Summary
Het huidige protocol beschrijft hoe een FeCl 3-gemedieerd letsel kan worden gebruikt om arteriële trombose te induceren en hoe arteriële letselmonsters in verschillende stadia van trombose kunnen worden verzameld en voorbereid voor elektronenmicroscopieanalyse.
Abstract
Hart- en vaatziekten zijn wereldwijd een belangrijke oorzaak van sterfte en morbiditeit. Aberrante trombose is een gemeenschappelijk kenmerk van systemische aandoeningen zoals diabetes en obesitas, en chronische ontstekingsziekten zoals atherosclerose, kanker en auto-immuunziekten. Bij vasculair letsel werken meestal het stollingssysteem, de bloedplaatjes en het endotheel op een georkestreerde manier om bloedingen te voorkomen door een stolsel te vormen op de plaats van het letsel. Afwijkingen in dit proces leiden tot overmatige bloedingen of ongecontroleerde trombose / onvoldoende antitrombotische activiteit, wat zich vertaalt in vaatocclusie en de gevolgen ervan. Het FeCl 3-geïnduceerde carotisletselmodel is een waardevol hulpmiddel om te onderzoeken hoe trombose in vivo begint en vordert. Dit model omvat endotheelschade / denudatie en daaropvolgende stolselvorming op de gewonde plaats. Het biedt een zeer gevoelige, kwantitatieve test om vasculaire schade en stolselvorming te controleren als reactie op verschillende graden van vasculaire schade. Eenmaal geoptimaliseerd, kan deze standaardtechniek worden gebruikt om de moleculaire mechanismen te bestuderen die ten grondslag liggen aan trombose, evenals de ultrastructurele veranderingen in bloedplaatjes in een groeiende trombus. Deze test is ook nuttig om de werkzaamheid van antitrombotische en bloedplaatjesaggregatieremmers te bestuderen. In dit artikel wordt uitgelegd hoe fecl 3-geïnduceerde arteriële trombose kan worden geïnitieerd en gecontroleerd en hoe monsters kunnen worden verzameld voor analyse door elektronenmicroscopie.
Introduction
Trombose is de vorming van een bloedstolsel dat een bloedvat gedeeltelijk of volledig blokkeert, waardoor de natuurlijke doorstroming van het bloed wordt belemmerd. Dit leidt tot ernstige en fatale cardiovasculaire gebeurtenissen, zoals ischemische hartziekten en beroertes. Hart- en vaatziekten zijn de belangrijkste oorzaak van morbiditeit en mortaliteit en veroorzaken wereldwijd eenop de vier sterfgevallen 1,2,3. Hoewel trombose zich manifesteert als een storing van het vasculaire systeem, kan het een gevolg zijn van een onderliggende microbiële of virale infectie, immuunstoornis, maligniteit of metabole aandoening. De bloedstroom wordt in stand gehouden door de complexe interactie tussen verschillende componenten van het vasculaire systeem, waaronder endotheelcellen, rood/witte bloedcellen, bloedplaatjes en stollingsfactoren4. Bij vasculair letsel interageren bloedplaatjes met kleefeiwitten op de subendotheliale matrix en geven hun korrelige inhoud vrij, die meer bloedplaatjes rekruteren5. Tegelijkertijd wordt de stollingscascade geactiveerd, wat leidt tot fibrinevorming en afzetting. Uiteindelijk wordt een stolsel gevormd, met bloedplaatjes en rode bloedcellen gevangen in een fibrine-mesh6. Hoewel bloedplaatjesaggregatieremmers en anticoagulantia beschikbaar zijn om trombose te moduleren, blijft onechte bloeding een groot probleem bij deze therapieën, waardoor de doseringen en combinaties van deze geneesmiddelen moeten worden verfijnd. Er is dus nog steeds een dringende behoefte om nieuwe antitrombotische geneesmiddelen te ontdekken7.
Trombose wordt bestudeerd met behulp van meerdere methoden om vasculair letsel toe te brengen: mechanisch (vaatligatie), thermisch (laserletsel) en chemisch letsel (FeCl3 / Rose Bengal-toepassing). De aard van trombose varieert afhankelijk van de locatie (arteriële versus veneuze), methode of omvang van het letsel. Van al deze typen is FeCl 3-geïnduceerd vaatletsel de meest gebruikte methode. Het is gebruikt bij muizen, ratten, konijnen, cavia's en honden 8,9,10,11,12. De methode is relatief eenvoudig, gemakkelijk te gebruiken en als de belangrijkste parameters gestandaardiseerd zijn, is deze gevoelig en reproduceerbaar in verschillende vasculaire systemen (bijv. Slagaders [halsslagader en femoraal], aderen [jugular] en arteriolen [cremaster en mesenterium]) (aanvullende tabel 1).
Dit model kan ook worden gebruikt om ons begrip van de mechanica en morfologie van stolselvorming te vergroten. Deze techniek biedt op unieke wijze het voordeel van het stoppen van trombose op verschillende stroomsnelheidspunten, om de tussenliggende stadia van het proces te bestuderen voordat het occlusief wordt. Recente ontwikkelingen in tromboseonderzoek hebben dit model gebruikt om de aandacht te vestigen op niet-farmacologische methoden van trombolyse13 of niet-invasieve toediening van antitrombotische en / of fibrinolytische middelen14,15. Verschillende groepen hebben aangetoond dat, wanneer bloedplaatjesmembranen zijn bedekt met deze therapeutica, de geneesmiddelen kunnen worden geactiveerd bij thermische stimulatie om stolsels aan te pakken16. De hier beschreven technieken kunnen nuttig zijn voor dergelijke studies als validatie van hun bevindingen op het niveau van enkele bloedplaatjes. In dit manuscript beschrijft Protocol 1 de basis FeCl 3-gemedieerde vasculaire letselprocedure, terwijl Protocol 2 de methode beschrijft om het vasculaire letselmonster te verzamelen en te fixeren voor verdere analyse door elektronenmicroscopie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle hier besproken experimenten werden beoordeeld en goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) aan de Universiteit van Kentucky.
OPMERKING: Chirurgische instrumenten zijn vermeld in figuur 1 en de materiaaltabel. C57BL/6J muizen, 8-10 weken oud, mannelijke/vrouwelijke of relevante genetisch gemanipuleerde (Knockout of Knockin) stammen werden gebruikt.
