Summary
В этом протоколе была подготовлена модель остеоартроза коленного сустава с использованием модифицированного метода Видемана, а также подробно описаны процедуры операции и меры предосторожности при акупотомии. Эффективность акупотомии была продемонстрирована путем тестирования механических свойств четырехглавой мышцы бедра и сухожилия, а также механических и морфологических свойств хряща.
Abstract
Артроз коленного сустава (КОА) является одним из наиболее часто встречающихся заболеваний в ортопедическом отделении, которое серьезно снижает качество жизни людей с КОА. Среди нескольких патогенных факторов биомеханический дисбаланс коленного сустава является одной из основных причин КОА. Акупотомологи считают, что восстановление механического баланса коленного сустава является ключом к лечению КОА. Клинические исследования показали, что акупотомия может эффективно уменьшить боль и улучшить подвижность коленного сустава за счет уменьшения адгезии, контрактуры мягких тканей и точек концентрации напряжения в мышцах и сухожилиях вокруг коленного сустава.
В этом протоколе мы использовали модифицированный метод Видемана для создания модели КОА путем иммобилизации левой задней конечности в прямом положении. Мы подробно описали метод операции и меры предосторожности, связанные с акупотомией, и оценили эффективность акупотомии в сочетании с теорией «Модуляция мышц и сухожилий для лечения заболеваний костей» путем выявления механических свойств четырехглавой мышцы бедра и сухожилия, а также механики и морфологии хряща. Результаты показывают, что акупотомия оказывает защитное действие на хрящ, регулируя механические свойства мягких тканей вокруг коленного сустава, улучшая стрессовую среду хряща и задерживая дегенерацию хряща.
Introduction
Остеоартроз коленного сустава (КОА) является наиболее частой формой остеоартрита, часто распознаваемой как заболевание всего сустава, характеризующееся дегенерацией суставного хряща, которая клинически проявляется болью, отеком и ограничением движений пораженных суставов1. Согласно последним эпидемиологическим статистическим данным, к 2020 году КОА затронул 654,1 миллиона человек во всем мире в возрасте 40 лет и старше. Распространенность и заболеваемость КОА возрастают с возрастом, являются самыми высокими среди людей среднего и пожилого возраста и чаще поражают женщин, чем мужчин2. Распространенность КОА, вероятно, будет расти из-за старения населения и эпидемии ожирения во всем мире, что представляет собой растущую угрозу глобальному общественному здравоохранению. Возраст, пол, ожирение, травмы и другие сложные факторы риска, связанные с КОА, напрямую влияют на нестабильность коленного сустава, что делает биомеханический дисбаланс в коленных суставах одной из основных причин КОА3.
В нормальных физиологических условиях коленный сустав находится в состоянии механического равновесия, обеспечивающего равномерное распределение механических нагрузок в суставе по хрящу. Любой механический дисбаланс в коленном суставе может привести к аномальной нагрузке на хрящ, что приводит к дегенерации хряща и возникновению КОА4. Мышечно-сухожильная система является основной динамической системой, поддерживающей механическое равновесие коленного сустава. Скоординированное движение мышце-сухожильной системы разгибателей и сгибателей может равномерно распределять нагрузку, создаваемую движением на поверхности хряща, избегая метаболического дисбаланса локальных хрящевых напряжений, выходящих за рамки его физиологической нагрузки, что приводит к потере хряща5. Снижение мышечной силы является основной причиной нарушения внутримышечных движений и повреждения хряща, которые могут возникнуть до симптоматического КОА.
КОА также может индуцировать артрогенное мышечное торможение (ОИМ), проявляющееся в виде мышечной слабости и снижения мышечной силы вокруг коленного сустава6. Среди этих мышц группа четырехглавой мышцы бедра функционирует как единственный разгибатель коленного сустава, важная структура для поддержания стабильности коленного сустава. Исследования показали, что уменьшение площади поперечного сечения квадрицепсов и мышечной силы значимо и положительно коррелирует с прогрессированием КОА7. Снижение силы квадрицепсов влияет на походку, устойчивость коленей, паттерны движений и многие другие функции. Кроме того, снижение мышечной силы ухудшает функцию сухожилий, что проявляется в снижении жесткости сухожилий, модуля упругости и других биомеханических свойств8. При длительном растяжении в мышцах и сухожилиях коленного сустава могут возникать такие изменения, как спайка и контрактура, что приводит к нарушению их механических свойств, вызывает нестабильность сустава и, в конечном счете, формирует порочный круг патологических изменений КОА. Поэтому для лечения КОА крайне важно улучшить механические свойства мышечно-сухожильной системы и восстановить механический баланс суставов.
Среди причин КОА биомеханический дисбаланс является основным фактором, вызывающим боль в колене, дисфункцию, воспалительные поражения и дегенерацию хряща9. Поэтому ключом к лечению КОА является восстановление биомеханического баланса коленного сустава. Акупотомологи считают, что этиология и патогенез КОА – это «механический дисбаланс». Когда механические характеристики мягких тканей вокруг колена аномально изменяются, коленный сустав теряет свой механический баланс, а аномальная механическая стрессовая среда сустава ускоряет дегенерацию, вызывая воспалительную стимуляцию, которая еще больше усугубляет спайки мягких тканей, контрактуры и дальнейшее снижение стабильности сустава. Этот порочный круг в конечном итоге перерастает в КОА. Ослабляя спайки и контрактуры мягких тканей, а также снижая концентрацию напряжения в мышцах и сухожилиях, акупотомия в сочетании с теорией «Модуляция мышц и сухожилий для лечения заболеваний костей» улучшает механику мягких тканей и «модулирует мышцы и сухожилия», что уравновешивает механическую нагрузку на сустав, эффективно облегчая дегенерацию хряща и «леча заболевания костей»10. С точки зрения выбора модели животного, исходя из цели данного исследования, была подготовлена модель КОА по модифицированному методу иммобилизации разгибания левой задней конечности по методу Видемана.
