Kartierung dysfunktionaler Protein-Protein-Wechselwirkungen bei Krankheiten

Zusammenfassung

Hier stellen wir ein Protokoll vor, das die Erfassung und Identifizierung krankheitsspezifischer Protein-Protein-Wechselwirkungen aus nativen Zellen und Geweben mit Hilfe chemischer Sonden und Massenspektrometrie ermöglicht. Die resultierenden Interaktionsdatensätze werden über eine spezielle webbasierte Plattform analysiert, um dynamische Netzwerkdysfunktionen und Veränderungen des Signalwegs im Zusammenhang mit Krankheiten aufzudecken.

Zusammenfassung

Protein-Protein-Interaktionsnetzwerke (PPI) werden bei Krankheiten dynamisch ummodelliert, doch die meisten systembiologischen Ansätze konzentrieren sich auf Veränderungen in der Proteinhäufigkeit und übersehen kritische Dysfunktionen auf Interaktionsebene. Hier stellen wir eine robuste, chemoproteomische Methode vor - ein dysfunktionales Protein-Protein-Interaktom (dfPPI), das eine systematische, krankheitskontextuelle Kartierung von PPI-Netzwerk-Dysfunktionen in Zellen und primärem menschlichem Gewebe mit hohem Durchsatz ermöglicht. Diese Methode integriert Sonden der chemischen Biologie, die selektiv Epichaperom-basierte Interaktom-Anordnungen erfassen, mit markierungsfreier Flüssigkeitschromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS) und netzwerkbasierter Computeranalyse, um die Neuverdrahtung von Proteinnetzwerken aufzudecken, die nicht allein aus transkriptomischen oder proteomischen Daten ersichtlich ist. Die dfPPI-Plattform kann über Krankheitszustände, Spezies und Gewebe hinweg eingesetzt werden, um umsetzbare Knoten der Dysfunktion zu identifizieren und hochauflösende Einblicke in das Fortschreiten der Krankheit auf Systemebene zu ermöglichen. In diesem Protokoll demonstrieren wir Schritt-für-Schritt-Verfahren für die Probenvorbereitung, die Behandlung chemischer Sonden, die Affinitätsanreicherung, die markierungsfreie LC-MS/MS-Analyse und bioinformatische Arbeitsabläufe zur Generierung und Interpretation von dfPPI-Datensätzen. Dieser Artikel zielt darauf ab, die Reproduzierbarkeit und Zugänglichkeit dieses Ansatzes zu fördern und seine Übernahme durch die breitere Systembiologie und translationale Forschung zu unterstützen.

Einleitung

Die Funktion von Zellen und damit auch von Organismen hängt von der präzisen Koordination von Protein-Protein-Interaktionsnetzwerken (PPI) ab ^1,2. Diese Netzwerke sind für die Organisation und Durchführung nahezu aller biologischen Prozesse verantwortlich. Während PPI-Netzwerke von Natur aus dynamisch sind und auf Stress reagieren, können sie bei Krankheiten abnormal neu verdrahtet werden, was zu maladaptiven Funktionen führt. Wichtig ist, dass diese Neuverdrahtung nicht unbedingt Veränderungen in der Gen- oder Proteinexpression mit sich bringt; vielmehr entsteht sie aus veränderten physikalischen Wechselwirkungen zwischen Proteinen, die ansonsten normal exprimiert werden ^3,4,5. Traditionelle Ansätze in der Systembiologie, wie z. B. Transkriptomik oder Proteomik, sind nicht in der Lage, diese kritischen Veränderungen auf der Interaktionsebene zu erfassen.

