Summary
이 프로토콜에서는 수정된 Videman 방법을 사용하여 무릎 골관절염 모델을 준비했으며 acupotomy의 수술 절차 및 주의 사항을 자세히 설명합니다. acupotomy의 효과는 대퇴사두근, 대퇴골 및 힘줄의 기계적 특성과 연골의 기계적 및 형태학적 특성을 테스트하여 입증되었습니다.
Abstract
무릎 골관절염(KOA)은 정형외과에서 가장 자주 발생하는 질병 중 하나로, KOA 환자의 삶의 질을 심각하게 떨어뜨립니다. 여러 병원성 요인 중 무릎 관절의 생체역학적 불균형은 KOA의 주요 원인 중 하나입니다. Acupotomology는 무릎 관절의 기계적 균형을 회복하는 것이 KOA 치료의 핵심이라고 믿습니다. 임상 연구에 따르면 아큐포토술은 무릎 관절 주변 근육과 힘줄의 유착, 연조직의 구축, 응력 집중점을 줄여 통증을 효과적으로 줄이고 무릎 이동성을 개선할 수 있습니다.
이 프로토콜에서는 수정된 Videman 방법을 사용하여 왼쪽 뒷다리를 직선 위치에 고정하여 KOA 모델을 구축했습니다. 대퇴사두근, 대퇴골 및 힘줄의 기계적 특성, 연골 역학 및 형태학의 검출을 통해 "뼈 질환 치료를 위한 근육 및 힘줄 조절" 이론과 연계하여 acupotomy의 효능을 평가했습니다. 그 결과 무릎 관절 주변 연조직의 기계적 성질을 조절하고 연골 스트레스 환경을 개선하며 연골 퇴화를 지연시켜 연골을 보호하는 효과가 있음을 알 수 있습니다.
Introduction
무릎 골관절염(KOA)은 가장 흔한 형태의 골관절염으로, 관절 연골 퇴행을 특징으로 하는 전체 관절 질환으로 인식되는 경우가 많으며, 임상적으로 통증, 부종 및 해당 관절의 움직임 제한으로 나타납니다1. 최근 역학 통계에 따르면 KOA는 2020년까지 전 세계적으로 40세 이상 6억 5,410만 명에게 영향을 미친 것으로 보고되었습니다. KOA의 유병률과 발병률은 나이가 들수록 증가하며, 중년과 노년층에서 가장 높으며, 남성보다 여성에게 더 많이 발생한다2. KOA의 유병률은 전 세계적으로 인구 고령화와 비만 전염병으로 인해 증가할 가능성이 높으며, 이는 전 세계 공중 보건에 대한 위협이 커지고 있습니다. 나이, 성별, 비만, 외상 및 KOA와 관련된 기타 복잡한 위험 요인은 모두 무릎 불안정성에 직접적인 영향을 미치며, 무릎 관절의 생체역학적 불균형은 KOA의 주요 원인 중 하나입니다3.
정상적인 생리적 조건에서 무릎 관절은 기계적 균형 상태에 있어 관절의 기계적 부하가 연골에 고르게 분산되도록 합니다. 무릎 관절의 기계적 불균형은 연골에 비정상적인 스트레스를 유발하여 연골 퇴화와 KOA4의 발병을 초래할 수 있습니다. 근육-힘줄 시스템은 무릎 관절의 기계적 균형을 유지하는 주요 동적 시스템입니다. 신전근과 굴곡근-힘줄 시스템의 조화로운 움직임은 연골 표면의 움직임에 의해 생성된 하중을 고르게 분산시켜 연골 손실을 초래하는 생리적 하중을 넘어서는 국소 연골 스트레스의 대사 불균형을 피할 수 있다5. 근력 감소는 근육 내 운동 장애 및 연골 손상의 주요 원인이며, 증상이 나타나기 전에 발생할 수 있습니다.
KOA는 또한 관절성 근육 억제(AMI)를 유도하여 무릎 주위의 근육 약화와 근력 감소로 나타날 수 있다6. 이 근육 중 대퇴사두근 그룹은 무릎 관절의 안정성을 유지하는 데 중요한 구조인 유일한 무릎 신전근으로 기능합니다. 연구에 따르면 대퇴사두근 단면적과 근력의 감소는 KOA 진행과 유의하고 긍정적인 상관관계가 있는 것으로 나타났다7. 대퇴사두근 근력의 감소는 보행 패턴, 무릎 안정성, 움직임 패턴 및 기타 여러 기능에 영향을 미칩니다. 또한, 근력의 감소는 힘줄 기능을 손상시키며, 이는 힘줄 경직도, 탄성률 및 기타 생체역학적 특성의 감소로 나타난다8. 장기간의 긴장 회복 시 무릎 관절의 근육과 힘줄에 유착, 구축 등의 변화가 일어나 기계적 성질이 손상되고 관절 불안정을 유발하여 궁극적으로 KOA의 병리학적 변화의 악순환이 발생할 수 있습니다. 따라서 KOA 치료는 근육-힘줄 시스템의 기계적 특성을 개선하고 관절의 기계적 균형을 회복하는 데 매우 중요합니다.