В данной работе подробно описано создание модели КОА с использованием модифицированного метода иммобилизации разгибания левой задней конечности по методу Видемана, а также метод операции и меры предосторожности при акупотомии. Мы демонстрируем эффективность акупотомии, проверяя механические свойства четырехглавой мышцы бедра и сухожилия и выявляя изменения напряжения и морфологии суставного хряща.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все эксперименты на животных были рассмотрены и одобрены Комитетом по этике животных Пекинского университета китайской медицины (No. BUCM-4-2022010101-1097). В этом протоколе 24 6-недельных новозеландских кролика-самцов содержались в определенных условиях, а именно при температуре 20-25 °C, влажности 50-60% и циркадном цикле 12 часов света и 12 часов в темноте, со свободным доступом к обычному рациону чау-чау. Кроликов обезболивали и приносили в жертву, сочетая глубокую анестезию и воздушную эмболизацию. Боль является одним из типичных патологических признаков КОА, а также является одним из ключевых показателей, используемых для оценки животных моделей КОА и методов вмешательства, поэтому анальгетики при подготовке модели не используются.
1. Модель кролика КОА
- Обезболивайте кроликов 3% пентобарбиталом натрия (30 мг/кг) внутривенно по краю уха. Чтобы подтвердить надлежащий уровень анестезии, обратите внимание на значительно ослабленный или отсутствующий роговичный рефлекс и отсутствие боли при пережатии кожи гемостатическими щипцами. Во время анестезии каждые 15 минут добавляйте 2-3 капли смазки в глаза кроликам, чтобы предотвратить пересыхание глаз кроликов.
- После анестезии зафиксируйте каждого кролика в положении лежа на спине, вытянув левую заднюю конечность в полностью выпрямленное положение.
- Зафиксируйте левую заднюю конечность каждого кролика в вытянутом положении.
- В качестве первого слоя используйте медицинский пластырь, чтобы покрыть кожу кролика от паха до голеностопного сустава.
- В качестве второго слоя намотайте поверх медицинской ленты двусторонний поролоновый скотч шириной 36 мм, а затем намотайте полимерную повязку от паха до голеностопного сустава. Убедитесь, что коленный сустав выпрямлен на 180°, а голеностопный сустав согнут на 60°.
- В качестве третьего слоя иммобилизуйте суставы небольшими шинами спереди и сзади коленного и голеностопного суставов, а внешний слой оберните стальной сеткой для защиты от укусов. Подставьте кроликам пальцы ног, чтобы проверить, нормально ли кровообращение.
- Обездвиживайте животных в течение 6 недель, чтобы установить модель КОА (рис. 1).
ПРИМЕЧАНИЕ: 1) Во время подготовки модели проверяйте пресс-формы через день. Если какие-либо формы ослаблены или отслоились, обезболивайте кроликов и повторно иммобилизуйте левые задние конечности в вытянутом положении. 2) Постелите на дно клеток защитные коврики, чтобы конечности кроликов не застряли и не нанесли травмы.
2. Акупотомическое вмешательство
ПРИМЕЧАНИЕ: Перед началом акупотомического вмешательства обезболивайте кроликов 3% пентобарбиталом натрия (30 мг/кг) путем внутривенной инъекции через ушной край.
- Определите точки лечения.
- Сбривают шерсть коленного сустава левой задней конечности кролика.
- Пальпируйте вставку сухожилия медиальной бедренной мышцы коленного сустава кролика, вставку сухожилия прямой бедренной кости, вставку сухожилия двуглавой мышцы бедра и синовиальную сумку гусиной лапки. Отметьте патологические уплотнения локальных мышц стерильным кожным маркером. Продезинфицируйте коленный сустав три раза, чередуя приемы медицинского йодофора и 75% медицинского спирта.
- Операция акупотомии
- Держите акупотомическое лезвие параллельно направлению движения, параллельно сухожилию и продольной оси конечности.
- Большим пальцем левой руки надавите на кожу, входящую в точку маркера, и двигайтесь вбок так, чтобы кровеносные сосуды и нервы были разделены на вентральной стороне большого пальца.
- Держа рукоятку для акупотомии в правой руке, быстро надавите с небольшим усилием, чтобы лезвие для акупотомии мгновенно прошло через кожу. Медленно продвигайте акупотомическое лезвие к локальным мышечным уплотнениям и делайте продольные надрезы и махи в стороны.
- После завершения операции акупотомии еще раз продезинфицируйте коленный сустав и наложите пластырь.
- Выполняйте эту операцию один раз в неделю в течение 4 недель (рисунок 2).
ПРИМЕЧАНИЕ: 1) Если в месте прикрепления сухожилия medialis, vastus lateralis, прямой мышцы бедра, двуглавой мышцы бедра или ансериновой сумки нет уплотнения или пуповидной ткани, следует использовать иглу для акупотомии, чтобы освободить их сухожильные вставки напрямую. 2) Во время акупотомического вмешательства не иммобилизуйте левые задние конечности кроликов в группе акупотомии и модельной группе в положении разгибания.
3. Модуль упругости четырехглавой мышцы бедра
ПРИМЕЧАНИЕ: 1) В этом эксперименте использовался ультразвуковой диагностический прибор для эластографии сдвиговой волны (SWE) в реальном времени для измерения модуля упругости четырехглавой мышцы бедра in vivo в каждой группе кроликов. 2) Тестер должен быть опытным сонографистом в ультразвуковом обнаружении. При измерении ультразвуковой датчик следует аккуратно помещать на поверхность кожи квадрицепсов, чтобы избежать локального мышечного напряжения. Измерения нужно проводить, когда животное находится в спокойном состоянии, без борьбы и активности. Если животное активно, подождите, пока оно успокоится, прежде чем проводить тест.