1. FeCl 3-geïnduceerde halsslagaderbeschadiging
- Inductie van muisanesthesie
- Weeg de muis.
- Verdoof de muis door 0,2 g/kg tribromoethanoloplossing intraperitoneaal (i.p.) te injecteren. Zorg ervoor dat de verdovingsoplossing op kamertemperatuur (RT) is voordat u deze injecteert. Deze dosis is voldoende om de muis gedurende ongeveer 1 uur te verdoven.
- Controleer de teenreflex door 5 minuten na injectie in de teen te knijpen om er zeker van te zijn dat de muis verdoofd is. Als de muis niet verdoofd is, trekt hij zijn teen weg. Als dat gebeurt, wacht dan 5 minuten en controleer opnieuw.
- Als de muis nog steeds niet volledig verdoofd is, dien dan 1/4 van de aanvangsdosis toe en wacht 5 minuten.
- Controleer tijdens de procedure periodiek het anesthesievlak van de muis via een teenknijp. Bovendien kunnen de ademhalingssnelheid en de lichaamstemperatuur ook worden gecontroleerd om een optimale anesthesie te behouden.
- Immobiliseer de muis
- Leg de muis op het verwarmingskussen (37 °C) in rugligging en gebruik plakband om de ledematen te immobiliseren.
- Gebruik een chirurgische draad (0,1 mm) om voorzichtig aan de bovenste voortanden van de muis te trekken om het cervicale / nekgebied te verlengen. Dit is belangrijk voor een betere visualisatie van het operatiegebied en de stabiliteit van de Doppler-sonde. De draadmaat is niet belangrijk, omdat deze alleen wordt gebruikt om de voortanden van het dier te trekken om de nek te verlengen.
- Incisie
- Spray het operatiegebied in met 70% ethanol of veeg het af met een alcoholdoekje.
- Breng met een wattenstaafje een kleine hoeveelheid ontharingscrème aan op het operatiegebied. Wacht 1-2 minuten en gebruik dan een natte papieren handdoek of tissue om de crème te verwijderen.
OPMERKING: Deze stap is belangrijk voor een schoon operatiegebied. - Maak met een schaar en een tang (figuur 1B11,1B13) een middellijnincisie van de onderkaak naar de suprasternale inkeping. Trek de huid in om een betere visualisatie van het gebied te verkrijgen (figuur 2A).
- Blootstelling aan halsslagaders
- Gebruik een chirurgische tang en een micro-ontleedtang om de overlappende oppervlakkige fascia stomp te ontleden en te verwijderen om de linker halsslagader bloot te leggen (figuur 1B12,1B13). Zorg ervoor dat u in dit stadium geen schaar gebruikt om te voorkomen dat u andere vasculatuur in dit gebied verwondt.
- Verwijder extra weefsel rond de halsslagader. Vermijd overmatige dissectie van het omliggende weefsel, omdat dit gebied de nervus vagus en de wervelslagader herbergt.
- Scheid de halsslagader van het omliggende weefsel door deze te ontleden met een chirurgische en hechttang (figuur 1B12,1B15,2C). Zorg ervoor dat u de slagader niet uitstrekt of trekt om mechanisch letsel aan de slagader of de omliggende vasculatuur te voorkomen.
- Plaats een stuk plastic onder de slagader om de locatie van het letsel te markeren (figuur 2D). Gebruik een gekleurd transparantieblad om het gemakkelijker te maken om te zien in het chirurgische veld.
- Plaatsing van de stromingsonde
- Plaats de Doppler transonische stroomsonde in een zoutoplossing (0,9% NaCl in dH2O) gedurende ongeveer 10 minuten voor de operatie. Steek het andere uiteinde van de sonde in een hulpstuk in de flowmeter om de aflezing van de stroom te vergemakkelijken. Sluit de flowmeter aan op een computer.
OPMERKING: Tussen de operaties door moet de Doppler transonische stroomsonde in een zoutoplossing zitten. Zorg ervoor dat u de sonde tijdens de hele procedure vochtig en schoon houdt. - Plaats de ultrasone Doppler transonische stromingsonde rond de slagader stroomopwaarts van het plastic (figuur 2D). Zorg ervoor dat het gebied van de vaathouder van de sonde niet te lang is (figuur 1C, rode pijl).
OPMERKING: Ondersteun de sonde indien nodig met gaasjes (figuur 1B1) om een geschikte hoogte van de sonde te bereiken, waardoor de optimale leespositie wordt vergemakkelijkt. - Als het operatiegebied op dit punt droog is, voeg dan een paar druppels RT-zoutoplossing toe om het gebied vochtig te houden. Controleer de meting van de stroomsonde. De optimale aflezing varieert voor elk dier en kan ergens tussen 0,6-1,2 ml / min liggen. Als het minder of niet stabiel is, wijzigt u de positie van de stroomsonde om een optimale meting te krijgen.
OPMERKING: Zorg ervoor dat de nek van de muis niet te lang is uitgeschoven en dat het operatiegebied schoon is.
- Plaats de Doppler transonische stroomsonde in een zoutoplossing (0,9% NaCl in dH2O) gedurende ongeveer 10 minuten voor de operatie. Steek het andere uiteinde van de sonde in een hulpstuk in de flowmeter om de aflezing van de stroom te vergemakkelijken. Sluit de flowmeter aan op een computer.
- De stroombasislijn vastleggen
- Controleer na het plaatsen van de sonde de bloedstroom gedurende 2 minuten om ervoor te zorgen dat de stroom stabiel is. Noteer vervolgens de stroom gedurende 2 minuten (figuur 3B) als basislijn. Voor een gedetailleerde beschrijving van de flowmeter, zie Subramaniam et al.17.
- Om de bloedstroom te registreren, start u de WinDAQ-software. Klik op de optie Bestand en klik vervolgens op Opnemen. Maak een nieuwe map en bestand en begin met opnemen. Om de opname te stoppen, klikt u op Stoppen in het bestandsgedeelte.
OPMERKING: WinDAQ-software is vrij verkrijgbaar bij de uitgever: https://www.dataq.com/products/windaq/.