KOA의 원인 중 생체역학적 불균형은 무릎 통증, 기능 장애, 염증성 병변 및 연골 퇴행의 주요 유발 요인이다9. 따라서 KOA 치료의 핵심은 무릎 관절의 생체역학적 균형을 회복하는 것입니다. Acupotomology는 KOA의 병인과 발병 기전이 "기계적 불균형"이라고 믿습니다. 무릎 주위 연조직의 기계적 특성이 비정상적으로 변하면 무릎 관절은 기계적 균형을 잃고 관절의 비정상적인 기계적 스트레스 환경은 퇴화를 가속화하여 염증 자극을 일으켜 연조직의 유착, 구축을 더욱 악화시키고 관절 안정성을 더욱 떨어뜨립니다. 이 악순환은 결국 KOA로 발전합니다. "뼈 질환을 치료하기 위한 근육 및 힘줄 조절" 이론과 함께 연조직 유착 및 구축을 완화하고 근육과 힘줄의 스트레스 집중을 감소시킴으로써 관절의 기계적 스트레스 균형을 맞추는 "근육과 힘줄 조절"과 함께 연조직 역학을 개선하고 "근육과 힘줄을 조절"하여 연골 퇴화를 효과적으로 완화하고 "뼈 질환을 치료"합니다.10. 동물모델 선정 측면에서는 본 연구의 목적에 따라 좌측 뒷다리 신전 고정화의 변형된 Videman 방법으로 KOA 모델을 준비하였다.
본 논문은 좌측 뒷다리 확장 고정술의 수정된 Videman 방법을 이용한 KOA 모델의 확립과 acupotomy의 수술 방법 및 주의사항에 대해 자세히 설명합니다. 대퇴사두근, 대퇴골 및 힘줄의 기계적 특성을 테스트하고 관절 연골 스트레스 및 형태의 변화를 감지하여 아큐포토술의 효과를 입증합니다.
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Protocol
모든 동물 실험은 베이징 중의학 대학 동물 윤리 위원회의 검토 및 승인을 받았습니다. BUCM-4-2022010101-1097)을 참조하십시오. 이 프로토콜에서는 6주 된 수컷 뉴질랜드 토끼 24마리를 20-25°C, 습도 50-60%, 12시간 밝음/12시간 어두운 일주기 주기와 같은 특정 조건에서 사육하고 규칙적인 차우 식단을 자유롭게 이용할 수 있도록 했습니다. 토끼는 마취를 하고 심부 마취와 공기 색전술을 병행하여 희생시켰다. 통증은 KOA의 전형적인 병리학적 특징 중 하나이며 KOA의 동물 모델 및 중재 방법을 평가하는 데 사용되는 주요 지표 중 하나이므로 모델 준비 중에는 진통제를 사용하지 않습니다.
1. KOA 토끼 모델
- 토끼의 귀 가장자리에 3% 펜토바르비탈 나트륨(30mg/kg)을 정맥 주사하여 마취합니다. 적절한 수준의 마취를 확인하려면 각막 반사가 현저히 약해지거나 없고 지혈 겸자로 피부를 고정했을 때 통증이 없는지 확인하십시오. 마취 중에는 토끼의 눈이 건조해지는 것을 방지하기 위해 15분마다 토끼의 눈에 윤활유 2-3방울을 떨어뜨립니다.
- 마취 후 각 토끼를 앙와위 자세로 고정하고 왼쪽 뒷다리를 완전히 뻗은 자세로 당깁니다.
- 각 토끼의 왼쪽 뒷다리를 뻗은 자세로 고정합니다.
- 첫 번째 레이어로 의료용 테이프를 사용하여 사타구니에서 발목 관절까지 토끼의 피부를 덮습니다.
- 두 번째 레이어로 의료용 테이프 위에 36mm 너비의 양면 폼 테이프를 감은 다음 사타구니에서 발목 관절까지 폴리머 붕대를 감습니다. 무릎 관절이 180° 직선이고 발목 관절이 60° 배굴곡되어 있는지 확인합니다.
- 세 번째 층으로 무릎과 발목 관절의 앞뒤에 작은 부목으로 관절을 고정하고 가장 바깥 층을 강철 메쉬로 감싸 물림을 방지합니다. 토끼의 발가락을 노출시켜 혈액 순환이 정상인지 관찰합니다.
- KOA 모델을 확립하기 위해 6주 동안 동물을 고정시킵니다(그림 1).
참고: 1) 모델 준비 중에는 이틀에 한 번씩 금형을 검사하십시오. 곰팡이가 느슨하거나 분리되면 토끼를 마취하고 왼쪽 뒷다리를 다시 뻗은 자세로 고정시킵니다. 2) 토끼의 팔다리가 끼어 다치는 것을 방지하기 위해 케이지 바닥에 보호 매트를 깔아주세요.
2. Acupotomy 중재
알림: acupotomy 개입을 시작하기 전에 귀 가장자리 정맥 주사로 토끼를 3% 펜토바르비탈 나트륨(30mg/kg)으로 마취합니다.
- 치료 지점을 결정하십시오.
- 토끼의 왼쪽 뒷다리 무릎 관절의 털을 깎습니다.
- 토끼 무릎 관절 내측 대퇴 근육 힘줄 삽입, 대퇴 직근 힘줄 삽입, 이두근 대퇴 힘줄 삽입 및 거위 발 윤활낭을 촉진합니다. 멸균 피부 마커로 국소 근육의 병리학적 지속 시간을 표시하십시오. 무릎 관절을 의료용 요오드포와 75% 의료용 알코올을 번갈아 가며 세 번 소독합니다.
- acupotomy의 수술
- acupotomy 블레이드를 힘줄과 사지의 세로축과 평행한 이동 방향과 평행하게 유지합니다.
- 왼손 엄지손가락으로 마커 포인트로 들어가는 피부를 누르고 옆으로 움직여 엄지손가락의 복부 쪽에서 혈관과 신경이 분리되도록 합니다.
- 오른손에 있는 acupotomy 핸들로 작은 힘으로 빠르게 눌러 acupotomy 블레이드가 즉시 피부를 통과하도록 합니다. acupotomy 블레이드를 국소 근육 지속 시간까지 천천히 전진시키고 세로로 자르고 옆으로 스윙합니다.
- acupotomy 수술이 완료되면 무릎 관절을 다시 소독하고 반창고를 붙입니다.