- Сбрейте шерсть, чтобы обнажить кожу в области квадрицепсов левой задней конечности.
- Используйте обычное двумерное ультразвуковое исследование для определения местоположения четырехглавой мышцы живота и определения области интереса (ROI), установленной на глубине 1-2 см.
- Запустите режим SWE для проверки.
- Равномерно установите область интереса на круглую область диаметром 2 мм и область интереса на глубину ~0,5-1 см от поверхности кожи.
- Используйте ультразвуковой диагностический прибор для генерации импульса силы акустического излучения для стимуляции мышечной ткани и получения тканевой эластографии.
- Подождите 2–3 секунды, пока изображение стабилизируется, а затем заморозьте изображение. Активируйте функцию Q-BOX прибора, чтобы измерить модуль Юнга четырехглавой мышцы.
- Подождите, пока система автоматически рассчитает максимальное, минимальное и среднее значения (единица измерения: KPa) модуля Юнга ROI. Выберите три ROI на одной глубине для трех измерений и возьмите среднее значение для статистического анализа.
ПРИМЕЧАНИЕ: Тестер должен быть опытным сонографистом в ультразвуковом обнаружении. При измерении ультразвуковой датчик следует аккуратно помещать на поверхность кожи квадрицепсов, чтобы избежать локального мышечного напряжения. Измерения нужно проводить, когда животное находится в спокойном состоянии, без борьбы и активности. Если животное активно, подождите, пока оно успокоится, прежде чем проводить тест.
4. Измерение силы сокращения четырехглавой мышцы бедра
ПРИМЕЧАНИЕ: После измерения силы сокращения четырехглавой мышцы бедра кроликов усыпляли с помощью воздушной эмболии под наркозом.
- Обезболивайте кроликов 3% пентобарбиталом натрия (30 мг/кг) внутривенно по краю уха. Чтобы убедиться в том, что был достигнут надлежащий уровень анестезии, обратите внимание на значительно ослабленный или отсутствующий роговичный рефлекс и отсутствие боли при зажиме кожи гемостатическими щипцами. Во время анестезии каждые 15 минут добавляйте 2-3 капли смазки в глаза кроликам, чтобы предотвратить пересыхание глаз кроликов.
- Обнажите четырехглавые мышцы и прикрепите датчик напряжения.
- Срежьте кожу ниже коленной чашечки, по продольной оси конечности вверх до основания бедра, и продолжайте разрезать кожу вверх на 3-4 см. Осторожно снимите кожу и фасцию и обнажите мышцу. Разрежьте связку надколенника и аккуратно отделите квадрицепсы от подвздошного соединения, сохраняя квадрицепсы в соединении с подвздошной мышцей.
- Наложите хирургические швы на сухожильное соединение между коленной чашечкой и четырехглавой мышцей. Растяните мышцу на всю длину в естественном состоянии, а затем прикрепите ее к датчику напряжения. Держите линию лигирования на мышце на прямой линии с линией лигирования на датчике силы.
- Закрепите датчик натяжения на кронштейне. Подсоедините линию сбора сигналов на преобразователе напряжения к процессору системы сбора биосигналов.
- Измерьте сократительную производительность четырехглавой мышцы.
- Вставляйте электроды параллельно четырехглавой мышце живота и избегайте любого контакта между электродами.
- Нажмите кнопку осциллографа. Отрегулируйте положение датчика силы на кронштейне, чтобы поддерживать базовую линию на нуле. Выберите параметры стимуляции стимулятора с шириной волны 5 мс и задержкой 10 мс.
- Сначала используйте один стимул и постепенно регулируйте интенсивность стимула от нуля с шагом 0,1 В каждый раз. Наблюдайте за изменениями кривой сокращения мышц и амплитуды сокращений до тех пор, пока не будет определена максимальная амплитуда одиночного сокращения (Pt) квадрицепсов. Запишите его для последующей статистики.
- Используйте кластерный стимул и используйте амплитуду стимула, которая индуцирует максимальную амплитуду однократного сокращения, в качестве базового уровня, чтобы непрерывно стимулировать мышцу и постепенно увеличивать частоту стимулов. Наблюдайте за изменениями кривой сокращения мышц до тех пор, пока не будет определена максимальная амплитуда сокращения (Pt) квадрицепсов. Запишите его для последующей статистики.
ПРИМЕЧАНИЕ: 1) После каждого мышечного сокращения мышце следует дать 30 секунд для расслабления, при этом мышечный буферный раствор непрерывно капает на мышцу. 2) Во время операции судите об анестезиологическом статусе, наблюдая за рефлексом век кроликов, ритмом дыхания, расслаблением мышц и реакцией на пощипывание кожи.
5. Механические характеристики сухожилия четырехглавой мышцы бедра
- Предварительная обработка: В день испытания измерьте длину, ширину и толщину сухожилия четырехглавой мышцы бедра штангенциркулем и установите специальный противоскользящий зажим в машину для усталостных испытаний. Повторная загрузка и выгрузка 15 раз для предварительной обработки.
- Тест на релаксацию напряжений: используйте датчик в диапазоне от 0 Н до 100 Н, растягивайте его со скоростью 5 мм/мин, пока он не достигнет необходимой длины, а затем начните сбор данных. Установите время сбора данных компьютера от t (0), собирая данные каждые 0,1 с, продолжительностью 1 800 с. После достижения заданного времени запишите данные и кривые.
- Испытание на растяжение: используйте датчик в диапазоне от 0 Н до 100 Н и растягивайте его со скоростью 5 мм/мин до максимальной нагрузки, пока образец не будет разорван. После испытания рассчитайте максимальное перемещение, предельную нагрузку и жесткость образца.