- Letsel
- Stop de opname van de stroom. Zorg ervoor dat u de positie van de sonde niet wijzigt, zodat de metingen consistent blijven na het letsel.
- Droog het gebied grondig af met een doekje/keukenpapier.
OPMERKING: Zelfs een klein volume resterende vloeistof kan de concentratie van FeCl3-oplossing die wordt gebruikt om vasculair letsel toe te brengen, veranderen. Dit leidt tot wisselende resultaten en beïnvloedt de reproduceerbaarheid. Wanneer het gebied volledig droog is, kan de sonde de stroom niet meten. - Plaats in een plastic weegboot een cirkelvormig filterpapier (1 mm diameter, gesneden met een oorpons met een diameter van 1 mm). Voeg 1 μL 6% FeCl3-oplossing (gemaakt in dH2O) toe aan het filtreerpapier.
OPMERKING: Zorg ervoor dat u de FeCl3-oplossing toevoegt vlak voordat u het filterpapier gebruikt. Het te vroeg weken van het papier kan leiden tot de verdamping van FeCl3-oplossing en de ernst van de verwonding veranderen. - Pak met een fijne tang het filterpapier op en leg het op de slagader stroomopwaarts van de sonde, op het deel van de slagader dat door het plastic wordt gemarkeerd (figuur 2D, E). Deze kunststof fungeert als een marker en een afstandhouder. Het markeert het gewonde gebied en voorkomt onbedoelde verdunning van de FeCl3 door contact met het omliggende vochtige gebied te vermijden.
OPMERKING: Zorg ervoor dat het filterpapier recht is, niet geknepen of anderszins gevouwen op welke manier dan ook. Eenmaal op de slagader geplaatst, verander de positie van het filterpapier niet; Dit verandert de omvang van het letsel. - Nadat u het filterpapier hebt geplaatst, start u de timer en registreert u de bloedstroom. Verwijder na 3 minuten het papier en voeg zoutoplossing toe op de plaats van het letsel om de FeCl3 te verwijderen en het verwondingsproces te stoppen. Het maakt het gebied ook vochtig. In dit stadium moet de bloedstroom terugkeren naar het basisniveau, zoals geregistreerd vóór het letsel.
- Bewaak en neem de stroom op totdat deze is teruggebracht tot 10% van de oorspronkelijke opname of nul bereikt. Er is een gestage afname zodra de trombus zich begint te vormen op de plaats van het letsel (figuur 3C). Let op eventuele significante schommelingen in de stroom gedurende deze tijd.
- Om de stabiliteit van de trombus te bestuderen, registreert u de snelle toename van de bloedstroom na elke significante en consistente afname. Deze voorvallen worden geclassificeerd als embolisatie als gevolg van instabiele trombose (figuur 4D). Na de consistente afname van de stroom kan de operator het letsel op de slagader zien aan het einde van het experiment (figuur 2F, blauwe pijl / gestippelde ovaal).
- De occlusietijd van het vat wordt gedefinieerd als de volledige stopzetting van de bloedstroom gedurende ten minste 1 min. Noteer het tijdstip waarop een occlusieve trombus wordt gevormd, zoals blijkt uit de nulwaarde of significante afname van de stroom.
- Beëindig het experiment na 30 min. Als de trombus zich niet binnen 30 minuten na de bewaking vormt, neem dan de stroom op, stop de opname en verwijder de sonde.
- Reinig de sonde met 70% ethanol en een borstel om achtergebleven weefsel/haar of vuil te verwijderen. Droog de sonde volledig voordat u deze in de opbergdoos plaatst. Droog de sonde volledig voordat u deze in de opbergdoos plaatst voor langdurige opslag.
- Euthanaseer de muis door cervicale dislocatie. Plaats het karkas in de afvalzak van het karkas, gelabeld met de naam van het laboratorium en de datum.
2. Verzameling en voorbereiding van monsters voor seriële block face scanning elektronenmicroscopie (SBF-SEM) studies na FeCl 3-geïnduceerde verwonding
OPMERKING: Het gepresenteerde EM-protocol is geschikt voor monstervoorbereiding voor SBF-SEM. Deze beeldvormende techniek biedt een ongekende mogelijkheid om de driedimensionale structuur van bloedplaatjes in een stolsel te bestuderen. Met deze techniek wordt het monster gevisualiseerd als een reeks opeenvolgende blok SEM-afbeeldingen, gegenereerd naarmate men vordert in het monster. Belangrijke punten voor dit preparaat zijn: 1) het monster moet worden gekleurd met zware metalen voor inbedding; en 2) het ingebedde kunststofmonster moet op passende wijze worden bijgesneden voor montage in de SEM (zie figuur 6 voor een visual van bijgesneden monsters). Post-embedding kleuring is niet mogelijk binnen de SEM. Bij het verzamelen van een monster van een FeCl 3-geïnduceerde vaatbeschadiging voor EM-analyse, moeten de volgende wijzigingen worden aangebracht tijdens het uitvoeren van de operatie. De wijzigingen in het gepresenteerde FeCl3-operatieprotocol zijn ook van toepassing op elke vorm van elektronenmicroscopie. Anesthesievoorwaarden en de stappen voor het maken van een incisie en het blootleggen van de halsslagader zijn hetzelfde als in Protocol 1.
- Na het blootleggen van de halsslagader, markeert u de plaats van verwonding door het gebied losjes te omringen tussen twee chirurgische draden (grootte: 0,1 mm) (figuur 5A, B).
- Plaats de sonde onder de slagader, distaal van de onderste draad (figuur 5C).
- Plaats het plastic stuk onder de slagader tussen de twee draden om de plaats te markeren voor FeCl3-letsel (figuur 5C).
- Voer stroommetingen uit voordat u letsel uitvoert om de basale stroom te noteren. Deze metingen worden gebruikt om te beslissen in welk stadium het monster zal worden verzameld.
OPMERKING: Zorg ervoor dat het fixatief (3% paraformaldehyde / PFA + 0,1% glutaaraldehyde, beide gemaakt in 1x PBS) klaar is en bij RT. Als alternatief kan ook fixatie met 2,5% glutaaraldehyde in een zoute achtergrond worden gebruikt.