- 4주 동안 일주일에 한 번씩 이 작업을 수행합니다(그림 2).
참고: 1) 내측광대, 외측광대, 대퇴직근, 대퇴이두근 또는 안세린 윤활낭의 힘줄 삽입 시 만진 내경 또는 탯줄과 같은 조직이 없는 경우 침구 절개술을 사용하여 힘줄 삽입을 직접 해제해야 합니다. 2) acupotomy 중재 중 acuretomy 그룹과 모델 그룹의 확장 위치에 토끼의 왼쪽 뒷다리를 고정하지 마십시오.
3. 대퇴사두근의 탄성 계수
참고: 1) 이 실험은 실시간 전단파 탄성 조영술(SWE) 초음파 진단 장비를 사용하여 각 토끼 그룹에서 생체 내 대퇴사두근의 탄성 계수를 측정했습니다. 2) 테스터는 초음파 검출에 경험이 풍부한 초음파 검사자여야 합니다. 측정할 때 초음파 프로브는 국소 근육 긴장을 피하기 위해 대퇴사두근의 피부 표면에 부드럽게 놓아야 합니다. 동물이 몸부림치거나 활동하지 않고 조용한 상태에 있을 때 측정해야 합니다. 동물이 활동적이라면 테스트를 수행하기 전에 진정될 때까지 기다리십시오.
- 털을 면도하여 왼쪽 뒷다리의 대퇴사두근 부위의 피부가 드러나도록 합니다.
- 기존의 2차원 초음파를 사용하여 대퇴사두근-복부를 찾고 1-2cm 깊이로 설정된 관심 영역(ROI)을 결정합니다.
- 검사를 위해 SWE 모드를 시작합니다.
- 관심 영역을 직경 2mm의 원형 영역으로 균일하게 설정하고 관심 영역을 피부 표면에서 ~0.5-1cm 깊이로 설정합니다.
- 초음파 진단 기기를 사용하여 음향 방사선 힘 임펄스를 생성하여 근육 조직을 자극하고 조직 엘라스토그래피를 얻습니다.
- 이미지가 안정화될 때까지 2-3초 동안 기다린 다음 이미지를 고정합니다. 기기의 Q-BOX 기능을 활성화하여 대퇴사두근의 영률을 측정합니다.
- 시스템이 영률(Young's modulus)의 최대값, 최소값, 평균값(단위: KPa)을 자동으로 계산할 때까지 기다립니다. 3개의 측정값에 대해 동일한 깊이에서 3개의 ROI를 선택하고 통계 분석을 위해 평균값을 취합니다.
알림: 테스터는 초음파 검출에 경험이 풍부한 초음파 검사자여야 합니다. 측정할 때 초음파 프로브는 국소 근육 긴장을 피하기 위해 대퇴사두근의 피부 표면에 부드럽게 놓아야 합니다. 동물이 몸부림치거나 활동하지 않고 조용한 상태에 있을 때 측정해야 합니다. 동물이 활동적이라면 테스트를 수행하기 전에 진정될 때까지 기다리십시오.
4. 대퇴사두근의 수축력 측정
참고: 대퇴사두근의 수축력을 측정한 후, 토끼는 마취 하에 공기 색전증에 의해 안락사되었습니다.
- 토끼의 귀 가장자리에 3% 펜토바르비탈 나트륨(30mg/kg)을 정맥 주사하여 마취합니다. 적절한 수준의 마취에 도달했는지 확인하려면 각막 반사가 현저히 약화되거나 없고 지혈 겸자로 피부를 조였을 때 통증이 없는지 확인하십시오. 마취 중에는 토끼의 눈이 건조해지는 것을 방지하기 위해 15분마다 토끼의 눈에 윤활유 2-3방울을 떨어뜨립니다.
- 대퇴사두근을 노출시키고 장력 변환기를 부착합니다.
- 슬개골 아래 피부를 팔다리의 세로 축을 따라 허벅지 바닥까지 위쪽으로 자르고 피부를 위쪽으로 3-4cm 계속 자릅니다. 피부와 근막을 정중하게 벗겨 근육을 노출시킵니다. 슬개골 인대를 자르고 대퇴사두근을 장골 접합부에서 조심스럽게 분리하여 대퇴사두근을 장골과 연결되도록 합니다.
- 슬개골과 대퇴사두근 사이의 힘줄 접합부에서 수술용 봉합사를 결찰합니다. 자연 상태에서 근육을 전체 길이로 늘린 다음 장력 변환기에 부착합니다. 근육의 결찰선을 힘 변환기의 결찰선과 일직선으로 유지합니다.
- 장력 변환기를 브래킷에 고정합니다. 장력 변환기의 신호 수집 라인을 생체 신호 수집 시스템 프로세서에 연결합니다.
- 대퇴사두근의 수축 성능을 측정합니다.
- 전극을 대퇴사두근 복부와 평행하게 삽입하고 전극 사이의 접촉을 피하십시오.
- 오실로스코프 버튼을 누릅니다. 브래킷에서 힘 변환기의 위치를 조정하여 기준선을 0으로 유지합니다. 파동 폭 이 5ms 이고 지연 이 10ms인 자극기의 자극 매개변수를 선택합니다.
- 먼저 단일 자극을 사용하고 자극 강도를 0에서 매번 0.1V씩 점진적으로 조정합니다. 대퇴사두근의 최대 단일 수축 진폭(Pt)이 결정될 때까지 근육 수축 곡선과 수축 진폭의 변화를 관찰합니다. 후속 통계를 위해 기록하십시오.
