Summary
I denne protokol blev der udarbejdet en knæartrosemodel ved hjælp af den modificerede Videman-metode, og operationsprocedurerne og forholdsreglerne ved akupotomi er detaljerede. Effektiviteten af akupotomi er blevet påvist ved at teste de mekaniske egenskaber af quadriceps femoris og sener og bruskens mekaniske og morfologiske egenskaber.
Abstract
Knæartrose (KOA) er en af de hyppigst forekommende sygdomme i den ortopædiske afdeling, hvilket alvorligt reducerer livskvaliteten hos mennesker med KOA. Blandt flere patogene faktorer er knæleddets biomekaniske ubalance en af hovedårsagerne til KOA. Acupotomology mener, at genopretning af knæleddets mekaniske balance er nøglen til behandling af KOA. Kliniske undersøgelser har vist, at akupotomi effektivt kan reducere smerter og forbedre knæmobiliteten ved at reducere vedhæftning, kontraktur af blødt væv og stresskoncentrationspunkter i muskler og sener omkring knæleddet.
I denne protokol brugte vi den modificerede Videman-metode til at etablere en KOA-model ved at immobilisere venstre bagben i en lige position. Vi har skitseret driftsmetoden og forholdsreglerne i forbindelse med akupotomi i detaljer og evalueret effektiviteten af akupotomi i forbindelse med teorien om "Modulerende muskler og sener til behandling af knoglelidelser" gennem påvisning af de mekaniske egenskaber af quadriceps femoris og sener samt bruskmekanik og morfologi. Resultaterne viser, at akupotomi har en beskyttende virkning på brusk ved at justere de mekaniske egenskaber af blødt væv omkring knæleddet, forbedre bruskstressmiljøet og forsinke bruskdegeneration.
Introduction
Knæartrose (KOA) er den hyppigste form for slidgigt, ofte anerkendt som en helledssygdom karakteriseret ved ledbruskdegeneration, som manifesterer sig klinisk som smerte, hævelse og begrænset bevægelse af de berørte led1. Ifølge de seneste epidemiologiske statistikker rapporteres KOA at have påvirket 654.1 millioner individer globalt, der var 40 år eller ældre i 2020. Forekomsten og forekomsten af KOA stiger med alderen, er den højeste hos midaldrende og ældre voksne og rammer flere kvinder end mænd2. Forekomsten af KOA vil sandsynligvis stige på grund af den aldrende befolkning og fedmeepidemien over hele verden, hvilket udgør en voksende trussel mod den globale folkesundhed. Alder, køn, fedme, traumer og andre komplicerede risikofaktorer forbundet med KOA påvirker alle direkte knæets ustabilitet, hvilket gør en biomekanisk ubalance i knæleddene til en af de primære årsager til KOA3.
Under normale fysiologiske forhold er knæleddet i en tilstand af mekanisk balance, hvilket sikrer, at de mekaniske belastninger i leddet fordeles jævnt på brusk. Enhver mekanisk ubalance i knæleddet kan føre til unormal belastning i brusk, hvilket resulterer i bruskdegeneration og udbrud af KOA4. Muskel-senesystemet er det vigtigste dynamiske system, der opretholder knæleddets mekaniske balance. Den koordinerede bevægelse af ekstensor- og flexormuskel-senesystemet kan jævnt fordele belastningen, der genereres af bevægelsen på bruskoverfladen, og undgå den metaboliske ubalance i lokale bruskspændinger ud over dens fysiologiske belastning, der resulterer i brusktab5. Nedsat muskelstyrke er hovedårsagen til intramuskulær bevægelsesforstyrrelse og bruskskader, som kan forekomme før symptomatisk KOA.
KOA kan også inducere artrogen muskelhæmning (AMI), der manifesterer sig som muskelsvaghed og nedsat muskelstyrke omkring knæet6. Blandt disse muskler fungerer quadriceps femoris-gruppen som den eneste knæekstensor, en vigtig struktur for at opretholde knæledstabilitet. Undersøgelser har vist, at et fald i quadriceps tværsnitsareal og muskelstyrke er signifikant og positivt korreleret med KOA progression7. Faldet i quadriceps styrke påvirker gangmønsteret, knæstabiliteten, bevægelsesmønstre og mange andre funktioner. Desuden forringer faldet i muskelstyrke senefunktionen, manifesteret som et fald i senestivhed, elastisk modul og andre biomekaniske egenskaber8. Ved langvarig belastningsreparation kan ændringer som vedhæftning og kontraktur forekomme i knæleddets muskler og sener, beskadige deres mekaniske egenskaber, forårsage ledstabilitet og i sidste ende danne en ond cirkel af patologiske ændringer af KOA. Det er derfor afgørende for KOA-behandlingen at forbedre muskelsenesystemets mekaniske egenskaber og genoprette den fælles mekaniske balance.
Blandt årsagerne til KOA er biomekanisk ubalance den vigtigste inducerende faktor for knæsmerter, dysfunktion, inflammatoriske læsioner og bruskdegeneration9. Derfor er nøglen til behandling af KOA at genoprette knæleddets biomekaniske balance. Acupotomology mener, at ætiologien og patogenesen af KOA er "mekanisk ubalance". Når de mekaniske egenskaber ved blødt væv omkring knæet ændres unormalt, mister knæleddet sin mekaniske balance, og leddets unormale mekaniske stressmiljø fremskynder degeneration, hvilket forårsager inflammatorisk stimulering for yderligere at forværre blødt vævs adhæsioner, kontrakturer og yderligere fald i ledstabilitet. Denne onde cirkel udvikler sig til sidst til KOA. Ved at løsne blødt vævs adhæsioner og kontrakturer samt reducere stresskoncentrationen i muskler og sener forbedrer akupotomi sammen med teorien om "modulerende muskler og sener til behandling af knoglelidelser" bløddelsmekanikken og "modulerer muskler og sener", som balancerer leddets mekaniske belastning, effektivt lindrer bruskdegeneration og "behandler knoglesygdomme"10. Med hensyn til valg af dyremodel, baseret på formålet med denne undersøgelse, udarbejdede vi KOA-modellen ved den modificerede Videman-metode til immobilisering af venstre bagbensforlængelse.
