O中制备30mM L-天冬氨酸溶液。
- 用分级乙醇系列对标本进行脱水。使用瓦尔迪维亚协议18的化学脱水。
- 在以下每种溶液中洗涤样品以逐渐脱水样品（图6B）：
25%乙醇3分钟
50%乙醇3分钟
75%乙醇3分钟
95%乙醇3分钟
100%乙醇10分钟，重复该步骤两次（共三次洗涤）。
- 在以下每种溶液中洗涤样品以逐渐脱水样品（图6B）：
- 在100%环氧丙烷（PO）中洗涤样品10分钟，并重复该步骤两次（总共三次洗涤）。
- 在 50%/50% PO/树脂中与 DMP 30 活化剂在室温下孵育过夜，并嵌入 100% Araldite 502/嵌入 812/DDSA 与 DMP30 活化剂中 48 小时。
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Representative Results
数据通常表示为闭塞时间，或形成完全闭塞血栓所需的时间。这些数据可以绘制为Kaplan-Meier生存曲线（图4A）19，带有条形图的点图，显示血流停止或实验终止时的最终血流（图4B），或折线图（图4C）。可以使用这种技术研究血栓稳定性。在大多数情况下，在FeCl3损伤时，血栓逐渐形成，随着其生长，血流量逐渐减少，在血管完全闭塞时达到零。在某些情况下，血流量在逐渐减少几分钟后突然增加。这被解释为生长中的血栓部分脱落，并且可以被视为栓塞事件（图4D）。闭塞性血栓形态（图7A）也可以使用这种方法进行研究。
表1：FeCl3诱导的血栓形成模型的潜在技术挑战和解决方案。请按此下载此表格。
图 1：在小鼠中进行 FeCl3 诱导的颈动脉血栓形成所需的手术器械。 （A） 1：徕卡S8AP0显微镜和支架。2：小动物加热垫覆盖铝箔。（二）1：纱布海绵。2： 26 克 x 3/8 针。3：1毫升注射器。4：无菌棉头涂抹器。5：黑色编织丝线。6：手术刀片。7：不锈钢刀柄。8：商业脱毛膏。9：打耳。10：解剖剪刀。11：细剪刀。12：手术钳。13：显微解剖钳。14：眼部敷料钳。15：缝合钳。（C） 带有柔性区域（红色箭头）和容纳容器的凹口（黑色箭头）的跨音速流动探头。 请点击此处查看此图的大图。
图 2：准备颈动脉损伤和测量血管闭塞的手术步骤。 使用剪刀和手术镊子，做一个中线部分，轻轻拉开组织（A），露出其下方的颈动脉（B）。黑色箭头表示血流方向 （B）。清洁环绕颈动脉（C）的周围组织，并放置一张塑料纸（黑色箭头所示的黄色塑料）和探针（D）。通过将FeCl 浸泡 3 的滤纸（由红色箭头显示）放在动脉 （E） 上来伤害血管。取出纸张并监测受伤情况。最后，损伤可见为黄白色条纹，由蓝色箭头（F）表示。 请点击此处查看此图的大图。
图 3：使用流量计读取血流量。 颈动脉中的血流量使用流量计（A）测量。使用文件选项卡 （B） 中的记录功能记录流程。在进行损伤之前，基线流量应相对恒定（约 0.8 mL/min，用黑色箭头表示）（B）。受伤后，血流量均匀减少（从起始值减少约50%，约0.4mL / min），用黑色箭头（C）表示。 请点击此处查看此图的大图。
图 4：来自 FeCl3 诱导的颈动脉损伤模型的代表性数据呈现。 显示了可用于呈现FeCl3诱导的血管损伤数据的各种方法。Kaplan-Meier存活曲线显示了每只小鼠的闭塞时间。执行对数排名检验以进行统计分析。 p ≤ 0.001 （A）。实验结束时的血流量也可以用条形图（B）表示。对于以 B 表示的数据，执行非配对 t 检验 *** p ≤ 0.001。误差线表示平均值±标清。从单个动物受伤后收集的多普勒血流数据可以用折线图（C）表示。在不同时间点（D）的单个小鼠血流量持续逐渐减少后血流量突然增加的潜在栓塞事件的例子。 请点击此处查看此图的大图。
图 5：用于电子显微镜研究的 FeCl3 诱导的损伤凝块的收集。 暴露动脉（A）后，通过松散地绑线（B）来标记损伤部位，然后将塑料纸放在动脉下方及其下游的探头（C）。执行伤害并监测损坏情况 （D）。按照文中的说明收集组织，清洁并切割样品的一侧笔直，另一侧倾斜，以显示血流方向（黑色箭头表示血流方向，红色轮廓表示受伤区域）（E）。 请点击此处查看此图的大图。
图6：电子显微镜样品的固定后处理和安装。 在处理步骤（A）之间在微量离心管中洗涤样品，并用增加浓度的乙醇（B）连续脱水。加工后，将它们嵌入树脂（C）中，并在块上标有血流方向（D），然后切成薄片进行成像。 请点击此处查看此图的大图。
图 7：FeCl3 介导的颈动脉损伤后完全闭塞性血栓近端和远端区域的代表性电子显微照片。 （A） 闭塞动脉的完整横截面，靠近损伤部位，下方有插图，显示较高放大倍率下的结构（a：2x和a'：4x）。受伤区域用A中的箭头表示。 比例尺：100μm。 （B）闭塞动脉的完整横截面，位于损伤部位远端，下方有插图，显示较高放大倍率下的结构（b：2x和b'：4x）。 请点击此处查看此图的大图。
补充表1：动物模型变化的简要调查，FeCl 3损伤部位，FeCl3浓度，损伤方法和血栓形成时间。请点击此处下载此文件。
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Discussion
将FeCl3局部应用于脉管系统以诱导血栓形成是一种广泛使用的技术，并且有助于建立各种血小板受体，配体信号通路及其抑制剂的作用20，21，22，23。FeCl3引起血栓形成的机制是多方面的;以前，内皮剥蚀被认为是血栓形成的原因，然而近年来，多份报告表明红细胞和血浆蛋白在此过程中的作用24，25，26，27。