6. Контактное поверхностное давление сустава и давление на единицу площади хряща
- Зафиксируйте образцы бедренной и большеберцовой костей с обеих сторон в прямом положении на приспособлении и выполните испытание на преднатяг. Измерьте приблизительный диапазон коленного сустава, нарежьте чувствительную к давлению бумагу такой же формы и запечатайте ее полиэтиленовой пленкой.
- Поместите запечатанную бумагу, чувствительную к давлению, между большеберцовым и бедренным суставами и проведите испытание коленного сустава давлением 5 мм/мин и максимальным давлением 50 Н. Поддерживайте давление в течение 2 минут, пока оно не достигнет 50 Н, когда чувствительная к давлению бумага стабильно окрасится.
- Через 2 минуты снимите чувствительную к давлению бумагу, закрепите цветную поверхность на листе бумаги формата А4 и сделайте снимки с отложенным масштабом.
- Загрузите изображение на компьютер. Используйте справочное программное обеспечение для измерения площади и многосегментного измерения для нерегулярных фигур. Измерьте давление на внутреннюю и внешнюю стороны суставов бедренной и большеберцовой костей и запишите результаты.
7. Окрашивание хряща коленного сустава Safranin O/Fast Green
- После окончания акупотомического вмешательства берут ткани хрящево-субхондрального костного комплекса и встраивают их в парафин. Нарежьте подготовленную ткань восковыми блоками и подготовьте предметные стекла. Депарафинизируйте подготовленные тканевые предметные стекла раствором для депарафинизации окружающей среды (I) и раствором для депарафинизации окружающей среды (II) в течение 15 мин каждый; затем последовательно погружают их в ксилол и безводный этанол (1:1), безводный этанол (I), 95% этанол, 85% этанол и 75% этанол по 2-5 мин на каждом этапе; И, наконец, замочите их в дистиллированной воде на 15 минут.
- Выполните окрашивание.
- Прокрасьте предметные стекла раствором Fast Green в течение 1 минуты. Во время этого процесса выньте предметные стекла из раствора и наблюдайте за ними под микроскопом до тех пор, пока ткань не окрасится в темно-зеленый цвет.
- Разделение цвета: Смойте излишки раствора Fast Green сверхчистой водой. Быстро замочите предметные стекла в 1% растворе уксусной кислоты на 5 - 10 секунд. Снова промойте предметное стекло сверхчистой водой.
- Окрашивайте предметные стекла в растворе сафранина О в течение 10-15 мин, пока хрящ не окрасится в красный цвет.
- Обезвоживайте и осветляйте ткани, запечатывайте предметные стекла и наблюдайте за ними под микроскопом.
- Замочите предметные стекла в 75% этаноле, 85% этаноле, 95% этаноле и 100% этаноле в течение 3–5 секунд подряд.
- Окуните предметные стекла в раствор для депарафинизации окружающей среды (I) и раствор для депарафинизации окружающей среды (II) на 10 минут последовательно. Выньте предметные стекла и капните нейтральную смолистую среду на переднюю часть предметных стекол, избегая ткани. Положите край покровного стекла на предметное стекло, а затем медленно опустите его, чтобы покрыть нейтральный бальзам. Удалите воздух и избегайте пузырьков воздуха. Сотрите излишки ксилола и нейтрального бальзама и оставьте на ночь при комнатной температуре.
- Рассматривайте предметные стекла под микроскопом и получайте изображения. Для каждой группы выберите шесть образцов коленного хряща кролика и случайным образом выберите четыре разных поля просмотра для каждого образца для оценки. Оценивают гистологию хряща каждой группы по методу Манкина (табл. 1).
8. Статистический анализ
- Выражайте данные в виде среднего значения ± стандартного отклонения (
± с). - Выполните односторонний дисперсионный анализ (ANOVA) и тест ЛСД для определения статистической значимости сравнений нескольких групп.
- Считать различия статистически значимыми, когда P < 0,05.
± с).Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Экспериментальные результаты механических свойств четырехглавой мышцы бедра и сухожилия
Для оценки влияния акупотомологии на механические свойства четырехглавой мышцы бедра у кроликов с КОА использовали упругую ультразвуковую визуализацию сдвиговой волной в реальном времени и датчик мышечного напряжения соответственно. По сравнению с контрольной группой, модуль Юнга четырехглавой мышцы бедра в группе КОА был снижен (P < 0,05). По сравнению с группой КОА модуль Юнга в группе акупотомии был увеличен (P < 0,05, рис. 3А). По показателям сократительной способности четырехглавой мышцы бедра по сравнению с контрольной группой амплитуда одиночных сокращений и амплитуда тетанического сокращения четырехглавой мышцы бедра были достоверно снижены в группе КОА (P < 0,05, P < 0,01). По сравнению с группой КОА амплитуда одиночных сокращений и амплитуда тетанического сокращения четырехглавой мышцы бедра в группе акупотомии были достоверно увеличены (P < 0,05, P < 0,01, рис. 3B,C). Эти результаты показывают, что акупотомия может улучшить модуль Юнга и сократительную способность мышц четырехглавой мышцы бедра у кроликов с КОА.
Для оценки влияния акупотомии на механические свойства сухожилия четырехглавой мышцы бедра у кроликов с КОА нами провели тест на растяжение и стресс-релаксационный тест на сухожилие четырехглавой мышцы бедра. По характеристикам растяжения сухожилия четырехглавой мышцы бедра по сравнению с контрольной группой предельная нагрузка и максимальное смещение сухожилия четырехглавой мышцы бедра в группе КОА были достоверно снижены (Р < 0,01, Р < 0,01), в то время как жесткость сухожилия четырехглавой мышцы бедра в группе КОА показала тенденцию к снижению (Р > 0,05). По сравнению с группой КОА предельная нагрузка и максимальное смещение сухожилия четырехглавой мышцы бедра в группе акупотомии были достоверно снижены (P < 0,01, P < 0,01), а жесткость сухожилия четырехглавой мышцы бедра в группе акупотомии показала тенденцию к повышению (P > 0,05, рис. 4A-C). По скорости релаксации напряжений, по сравнению с контрольной группой, скорость релаксации сухожилия четырехглавой мышцы бедра в группе КОА была снижена (P < 0,05). По сравнению с группой КОА скорость релаксации напряжений сухожилия четырехглавой мышцы бедра в группе акупотомии была повышена (P < 0,05, рис. 4D). Эти результаты показывают, что акупотомия может улучшить характеристики растяжения и релаксации сухожилия четырехглавой мышцы бедра у кроликов с КОА.