Dette papir beskriver etableringen af KOA-modellen ved hjælp af den modificerede Videman-metode til forlængelse af venstre bagben, immobilisering og driftsmetode og forholdsregler ved akupotomi. Vi demonstrerer effektiviteten af akupotomi ved at teste de mekaniske egenskaber af quadriceps femoris og sener og detektere ændringer i ledbruskstress og morfologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøg blev gennemgået og godkendt af Animal Ethics Committee of Beijing University of Chinese Medicine (nr. BUCM-4-2022010101-1097). I denne protokol blev 24 6 uger gamle newzealandske hankaniner anbragt under en bestemt tilstand, nemlig 20-25 °C, 50-60% fugtighed og en 12 timers lys/12 timers mørk døgnrytme med fri adgang til en almindelig chow-diæt. Kaninerne blev bedøvet og ofret ved at kombinere dyb anæstesi og luftembolisering. Smerter er et af de typiske patologiske træk ved KOA og er også en af nøgleindikatorerne, der bruges til at evaluere dyremodeller af KOA og interventionsmetoder, så smertestillende midler anvendes ikke under modelforberedelse.
1. KOA kaninmodellen
- Bedøv kaniner med 3% pentobarbitalnatrium (30 mg / kg) intravenøst ved ørekanten. For at bekræfte det passende niveau af anæstesi skal du kigge efter en signifikant svækket eller fraværende hornhinderefleks og fraværet af smerte ved fastspænding af huden med hæmostatiske tang. Under anæstesi tilsættes 2-3 dråber smøremiddel til kaninernes øjne hvert 15. minut for at forhindre, at kaninernes øjne tørrer ud.
- Efter anæstesi skal du fastgøre hver kanin i liggende stilling og trække venstre bagben i en fuldt udvidet position.
- Fastgør venstre bagben af hver kanin i udvidet position.
- Som det første lag skal du bruge medicinsk tape til at dække kaninens hud fra lysken til ankelleddet.
- Som det andet lag vikles 36 mm bredt, dobbeltsidet skumtape over medicinsk tape og vikles derefter en polymerbandage fra lysken til ankelleddet. Sørg for, at knæleddet er 180° lige, og at ankelleddet er dorsiflexet med 60°.
- Som det tredje lag skal du immobilisere leddene med små skinner foran og bag på knæ- og ankelleddene og vikle stålnet rundt om det yderste lag for at beskytte mod bid. Udsæt kaninernes tæer for at observere, om blodcirkulationen er normal.
- Immobiliser dyrene i 6 uger for at etablere KOA-modellen (figur 1).
BEMÆRK: 1) Under modelforberedelsen skal du inspicere formene hver anden dag. Hvis nogen forme er løse eller løsrevet, bedøve kaninerne og re-immobilisere venstre bagben i en udvidet position. 2) Læg beskyttelsesmåtter på bunden af burene for at forhindre, at kaninernes lemmer sidder fast og forårsager skade.
2. Acupotomy intervention
BEMÆRK: Før starten af akupotomiinterventionen bedøves kaninerne med 3% pentobarbitalnatrium (30 mg / kg) ved intravenøs injektion af øremarginen.
- Bestem behandlingspunkterne.
- Barber pelsen af knæleddet på kaninens venstre bagben.
- Palperer kaninens knæleds mediale lårbensmuskel seneindsættelse, rektus lårbensseneindsættelse, biceps femoris seneindsættelse og gåsefod bursa. Marker patologiske indurationer af lokale muskler med en steril hudmarkør. Desinficere knæleddet tre gange med skiftende runder af medicinsk iodophor og 75% medicinsk alkohol.
- Operation af akupotomi
- Hold akupotomibladet parallelt med kørselsretningen parallelt med senen og lemmens længdeakse.
- Brug tommelfingeren på venstre hånd til at trykke ned på huden, der kommer ind i markørpunktet, og bevæg dig sideværts, så blodkar og nerver adskilles på den ventrale side af tommelfingeren.
- Med akupotomihåndtaget i højre hånd trykkes hurtigt ned med en lille kraft, så akupotomibladet øjeblikkeligt passerer gennem huden. Fremfør langsomt akupotomibladet til de lokale muskelindurationer og lav langsgående snit og svinger sideværts.
- Når akupotomioperationen er afsluttet, desinficeres knæleddet igen og påføres et båndhjælpemiddel.
- Udfør denne operation en gang om ugen i 4 uger (figur 2).
BEMÆRK: 1) Hvis der ikke er induration eller snorelignende væv berørt ved seneindsættelsen af vastus medialis, vastus lateralis, rectus femoris, biceps femoris eller anserine bursa, skal akupotominålen bruges til at frigive deres seneindsættelser direkte. 2) Under akupotomiintervention må du ikke immobilisere venstre bagben af kaniner i akupotomigruppen og modelgruppen i forlængelsesposition.
3. Elastisk modul af quadriceps femoris
BEMÆRK: 1) Dette eksperiment brugte ultralydsdiagnostisk instrument til realtidsforskydningsbølgeelastografi (SWE) til at måle det elastiske modul af quadriceps femoris in vivo i hver gruppe kaniner. 2) Testeren skal være en erfaren sonograf i ultralyddetektion. Ved måling skal ultralydssonden forsigtigt placeres på hudoverfladen af quadriceps for at undgå lokal muskelspænding. Målinger skal tages, når dyret er i en stille tilstand uden kamp eller aktivitet. Hvis dyret er aktivt, skal du vente, indtil det er roligt, før du udfører testen.