- 클러스터 자극을 이용해, 최대 단일 수축 진폭을 유도하는 자극 진폭을 기준선으로 하여 근육을 지속적으로 자극하고 서서히 자극 주파수를 높인다. 대퇴사두근의 최대 수축 진폭(Pt)이 결정될 때까지 근육 수축 곡선의 변화를 관찰합니다. 후속 통계를 위해 기록하십시오.
참고: 1) 각 근육 수축 후 근육에 지속적으로 떨어지는 근육 완충 용액으로 근육을 이완하기 위해 30초를 주어야 합니다. 2) 수술 중 토끼의 눈꺼풀 반사, 호흡 리듬, 근육 이완 및 피부 꼬집기 반응을 모니터링하여 마취 상태를 판단합니다.
5. 대퇴사두근 힘줄의 기계적 성능
- 전처리: 시험 당일, 버니어 캘리퍼스로 대퇴사두근 힘줄의 길이, 너비, 두께를 측정하고 피로 시험기에 특수 미끄럼 방지 클램프를 설치합니다. 전처리를 위해 로딩 및 언로딩을 15회 반복합니다.
- 응력 완화 테스트: 0N에서 100N 범위의 센서를 사용하여 필요한 길이에 도달할 때까지 5mm/min의 속도로 늘린 다음 데이터 수집을 시작합니다. 컴퓨터 데이터 수집 시간을 t(0)에서 설정하여 0.1초마다 데이터를 수집하고 1,800초 동안 지속합니다. 설정된 시간에 도달한 후 데이터와 곡선을 기록합니다.
- 인장 시험: 0 N에서 100 N 범위의 센서를 사용하여 시편이 분리될 때까지 최대 하중까지 5 mm/min의 속도로 늘립니다. 시험 후 시편의 최대 변위, 극한 하중 및 강성을 계산합니다.
6. 연골의 단위 면적당 관절 접촉면 압력 및 압력
- 대퇴골과 경골 시편을 양쪽에 고정하고 고정 장치의 직선 위치에 고정하고 예압 테스트를 수행합니다. 무릎 관절의 대략적인 범위를 측정하고 감압 용지를 같은 모양으로 자르고 비닐 랩으로 밀봉합니다.
- 밀봉된 감압지를 경골과 대퇴골 관절 사이에 놓고 무릎 관절에 압력 5mm/min, 최대 압력 50N으로 압력 테스트를 수행합니다. 압력에 민감한 용지가 안정적으로 착색될 때 50N에 도달할 때까지 2분 동안 압력을 유지합니다.
- 2분 후 압력 감지 용지를 제거하고 A4 크기의 용지에 컬러 표면을 고정한 다음 배율을 따로 두고 이미지를 획득합니다.
- 이미지를 컴퓨터에 업로드합니다. 참조된 소프트웨어를 사용하여 면적을 측정하고 불규칙한 수치를 측정하기 위해 다중 세그먼트 측정을 수행합니다. 대퇴골과 경골 관절의 내부와 외부에 가해지는 압력을 측정하고 결과를 기록합니다.
7. 무릎 관절 연골의 Safranin O/Fast Green 염색
- acupotomy 개입이 끝난 후 연골-연골하 뼈 복합 조직을 채취하여 파라핀에 삽입합니다. 준비된 티슈 왁스 블록을 자르고 슬라이드를 준비합니다. 준비된 조직 슬라이드를 환경 탈랍 용액(I)과 환경 탈랍 용액(II)으로 각각 15분 동안 탈파라핀화합니다. 그런 다음 크실렌과 무수 에탄올(1:1), 무수 에탄올(I), 95% 에탄올, 85% 에탄올 및 75% 에탄올에 연속적으로 담그고 각 단계에서 2-5분 동안 담그십시오. 마지막으로 증류수에 15분 동안 담가둡니다.
- 염색을 수행합니다.
- Fast Green 용액으로 슬라이드를 1분 동안 염색합니다. 이 과정에서 용액에서 슬라이드를 꺼내 조직이 짙은 녹색으로 염색될 때까지 현미경으로 관찰합니다.
- 색상 분리: 여분의 Fast Green 용액을 초순수로 헹굽니다. 슬라이드를 1% 아세트산 용액에 5 - 10초 동안 빠르게 담그십시오. 다시 초순수로 슬라이드를 헹굽니다.
- 연골이 붉게 물들 때까지 10-15분 동안 사프라닌 O 용액에 슬라이드를 염색합니다.
- 조직을 탈수하고 정화하고 유리 슬라이드를 밀봉하고 현미경으로 관찰합니다.
- 슬라이드를 75% 에탄올, 85% 에탄올, 95% 에탄올, 100% 에탄올에 3-5초 연속으로 담그십시오.
- 슬라이드를 환경 탈랍 용액(I)과 환경 탈왁스 용액(II)에 연속적으로 10분 동안 담그십시오. 슬라이드를 꺼내고 조직을 피하면서 슬라이드 전면에 중성 수지 매체를 떨어뜨립니다. 커버글라스의 가장자리를 슬라이드에 놓고 천천히 내려 중성 발삼을 덮습니다. 공기를 제거하고 기포를 피하십시오. 여분의 자일렌과 중성 발삼을 닦아내고 실온에서 하룻밤 동안 그대로 두십시오.
- 현미경으로 슬라이드를 관찰하고 이미지를 획득합니다. 각 그룹에 대해 토끼 무릎 연골 샘플 6개를 선택하고 평가를 위해 각 샘플에 대해 4개의 서로 다른 보기 필드를 무작위로 선택합니다. Mankin 방법에 따라 각 그룹의 연골 조직학을 채점합니다(표 1).
8. 통계 분석
- 데이터를 평균 ± 표준편차(
± s)로 표현합니다. - 일원분산분석(ANOVA) 및 LSD 검정을 수행하여 다중 그룹 비교의 통계적 유의성을 확인합니다.