Экспериментальные результаты измерения давления и давления на единицу площади на контактной поверхности хряща и морфологии хряща
По максимальному давлению на контактную поверхность хряща по сравнению с контрольной группой достоверной разницы в максимальном давлении на контактную поверхность хряща в группе КОА не выявлено (Р > 0,05), но наблюдалась тенденция к снижению. По сравнению с группой КОА, в группе акупотомии не было выявлено существенной разницы в максимальном давлении на контактную поверхность хряща (P > 0,05), но наблюдалась тенденция к повышению (рис. 5А). По давлению на единицу площади контактной поверхности хряща по сравнению с контрольной группой в группе КОА не было существенной разницы в максимальном давлении на единицу площади (Р > 0,05), но наблюдалась тенденция к снижению. По сравнению с контрольной группой, в группе акупотомии не было существенной разницы в максимальном давлении на единицу площади (Р > 0,05), но наблюдалась тенденция к росту (рис. 5Б). Эти результаты показывают, что акупотомическое вмешательство имело тенденцию к увеличению максимального давления и давления на единицу площади контактной поверхности хряща, что указывает на положительное влияние на стрессовую среду хряща.
Для оценки влияния акупотомии на морфологию хряща использовали окрашивание Safranin O-Fast Green. В контрольной группе поверхность хряща была гладкой; хондроциты во всех слоях располагались аккуратно и упорядоченно; поверхностные хондроциты расположены в форме веретена; средние и глубокие слои хондроцитов располагались столбчатым расположением; Линия прилива была ясной и полной; и не было образования паннуса (рис. 6А). В группе КОА поверхность хряща была шероховатой или имелись дефекты шелушения; уменьшалось количество поверхностных хондроцитов; иерархия и расположение хондроцитов были нарушены; в хондроцитах среднего слоя наблюдались признаки обезвоживания, сокращения и некроза; наблюдалась кластеризация хондроцитов; приливные линии были размыты или были видны искаженные трещины; В некоторых районах наблюдались повторяющиеся приливно-отливные линии; кровеносные сосуды, возможно, прошли через приливную линию в некальцинированный слой хряща; или имело место образование паннуса (рис. 6Б). В группе акупотомии поверхностный слой хряща был относительно гладким; структура хондроцитов была нормальной; расположение хондроцитов во всех слоях было относительно аккуратным; приливно-отливная линия была четкой или изредка повторялись приливные линии; образования паннуса не было (рис. 6С). По морфологическим показателям хряща, по сравнению с контрольной группой, показатель хряща по шкале Маркина группы КОА был достоверно повышен (P < 0,01). По сравнению с группой КОА, показатель Маркина хряща в группе акупотомии был значительно снижен (P < 0,01, рис. 6D). Эти результаты показывают, что целостность хряща кроликов с КОА была повреждена, и что вмешательство акупотомии может отсрочить дегенерацию хряща и оказать защитное действие на хрящ.
Рисунок 1: Модифицированный метод Видемана для создания модели остеоартроза коленного сустава. (A) Материалы, необходимые для создания модели KOA. (Б) Используйте чувствительную к давлению медицинскую ленту, чтобы покрыть левую заднюю конечность кроликов. (C) Оберните полимерными бинтами левую заднюю конечность кроликов. (Д,Э) Используйте шины, чтобы обездвижить коленный и голеностопный суставы кролика. (F) Оберните проволочную сетку, чтобы кролики не грызли. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Метод операции акупотомического вмешательства. (А) Подготовка кожи в коленном суставе левой задней конечности кролика. (B) Выберите точки введения и используйте хирургический маркер для кожи, чтобы отметить эти позиции. (C) Используйте медицинский йодофор для дезинфекции. (D) Надавить и отделить, чтобы избежать повреждения нервов и кровеносных сосудов. (E) Проколоть акупотомию и прооперировать. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Механические свойства четырехглавой мышцы бедра. (А) Анализ модуля Юнга четырехглавой мышцы бедра; (Б) анализ амплитуды одиночных сокращений четырехглавой мышцы бедра; (C) анализ амплитуды тетанического сокращения четырехглавой мышцы бедра. Значения являются средними ± SD. N = 6 на группу. По сравнению с соответствующей контрольной группой: *P < 0,05 и **P < 0,01; по сравнению с соответствующей модельной группой: #P < 0,05 и ##P < 0,01. Аббревиатура: КОА = остеоартроз коленного сустава. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Механические свойства сухожилия четырехглавой мышцы бедра. (А) Анализ предельной нагрузки сухожилия четырехглавой мышцы бедра; (Б) анализ максимального смещения сухожилия четырехглавой мышцы бедра; (В) анализ жесткости сухожилия четырехглавой мышцы бедра; (D) релаксация напряжения сухожилия четырехглавой мышцы бедра. Значения являются средними ± SD. N = 6 на группу. По сравнению с соответствующей контрольной группой: *P < 0,05 и **P < 0,01; по сравнению с соответствующей модельной группой: #P < 0,05 и ##P < 0,01. Аббревиатура: КОА = остеоартроз коленного сустава. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Давление на контактную поверхность хряща. (А) Анализ максимального давления на контактную поверхность хряща; (Б) анализ давления на единицу площади контактной поверхности хряща. Значения являются средними ± SD. N = 6 на группу. Аббревиатура: КОА = остеоартроз коленного сустава. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6: Окрашивание хряща зеленым Safranin O-Fast и маркиновой оценкой хряща. (А) контрольная группа, (Б) модельная группа, (В) группа акупотомии, (Г) анализ оценки маркера хряща. Значения являются средними ± SD. N = 6 на группу. По сравнению с соответствующей контрольной группой: **P < 0,01; по сравнению с соответствующей модельной группой: ##P < 0,01. Масштабные линейки = 50 мкм (A-C). Аббревиатура: КОА = остеоартроз коленного сустава. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