- Barber pelsen for at udsætte huden i quadriceps regionen af venstre bagben.
- Brug konventionel todimensionel ultralyd til at lokalisere quadriceps musculo-abdomen og bestemme interesseområdet (ROI), indstillet til en dybde på 1-2 cm.
- Start SWE-tilstand til inspektion.
- Indstil interesseområdet ensartet til et cirkulært område med en diameter på 2 mm og interesseområdet til ~ 0,5-1 cm dybt fra hudens overflade.
- Brug ultralyddiagnostisk instrument til at generere en akustisk strålingskraftimpuls for at stimulere muskelvævet og opnå vævselastografi.
- Vent i 2-3 sekunder på, at billedet stabiliseres, og frys derefter billedet. Aktivér instrumentets Q-BOX-funktion for at måle Youngs modul i quadriceps muskelen.
- Vent på, at systemet automatisk beregner maksimum-, minimum- og gennemsnitsværdierne (enhed: KPa) for Youngs ROI-modul. Vælg tre ROI'er i samme dybde for tre målinger, og tag gennemsnitsværdien til statistisk analyse.
BEMÆRK: Testeren skal være en erfaren sonograf i ultralyddetektion. Ved måling skal ultralydssonden forsigtigt placeres på hudoverfladen af quadriceps for at undgå lokal muskelspænding. Målinger skal tages, når dyret er i en stille tilstand uden kamp eller aktivitet. Hvis dyret er aktivt, skal du vente, indtil det er roligt, før du udfører testen.
4. Måling af sammentrækningskraften af quadriceps femoris
BEMÆRK: Efter måling af sammentrækningskraften af quadriceps femoris blev kaninerne aflivet ved luftemboli under anæstesi.
- Bedøv kaninerne med 3% pentobarbitalnatrium (30 mg / kg) intravenøst ved ørekanten. For at bekræfte, at det passende niveau af anæstesi er nået, skal du kigge efter en signifikant svækket eller fraværende hornhinderefleks og fraværet af smerte ved fastspænding af huden med hæmostatisk tang. Under anæstesi tilsættes 2-3 dråber smøremiddel til kaninernes øjne hvert 15. minut for at forhindre, at kaninernes øjne tørrer ud.
- Udsæt quadriceps musklerne og fastgør spændingstransduceren.
- Skær huden under patellaen langs lemmens længdeakse opad til lårets bund, og fortsæt med at skære huden opad med 3-4 cm. Skræl forsigtigt huden og fasciaen af, og udsæt musklen. Skær patellar ligamentet og adskil forsigtigt quadriceps fra iliac junction, og hold quadriceps i forbindelse med iliacium.
- Ligate de kirurgiske suturer ved senekrydset mellem patella og quadriceps muskel. Stræk musklen til sin fulde længde i sin naturlige tilstand, og fastgør den derefter til spændingstransduceren. Hold ligeringslinjen på musklen i en lige linje med ligeringslinjen på krafttransduceren.
- Fastgør spændingstransduceren til beslaget. Tilslut signaloptagelseslinjen på spændingstransduceren til biosignaloptagelsessystemprocessoren.
- Mål quadriceps muskelens kontraktile ydeevne.
- Indsæt elektroderne parallelt med quadriceps abdomen og undgå enhver kontakt mellem elektroderne.
- Tryk på oscilloskopknappen. Juster krafttransducerens position på beslaget for at holde basislinjen på nul. Vælg stimulatorens stimuleringsparametre med en bølgebredde på 5 ms og en forsinkelse på 10 ms.
- Brug først en enkelt stimulus og juster gradvist stimulusintensiteten fra nul med en stigning på 0,1 V hver gang. Overhold ændringerne i muskelkontraktionskurven og kontraktionsamplitude, indtil quadriceps maksimale enkeltkontraktionsamplitude (Pt) bestemmes. Optag det til efterfølgende statistik.
- Brug en klyngestimulus, og brug stimulusamplituden, der inducerer den maksimale enkeltkontraktionsamplitude som basislinje for kontinuerligt at stimulere musklen og gradvist øge stimulusfrekvensen. Overhold ændringerne i muskelkontraktionskurven, indtil quadriceps maksimale sammentrækningsamplitude (Pt) er bestemt. Optag det til efterfølgende statistik.
BEMÆRK: 1) Efter hver muskelsammentrækning skal musklen gives 30 s for at slappe af med muskelbufferopløsningen, der dryppes kontinuerligt på musklen. 2) Under operationen bedømmes anæstesistatus ved at overvåge kaninernes øjenlågsrefleks, åndedrætsrytme, muskelafslapning og hudklemmerespons.
5. Den mekaniske ydeevne af quadriceps senen
- Forbehandling: På testdagen måles længden, bredden og tykkelsen af quadriceps senen med en vernier caliper og installeres en speciel skridsikker klemme i træthedstestmaskinen. Gentag ilægning og losning 15x til forbehandling.
- Stressafslapningstest: Brug sensoren fra 0 N til 100 N, stræk den med en hastighed på 5 mm / min , indtil den når den krævede længde, og begynd derefter at indsamle data. Indstil computerens dataindsamlingstid fra t (0), indsamling af data hver 0,1 s, der varer i 1.800 s. Når du har nået den indstillede tid, skal du registrere data og kurver.
- Trækprøvning: Brug sensoren fra 0 N til 100 N , og stræk den med en hastighed på 5 mm/min til den maksimale belastning, indtil prøven trækkes fra hinanden. Efter testen beregnes prøvens maksimale forskydning, ultimative belastning og stivhed.
6. Fælles kontaktoverfladetryk og tryk pr. Bruskarealenhed
- Fastgør lårbens- og skinnebensprøverne på begge sider i en lige position på armaturet, og udfør en forspændingstest. Mål knæleddets omtrentlige rækkevidde, skær det trykfølsomme papir i samme form, og forsegl det med plastfolie.