- P가 0.05일 때 통계적으로 유의< 차이를 고려하십시오.
± s)로 표현합니다.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
대퇴사두근과 힘줄의 기계적 성질 실험결과
KOA를 가진 토끼의 대퇴사두근의 기계적 특성에 대한 acupotomology의 효과를 평가하기 위해 실시간 전단파 탄성 초음파 영상과 근육 긴장 변환기를 각각 사용했습니다. 대조군과 비교했을 때, KOA 그룹에서 대퇴사두근의 영률(Young's modulus)은 감소하였다(P < 0.05). KOA 그룹과 비교하여, acupotomy 그룹의 Young's modulus는 증가하였다(P < 0.05, 도 3A). 대퇴사두근의 수축 능력은 대조군에 비해 대퇴사두근의 단일수축 진폭과 대퇴사두근의 파상적 수축 진폭이 KOA군에서 유의하게 감소하였다(P < 0.05, P < 0.01). KOA 투여군과 비교했을 때, 두공절개술군에서 대퇴사두근의 단수축 진폭 및 파상적 수축 진폭이 유의하게 증가하였다(P < 0.05, P < 0.01, 그림 3B,C). 이러한 결과는 아큐포토술이 KOA가 있는 토끼의 대퇴사두근의 영률 및 근육 수축성을 개선할 수 있음을 보여줍니다.
KOA를 가진 토끼의 대퇴사두근 힘줄의 기계적 특성에 대한 acupotomy의 효과를 평가하기 위해 대퇴사두근 힘줄에 대한 인장 시험과 응력 완화 시험을 실시했습니다. 대퇴사두근 힘줄의 인장특성은 대조군에 비해 KOA군에서 대퇴사두근 힘줄의 최종 하중 및 최대 변위가 유의하게 감소한 반면(P < 0.01, P < 0.01), KOA 그룹의 대퇴사두근 힘줄의 강성은 하향 경향을 보였다(P > 0.05)입니다. KOA 투여군과 비교했을 때, 두공절개술군에서 대퇴사두근 힘줄의 최종 하중 및 최대 변위는 유의하게 감소하였고(P < 0.01, P < 0.01), 경구절개술군에서 대퇴사두근 힘줄의 경직도는 상승 경향을 보였다(P > 0.05, 그림 4A-C). 응력 완화율 측면에서는 대조군에 비해 KOA 그룹의 대퇴사두근 힘줄의 응력 완화율이 감소하였다(P < 0.05). KOA 투여군과 비교했을 때, 아쿠포토토미 투여군에서 대퇴사두근 힘줄의 응력 완화율이 증가하였다(P < 0.05, 도 4D). 이러한 결과는 세포절개술이 KOA를 가진 토끼의 대퇴사두근 힘줄의 인장 및 응력 이완 특성을 향상시킬 수 있음을 보여줍니다.
연골 접촉면과 연골 형태에 대한 단위 면적당 압력과 압력의 실험 결과
연골 접촉면에 대한 최대 압력은 대조군과 비교했을 때 KOA 그룹에서 연골 접촉면에 대한 최대 압력에 유의한 차이는 없었으나(P > 0.05), 하향 추세가 있었다. KOA 투여군과 비교했을 때, 아큐포토 절제술 투여군에서 연골 접촉면에 대한 최대 압력에는 유의한 차이가 없었지만(P > 0.05), 상승 경향을 보였다(그림 5A). 연골 접촉면의 단위면적당 압력은 대조군과 비교했을 때 KOA군에서 단위면적당 최대압력은 유의한 차이가 없었으나(P > 0.05), 하향 추세를 보였다. 대조군과 비교했을 때, 아큐포토 절제술 그룹의 단위 면적당 최대 압력에는 유의한 차이가 없었지만(P > 0.05), 상승 추세가 있었습니다(그림 5B). 이러한 결과는 절개술 중재술이 연골 접촉면의 단위 면적당 최대 압력과 압력을 증가시키는 경향이 있음을 보여주며, 이는 연골 스트레스 환경에 긍정적인 영향을 미친다는 것을 나타냅니다.
연골 형태에 대한 acupotomy의 효과를 평가하기 위해 Safranin O-Fast Green 염색을 사용했습니다. 대조군에서는 연골 표면이 매끄러웠다. 모든 층의 연골세포는 깔끔하고 질서 정연하게 배열되어 있었다. 표재성 연골세포는 방추 모양으로 배열되었다. 연골세포의 중간 층과 깊은 층은 원주 배열로 배열되었습니다. 조수간만의 차는 맑고 완전했다. 판누스(pannus) 형성은 없었다(그림 6A). KOA 그룹에서는 연골 표면이 거칠거나 박리 결함이 있었습니다. 표재성 연골세포의 수가 감소하였다; 연골세포의 위계와 배열이 무질서했다. 중간층 연골세포는 탈수, 수축 및 괴사의 징후를 보였다. 연골세포 군집이 관찰되었다. 조수간만의 차가 흐릿하거나 왜곡된 골절이 보였다. 일부 지역에서는 반복되는 조수 간만의 차가 보일 수 있습니다. 혈관은 조석선을 통해 석회화되지 않은 연골로 통과했을 수 있습니다. 또는 판누스(pannus) 형성이 있었다(그림 6B). acupotomy 그룹에서 연골의 표층은 비교적 매끄러웠습니다. 연골세포의 구조는 정상이었다. 모든 층에서 연골세포의 배열은 비교적 깔끔했다. 조수간만의 차가 맑았거나 간간이 반복되는 조수간만의 차가 있었다. 판누스 형성은 없었다(그림 6C). 연골 형태학적 점수는 대조군에 비해 KOA 그룹의 연골 Markin 점수가 유의하게 증가했다(P < 0.01). KOA 투여군과 비교했을 때, 아큐포토 토미 투여군의 연골 Markin 점수는 유의하게 감소하였다(P < 0.01, 도 6D). 이러한 결과는 KOA가 있는 토끼의 연골 무결성이 손상되었으며 acupotomy 개입이 연골의 퇴화를 지연시키고 연골에 대한 보호 효과를 가질 수 있음을 보여줍니다.