| И. Структура | III. Окрашивание | ||
| a. Нормальный | 0 | a. Нормальный | 0 |
| b. Неровности поверхности | 1 | b. Незначительное уменьшение | 1 |
| c. Паннус и неровности поверхности | 2 | c. Умеренное снижение | 2 |
| d. Расщелины в переходную зону | 3 | d. Значительное снижение | 3 |
| e. Расщелины в радиальную зону | 4 | e. Краситель не указан | 4 |
| f. Расщелины в кальцинированной зоне | 5 | ||
| g. Полная дезорганизация | 6 | ||
| II. Ячейки | IV. Целостность приливного знака | ||
| a. Нормальный | 0 | a. Целый | 0 |
| b. Диффузная гиперцеллюлярность | 1 | b. Пересеченные кровеносными сосудами | 1 |
| c. Клонирование | 2 | ||
| d. Гипоцеллюлярность | 3 | ||
Таблица 1: Модифицированная оценка Манкина.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Подходящая модель животного является одним из ключевых факторов для достижения экспериментальных целей и прояснения конкретного научного вопроса. Это исследование было основано на теориях «Цзунцзинь, контролирующего кости и смазывающего суставы» и «механического дисбаланса» в акупотомологии, с целью объяснить научную коннотацию, лежащую в основе лечения КОА путем «модуляции мышц и сухожилий для лечения заболеваний костей» в терапии акупотомии. Другими словами, акупотомия улучшает аномальную механическую среду хряща, регулируя механические характеристики мягких тканей вокруг колена, чтобы замедлить дегенерацию и защитить хрящ. Модели КОА на животных обычно подразделяются на две категории: спонтанные и индуцированные модели. Спонтанные модели КОА используются реже из-за относительно большой продолжительности моделирования и больших ограничений. Индуцированные модели КОА могут быть установлены хирургическими методами (например, модифицированным методом Хульта, менискэктомией, разрывом передней крестообразной связки, внутрисуставной инъекцией и иммобилизацией сустава). Хирургические методы, в том числе разрезание медиальной коллатеральной связки, передней крестообразной связки, удаление медиального мениска и других структур, используются для дестабилизации коленного сустава, что приведет к внутреннему механическому дисбалансу и прямому трению между суставными поверхностями, тем самым индуцируя КОА11. Этот тип модели больше подходит для исследования травматического артрита. Внутрисуставная инъекция доставляет лекарство в полость коленного сустава, чтобы вызвать воспаление, метаболические нарушения хондроцитов и токсические реакции хондроцитов в полости сустава, таким образом, развивая КОА, но мало влияя на нагрузку на сустав12. Иммобилизация сустава развивает и усугубляет дегенерацию суставного хряща, ограничивая движение коленного сустава, вызывая атрофию мышц и связок вокруг колена, что приводит к изменениям нагрузки на сустав, тем самым устанавливая модель KOA12.
Модифицированный метод Видемана – это метод иммобилизации суставов, который в большей степени соответствует патологическому процессу КОА, вызванному слабостью мышц коленного сустава человека, что проявляется в неиспользуемой атрофии мышц и связок колена путем иммобилизации колена в перерастянутом положении, что приводит к изменениям напряжения сустава и дегенерации хряща. По сравнению с хирургическими методами, которые вызывают нестабильность сустава, приводящую к КОА, модифицированный метод Видемана больше соответствует естественному патогенезу КОА, при котором повреждение сухожилий является первой фазой, за которой следует заболевание сухожилий и костей; Поэтому он больше подходит для данного исследования13. Поскольку эффект акупотомии при лечении ранней или средней стадии КОА более очевиден, время формирования составляет 6 недель, что согласуется с патологическими изменениями КОА средней стадии. В процессе индукции модели длительное торможение при переразгибании может привести к неработоспособности атрофии мышц вокруг коленного сустава, а дискомфорт в левой задней конечности часто заставляет кроликов грызть модельные приспособления. Так как модельные приборы могут болтаться, необходимо регулярно проверять герметичность устройства кроликового типа и вовремя их укреплять. Кроме того, необходимо всегда обращать внимание на кровоснабжение конечностей кролика, отеки, поражения кожи, симптомы со стороны пищеварительного тракта, и при необходимости снимать модельные приспособления. Так как кролики во время этого процесса находятся в состоянии наркоза, необходимо держать кроликов в тепле и обращать внимание на состояние кроликов в режиме реального времени, пока кролики не проснутся.
Акупотомия включает в себя функцию скальпеля в дополнение к существующей акупунктурной игле, используя концепцию иглоукалывания для проникновения в тело, с режущим и разделяющим эффектом, превосходящим акупунктурную иглу, при этом нанося гораздо меньше травм человеческому телу, чем скальпель14. Акупотомологи считают, что первопричиной КОА является механический дисбаланс из-за повреждения мягких тканей вокруг коленного сустава. Поэтому ключом к лечению КОА с помощью акупотомии является восстановление механического баланса коленного сустава. Что касается выбора лечебных точек, то, с одной стороны, акупотомия основана на теории меридианов и сухожилий и принимает за акупунктурную точку болезненную локализацию. С другой стороны, акупотомия руководствуется современной анатомией и биомеханикой и считает, что повреждение мягких тканей вокруг коленного сустава вызывает спайку и сокращение, что разрушает механический баланс коленного сустава и создает точки высокого напряжения в суставе. Поэтому точки адгезии, сжатия и высокого напряжения тканей часто принимаются в качестве точек лечения15,16.