- Det forseglede trykfølsomme papir anbringes mellem skinnebens- og lårbensleddene, og der foretages en trykprøvning af knæleddet med et tryk på 5 mm/min og et maksimalt tryk på 50 N. Hold trykket i 2 min , indtil det når 50 N , når det trykfølsomme papir er stabilt farvet.
- Efter 2 minutter skal du fjerne det trykfølsomme papir, fastgøre den farvede overflade på et ark papir i A4-størrelse og hente billeder med skalaen afsat.
- Upload billedet til computeren. Brug den refererede software til arealmåling og måling af flere segmenter for uregelmæssige tal. Mål trykket på indersiden og ydersiden af leddene i lårbenet og skinnebenet og registrer resultaterne.
7. Safranin O/Fast Green farvning af knæledsbrusk
- Efter afslutningen af akupotomiinterventionen skal du tage brusk-subchondral knoglekompleksvæv og indlejre dem i paraffin. Skær de forberedte vævsvoksblokke og forbered dias. Afparaffiniser de forberedte vævsglas med miljøafvoksningsopløsning (I) og miljøafvoksningsopløsning (II) i 15 minutter hver; dypp dem derefter successivt i xylen og vandfri ethanol (1: 1), vandfri ethanol (I), 95% ethanol, 85% ethanol og 75% ethanol, 2-5 minutter hvert trin; og til sidst blødlægges de i destilleret vand i 15 min.
- Udfør farvning.
- Plet rutsjebanerne med Fast Green opløsning i 1 min. Under denne proces skal du tage diasene ud af opløsningen og observere dem under mikroskopet, indtil vævet er farvet mørkegrønt.
- Farveseparation: Skyl den overskydende Fast Green-opløsning med ultrarent vand. Sug gliderne hurtigt i blød i 1% eddikesyreopløsning i 5 - 10 sekunder. Skyl igen diaset med ultrarent vand.
- Plet gliderne i Safranine O-opløsning i 10-15 minutter, indtil brusk er farvet rødt.
- Dehydrer og klargør vævet, forsegl glasskinnerne og observer dem under mikroskopet.
- Sug lysbillederne i blød i 75% ethanol, 85% ethanol, 95% ethanol og 100% ethanol i 3 - 5 sekunder efter hinanden.
- Dyp diasene i miljøafvoksningsopløsning (I) og miljøafvoksningsopløsning (II) i 10 minutter efter hinanden. Tag diasene ud og slip det neutrale harpiksholdige medium på forsiden af diasene, undgå vævet. Placer kanten af dækglasset på diaset, og læg det derefter langsomt ned for at dække den neutrale balsam. Fjern luften og undgå luftbobler. Tør den ekstra xylen og neutrale balsam af, og lad den stå natten over ved stuetemperatur.
- Overhold diasene under mikroskopet og tag billeder. For hver gruppe skal du vælge seks prøver af kaninknæbrusk og tilfældigt vælge fire forskellige synsfelter for hver prøve til evaluering. Score bruskhistologien for hver gruppe i henhold til Mankin-metoden (tabel 1).
8. Statistisk analyse
- Udtrykkes data som gennemsnit ± standardafvigelse (
± s). - Udfør envejsanalyse af varians (ANOVA) og LSD's test til bestemmelse af den statistiske signifikans af flere gruppesammenligninger.
- Overvej forskelle statistisk signifikante, når P < 0,05.
± s).Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Eksperimentelle resultater af mekaniske egenskaber af quadriceps femoris og sene
For at evaluere effekten af akupotomologi på de mekaniske egenskaber af quadriceps femoris hos kaniner med KOA brugte vi henholdsvis realtidsforskydningsbølgeelastisk ultralydsbilleddannelse og en muskelspændingstransducer. Sammenlignet med kontrolgruppen blev Youngs modul af quadriceps femoris i KOA-gruppen reduceret (P < 0,05). Sammenlignet med KOA-gruppen blev Youngs akupotomimodul øget (P < 0,05, figur 3A). Med hensyn til quadriceps femoris sammentrækningsevne sammenlignet med kontrolgruppen blev enkelt kontraktionsamplitude og tetanisk sammentrækningsamplitude af quadriceps femoris signifikant reduceret i KOA-gruppen (P < 0,05, P < 0,01). Sammenlignet med KOA-gruppen blev enkelt kontraktionsamplitude og tetanisk kontraktionsamplitude af quadriceps femoris i akupotomigruppen signifikant øget (P < 0,05, P < 0,01, figur 3B, C). Disse resultater viser, at akupotomi kan forbedre Youngs modul og muskelkontraktilitet af quadriceps femoris hos kaniner med KOA.
For at evaluere effekten af akupotomi på quadriceps senens mekaniske egenskaber hos kaniner med KOA gennemførte vi en træktest og en stressafslapningstest på quadriceps senen. Med hensyn til quadriceps senens trækegenskaber sammenlignet med kontrolgruppen blev den ultimative belastning og maksimale forskydning af quadriceps senen i KOA-gruppen signifikant reduceret (P < 0,01, P < 0,01), mens stivheden af quadriceps senen i KOA gruppen viste en nedadgående tendens (P > 0,05). Sammenlignet med KOA-gruppen blev den ultimative belastning og maksimale forskydning af quadriceps senen i akupotomigruppen signifikant reduceret (P < 0,01, P < 0,01), og stivheden af quadriceps senen i akupotomigruppen viste en opadgående tendens (P > 0,05, figur 4A-C). Med hensyn til stressafslapningshastigheden sammenlignet med kontrolgruppen blev stressafslapningshastigheden for quadriceps senen i KOA-gruppen reduceret (P < 0,05). Sammenlignet med KOA-gruppen blev stressafslapningshastigheden for quadriceps senen i akupotomigruppen øget (P < 0,05, figur 4D). Disse resultater viser, at akupotomi kan forbedre træk- og stressafslapningsegenskaberne for quadriceps senen hos kaniner med KOA.