LET OP: Zowel paraformaldehyde als glutaaraldehyde zijn zeer giftig en irriterend. Tijdens het hanteren ervan moeten handschoenen, een oogschild en maskers worden gebruikt om te beschermen tegen blootstelling. Alle fixatieve oplossingen zijn giftig en fixatiestappen moeten worden uitgevoerd in een zuurkast. - Voer de blessure uit door FeCl 3-gedrenkt filterpapier gedurende 3 minuten op de slagader te plaatsen (8% FeCl3 wordt gebruikt) (deze tijd kan ook variëren). Verwijder na 3 minuten het filterpapier en voeg zoutoplossing toe op de plaats van de verwonding om overtollig restant FeCl3 te verwijderen. Deze stap is nodig om de variabele omvang van het letsel te voorkomen en het tellen van de stroom door de sonde te vergemakkelijken (figuur 5D).
- Controleer de stroommeting. Wanneer de stroom onder 50% van de beginwaarde daalt, verwijdert u de sonde. Droog het gebied snel en voeg het fixatiemiddel in het gebied toe om het letselgebied extern te fixeren.
- Houd de slagader onmiddellijk in de buurt van het letselgebied met een tang en snijd stroomafwaarts van de onderste draad en stroomopwaarts van de bovenste draad. Vraag indien nodig een andere persoon om te helpen het ene uiteinde te snijden. Leg het weefsel op de plastic weefselkweekschaal in dezelfde richting als het werd verzameld en voeg een paar druppels van het fixatiemiddel toe.
OPMERKING: Het doorsnijden van de slagader veroorzaakt onmiddellijk uitgebreide bloedingen, dus zorg ervoor dat u de slagader vasthoudt voordat u deze de eerste keer snijdt. In dit scenario wordt de muis geëxsanguineerd. De muis wordt geëuthanaseerd door exsanguinatie en cervicale dislocatie. - Reinig met behulp van een scalpel het extra weefsel rond de slagader. Let op de oriëntatie van de bloedstroom. Om dat te markeren, snijdt u het ene uiteinde horizontaal en het andere taps toelopend / schuin (figuur 5E).
- Bewaar het monster in fixatief (3% PFA en 0,1% glutaaraldehyde) gedurende 1 uur bij RT. Bewaar het monster vervolgens in 1% PFA bij 4 °C totdat het op nat ijs naar het monsterverwerkingslaboratorium wordt gestuurd voor EM-analyse.
OPMERKING: De monsters mogen niet worden ingevroren. De uitdagingen voor deze methode van monsterverzameling zijn:- De eerste meting is mogelijk niet optimaal of kan fluctueren na het letsel. Dit kan van invloed zijn op de omvang van het letsel dat wordt gekozen om te arresteren voor EM-analyse. Om dit probleem aan te pakken, moet u de basislijnmeting een paar minuten opnemen, nadat u verschillende posities van het plaatsen van de sonde hebt geprobeerd om te beslissen welke positie optimaal is.
- De tijd om het letsel te stoppen door externe fixatieve en daadwerkelijke snijden van de arteriële sectie voor analyse toe te voegen, kan variabiliteit toevoegen aan de mate van trombose. Wees snel tijdens het verzamelen van monsters na externe bevestiging.
- Ontvang de monsters voor verwerking voor EM-analyse in 1% PFA op nat ijs. Spoel de monsters gedurende 3 minuten op ijs met 0,1 M cacodylaatbuffer om verdere verwerking te starten.
- Bevestig de monsters gedurende 1 uur op ijs in 0,1 M cacodylaatbuffer + 2,5% glutaaraldehyde + 2 mM CaCl2.
- Gooi het fixeermiddel weg en was de monsters met koude 0,1 M natriumcacodylaatbuffer met 2 mM CaCl2 (5 x 3 min) (figuur 6A).
- Bevestig de monsters met osmiumoplossing (3% kaliumferrocyanide [K 4 C 6 N6Fe]+ 0,3 M cacodylaatbuffer + 4 mM CaCl 2 gemengd met een gelijk volume van 4% waterig osmiumtetroxide [OsO4; in ddH2 O]) gedurende 1 uur op ijs.
- Terwijl de monsters fixeren, maakt u verse 1% trichlooraceetaldehydehydraat (TCH) oplossing in ddH2O. Incubeer de oplossing bij 60 °C gedurende 1 uur terwijl u voorzichtig mengt.
- Was de monsters na het fixeren met ddH2O bij RT gedurende 5 x 3 min.
- Incubeer de monsters in gefilterde 1% TCH-oplossing (gemaakt in ddH2O) gedurende 20 minuten bij RT.
- Was de monsters met ddH2O bij RT (5 x 3 min).
- Fixeer de monsters in 2% osmiumtetroxide in ddH2O gedurende 30 minuten bij RT.
- Was de monsters met ddH2O bij RT gedurende 5 x 3 min elk.
- Plaats de monsters in 1% uranylacetaat (waterig) en incubeer een nacht bij 4 °C.
- Was de monsters met ddH2O bij RT gedurende 5 x 3 minuten elk, en verwerk ze met en bloc Walton's loodaspartaatkleuring.
- En bloc Walton's lood aspartaat kleuring3:
- Maak 30 mM L-asparaginezuuroplossing in ddH2O.
OPMERKING: Het asparaginezuur lost sneller op als de pH wordt verhoogd tot 3,8. Deze voorraadoplossing is 1-2 maanden stabiel als deze gekoeld wordt bewaard. - Maak 20 mM loodnitraatoplossing in 10 ml asparaginezuurbouillon en stel de pH in op 5,5 met 1 N KOH.
- Breng de monsters gedurende 30 minuten in loodaspartaatoplossing bij 60 °C, na vijf wasbeurten met ddH2O bij RT, elk gedurende 3 minuten.
- Maak 30 mM L-asparaginezuuroplossing in ddH2O.
- Droog de monsters uit met een gegradeerde ethanolserie. Gebruik de chemische uitdroging door Valdivia protocol18.
- Was de monsters in elk van de volgende oplossingen om het monster geleidelijk te drogen (figuur 6B):
25% ethylalcohol gedurende 3 min
50% ethylalcohol gedurende 3 min
75% ethylalcohol gedurende 3 min
95% ethylalcohol gedurende 3 min
100% ethylalcohol gedurende 10 minuten en herhaal de stap twee keer (in totaal drie wasbeurten).