该协议中最关键的步骤是：放置多普勒探头以获得最佳流量，放置滤纸以及迅速终止损伤以检索并立即固定样本。表 1 描述了这些步骤中事故的后果以及如何解决这些问题。虽然简单而灵敏，但根据动物模型、动物背景、血管损伤部位、FeCl3 浓度、FeCl3 应用方法、应用持续时间、动物年龄和性别以及使用的麻醉类型，使用起来可能具有挑战性。这些差异可以解释文献中报道的C57BL / 6J中血栓形成时间相对较宽的范围（补充表1）27，28，29，30，31，32。该协议建议使用8-10周龄的小鼠进行实验，因为脉管系统大小更容易可视化和手术。一些小组使用年仅6周大的小鼠33。必须使小鼠的年龄匹配，以便在各种动物群体之间进行一致和可重复的比较。所描述的麻醉，三溴乙醇，是优选的，因为它容易获得，更容易施用，它在所需的持续时间内保持麻醉平面，并且所需的剂量是可重复的。还有许多其他麻醉选择，包括异氟醚和三溴乙醇与叔戊醇与甲苯噻嗪和/或乙酰丙嗪的各种组合。必须使用最佳剂量来实现镇静，而不会对动物的心率或血压产生负面影响。在整个实验中使用相同的麻醉方法可以防止对血栓形成时间的潜在复合影响。
这份手稿介绍了一个详细的程序，以尽量减少数据变化并提高可重复性。提供了一个表格来解决手术过程中可能出现的一些问题（表1）。此外，本手稿提出了一种在损伤结束时收集样本的方法，以研究闭塞性血栓的结构和形态（图 7）。EM的分辨率提供了比以前更好的可视化25 生长中的血小板，以及它们如何与其他血小板和血管损伤近端和远端的内皮相互作用。它还可用于研究损伤部位血小板的各种活化阶段。
该技术的另一个重要优点是，操作员可以使用基线读数来决定在哪个阶段收集血栓样本。应该注意的是，这些是近似时间，并不表示损伤/血栓形成的确切程度。基础读数取决于探头的最佳放置，如果放置不正确，读数可能仅记录部分流量。这导致对终止时间的错误解释，从而导致对收集样品的形态进行错误的解释。需要立即终止损伤过程并立即固定样品，以获得一致且可重复的结果。
该协议提供了评估闭塞性血栓形成所需的最低设置。随着显微镜的进步，一些小组使用这种技术来荧光标记血小板/内皮细胞和/或血小板释放物，例如PF4和P-Selectin和纤维蛋白，以可视化 体内 血栓形成的特定方面并确定其动力学34，35。如前所述，此处的方法可以报告栓塞事件，这表明血栓不稳定（图4D）。
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Disclosures
作者与本研究没有利益冲突。
ORCID 配置文件： S.J.： 0000-0001-6925-2116;S.W.W.：00000-0001-5577-0473。
Acknowledgments
作者感谢白心实验室的成员仔细阅读这份手稿。这项工作得到了NIH，NHLBI（HL56652，HL138179和HL150818）的资助，以及退伍军人事务部对SWW的优异奖，R01 HL 155519到BS，以及NIBIB对R.D.L.的校内计划资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% Saline | Fisher Scientific | BP358-212 | NaCl used to make a solution of 0.9% saline |
| 1 mL Syringe | Becton, Dickinson and Company | 309659 | |
| 190 Proof Ethanol | KOPTEC | V1101 | Used to make a 70% ethanol solution to use for prepping the mouse for surgery |
| 2,2,2 Tribromoethanol | Sigma Aldrich | 48402 | |
| 25 Yard Black Braided Silk Suture (5-0) | DEKNATEL | 136082-1204 | |
| 26G x 3/8 Needle | Becton, Dickinson and Company | 305110 | |
| 2-methyl-2-butanol | Sigma Aldrich | 240486 | |
| 7.5 mL Transfer Pipet, Graduated to 3 mL | Globe Scientific Inc. | 135010 | |
| Alcohol Prep Pads (70% Isopropyl Alcohol) | Medline | MDS090735 | |
| Araldite GY 502 | Electron microscopy Services | 10900 | |
| Cell Culture Dish 35mm X 10mm | Corning Incorporated | 430165 | |
| Compact Scale | Ward's Science | 470314-390 | |
| Dissecting Scissors, 12.5 cm long | World Precision Instrument | 15922-G | |
| DMP-30 activator | Electron microscopy Services | 13600 | |
| Dodenyl Succinic Anhydride/ DDSA | Electron microscopy Services | 13700 | |
| Doggy Poo Bags/animal carcass disposal bag | Crown Products | PP-RB-200 | |
| Doppler FlowProbe | Transonic Systems Inc. | MA0.5PSB | |
| EMBED 812 resin | Electron microscopy Services | 14900 | |
| Ethyl Alcohol, anhydrous 200 proof | Electron microscopy Services | 15055 | |
| Eye Dressing Forceps, 4" Full Curved, Standard, 0.8mm Wide Tips | Integra Miltex | 18-784 | |