Eksperimentelle resultater af tryk og tryk pr. arealenhed på bruskkontaktfladen og bruskmorfologien
Med hensyn til det maksimale tryk på bruskkontaktfladen sammenlignet med kontrolgruppen var der ingen signifikant forskel i det maksimale tryk på bruskkontaktfladen i KOA-gruppen (P > 0,05), men der var en nedadgående tendens. Sammenlignet med KOA-gruppen var der ingen signifikant forskel i det maksimale tryk på bruskkontaktfladen i akupotomigruppen (P > 0,05), men der var en opadgående tendens (figur 5A). Med hensyn til trykket pr. arealenhed af bruskkontaktfladen sammenlignet med kontrolgruppen var der ingen signifikant forskel i det maksimale tryk pr. arealenhed i KOA-gruppen (P > 0,05), men der var en nedadgående tendens. Sammenlignet med kontrolgruppen var der ingen signifikant forskel i det maksimale tryk pr. arealenhed i akupotomigruppen (P > 0,05), men der var en opadgående tendens (figur 5B). Disse resultater viser, at akupotomiinterventionen havde en tendens til at øge det maksimale tryk og tryk pr. arealenhed af bruskkontaktfladen, hvilket indikerer positive virkninger på bruskstressmiljøet.
For at evaluere effekten af akupotomi på bruskmorfologi brugte vi Safranin O-Fast Green farvning. I kontrolgruppen var bruskoverfladen glat; kondrocytterne i alle lag blev arrangeret pænt og ordnet; de overfladiske chondrocytter blev arrangeret i en spindelform; de midterste og dybe lag af chondrocytter blev arrangeret i et søjleformet arrangement; tidevandslinjen var klar og komplet; og der var ingen pannusdannelse (figur 6A). I KOA-gruppen var bruskens overflade ru, eller der var skrælningsfejl; antallet af overfladiske chondrocytter blev reduceret; chondrocythierarki og arrangement var uordnet; mellemlaget chondrocytter viste tegn på dehydrering, sammentrækning og nekrose; chondrocytklyngedannelse blev observeret; tidevandslinjer blev sløret eller forvrænget brud blev set; gentagne tidevandslinjer kunne ses i nogle områder; blodkar kan have passeret gennem tidevandslinjen ind i det ikke-forkalkede lagbrusk; eller der var pannusdannelse (figur 6B). I akupotomigruppen var bruskens overfladelag relativt glat; strukturen af chondrocytter var normal; arrangementet af chondrocytter i alle lag var relativt pænt; tidevandslinjen var klar, eller lejlighedsvis var der gentagne tidevandslinjer; der var ingen pannusdannelse (figur 6C). Med hensyn til bruskmorfologiske scorer sammenlignet med kontrolgruppen blev brusk Markin-scoren i KOA-gruppen signifikant øget (P < 0,01). Sammenlignet med KOA-gruppen blev brusk Markin-scoren i akupotomigruppen signifikant reduceret (P < 0,01, figur 6D). Disse resultater viser, at bruskintegriteten hos kaniner med KOA blev beskadiget, og at akupotomiintervention kunne forsinke degenerering af brusk og have en beskyttende virkning på brusk.
Figur 1: Modificeret Videman-metode til etablering af en model for knæartrose. (A) Materialer, der kræves til etablering af KOA-modellen. (B) Brug medicinsk trykfølsom tape til at dække venstre bagben af kaniner. (C) Wrap polymer bandager omkring venstre bagben af kaniner. (D,E) Brug skinner til at immobilisere kaninens knæ og ankelled. (F) Wrap trådnet for at forhindre kaninerne i at gnave. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Metode til akupotomiintervention. (A) Hudforberedelse ved knæleddet på en kanins venstre bagben. (B) Vælg indsættelsespunkter, og brug en kirurgisk hudmarkør til at markere positionerne. (C) Brug medicinsk iodophor til at desinficere. (D) Tryk og adskil for at undgå nerver og blodkar. (E) Gennembor akupotomien og operere. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Mekaniske egenskaber af quadriceps femoris. (A) Analyse af Youngs modul af quadriceps femoris; B) analyse af enkelt sammentrækningsamplitude af quadriceps femoris (C) analyse af tetanisk sammentrækningsamplitude af quadriceps femoris. Værdier er midler ± SD. N = 6 pr. Gruppe. Sammenlignet med den tilsvarende kontrolgruppe: *P < 0,05 og **P < 0,01; sammenlignet med den tilsvarende modelgruppe: #P < 0,05 og ##P < 0,01. Forkortelse: KOA = knæartrose. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Mekaniske egenskaber af quadriceps senen. (A) Analyse af den endelige belastning af quadriceps senen; B) analyse af quadriceps senens maksimale forskydning C) analyse af stivheden af quadriceps senen (D) stress afslapning af quadriceps senen. Værdier er midler ± SD. N = 6 pr. Gruppe. Sammenlignet med den tilsvarende kontrolgruppe: *P < 0,05 og **P < 0,01; sammenlignet med den tilsvarende modelgruppe: #P < 0,05 og ##P < 0,01. Forkortelse: KOA = knæartrose. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Tryk på bruskens kontaktflade. A) Analyse af det maksimale tryk på bruskkontaktfladen. B) analyse af trykket pr. arealenhed af bruskkontaktfladen. Værdier er midler ± SD. N = 6 pr. Gruppe. Forkortelse: KOA = knæartrose. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: Farvning af brusk med Safranin O-Fast grøn og markin score af brusk. (A) kontrolgruppe, (B) modelgruppe, (C) akupotomigruppe, (D) analyse af bruskens markinscore. Værdier er midler ± SD. N = 6 pr. Gruppe. Sammenlignet med den tilsvarende kontrolgruppe: **P < 0,01; sammenlignet med den tilsvarende modelgruppe: ##P < 0,01. Skalastænger = 50 μm (A-C). Forkortelse: KOA = knæartrose. Klik her for at se en større version af denne figur.