그림 1: 무릎 골관절염 모델을 확립하기 위해 수정된 Videman 방법. (A) KOA 모델 구축에 필요한 자료. (B) 의료용 감압 테이프를 사용하여 토끼의 왼쪽 뒷다리를 덮습니다. (C) 토끼의 왼쪽 뒷다리에 폴리머 붕대를 감습니다. (디,이) 부목을 사용하여 토끼의 무릎과 발목 관절을 고정하십시오. (F) 토끼가 갉아먹는 것을 방지하기 위해 철망을 감쌉니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: Acupotomy 중재 수술 방법. (A) 토끼의 왼쪽 뒷다리 무릎 관절의 피부 준비. (B) 삽입 지점을 선택하고 수술용 피부 마커를 사용하여 위치를 표시합니다. (C) 의료용 요오드호를 사용하여 소독하십시오. (D) 신경과 혈관을 피하기 위해 압력을 가하고 분리하십시오. (E) acupotomy를 뚫고 수술합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 대퇴사두근의 기계적 특성. (A) 대퇴사두근의 영률(Young's modulus of quadriceps femoris) 분석; (B) 대퇴사두근의 단일 수축 진폭 분석; (C) 대퇴사두근의 파상풍 수축 진폭 분석. 값은 평균± SD입니다. 그룹당 N = 6입니다. 해당 대조군과 비교: *P < 0.05 및 **P < 0.01; 해당 모델 그룹과 비교: #P < 0.05 및 ##P < 0.01. 약어: KOA = 무릎 골관절염. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 대퇴사두근 힘줄의 기계적 특성. (A) 대퇴사두근 힘줄의 최종 하중 분석; (B) 대퇴사두근 힘줄의 최대 변위 분석; (C) 대퇴사두근 힘줄의 강성 분석; (D) 대퇴사두근 힘줄의 응력 이완. 값은 평균± SD입니다. 그룹당 N = 6입니다. 해당 대조군과 비교: *P < 0.05 및 **P < 0.01; 해당 모델 그룹과 비교: #P < 0.05 및 ##P < 0.01. 약어: KOA = 무릎 골관절염. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 연골 접촉면의 압력. (A) 연골 접촉면에 대한 최대 압력 분석; (B) 연골 접촉면의 단위 면적당 압력 분석. 값은 평균± SD입니다. 그룹당 N = 6입니다. 약어: KOA = 무릎 골관절염. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: Safranin O-Fast green 및 연골의 markin score를 사용한 연골 염색. (A) 대조군, (B) 모델군, (C) 절개술군, (D) 연골의 마킨 점수 분석. 값은 평균± SD입니다. 그룹당 N = 6입니다. 해당 대조군과 비교: **P < 0.01; 해당 모델 그룹과 비교: ##P < 0.01. 스케일 바 = 50μm(A-C). 약어: KOA = 무릎 골관절염. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 나. 구조 | III. 염색 | ||
| a. 보통 | 0 | a. 보통 | 0 |
| b. 표면 불규칙성 | 1 | b. 약간의 감소 | 1 |
| c. Pannus 및 표면 불규칙성 | 2 | c. 적당한 감소 | 2 |
| d. 전이 영역으로의 틈 | 3 | d. 가혹한 감소 | 3 |
| e. 방사형 영역에 대한 틈 | 4 | e. 염료 없음 | 4 |
| f. 석회화 구역에 대한 틈 | 5 | ||
| g. 완전한 무질서 | 6 | ||
| II. 세포 | IV. 타이드마크 무결성 | ||
| a. 보통 | 0 | a. 그대로 | 0 |
| b. 확산 초세포성(Diffuse hypercellularity) | 1 | b. 혈관에 의해 교차 | 1 |
| c.클로닝 | 2 | ||
| d. 저세포성 | 3 | ||
표 1: 수정된 맨킨 점수.
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Discussion
적절한 동물 모델은 실험 목표를 달성하고 특정 과학적 질문을 명확히 하기 위한 핵심 요소 중 하나입니다. 본 연구는 정진의 뼈 조절 및 관절 윤활 이론과 "기계적 불균형" 이론을 바탕으로 한 것으로, 절구술 치료에서 "뼈 질환을 치료하기 위해 근육과 힘줄을 조절"함으로써 KOA 치료의 과학적 의미를 설명하는 것을 목표로 합니다. 즉, 무릎 주위 연조직의 기계적 특성을 조절하여 연골의 비정상적인 기계적 환경을 개선하여 퇴화를 지연시키고 연골을 보호하는 것입니다. KOA 동물 모델은 일반적으로 자발적 모델과 유도 모델의 두 가지 범주로 분류됩니다. 자발적 KOA 모델은 모델링 기간이 상대적으로 길고 제한 사항이 많기 때문에 덜 사용됩니다. 유도 KOA 모델은 외과적 접근법(예: 수정된 Hulth 방법, 반월상 연골 절제술, 전방 십자인대 파열, 관절 내 주사 및 관절 고정)을 통해 확립할 수 있습니다. 내측 측부 인대, 전방 십자인대 절단, 내측 반월상 연골 및 기타 구조물 제거 등의 수술 방법을 사용하여 무릎 관절을 불안정하게 만들어 내부 기계적 불균형과 관절 표면 간의 직접적인 마찰을 유발하여 KOA11을 유발합니다. 이 유형의 모델은 외상성 관절염 연구에 더 적합합니다. 관절 내 주사는 무릎 관절강에 약물을 전달하여 관절강 내 연골세포의 염증, 연골세포의 대사장애, 연골세포의 독성 반응을 유도하여 관절 스트레스에는 거의 영향을 미치지 않으면서 KOA를 발생시킨다12. 관절 고정은 무릎 관절의 움직임을 제한하여 무릎 주위의 근육과 인대의 위축을 유발하여 관절 연골 퇴화를 발생시키고 악화시켜 관절 스트레스의 변화를 초래하여 KOA 모델12를 확립합니다.