| Filter Paper | VWR | 28310-106 | |
| Fine Scissors - Sharp-Blunt | Fine Science Tools | 14028-10 | |
| Finger Loop Ear Punches | Fine Science Tools | 24212-01 | |
| Gauze Sponges 2” x 2” – 12 Ply | Dukal Corporation | 2128 | |
| Glutaraldehyde (10% solution) | Electron microscopy Services | 16120 | |
| Integra Miltex Carbon Steel Surgical Blade #10 | Integra® Miltex® | 4110 | |
| Iron (III) Chloride | SIGMA-ALDRICH | 157740-100G | |
| Knife Handle Miltex® Extra Fine Stainless Steel Size 3 | Integra Lifesciences | 157510 | |
| L-aspartic acid | Sigma Fisher | A93100 | |
| L-aspartic acid | Fisher Scientific | BP374-100 | |
| Lead Nitrate | Fisher Scientific | L-62 | |
| LEICA S8AP0 Microscope | LEICA | No longer available | No longer available from the company |
| LEICA S8AP0 Microscope Stand | LEICA | 10447255 | No longer available from the company |
| Light-Duty Tissue Wipers | VWR | 82003-822 | |
| Micro Dissecting Forceps; 1x2 Teeth, Full Curve; 0.8 mm Tip Width; 4" Length | Roboz Surgical Instrument Company | RS-5157 | |
| Osmium Tetroxide 4% aqueous solution | Electron microscopy Services | 19150 | |
| Paraformaldehyde (16% solution) | Electron microscopy Services | 15710 | |
| Potassium ferricyanide | SIGMA-ALDRICH | P-8131 | |
| Propylene Oxide, ACS reagent | Electron microscopy Services | 20401 | |
| Rainin Classic Pipette PR-10 | Rainin | 17008649 | |
| Research Flowmeter | Transonic Systems Inc. | T402B01481 | Model: T402 |
| Scotch Magic Invisible Tape, 3/4" x 1000", Clear | Scotch | 305289 | |
| Small Animal Heated Pad | K&H Manufacturing Inc. | Model: HM10 | |
| Sodium Cacodylate Buffer 0.2M, pH7.4 | Electron microscopy Services | 11623 | |
| Sterile Cotton Tipped Applicators | Puritan Medical Products | 25-806 1WC | |
| Steromaster Illuminator | Fisher Scientific | 12-562-21 | No longer available from the company |
| Surgical Dumont #7 Forceps | Fine Science Tools | 11271-30 | |
| Thiocarbohydrazide (TCH) | SIGMA-ALDRICH | 88535 | |
| Universal Low Retention Pipet Tip Reloads (0.1-10 µL) | VWR | 76323-394 | |
| Uranyl Acetate | Electron microscopy Services | 22400 | |
| Veet Gel Cream Hair Remover | Reckitt Benckiser | 3116875 | |
| White Antistatic Hexagonal Weigh Boats, Medium, 64 x 15 x 19 mm | Fisher Scientific | S38975 | |
| WinDAQ/100 Software for Windows | DATAQ Instruments, Inc. | Version 3.38 | Freely available to download. https://www.dataq.com/products/windaq/ |
| ZEISS AxioCam Icc 1 | ZEISS | 57615 |
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