| I. Struktur | III. Farvning | ||
| en. Normal | 0 | en. Normal | 0 |
| b. Uregelmæssigheder på overfladen | 1 | b. Let reduktion | 1 |
| c. Pannus og uregelmæssigheder på overfladen | 2 | c. Moderat reduktion | 2 |
| d. Kløfter til overgangszone | 3 | d. Alvorlig reduktion | 3 |
| e. Kløfter til radial zone | 4 | e. Intet farvestof noteret | 4 |
| f. Kløfter til forkalket zone | 5 | ||
| g. Fuldstændig uorganisering | 6 | ||
| II. Celler | IV. Tidemærkets integritet | ||
| en. Normal | 0 | en. Intakt | 0 |
| b. Diffus hypercellularitet | 1 | b. Krydset af blodkar | 1 |
| c.Kloning | 2 | ||
| d. Hypocellularitet | 3 | ||
Tabel 1: Modificeret Mankin-score.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En passende dyremodel er en af nøglefaktorerne for at nå eksperimentelle mål og afklare et specifikt videnskabeligt spørgsmål. Denne undersøgelse var baseret på teorierne om "Zongjin kontrollerer knogler og smørende led" og "mekanisk ubalance" i akupotomologi med det formål at forklare den videnskabelige konnotation bag behandlingen af KOA ved at "modulere muskler og sener til behandling af knoglesygdomme" i akupotomibehandling. Med andre ord forbedrer akupotomi bruskens unormale mekaniske miljø ved at regulere de mekaniske egenskaber ved blødt væv omkring knæet for at forsinke degenerationen og beskytte brusk. KOA dyremodeller klassificeres generelt i to kategorier: spontane og inducerede modeller. Spontane KOA-modeller bruges mindre på grund af relativt lang modelleringsvarighed og større begrænsninger. Inducerede KOA-modeller kan etableres ved kirurgiske tilgange (fx modificeret Hulth-metode, meniskektomi, brud på det forreste korsbånd, intraartikulær injektion og ledimmobilisering). Kirurgiske metoder, herunder skæring af det mediale sikkerhedsbånd, forreste korsbånd, fjernelse af medial menisk og andre strukturer, bruges til at destabilisere knæleddet, hvilket vil føre til intern mekanisk ubalance og direkte friktion mellem ledfladerne og derved fremkalde KOA11. Denne type model er mere egnet til undersøgelse af traumatisk arthritis. Den intraartikulære injektion leverer medicin til knæledshulen for at fremkalde betændelse, metaboliske lidelser i chondrocytter og toksiske reaktioner af chondrocytter i ledhulen, hvorved KOA udvikles, mens den har ringe effekt på ledstress12. Fælles immobilisering udvikler og forværrer ledbruskdegeneration ved at begrænse knæleddets bevægelse, hvilket forårsager atrofi af muskler og ledbånd omkring knæet, hvilket resulterer i ændringer i ledspænding, hvorved der etableres en KOA model12.
Den modificerede Videman-metode er en fælles immobiliseringsmetode, som er mere i tråd med den patologiske proces af KOA forårsaget af svaghed i de menneskelige knæmuskler, som det ses ved brug af atrofi af knæmuskler og ledbånd ved at immobilisere knæet i en overstrakt position, hvilket resulterer i ændringer i ledstress og bruskdegeneration. Sammenlignet med kirurgiske metoder, der forårsager ledstabilitet, der resulterer i KOA, er den modificerede Videman-metode mere i overensstemmelse med den naturlige patogenese af KOA, hvor seneskade er den første fase efterfulgt af sene- og knoglesygdommen; Det er derfor mere egnet til denne undersøgelse13. Da effekten af akupotomi i behandlingen af KOA i tidlig fase eller mellemstadium er mere indlysende, er støbetiden 6 uger, hvilket er i overensstemmelse med de patologiske ændringer i mellemstadiet KOA. I processen med modelinduktion kan langvarig overforlængelsesbremsning føre til manglende brug af atrofi af musklerne omkring knæleddet, og ubehag i venstre bagben får ofte kaniner til at gnave modelapparater. Da modelapparater kan være løse, er det nødvendigt regelmæssigt at kontrollere tætheden af kanin-type enheden og forstærke dem i tide. Derudover er det nødvendigt altid at være opmærksom på kaninens blodforsyning, hævelse, hudlæsioner og fordøjelseskanalen symptomer, og fjern modelapparaterne om nødvendigt. Da kaninerne er i bedøvelsestilstand under denne proces, er det nødvendigt at holde kaninerne varme og være opmærksomme på kaninernes tilstand i realtid, indtil kaninerne vågner op.
Acupotomy involverer en skalpelfunktion ud over den eksisterende akupunkturnål, der bruger begrebet akupunktur til at trænge ind i kroppen, med skære- og adskillende virkninger, der er bedre end en akupunkturnål, samtidig med at den bringer langt mindre traumer til menneskekroppen end en skalpel14. Acupotomology mener, at den grundlæggende årsag til KOA er den mekaniske ubalance på grund af blødt vævsskade omkring knæleddet. Derfor er nøglen til behandling af KOA med akupotomi at genoprette knæleddets mekaniske balance. Med hensyn til udvælgelsen af behandlingspunkter er akupotomi på den ene side baseret på teorien om meridianer og sener og tager smertefuld lokalitet som akupunkt. På den anden side styres akupotomi af moderne anatomi og biomekanik og mener, at blødt vævsskader omkring knæleddet forårsager vedhæftning og sammentrækning, hvilket ødelægger knæleddets mekaniske balance og producerer højspændingspunkter i leddet. Derfor tages vævsadhæsion, sammentrækning og højspændingspunkter ofte som behandlingspunkter15,16.