Die PPI-Kartierungstechnologien haben sich erheblich weiterentwickelt und bieten Einblicke in die Organisation und Regulierung von Mobilfunknetzen 6,7,8,9,10,11. Häufig verwendete Ansätze, einschließlich Affinitätsreinigungs-Massenspektrometrie (AP-MS), Vernetzung (XL)-MS, Proximity-Markierung und Co-Fraktionierung, bieten jeweils spezifische Vorteile, wie z. B. hohe Spezifität, räumliche Auflösung oder die Fähigkeit, transiente Komplexe zu detektieren 6,8,9,10,11 . Diese Methoden erfordern jedoch oft Köderproteine, genetische Manipulation oder komplexe Bioinformatik und können Schwierigkeiten haben, die groß angelegte, krankheitsbedingte Neuverdrahtung von Proteinnetzwerken in nativen biologischen Systemen zu erfassen 6,7,8,9,10,11 . Den meisten fehlt es auch an Skalierbarkeit, was sie für die Analyse großer Stichprobenkohorten oder die systematische Kartierung von Interaktomänderungen über Bedingungen, Zelltypen oder Zeitpunkte hinweg unpraktisch macht 6,7,8,9,10,11 (Tabelle 1).

Um diese Lücke zu schließen, haben wir die dysfunktionale Protein-Protein-Interaktom-Plattform (dfPPI) entwickelt, eine chemoproteomische Methode, die direkt die PPI-Netzwerk-Dysfunktionen identifiziert, die für die Phänotypen^{der Krankheit verantwortlich sind 12}. Es nutzt eine wichtige biologische Erkenntnis: In Krankheitszuständen bildet eine Untergruppe molekularer Chaperone supramolekulare Gerüste, die als Epichaperome bezeichnet^werden 13,14,15. Diese Strukturen fungieren nicht bei der Proteinfaltung, sondern als Gerüst-Interaktions-Hubs, die die Proteinkonnektivität neu organisieren³. Entscheidend ist, dass die Proteine, die in Epichaperome sequestriert werden, nicht zufällig sind; Sie sind diejenigen, die aktiv an der Aufrechterhaltung des Krankheitsphänotyps beteiligt sind 16,17,18,19,20. Durch die Erfassung dieser Epichaperom-gebundenen Proteine und ihrer Interaktoren identifiziert dfPPI die genauen Netzwerkveränderungen, die bestimmte Krankheitszustände antreiben. Epichaperom-getriebene Netzwerk-Rewiring ist bei allen Krankheiten weit verbreitet - die Mehrheit in Alzheimer-Kohorten und ~70% in Krebsproben^16,20 - was die Anwendbarkeit von dfPPI auf große, krankheitsfokussierte Studien unterstützt.

Die dfPPI-Plattform umfasst den gesamten Arbeitsablauf von der Probenvorbereitung über die Erfassung der Epichaperom-Affinität und die Interaktom-Identifizierung durch MS bis hin zu nachgelagerten bioinformatischen Analysen wie der Anreicherung des Signalwegs und der Modellierung funktioneller Proteinnetzwerke (Abbildung 1). Das Verfahren verwendet Epichaperom-spezifische chemische Sonden, die auf Affinitätsmatrizen (PU-Kügelchen oder andere Sonden)13,16,17 immobilisiert sind, um das funktionelle Interaktom aus Zellen oder Geweben zu isolieren. Diese Sonden wurden bereits in mehreren Publikationen rigoros auf Spezifität zu Epichaperomen und Eignung für dfPPI^validiert 16,17,18,20,21,22. Die gefangenen Komplexe werden einer MS unterzogen, wobei sowohl On-Bead- als auch In-Gel-Aufschluss-Workflows verwendet werden, gefolgt von markierungsfreien LC-MS/MS. Die resultierenden Daten können dann über eine spezielle Bioinformatik-Pipeline analysiert werden, die Dysfunktionen auf Interaktionsebene definiert und mit biologischen Prozessen und Phänotypen verknüpft. Da Epichaperome kontextspezifische Interaktome untermauern 17,18,20, zeigt dfPPI, wie Proteinnetzwerke in einer bestimmten Krankheit, einem bestimmten Zelltyp oder einem bestimmten Stadium umgebaut werden, was es zu einem leistungsfähigen systembiologischen Werkzeug für die präzise Phänotypisierung macht.

Die Methode ist hochgradig skalierbar und wurde auf Hunderte von klinischen und experimentellen Proben angewendet, einschließlich postmortalem menschlichem Gewebe und kultivierten Zellen, bei verschiedenen Krankheiten wie Krebs und Neurodegeneration 16,17,18,19,20,22,23. Durch die Aufdeckung der PPI-Veränderungen, die einen pathologischen Zustand definieren, ermöglicht dfPPI sowohl mechanistische Einblicke als auch die Entdeckung umsetzbarer therapeutischer Ziele 16,17,18,19,20,22,23.