Биомеханический анализ мягких тканей показывает, что точки прикрепления сухожилий и костей в основном находятся там, где сосредоточены напряжения мягких тканей, также называемые концентрацией напряжений, и где легко образуются патологические продукты, такие как спайки, контрактуры и шнуровидные узелки17. Кроме того, клиническая практика доказала, что чувствительные точки, обнаруженные при пальпации, часто перекрываются с точками прикрепления сухожилий и костей. Таким образом, в этом исследовании было выбрано прикрепление сухожилий в vastus medialis, vastus lateralis, rectus femoris, bigeps femoris и anserine bursa. Несмотря на то, что акупотомия наносит меньше травм тканям, она все же является методом инвазивного вмешательства. Во время вмешательства необходимо строго соблюдать четырехступенчатую процедуру акупотомии: расположение, направление, надавливание-отпускание и пункция. Кроме того, пользователи должны быть осторожны со степенью расслабления и частотой лечения каждого вмешательства. Желательно освобождать каждую лечебную точку 2-3 раза в неделю, чтобы не допустить чрезмерного повреждения тканей. После завершения акупотомического вмешательства коленный сустав левой задней конечности кролика снова дезинфицируют и накладывают пластырь на точку входа акупотомии.
Стабильные коленные суставы являются необходимым условием для поддержания механического равновесия и выполнения нормальных физиологических движений18. Мышцы и сухожилия - важные факторы поддержания стабильности коленного сустава - представляют собой вязкоупругие тканевые структуры, определяющие различные механические свойства мышц при сокращении и пассивном растяжении, которые являются важными компонентами механических свойств мышц и обеспечивают нормальную двигательную функцию мышц. Модуль упругости, показатель механических свойств мягких тканей, положительно коррелирует с изменениями механической функции четырехглавой мышцы бедра19. Физиологически сокращение скелетных мышц включает в себя две формы: одиночное сокращение и тетаническое сокращение. Первый является основной единицей мышечной деятельности, а второй в основном обеспечивает плавное движение скелетной мускулатуры. Поэтому для оценки сократительной функции мышц обычно используют максимальную амплитуду одиночных и тетанических сокращений.
Неиспользование атрофии скелетных мышц приводит к уменьшению тетанического сокращения и максимальному произвольному сокращению, что указывает на снижение сократительной способности мышц20. Снижение мышечной силы может повредить функцию сухожилий, что проявляется в снижении вязкоупругости сухожилий и снижении способности сухожилий сопротивляться деформации8. При патологических состояниях может снижаться стресс-релаксация и растягивающие свойства сухожилий, в результате чего коленный сустав теряет равновесие и ускоряется развитие КОА. Поэтому в данном исследовании для оценки влияния акупотомии на механические свойства квадрицепсов были выбраны модуль упругости, амплитуда одиночного сокращения, амплитуда тетанического сокращения квадрицепса, характеристики растяжения сухожилия четырехглавой мышцы бедра, такие как предельная нагрузка, максимальное смещение, жесткость, а также релаксация напряжений сухожилия четырехглавой мышцы бедра. Стресс-тест и испытание под давлением опорной области хряща и окрашивание хряща коленного сустава Safranin O/Fast Green были использованы для оценки того, улучшает ли терапия акупотомией механические свойства четырехглавой мышцы бедра и оказывает ли защитное действие на хрящ. Экспериментальные результаты показывают, что акупотомия в сочетании с теорией «модуляции мышц и сухожилий для лечения заболеваний костей» может улучшить стрессовую среду хряща, замедлить дегенерацию хряща и оказать защитное действие на хрящ за счет модуляции механических свойств мышц и сухожилий квадрицепсов.
У этого эксперимента есть определенные ограничения. С одной стороны, мы не оценивали смещение коленного сустава и его влияние на биомеханический дисбаланс коленного сустава. С другой стороны, в этом исследовании был выбран модифицированный метод иммобилизации разгибания левой задней конечности Видемана для моделирования КОА, чтобы прояснить роль акупотомии в замедлении дегенерации хряща путем модуляции механических свойств мягких тканей вокруг колена. Однако роль акупотомии при остеоартрозе коленного сустава, вызванном травматическими факторами, такими как разрывы связок и мениска, не исследована. Кроме того, акупотомическое вмешательство является разновидностью закрытой, малоинвазивной хирургии. В этом исследовании как пальпация, так и акупотомия выполнялись без обнажения пораженной ткани в условиях непрямого зрения. Для снижения влияния субъективных факторов на результаты эксперимента и пальпация, и акупотомическое вмешательство выполнялись одним и тем же персоналом. Таким образом, хотя и существуют определенные ограничения, они не влияют на достоверность выводов данного исследования.
Таким образом, в данной работе подробно описывается индукция модели КОА с помощью модифицированного метода Видемана (иммобилизация разгибания левой задней конечности) и акупотомического вмешательства. Также показан анализ механизма акупотомического лечения КОА с помощью экспериментов по модулю упругости и сократительной функции квадрицепса, механическим характеристикам сухожилия четырехглавой мышцы бедра, силе и давлению опорной области суставного хряща и окрашиванию хряща коленного сустава Safranin O/Fast Green. Изучение механизма акупотомии для улучшения биомеханических свойств мягких тканей может дать новое представление о лечении КОА и других системных травм, связанных со спортом.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.