Den biomekaniske analyse af blødt væv viser, at fastgørelsespunkterne for sener og knogler for det meste er, hvor blødt vævsspændinger er koncentreret, også kaldet stresskoncentration, og hvor patologiske produkter som adhæsioner, kontrakturer og snorlignende knuder let produceres17. Derudover har klinisk praksis vist, at de ømme punkter, der findes ved palpation, ofte overlapper fastgørelsespunkterne i sener og knogler. Derfor valgte denne undersøgelse seneindsættelse af vastus medialis, vastus lateralis, rectus femoris, biceps femoris og anserine bursa. Selvom akupotomi forårsager mindre traumer i vævene, er det stadig en metode til invasiv intervention. Under interventionen er det nødvendigt nøje at følge firetrinsproceduren for akupotomi: placering, retning, tryk-frigivelse og punktering. Derudover skal brugerne være forsigtige med graden af afslapning og behandlingsfrekvens for hver intervention. Det anbefales at frigive hvert behandlingspunkt 2-3 gange en gang om ugen for at forhindre overdreven skade på vævene. Efter akupotomiinterventionen er afsluttet, desinficeres knæleddet på kaninens venstre bagben igen, og båndhjælpemidler påføres akupotomiindgangspunktet.
Stabile knæled er en forudsætning for at opretholde mekanisk balance og udføre normale fysiologiske bevægelser18. Muskler og sener - vigtige faktorer for at opretholde knæledstabilitet - er viskoelastiske vævsstrukturer, der bestemmer musklernes forskellige mekaniske egenskaber i sammentrækning og passivt træk, som er vigtige komponenter i musklernes mekaniske egenskaber og sikrer musklernes normale motorfunktion. Elasticitetsmodulet, en indikator for de mekaniske egenskaber af blødt væv, er positivt korreleret med ændringer i den mekaniske funktion af quadriceps femoris19. Fysiologisk omfatter skeletmuskelkontraktion to former: enkelt sammentrækning og tetanisk sammentrækning. Førstnævnte er den grundlæggende enhed for muskelaktivitet, mens sidstnævnte hovedsageligt producerer jævn bevægelse af skeletmuskler. Derfor anvendes den maksimale amplitude af enkelt og tetanisk sammentrækning almindeligvis til evaluering af muskelkontraktil funktion.
Brug af skeletmuskelatrofi fører til reduceret tetanisk sammentrækning og maksimal frivillig sammentrækning, hvilket indikerer et fald i muskelkontraktil evne20. Faldet i muskelstyrke kan beskadige senernes funktion, manifesteret som et fald i seneviskoelasticitet og et fald i senernes evne til at modstå deformation8. Under patologiske tilstande kan stressafslapning og trækegenskaber af sener falde, hvilket får knæleddet til at miste balance og fremskynde udviklingen af KOA. Derfor blev i denne undersøgelse det elastiske modul, amplitude af enkelt sammentrækning, amplitude af tetanisk sammentrækning af quadriceps, trækegenskaber ved quadriceps senen såsom ultimativ belastning, maksimal forskydning, stivhed samt stressafslapning af quadriceps senen valgt til at evaluere effekten af akupotomi på quadriceps mekaniske egenskaber. Stress- og tryktesten af bruskens lejeområde og Safranin O/Fast Green-farvningen af knæledsbrusk blev brugt til at vurdere, om akupotomibehandling forbedrede quadriceps femoris' mekaniske egenskaber og udøvede en beskyttende virkning på brusk. De eksperimentelle resultater viser, at akupotomi kombineret med teorien om "modulerende muskler og sener til behandling af knoglesygdomme" kan forbedre bruskens stressmiljø, forsinke bruskdegeneration og have en beskyttende virkning på brusk ved at modulere de mekaniske egenskaber af muskler og sener i quadriceps.
Der er visse begrænsninger for dette eksperiment. På den ene side evaluerede vi ikke knæforskydning og dens virkning på knæbiomekaniske ubalancer. På den anden side valgte denne undersøgelse den modificerede Videman-metode til immobilisering af venstre bagbensforlængelse til KOA-modellering for at belyse akupotomiens rolle i forsinkelse af bruskdegeneration ved at modulere de mekaniske egenskaber af blødt væv omkring knæet. Imidlertid er akupotomiens rolle i knæartrose forårsaget af traumatiske faktorer, såsom ledbånd og meniske tårer, ikke blevet undersøgt. Derudover er akupotomiintervention en slags lukket, minimalt invasiv kirurgi. I denne undersøgelse blev både palpations- og akupotomiinterventioner udført uden at udsætte det syge væv under ikke-direkte synsforhold. For at reducere virkningen af subjektive faktorer på de eksperimentelle resultater blev både palpation og akupotomiintervention udført af det samme personale. Selv om der er visse begrænsninger, påvirker de således ikke pålideligheden af konklusionerne i denne undersøgelse.