변형된 Videman 방법은 관절 고정법으로, 무릎을 과도하게 신전한 자세로 고정시킴으로써 무릎 근육과 인대가 위축되어 관절 스트레스의 변화와 연골 퇴화를 초래하는 것에서 볼 수 있듯이 인체 무릎 근육의 약화로 인한 KOA의 병리학적 과정에 더 부합합니다. KOA를 유발하는 관절 불안정을 유발하는 수술적 방법과 비교할 때, 수정된 Videman 방법은 힘줄 손상이 첫 번째 단계이고 힘줄과 뼈 질환이 그 뒤를 잇는 KOA의 자연 발병 기전에 더 부합합니다. 따라서 본 연구에 더 적합하다13. 초기 또는 중기 KOA의 치료에서 acupotomy의 효과가 더 분명하기 때문에 성형 시간은 6주이며 이는 중기 KOA의 병리학적 변화와 일치합니다. 모형 유도 과정에서 장시간 과신전 제동은 무릎 관절 주변 근육의 위축으로 이어질 수 있으며, 왼쪽 뒷다리의 불편함으로 인해 토끼가 모형 기구를 갉아먹는 경우가 많습니다. 모델 기기가 헐거워질 수 있으므로 토끼형 장치의 조임 상태를 정기적으로 확인하고 적시에 보강해야 합니다. 또한 토끼의 사지 혈액 공급, 부종, 피부 병변 및 소화관 증상에 항상주의를 기울이고 필요한 경우 모델 기기를 제거해야합니다. 이 과정에서 토끼는 마취 상태이기 때문에 토끼가 깨어날 때까지 토끼를 따뜻하게 유지하고 토끼의 상태를 실시간으로 살피는 것이 필요합니다.
침술은 기존의 침에 메스 기능을 더하여 침의 개념을 이용하여 몸에 침투하는 침술로, 침에 비해 절단 및 분리 효과가 우수하면서도 메스보다 인체에 미치는 외상이 훨씬 적다(14). Acupotomology는 KOA의 근본 원인이 무릎 관절 주변의 연조직 손상으로 인한 기계적 불균형이라고 생각합니다. 따라서 무릎 관절의 기계적 균형을 회복하는 것이 관건입니다. 치료 지점의 선택과 관련하여 한편으로 acupotomy는 경락과 힘줄의 이론을 기반으로하며 통증 부위를 경혈로 사용합니다. 반면에 acupotomy는 현대 해부학 및 생체 역학에 의해 안내되며 무릎 관절 주변의 연조직 손상이 유착과 수축을 일으켜 무릎 관절의 기계적 균형을 파괴하고 관절에 높은 응력 지점을 생성한다고 믿습니다. 따라서 조직 접착, 수축 및 높은 스트레스 지점은 종종 치료 지점15,16으로 간주됩니다.
연조직의 생체역학적 분석에 따르면 힘줄과 뼈의 부착점은 대부분 연조직 응력이 집중되는 곳(응력 집중이라고도 함)과 유착, 구축 및 탯줄 모양의 결절과 같은 병리학적 산물이 쉽게 생성되는 곳이다17. 또한 임상적 실습을 통해 촉진에 의해 발견되는 압통점이 힘줄과 뼈의 부착점과 겹치는 경우가 많다는 것이 입증되었습니다. 따라서 본 연구는 vastus medialis, vastus lateralis, rectus femoris, biceps femoris, anserine bursa의 힘줄 삽입을 선택하였다. acupotomy는 조직에 덜 외상을 유발하지만 여전히 침습적 개입 방법입니다. 중재 중에는 acupotomy의 4단계 절차(위치, 방향, 눌렀다가 놓기, 천공)를 엄격히 따라야 합니다. 또한 사용자는 각 중재의 이완 정도와 치료 빈도에 주의해야 합니다. 조직의 과도한 손상을 방지하기 위해 일주일에 한 번 2-3 번 각 치료 지점을 해제하는 것이 좋습니다. acupotomy 중재가 완료되면 토끼의 왼쪽 뒷다리의 무릎 관절을 다시 소독하고 acupotomy 입구에 반창고를 붙입니다.
안정적인 무릎 관절은 기계적 균형을 유지하고 정상적인 생리적 움직임을 수행하기 위한 전제 조건이다18. 무릎 관절의 안정성을 유지하는 데 중요한 요소인 근육과 힘줄은 근육의 기계적 성질의 중요한 구성 요소인 수축과 수동 당김 시 근육의 다양한 기계적 특성을 결정하는 점탄성 조직 구조로, 근육의 정상적인 운동 기능을 보장합니다. 연조직의 기계적 성질을 나타내는 지표인 탄성계수는 대퇴사두근의 기계적 기능 변화와 양의 상관관계가 있다19. 생리학적으로 골격근 수축에는 단일 수축과 파상근 수축의 두 가지 형태가 있습니다. 전자는 근육 활동의 기본 단위이고 후자는 주로 골격근의 부드러운 움직임을 생성합니다. 따라서 단일 및 파상풍 수축의 최대 진폭은 일반적으로 근육 수축 기능을 평가하는 데 사용됩니다.