- Was de monsters in elk van de volgende oplossingen om het monster geleidelijk te drogen (figuur 6B):
- Was de monsters gedurende 10 minuten in 100% propyleenoxide (PO) en herhaal de stap twee keer (in totaal drie wasbeurten).
- Incubeer in 50%/50% PO/hars met DMP 30 activator 's nachts bij RT, en embed in 100% Araldite 502/embed 812/DDSA met DMP30 activator gedurende 48 uur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De gegevens worden over het algemeen gepresenteerd als tijd tot occlusie, of tijd die nodig is om een volledig occlusieve trombus te vormen. Deze gegevens kunnen worden uitgezet als een Kaplan-Meier-overlevingscurve (figuur 4A)19, een dot plot met balken die de terminale bloedstroom weergeven op het moment van stopzetting van de bloedstroom of de beëindiging van een experiment (figuur 4B), of als een lijngrafiek (figuur 4C). De stabiliteit van de trombus kan met deze techniek worden bestudeerd. In de meeste gevallen, bij FeCl3-letsel, vormt de trombus zich geleidelijk en naarmate deze groeit, neemt de bloedstroom geleidelijk af en bereikt nul bij volledige occlusie van het vat. In sommige gevallen neemt de bloedstroom plotseling toe na een geleidelijke afname gedurende enkele minuten. Dit wordt geïnterpreteerd als gedeeltelijke uitscheiding van de groeiende trombus en kan worden beschouwd als een embolisatiegebeurtenis (figuur 4D). Occlusieve trombusmorfologie (figuur 7A) kan ook met deze methode worden bestudeerd.
Tabel 1: Potentiële technische uitdagingen in het FeCl 3-geïnduceerde trombosemodel en oplossingen. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Figuur 1: Chirurgische instrumenten die nodig zijn om FeCl 3-geïnduceerde trombose van de halsslagader bij muizen uit te voeren. (A) 1: LEICA S8AP0 microscoop en standaard. 2: Kleine dier verwarmde pad bedekt met aluminiumfolie. (B) 1: Gaassponzen. 2: 26 G x 3/8 naald. 3: 1 ml spuit. 4: Steriele applicators met katoenpunt. 5: Zwart gevlochten zijden hechtdraad. 6: Chirurgisch mes. 7: Roestvrijstalen meshandvat. 8: Commerciële ontharingscrème. 9: Oorstoot. 10: Schaar ontleden. 11: Fijne schaar. 12: Chirurgische tang. 13: Micro ontleedtang. 14: Oogverbandtang. 15: Hechttang. (C) Transonische stromingsonde met het flexibele gebied (rode pijl) en een inkeping die een vat vasthoudt (zwarte pijl). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Chirurgische stappen om de halsslagader voor te bereiden op letsel en vaatocclusie te meten. Maak met een schaar en een chirurgische tang een middellijngedeelte en trek voorzichtig het weefsel weg (A) om de halsslagader eronder bloot te leggen (B). De zwarte pijl geeft de richting van de bloedstroom (B) aan. Reinig het omliggende weefsel rond de halsslagader (C) en plaats een stuk plastic papier (geel plastic weergegeven door een zwarte pijl) en de sonde (D). Verwond het vat door FeCl 3-gedrenkt filterpapier (aangegeven door een rode pijl) op de slagader (E) te plaatsen. Verwijder het papier en controleer het letsel. Aan het einde is de verwonding zichtbaar als een geel-witte streep, aangegeven door de blauwe pijlpunt (F). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Bloedstroomuitlezing met behulp van de flowmeter. De bloedstroom in de halsslagader wordt gemeten met behulp van een flowmeter (A). De stroom wordt opgenomen met behulp van een recordfunctie op het tabblad Bestand (B). De basislijnstroom moet relatief constant zijn voordat het letsel wordt uitgevoerd (ongeveer 0,8 ml / min, aangegeven door een zwarte pijl) (B). Na het letsel neemt de bloedstroom gelijkmatig af (ongeveer 50% afname van de startwaarde, ongeveer 0,4 ml / min), weergegeven door een zwarte pijl (C). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Representatieve gegevenspresentaties van het FeCl 3-geïnduceerde carotisletselmodel. Verschillende methoden die beschikbaar zijn om gegevens van FeCl 3-geïnduceerd vasculaire letsel te presenteren, worden getoond. Kaplan-Meier overlevingscurves tonen de tijd tot occlusie voor elke muis. Een log-rank test wordt uitgevoerd voor statistische analyse. p ≤ 0,001 (A). De bloedstroom aan het einde van het experiment kan ook worden weergegeven in een staafdiagram (B). Voor de in B weergegeven gegevens werd een ongepaarde t-test uitgevoerd *** p ≤ 0,001. De foutbalk staat voor gemiddelde ± SD. De Doppler-stroomgegevens die na de verwonding van een enkel dier zijn verzameld, kunnen worden weergegeven in een lijngrafiek (C). Voorbeeld van een mogelijke embolisatiegebeurtenis door de plotselinge toename van de bloedstroom na een aanhoudende geleidelijke afname van de stroom in een enkele muis op verschillende tijdstippen (D). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Verzameling van FeCl 3-geïnduceerde letselstolsels voor elektronenmicroscopiestudies. Na het blootleggen van een slagader (A), markeert u de plaats van het letsel door de draden losjes te binden (B) en plaatst u het plastic papier onder de slagader en de sonde stroomafwaarts ervan (C). Voer het letsel uit en bewaak de schade (D). Verzamel het weefsel zoals uitgelegd in de tekst en reinig en snijd het monster recht aan de ene kant en schuin aan de andere kant om de richting van de bloedstroom aan te geven (de zwarte pijl geeft de richting van de bloedstroom aan en de rode omtrek geeft het gewonde gebied aan) (E). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Postfixatieverwerking en montage van monsters voor elektronenmicroscopie. De monsters worden gewassen in microcentrifugebuizen tussen verwerkingsstappen (A) en serieel gedehydrateerd met een verhoogde concentratie ethanol (B). Na verwerking worden ze ingebed in hars (C) en de blokken worden gemarkeerd met de richting van de bloedstroom (D) en vervolgens in plakjes gesneden voor beeldvorming. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 7: Representatieve elektronenmicrografieën van proximale en distale regio's van een volledig occlusieve trombus na FeCl 3-gemedieerde carotisbeschadiging. (A) Een volledige dwarsdoorsnede van een afgesloten slagader, proximaal ten opzichte van de plaats van het letsel, met inzetstukken eronder, met structuren bij een hogere vergroting (a: 2x, en a': 4x). Het gewonde gebied wordt aangegeven met een pijl in A. Schaalbalk: 100 μm. (B) Een volledige dwarsdoorsnede van een afgesloten slagader, distaal van de plaats van het letsel, met inzetstukken eronder, met structuren bij hogere vergroting (b: 2x en b': 4x). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullende tabel 1: Een kort overzicht van variaties in diermodellen, FeCl 3-verwondingsplaats, FeCl3-concentratie, letselmethode en trombosetijden. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De topische toepassing van FeCl3 op de vasculatuur om trombose te induceren is een veel gebruikte techniek en heeft een belangrijke rol gespeeld bij het vaststellen van rollen voor verschillende bloedplaatjesreceptoren, ligandsignaleringsroutes en hun remmers20,21,22,23. Het mechanisme waardoor FeCl3 trombose veroorzaakt is veelzijdig; Eerder werd endotheeldenudatie beschouwd als een oorzaak van trombose, maar in de afgelopen jaren hebben meerdere rapporten de rol van rode bloedcellen en plasma-eiwitten in dit proces gesuggereerd24,25,26,27.