Sammenfattende beskriver dette papir detaljeret KOA-modelinduktionen med den modificerede Videman-metode (venstre bagbens forlængelsesimmobilisering) og akupotomiinterventionen. Det viser også analysen af mekanismen for akupotomibehandling for KOA gennem eksperimenter på quadriceps elastiske modul og kontraktile funktion, quadriceps senens mekaniske egenskaber, kraften og trykket af ledbruskens lejeareal og Safranin O / Fast Green-farvning af knæledsbrusk. Undersøgelse af akupotomiens mekanisme til forbedring af blødt vævs biomekaniske egenskaber kan give ny indsigt i behandlingen af KOA og andre sportsrelaterede systemiske skader.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at oplyse.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af National Natural Science Foundation of China (No.82074523,82104996).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acupotomy | Beijing Zhuoyue Huayou Medical Devices Co., Ltd. | 0.4 x 40 mm | |
| Connect Cast Orthopedic Casting Tape | Suzhou Connect Medical Technology Co.,Ltd. | KCP06 | 15.0 cm x 360 cm |
| Double-sided Foam Tape | Deli Group Co.,Ltd. | NO.30416 | 36 mm x 5 yard x 2.5 mm |
| Environmental Dewaxing Solution | Wuhan Servicebio Technology Co.,Ltd. | G1128 | |
| Ethanol absolute | Beijing Hengkangda Medicine Co., Ltd. | ||
| Fast Green solution | Wuhan Servicebio Technology Co.,Ltd. | G1031 | |
| Fast grenn FCF | Sigma,America | 2353-45-9 | |
| Fatigue testing machine | BOSE, America | Bose Electro Force 3300 | |
| Four-channel physiological recorder | Chengdu Instrumeny Frctory | RM-6420 | |
| FPD-305E | Fuji, Japan | ||
| FPD-306E | Fuji, Japan | ||
| Hematoxylin solution | Wuhan Servicebio Technology Co.,Ltd. | G1005 | |
| Medical iodophor disinfectant | Shan Dong Lircon Medical Technology Co., Ltd. | ||
| Medical Tape | Shandong Rongjian Sanitary Products Co., Ltd. | 200402 | 1.5 x 500 cm |
| Muscle tension transducer | Chengdu Instrumeny Frctory | JH-2204005, 50 g | |
| Prescale | Fuji, Japan | ||
| Real-time SWE ultrasound diagnostic instrument | SuperSonic Imagine SA,France | SuperSonic Imagine AixPlorer | |
| Rhamsan gum | Wuhan Servicebio Technology Co.,Ltd. | WG10004160 | |
| Safranine O | Sigma,America | 477-73-6 | |
| Safranine O solution | Wuhan Servicebio Technology Co.,Ltd. | G1015 | |
| Statistical Package for the Social Sciences (SPSS) | IBM, America |
References
- Roseti, L., Desando, G., Cavallo, C., Petretta, M., Grigolo, B.
- Cui, A. Y., et al. Global, regional prevalence, incidence and risk factors of knee osteoarthritis in population-based studies. EClinicalMedicine. 29-30, 100587 (2020).
- Miyauchi, A., et al. Alleviation of murine osteoarthritis by deletion of the focal adhesion mechanosensitive adapter, Hic-5. Sci Rep. 9 (1), 15770 (2019).
- Wright, T. Biomechanical factors in osteoarthritis: the effects of joint instability. HSS J. 8 (1), 15-17 (2012).
- Patsika, G., Kellis, E., Kofotolis, N., Salonikidis, K., Amiridis, I. G. Synergetic and antagonist muscle strength and activity in women with knee osteoarthritis. J Geriatr Phys Ther. 37 (1), 17-23 (2014).
- Blalock, D., Miller, A., Tilley, M., Wang, J. X.
- Henriksen, M., Christensen, R., Danneskiold-Samsøe, B., Bliddal, H. Changes in lower extremity muscle mass and muscle strength after weight loss in obese patients with knee osteoarthritis: a prospective cohort study. Arthritis Rheum. 64 (2), 438-442 (2012).
- Schwartz, A. G., Lipner, J. H., Pasteris, J. D., Genin, G. M., Thomopoulos, S. Muscle loading is necessary for the formation of a functional tendon enthesis. Bone. 55 (1), 44-51 (2013).
- Felson, D. T. Osteoarthritis as a disease of mechanics. Osteoarthr Cartil. 21 (1), 10-15 (2013).
- Ma, S. N., et al. Effect of acupotomy on FAK-PI3K signaling pathways in KOA rabbit articular cartilages. Evid Based Complement Alternat Med. 2017, 4535326 (2017).
- Yu, P., et al. Research progress of experimental animal models of knee osteoarthritis. China Medical Herald. 16 (27), 41-44 (2019).
- Li, L. H., et al. Research progress of rabbit knee osteoarthritis model. Journal of Jiangxi University of Chinese Medicine. 31 (4), 108-113 (2019).
- Zhang, W., Gao, Y., Guo, C. Q., Khattab, I. Z. A., Mokhtari, F. Effect of acupotomy versus electroacupuncture on ethology and morphology in a rabbit model of knee osteoarthritis. J Tradit Chin Med. 39 (2), 229-236 (2019).
- An, X. Y., et al. Chondroprotective effects of combination therapy of acupotomy and human adipose mesenchymal stem cells in knee osteoarthritis rabbits via the GSK3 beta-cyclin D1-CDK4/CDK6 signaling pathway. Aging Dis. 11 (5), 1116-1132 (2020).
- Guo, C. Q., Liu, N. G. Analysis on the distribution features of Ashi points in Jingjin disorders. Journal of Basic Chinese Medicine. 17 (8), 899-900 (2011).
- Guo, C. Q., et al. Effects of acupotomy therapy on tenderness point around knee joint in patients with knee osteoarthritis: a randomized controlled clinical trial. Journal of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine. 33 (3), 3-5 (2010).
- Zhao, Y., Dong, F. H., Zhang, K. Analysis of soft tissues mechanical changes and treatment of meridian tendon pain. Beijing Journal of Traditional Chinese Medicine. (9), 705-707 (2008).
- Zhang, L. P., Cheng, F., Liu, D. Y., Zhu, L. G. Application progress of biomechanics in knee osteoarthritis. Chinese Archives of Traditional Chinese Medicine. 34 (7), 1644-1647 (2016).
- Thomas, A. C., Sowers, M., Karvonen-Gutierrez, C., Palmieri-Smith, R. M. Lack of quadriceps dysfunction in women with early knee osteoarthritis. J Orthop Res. 28 (5), 595-599 (2010).
- Li, L., et al. Effects of unloaded muscle atrophy on contractile characteristics of hind-limb skeletal muscles in mice. Space Med Med Eng. 25 (5), 322-325 (2012).