골격근 위축은 파상근 수축 감소와 자발적 수축 극대화로 이어지며, 이는 근육 수축 능력의 감소를 나타낸다20. 근력의 감소는 힘줄의 기능을 손상시킬 수 있으며, 이는 힘줄의 점탄성의 감소와 힘줄의 변형에 저항하는 능력의 감소로 나타난다8. 병리학적 조건에서는 힘줄의 응력 완화와 인장 특성이 감소하여 무릎 관절의 균형을 잃고 KOA의 진행을 가속화할 수 있습니다. 따라서 본 연구에서는 대퇴사두근의 기계적 특성에 대한 acupotomy의 효과를 평가하기 위해 탄성률, 단일수축의 진폭, 대퇴사두근의 파상적 수축의 진폭, 극하중, 최대변위, 강성 등 대퇴사두근 힘줄의 인장특성, 대퇴사두근 힘줄의 응력 완화 등을 선정하였다. 연골 지지력 부위의 스트레스 및 압력 테스트와 무릎 관절 연골의 Safranin O/Fast Green 염색을 사용하여 두공절개술 요법이 대퇴사두근의 기계적 특성을 개선하고 연골에 보호 효과를 발휘하는지 여부를 평가했습니다. 실험 결과는 "뼈 질환을 치료하기 위해 근육과 힘줄을 조절한다"는 이론과 결합된 지압술이 대퇴사두근의 근육과 힘줄의 기계적 특성을 조절하여 연골의 스트레스 환경을 개선하고 연골 퇴화를 지연시키며 연골에 보호 효과를 줄 수 있음을 보여줍니다.
이 실험에는 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 한편으로는, 무릎 정렬 불량과 무릎 생체역학적 불균형에 미치는 영향을 평가하지 않았다. 한편, 본 연구는 무릎 주변 연조직의 기계적 특성을 조절하여 연골 퇴화를 지연시키는 데 있어 지각절개술의 역할을 규명하기 위해 KOA 모델링을 위해 왼쪽 뒷다리 확장 고정의 수정된 Videman 방법을 선택했습니다. 그러나 인대 및 반월상 연골 파열과 같은 외상성 요인으로 인한 무릎 골관절염에서 acupotomy의 역할은 조사되지 않았습니다. 또한 acupotomy 중재술은 일종의 폐쇄형 최소 침습 수술입니다. 이 연구에서는 촉진 및 침구 절개술 중재 모두 비직접적인 시력 조건에서 병든 조직을 노출시키지 않고 수행되었습니다. 실험 결과에 대한 주관적 요인의 영향을 줄이기 위해 촉진 및 acupotomy 중재를 동일한 인원이 수행했습니다. 따라서 특정 제한 사항이 있지만 본 연구 결론의 신뢰성에 영향을 미치지 않습니다.
요약하면, 본 논문은 수정된 Videman 방법(왼쪽 뒷다리 확장 고정)을 사용한 KOA 모델 유도와 acupotomy 중재에 대해 자세히 설명합니다. 또한 대퇴사두근의 탄성계수 및 수축 기능, 대퇴사두근 힘줄의 기계적 특성, 관절 연골 지지부의 힘과 압력, 무릎 관절 연골의 Safranin O/Fast Green 염색 등에 대한 실험을 통해 KOA의 지압술 치료 기전을 분석합니다. 연조직의 생체역학적 특성을 개선하기 위한 세포절개술의 메커니즘을 연구하는 것은 KOA 및 기타 스포츠 관련 전신 부상의 치료에 대한 새로운 통찰력을 제공할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
이 연구는 중국 국립 자연 과학 재단 (No.82074523,82104996)의 지원을 받았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acupotomy | Beijing Zhuoyue Huayou Medical Devices Co., Ltd. | 0.4 x 40 mm | |
| Connect Cast Orthopedic Casting Tape | Suzhou Connect Medical Technology Co.,Ltd. | KCP06 | 15.0 cm x 360 cm |
| Double-sided Foam Tape | Deli Group Co.,Ltd. | NO.30416 | 36 mm x 5 yard x 2.5 mm |
| Environmental Dewaxing Solution | Wuhan Servicebio Technology Co.,Ltd. | G1128 | |
| Ethanol absolute | Beijing Hengkangda Medicine Co., Ltd. | ||
| Fast Green solution | Wuhan Servicebio Technology Co.,Ltd. | G1031 | |
| Fast grenn FCF | Sigma,America | 2353-45-9 | |
| Fatigue testing machine | BOSE, America | Bose Electro Force 3300 | |
| Four-channel physiological recorder | Chengdu Instrumeny Frctory | RM-6420 | |
| FPD-305E | Fuji, Japan | ||
| FPD-306E | Fuji, Japan | ||
| Hematoxylin solution | Wuhan Servicebio Technology Co.,Ltd. | G1005 | |
| Medical iodophor disinfectant | Shan Dong Lircon Medical Technology Co., Ltd. | ||
| Medical Tape | Shandong Rongjian Sanitary Products Co., Ltd. | 200402 | 1.5 x 500 cm |
| Muscle tension transducer | Chengdu Instrumeny Frctory | JH-2204005, 50 g | |
| Prescale | Fuji, Japan | ||
| Real-time SWE ultrasound diagnostic instrument | SuperSonic Imagine SA,France | SuperSonic Imagine AixPlorer | |
| Rhamsan gum | Wuhan Servicebio Technology Co.,Ltd. | WG10004160 | |
| Safranine O | Sigma,America | 477-73-6 | |
| Safranine O solution | Wuhan Servicebio Technology Co.,Ltd. | G1015 | |
| Statistical Package for the Social Sciences (SPSS) | IBM, America |
References
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