De meest kritieke stappen in dit protocol zijn: de plaatsing van de Doppler-sonde om een optimale stroom te krijgen, de plaatsing van het filterpapier en de snelle beëindiging van de verwonding om het monster op te halen en onmiddellijk te fixeren. De gevolgen van ongelukken in deze stappen en hoe deze aan te pakken, worden beschreven in tabel 1. Hoewel eenvoudig en gevoelig, kan deze techniek een uitdaging zijn om te gebruiken, afhankelijk van het diermodel, de achtergrond van het dier, de plaats van vasculair letsel, de concentratie van FeCl 3, FeCl3-toepassingsmethode, de duur van de toepassing, de leeftijd en het geslacht van het dier en het type anesthesie dat wordt gebruikt. Deze verschillen kunnen verantwoordelijk zijn voor het relatief brede bereik van trombosetijden in C57BL/6J gerapporteerd in de literatuur (aanvullende tabel 1)27,28,29,30,31,32. Dit protocol stelt voor om muizen van 8-10 weken oud te gebruiken voor het experiment, omdat de grootte van de vasculatuur gemakkelijker te visualiseren en te surgeriseren is. Sommige groepen hebben muizen gebruikt zo jong als 6 weken oud33. Het is noodzakelijk om de leeftijd van de muizen te matchen voor een consistente en reproduceerbare vergelijking tussen verschillende diergroepen. De beschreven anesthesie, tribromoethanol, heeft de voorkeur omdat het direct beschikbaar is, gemakkelijker toe te dienen is, het een anesthesievlak handhaaft voor de vereiste duur en de vereiste dosering reproduceerbaar is. Veel andere verdovingsopties zijn beschikbaar, waaronder isofluraan en verschillende combinaties van tribromoethanol met tertiaire amylalcohol met xylazine en / of acepromazine. Het is noodzakelijk om een optimale dosis te gebruiken om sedatie te bereiken zonder de hartslag of bloeddruk van het dier negatief te beïnvloeden. Het gebruik van dezelfde methode van anesthesie gedurende het hele experiment voorkomt mogelijke samengestelde effecten op de trombosetijd.
Dit manuscript presenteert een gedetailleerde procedure om gegevensvariaties te minimaliseren en de reproduceerbaarheid te vergroten. Er wordt een tabel verstrekt om enkele problemen op te lossen die zich tijdens deze operatie kunnen voordoen (tabel 1). Bovendien stelt dit manuscript een methode voor om monsters te verzamelen aan het einde van het letsel om de structuur en morfologie van een occlusieve trombus te bestuderen (figuur 7). De resolutie van EM biedt een betere visualisatie dan voorheen mogelijkwas 25 van bloedplaatjes in een groeiende thombus, en hoe ze interageren met andere bloedplaatjes en het endotheel, zowel proximaal als distaal van het vasculaire letsel. Het kan ook worden gebruikt om verschillende activeringsstadia van bloedplaatjes op de plaats van de verwonding te bestuderen.
Een ander belangrijk voordeel van deze techniek is dat de operator aan de hand van basislijnmetingen kan bepalen in welk stadium het trombusmonster wordt verzameld. Opgemerkt moet worden dat dit geschatte timings zijn en niet de exacte omvang van letsel / trombose aangeven. Basale metingen zijn afhankelijk van de optimale plaatsing van de sonde en als ze niet correct worden geplaatst, kunnen de metingen slechts gedeeltelijke stroming registreren. Dit leidt tot een verkeerde interpretatie van de beëindigingstijd en dus morfologie van het verzamelde monster. Onmiddellijke beëindiging van het letselproces en onmiddellijke fixatie van de monsters zijn vereist om consistente en reproduceerbare resultaten te bereiken.
Dit protocol presenteert de minimaal vereiste instellingen voor de evaluatie van occlusieve trombose. Met de vooruitgang in microscopie hebben verschillende groepen deze techniek gebruikt om de bloedplaatjes / endotheelcellen en / of de bloedplaatjesafgifte, zoals PF4 en P-Selectine en fibrine, fluorescerend te labelen om specifieke aspecten van in vivo trombose te visualiseren en de kinetiek ervan te bepalen34,35. Zoals beschreven, kan de methode hier rapporteren over embolisatiegebeurtenissen, die wijzen op trombusinstabiliteit (figuur 4D).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten met betrekking tot deze studie.
ORCID profielen: S.J.: 0000-0001-6925-2116; ZW: 00000-0001-5577-0473.