In diesem Protokoll beschreiben wir detailliert die experimentellen Komponenten der dfPPI-Plattform, von der Affinitätserfassung von Epichaperom-gebundenen Interaktomen über die Probenvorbereitung für LC-MS/MS bis hin zur Interaktomidentifikation mittels MS. Die computergestützte Analyse-Pipeline - d.h. was mit der Liste der von MS identifizierten Proteine gemacht wird, um differentielle Wechselwirkungen und funktionelle Konsequenzen zu definieren - wird hier aus Platzgründen nicht behandelt. Es ist jedoch frei zugänglich und ausführlich dokumentiert über die dfPPI Shiny App unter https://epichaperomics.mskcc.org (aktualisiert auf https://dfppi.mskcc.org) und über die Chiosis Lab-Website unter https://www.chiosislab.com/resources. Zusätzlich zu diesen Portalen sind die komplette Bioinformatik-Pipeline und die begleitenden Skripte in mehreren Publikationen enthalten, die dfPPI auf Krebs 16,17,19 und Alzheimer^18,20 anwenden.

Protokoll

Das Protokoll folgt den Richtlinien der Ethikkommission für Humanforschung und des Ausschusses für Tierpflege und -verwendung unserer Institution. Die in der Studie verwendeten Geräte und Reagenzien sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Probenvorbereitung für die Affinitätserfassung