Acknowledgments
Работа выполнена при поддержке Национального фонда естественных наук Китая (No82074523,82104996).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acupotomy | Beijing Zhuoyue Huayou Medical Devices Co., Ltd. | 0.4 x 40 mm | |
| Connect Cast Orthopedic Casting Tape | Suzhou Connect Medical Technology Co.,Ltd. | KCP06 | 15.0 cm x 360 cm |
| Double-sided Foam Tape | Deli Group Co.,Ltd. | NO.30416 | 36 mm x 5 yard x 2.5 mm |
| Environmental Dewaxing Solution | Wuhan Servicebio Technology Co.,Ltd. | G1128 | |
| Ethanol absolute | Beijing Hengkangda Medicine Co., Ltd. | ||
| Fast Green solution | Wuhan Servicebio Technology Co.,Ltd. | G1031 | |
| Fast grenn FCF | Sigma,America | 2353-45-9 | |
| Fatigue testing machine | BOSE, America | Bose Electro Force 3300 | |
| Four-channel physiological recorder | Chengdu Instrumeny Frctory | RM-6420 | |
| FPD-305E | Fuji, Japan | ||
| FPD-306E | Fuji, Japan | ||
| Hematoxylin solution | Wuhan Servicebio Technology Co.,Ltd. | G1005 | |
| Medical iodophor disinfectant | Shan Dong Lircon Medical Technology Co., Ltd. | ||
| Medical Tape | Shandong Rongjian Sanitary Products Co., Ltd. | 200402 | 1.5 x 500 cm |
| Muscle tension transducer | Chengdu Instrumeny Frctory | JH-2204005, 50 g | |
| Prescale | Fuji, Japan | ||
| Real-time SWE ultrasound diagnostic instrument | SuperSonic Imagine SA,France | SuperSonic Imagine AixPlorer | |
| Rhamsan gum | Wuhan Servicebio Technology Co.,Ltd. | WG10004160 | |
| Safranine O | Sigma,America | 477-73-6 | |
| Safranine O solution | Wuhan Servicebio Technology Co.,Ltd. | G1015 | |
| Statistical Package for the Social Sciences (SPSS) | IBM, America |
References
- Roseti, L., Desando, G., Cavallo, C., Petretta, M., Grigolo, B.
- Cui, A. Y., et al. Global, regional prevalence, incidence and risk factors of knee osteoarthritis in population-based studies. EClinicalMedicine. 29-30, 100587 (2020).
- Miyauchi, A., et al. Alleviation of murine osteoarthritis by deletion of the focal adhesion mechanosensitive adapter, Hic-5. Sci Rep. 9 (1), 15770 (2019).
- Wright, T. Biomechanical factors in osteoarthritis: the effects of joint instability. HSS J. 8 (1), 15-17 (2012).
- Patsika, G., Kellis, E., Kofotolis, N., Salonikidis, K., Amiridis, I. G. Synergetic and antagonist muscle strength and activity in women with knee osteoarthritis. J Geriatr Phys Ther. 37 (1), 17-23 (2014).
- Blalock, D., Miller, A., Tilley, M., Wang, J. X.
- Henriksen, M., Christensen, R., Danneskiold-Samsøe, B., Bliddal, H. Changes in lower extremity muscle mass and muscle strength after weight loss in obese patients with knee osteoarthritis: a prospective cohort study. Arthritis Rheum. 64 (2), 438-442 (2012).
- Schwartz, A. G., Lipner, J. H., Pasteris, J. D., Genin, G. M., Thomopoulos, S. Muscle loading is necessary for the formation of a functional tendon enthesis. Bone. 55 (1), 44-51 (2013).
- Felson, D. T. Osteoarthritis as a disease of mechanics. Osteoarthr Cartil. 21 (1), 10-15 (2013).
- Ma, S. N., et al. Effect of acupotomy on FAK-PI3K signaling pathways in KOA rabbit articular cartilages. Evid Based Complement Alternat Med. 2017, 4535326 (2017).
- Yu, P., et al. Research progress of experimental animal models of knee osteoarthritis. China Medical Herald. 16 (27), 41-44 (2019).
- Li, L. H., et al. Research progress of rabbit knee osteoarthritis model. Journal of Jiangxi University of Chinese Medicine. 31 (4), 108-113 (2019).
- Zhang, W., Gao, Y., Guo, C. Q., Khattab, I. Z. A., Mokhtari, F. Effect of acupotomy versus electroacupuncture on ethology and morphology in a rabbit model of knee osteoarthritis. J Tradit Chin Med. 39 (2), 229-236 (2019).
- An, X. Y., et al. Chondroprotective effects of combination therapy of acupotomy and human adipose mesenchymal stem cells in knee osteoarthritis rabbits via the GSK3 beta-cyclin D1-CDK4/CDK6 signaling pathway. Aging Dis. 11 (5), 1116-1132 (2020).
- Guo, C. Q., Liu, N. G. Analysis on the distribution features of Ashi points in Jingjin disorders. Journal of Basic Chinese Medicine. 17 (8), 899-900 (2011).
- Guo, C. Q., et al. Effects of acupotomy therapy on tenderness point around knee joint in patients with knee osteoarthritis: a randomized controlled clinical trial. Journal of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine. 33 (3), 3-5 (2010).
- Zhao, Y., Dong, F. H., Zhang, K. Analysis of soft tissues mechanical changes and treatment of meridian tendon pain. Beijing Journal of Traditional Chinese Medicine. (9), 705-707 (2008).
- Zhang, L. P., Cheng, F., Liu, D. Y., Zhu, L. G. Application progress of biomechanics in knee osteoarthritis. Chinese Archives of Traditional Chinese Medicine. 34 (7), 1644-1647 (2016).
- Thomas, A. C., Sowers, M., Karvonen-Gutierrez, C., Palmieri-Smith, R. M. Lack of quadriceps dysfunction in women with early knee osteoarthritis. J Orthop Res. 28 (5), 595-599 (2010).
- Li, L., et al. Effects of unloaded muscle atrophy on contractile characteristics of hind-limb skeletal muscles in mice. Space Med Med Eng. 25 (5), 322-325 (2012).