Acknowledgments
De auteurs bedanken de leden van het Whiteheart Laboratory voor hun zorgvuldige inzage van dit manuscript. Het werk werd ondersteund door subsidies van de NIH, NHLBI (HL56652, HL138179 en HL150818), en een Department of Veterans Affairs Merit Award aan S.W.W., R01 HL 155519 aan B.S., en NIBIB intramurale programmasubsidie aan R.D.L.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% Saline | Fisher Scientific | BP358-212 | NaCl used to make a solution of 0.9% saline |
| 1 mL Syringe | Becton, Dickinson and Company | 309659 | |
| 190 Proof Ethanol | KOPTEC | V1101 | Used to make a 70% ethanol solution to use for prepping the mouse for surgery |
| 2,2,2 Tribromoethanol | Sigma Aldrich | 48402 | |
| 25 Yard Black Braided Silk Suture (5-0) | DEKNATEL | 136082-1204 | |
| 26G x 3/8 Needle | Becton, Dickinson and Company | 305110 | |
| 2-methyl-2-butanol | Sigma Aldrich | 240486 | |
| 7.5 mL Transfer Pipet, Graduated to 3 mL | Globe Scientific Inc. | 135010 | |
| Alcohol Prep Pads (70% Isopropyl Alcohol) | Medline | MDS090735 | |
| Araldite GY 502 | Electron microscopy Services | 10900 | |
| Cell Culture Dish 35mm X 10mm | Corning Incorporated | 430165 | |
| Compact Scale | Ward's Science | 470314-390 | |
| Dissecting Scissors, 12.5 cm long | World Precision Instrument | 15922-G | |
| DMP-30 activator | Electron microscopy Services | 13600 | |
| Dodenyl Succinic Anhydride/ DDSA | Electron microscopy Services | 13700 | |
| Doggy Poo Bags/animal carcass disposal bag | Crown Products | PP-RB-200 | |
| Doppler FlowProbe | Transonic Systems Inc. | MA0.5PSB | |
| EMBED 812 resin | Electron microscopy Services | 14900 | |
| Ethyl Alcohol, anhydrous 200 proof | Electron microscopy Services | 15055 | |
| Eye Dressing Forceps, 4" Full Curved, Standard, 0.8mm Wide Tips | Integra Miltex | 18-784 | |
| Filter Paper | VWR | 28310-106 | |
| Fine Scissors - Sharp-Blunt | Fine Science Tools | 14028-10 | |
| Finger Loop Ear Punches | Fine Science Tools | 24212-01 | |
| Gauze Sponges 2” x 2” – 12 Ply | Dukal Corporation | 2128 | |
| Glutaraldehyde (10% solution) | Electron microscopy Services | 16120 | |
| Integra Miltex Carbon Steel Surgical Blade #10 | Integra® Miltex® | 4110 | |
| Iron (III) Chloride | SIGMA-ALDRICH | 157740-100G | |
| Knife Handle Miltex® Extra Fine Stainless Steel Size 3 | Integra Lifesciences | 157510 | |
| L-aspartic acid | Sigma Fisher | A93100 | |
| L-aspartic acid | Fisher Scientific | BP374-100 | |
| Lead Nitrate | Fisher Scientific | L-62 | |
| LEICA S8AP0 Microscope | LEICA | No longer available | No longer available from the company |
| LEICA S8AP0 Microscope Stand | LEICA | 10447255 | No longer available from the company |
| Light-Duty Tissue Wipers | VWR | 82003-822 | |
| Micro Dissecting Forceps; 1x2 Teeth, Full Curve; 0.8 mm Tip Width; 4" Length | Roboz Surgical Instrument Company | RS-5157 | |
| Osmium Tetroxide 4% aqueous solution | Electron microscopy Services | 19150 | |
| Paraformaldehyde (16% solution) | Electron microscopy Services | 15710 | |
| Potassium ferricyanide | SIGMA-ALDRICH | P-8131 | |
| Propylene Oxide, ACS reagent | Electron microscopy Services | 20401 | |
| Rainin Classic Pipette PR-10 | Rainin | 17008649 | |
| Research Flowmeter | Transonic Systems Inc. | T402B01481 | Model: T402 |
| Scotch Magic Invisible Tape, 3/4" x 1000", Clear | Scotch | 305289 | |
| Small Animal Heated Pad | K&H Manufacturing Inc. | Model: HM10 | |
| Sodium Cacodylate Buffer 0.2M, pH7.4 | Electron microscopy Services | 11623 | |
| Sterile Cotton Tipped Applicators | Puritan Medical Products | 25-806 1WC | |
| Steromaster Illuminator | Fisher Scientific | 12-562-21 | No longer available from the company |
| Surgical Dumont #7 Forceps | Fine Science Tools | 11271-30 | |
| Thiocarbohydrazide (TCH) | SIGMA-ALDRICH | 88535 | |
| Universal Low Retention Pipet Tip Reloads (0.1-10 µL) | VWR | 76323-394 | |
| Uranyl Acetate | Electron microscopy Services | 22400 | |
| Veet Gel Cream Hair Remover | Reckitt Benckiser | 3116875 | |
| White Antistatic Hexagonal Weigh Boats, Medium, 64 x 15 x 19 mm | Fisher Scientific | S38975 | |
| WinDAQ/100 Software for Windows | DATAQ Instruments, Inc. | Version 3.38 | Freely available to download. https://www.dataq.com/products/windaq/ |
| ZEISS AxioCam Icc 1 | ZEISS | 57615 |
References
- Lozano, R., et al. Global and regional mortality from 235 causes of death for 20 age groups in 1990 and 2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2010. Lancet. 380 (9859), 2095-2128 (2012).
- Raskob, G. E., et al. Thrombosis: a major contributor to global disease burden. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34 (11), 2363-2371 (2014).
- Walton, J. Lead aspartate, an en bloc contrast stain particularly useful for ultrastructural enzymology. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 27 (10), 1337-1342 (1979).
- Palta, S., Saroa, R., Palta, A.
- Joshi, S., Whiteheart, S. W. The nuts and bolts of the platelet release reaction. Platelets. 28 (2), 129-137 (2017).
- Periayah, M. H., Halim, A. S., Mat Saad, A. Z. Mechanism action of platelets and crucial blood coagulation pathways in hemostasis. International Journal of Hematology-Oncology and Stem Cell Research. 11 (4), 319-327 (2017).
- Alexopoulos, D., Katogiannis, K., Sfantou, D., Lekakis, J. Combination antiplatelet treatment in coronary artery disease patients: A necessary evil or an overzealous practice. Platelets. 29 (3), 228-237 (2018).
- Kurz, K. D., Main, B. W., Sandusky, G. E. Rat model of arterial thrombosis induced by ferric chloride. Thrombosis Research. 60 (4), 269-280 (1990).
- Denis, C. V., et al. Towards standardization of in vivo thrombosis studies in mice. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 9 (8), 1641-1644 (2011).
- Marsh Lyle, E., et al. Assessment of thrombin inhibitor efficacy in a novel rabbit model of simultaneous arterial and venous thrombosis. Thrombosis and Haemostasis. 79 (3), 656-662 (1998).
- Kato, Y., et al. Inhibition of arterial thrombosis by a protease-activated receptor 1 antagonist, FR171113, in the guinea pig. European Journal of Pharmacology. 473 (2-3), 163-169 (2003).
- Huttinger, A. L., et al. Ferric chloride-induced canine carotid artery thrombosis: a large animal model of vascular injury. Journal of Visualized Experiments. (139), e57981 (2018).
- Zhang, W., et al. Antithrombotic therapy by regulating the ROS-mediated thrombosis microenvironment and specific nonpharmaceutical thrombolysis Using Prussian blue nanodroplets. Small. 18 (15), 2106252 (2022).
- Liu, B., et al. Platelet membrane cloaked nanotubes to accelerate thrombolysis by thrombus clot-targeting and penetration. Small. , 2205260 (2022).
- Refaat, A., et al. Near-infrared light-responsive liposomes for protein delivery: Towards bleeding-free photothermally-assisted thrombolysis. Journal of Controlled Release. 337, 212-223 (2021).
- Li, S., et al. Biomimetic nanoplatelets to target delivery hirudin for site-specific photothermal/photodynamic thrombolysis and preventing venous thrombus formation. Small. 18 (51), 2203184 (2022).
- Subramaniam, S., Kanse, S. M. Ferric chloride-induced arterial thrombosis in mice. Current Protocols in Mouse Biology. 4 (4), 151-164 (2014).
- Cocchiaro, J. L., Kumar, Y., Fischer, E. R., Hackstadt, T., Valdivia, R. H. Cytoplasmic lipid droplets are translocated into the lumen of the Chlamydia trachomatis parasitophorous vacuole. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (27), 9379-9384 (2008).
- Kaplan, E. L., Meier, P.
- Chauhan, A. K., Kisucka, J., Lamb, C. B., Bergmeier, W., Wagner, D. D. von Willebrand factor and factor VIII are independently required to form stable occlusive thrombi in injured veins. Blood. 109 (6), 2424-2429 (2007).
- Andre, P., et al. CD40L stabilizes arterial thrombi by a beta3 integrin--dependent mechanism. Nature Medicine. 8 (3), 247-252 (2002).
- Ni, H., et al. Persistence of platelet thrombus formation in arterioles of mice lacking both von Willebrand factor and fibrinogen. Journal of Clinical Investigation. 106 (3), 385-392 (2000).
- Bergmeier, W., et al. The role of platelet adhesion receptor GPIbalpha far exceeds that of its main ligand, von Willebrand factor, in arterial thrombosis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (45), 16900-16905 (2006).
- Ciciliano, J. C., et al. Resolving the multifaceted mechanisms of the ferric chloride thrombosis model using an interdisciplinary microfluidic approach. Blood. 126 (6), 817-824 (2015).
- Eckly, A., et al. Mechanisms underlying FeCl3-induced arterial thrombosis. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 9 (4), 779-789 (2011).
- Woollard, K. J., Sturgeon, S., Chin-Dusting, J. P. F., Salem, H. H., Jackson, S. P. Erythrocyte hemolysis and hemoglobin oxidation promote ferric chloride-induced vascular injury. Journal of Biological Chemistry. 284 (19), 13110-13118 (2009).
- Shim, Y., et al. Characterization of ferric chloride-induced arterial thrombosis model of mice and the role of red blood cells in thrombosis acceleration. Yonsei Medical Journal. 62 (11), 1032-1041 (2021).
- Ghosh, S., et al. Evaluation of the prothrombotic potential of four-factor prothrombin complex concentrate (4F-PCC) in animal models. PLoS One. 16 (10), 0258192 (2021).
- Wilbs, J., et al. Cyclic peptide FXII inhibitor provides safe anticoagulation in a thrombosis model and in artificial lungs. Nature Communications. 11 (1), 3890 (2020).
- Wei, Y., Deng, X., Sheng, G., Guo, X. B. A rabbit model of cerebral venous sinus thrombosis established by ferric chloride and thrombin injection. Neuroscience Letters. 662, 205-212 (2018).
- Jacob-Ferreira, A. L., et al. Antithrombotic activity of Batroxase, a metalloprotease from Bothrops atrox venom, in a model of venous thrombosis. International Journal of Biological Macromolecules. 95, 263-267 (2017).
- Zhou, X., et al. A rabbit model of cerebral microembolic signals for translational research: preclinical validation for aspirin and clopidogrel. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 14 (9), 1855-1866 (2016).
- Yang, X., et al. Effect of evodiamine on collagen-induced platelet activation and thrombosis. BioMed Research International. 2022, 4893859 (2022).
- Li, W., McIntyre, T. M., Silverstein, R. L. Ferric chloride-induced murine carotid arterial injury: A model of redox pathology. Redox Biology. 1 (1), 50-55 (2013).
- Li, W., Nieman, M., Sen Gupta, A. Ferric chloride-induced murine thrombosis models. Journal of Visualized Experiments. (115), e54479 (2016).
- Holly, S. P., et al. Ether lipid metabolism by AADACL1 regulates platelet function and thrombosis. Blood Advances. 3 (22), 3818-3828 (2019).
- Bird, J. E., et al. Prediction of the therapeutic index of marketed anti-coagulants and anti-platelet agents by guinea pig models of thrombosis and hemostasis. Thrombosis Research. 123 (1), 146-158 (2008).