1. Proteinextraktion aus Gewebe
   HINWEIS: Dieses Protokoll wurde für postmortale Hirngewebeproben optimiert.
   1. Bereiten Sie einen Proteinextraktionspuffer vor, der 20 mM Tris (pH 7,5), 20 mM KCl, 5 mM MgCl₂ und 0,01 % NP-40 (nativer Lysepuffer) enthält. Fügen Sie unmittelbar vor der Anwendung Protease- und Phosphatasehemmer hinzu. Den Puffer auf Eis legen.
   2. Geben Sie das gefrorene Gewebe (Zielvolumen ca. 50 mm³) in ein Mikrogewebe-Homogenisatorröhrchen, das aus einem speziellen 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen besteht, das mit einem Stößel bestückt ist. Fügen Sie 500-700 μl nativen Lysepuffer hinzu und passen Sie das Volumen an die Kompaktheit des Gewebes und die einfache Homogenisierung an. Homogenisieren Sie die Probe auf Eis, indem Sie den Stößel vorsichtig auf und ab und gegen die abrasiven Wände des Homogenisatorrohrs bewegen, bis eine homogene Suspension gebildet wird.
      HINWEIS: Führen Sie alle Schritte auf Eis durch, um die Proteinanordnungen in ihrer nativen Konfiguration zu erhalten und einen Proteinabbau zu vermeiden.
   3. Inkubieren Sie die Lysate 30 Minuten lang bei 4 °C, indem Sie das Fläschchen auf eine Rotationseinheit stellen. Mischen Sie die Proben während der Inkubation vorsichtig mit Rotation.
   4. Zentrifugieren Sie die Proben bei 13.000 × g für 10 min bei 4 °C mit einer Tischzentrifuge, um Rückstände zu entfernen.
   5. Sammeln Sie die Überstände und überführen Sie sie in durchsichtige 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen. Vermeiden Sie es, das Pellet während des Umfüllens zu stören.
   6. Bestimmen Sie die Gesamtproteinkonzentration im Überstand mit dem Bicinchoninsäure (BCA)-Assay-Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers.
      HINWEIS: Proteinlysate können bis zur Verwendung bei -80 °C gelagert werden. Vermeiden Sie wiederholte Frost-Tau-Zyklen. Siehe eine frühere Veröffentlichung²⁴ für die Auswirkungen wiederholter Gefrier-Tau-Zyklen und der Lagertemperatur auf die Integrität von Proteinanordnungen.
2. Normalisierung von Stichproben
   HINWEIS: HSP90α und HSP90β sind Kernkomponenten des Epichaperoms und sind die direkten Bindungspartner der chemischen Sonde, die für die Interaktomerfassung verwendet wird 13,21,23. Die Normalisierung von Proben auf Basis von HSP90α (oder HSP90β) stellt sicher, dass die Menge des sondenzielbaren Epichaperoms über die Proben hinweg abgestimmt ist, was für einen genauen Vergleich der erfassten Interaktome unerlässlich ist. Die Proben können auf der Grundlage von HSP90-Werten, die durch Western Blot bestimmt werden, normalisiert werden, aber es können auch andere Methoden verwendet werden. Wenn die HSP90-Werte in allen Proben vergleichbar sind, überspringen Sie diesen Abschnitt und fahren Sie mit Schritt 1.3 fort. Die Verwendung von HSP90α/β-Blotting dient hier nur der Eingangsnormalisierung und sollte nicht als Maß für die Epichaperom-Häufigkeit interpretiert werden.
   1. Bereiten Sie 2× Laemmli-Probenpuffer vor, bestehend aus 4 % Natriumdodecylsulfat (SDS), 20 % Glycerin, 10 % 2-Mercaptoethanol, 0,02 % Bromphenolblau und 0,125 M Tris-HCl, pH ~6,8.
      ACHTUNG: 2-Mercaptoethanol ist giftig und flüchtig und sollte in einem Abzug gehandhabt werden.
   2. Kombinieren Sie 5 μg des gesamten Hirnproteinextrakts (aus Schritt 1.1) 1:1 (v/v) mit 2× Laemmli Probenpuffer in einem durchsichtigen 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen.
   3. Erhitzen Sie die Proben 3-5 Minuten lang auf 95 °C in einer Heizeinheit, um die Proteine zu denaturieren, bevor Sie sie auf die Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) laden.
   4. Laden Sie die Proben auf vorgefertigte 8%ige Tris-Glycin-Proteingele. Alternativ können Sie auch handgegossene Gele verwenden.
   5. Laden Sie 5 μl vorgefärbten Proteinstandard auf jedes Gel, z. B. in die erste Vertiefung, um das Molekulargewicht des Proteins zu bestimmen.
   6. Lassen Sie die Gele in 1× TGS (Tris-Glycin-SDS) Laufpuffer bei RT laufen. Die typische Laufzeit beträgt 1,5-2 h bei 100 V.
   7. Bereiten Sie einen Transferpuffer vor, der 25 mM Tris, 192 mM Glycin und 20 % Methanol enthält.
      ACHTUNG: Methanol ist brennbar und sollte gemäß den Sicherheitsrichtlinien gehandhabt werden.
   8. Die Proteine werden auf eine Nitrozellulosemembran in einem Transferpuffer bei 4 °C für 60 min bei konstanter Spannung (100 V) übertragen.
   9. Bereiten Sie eine Membranwaschlösung (1× TBS-0,1 % Tween-20) und eine Blockierungslösung (5 % Milch in 1× TBS-0,1 % Tween-20) vor. Dieses Protokoll verwendet fettfreies Trockenmilchpulver aus einer kommerziellen Quelle.
   10. Legen Sie die Membran 1 h bei Raumtemperatur (RT) unter leichtem Rühren in eine Blockierlösung auf eine Plattformwippe. Verwenden Sie 10 ml Blockierungslösung pro Mini-Gel.
   11. Entfernen Sie die Blockierungslösung und inkubieren Sie die Membran mit Anti-HSP90α-Antikörper (1:6.000 Verdünnung in 10 mL Blockierungslösung) über Nacht bei 4 °C auf einer Plattformwippe.
   12. Entfernen Sie die Antikörperlösung und waschen Sie die Membran dreimal für jeweils 5 Minuten mit 10 mL Waschlösung.
   13. Fügen Sie den HRP-konjugierten Ziegen-Anti-Kaninchen-Sekundärantikörper hinzu (1:5.000 Verdünnung in 10 mL 1× TBS-0,1% Tween-20) und inkubieren Sie 1 h lang bei RT auf einer Plattformwippe.
   14. Entfernen Sie den Sekundärantikörper und waschen Sie die Membran viermal mit Waschlösung (gleiches Volumen und Zeitpunkt wie oben).
   15. Detektieren Sie das HSP90α-spezifische Chemilumineszenzsignal mit einem ECL-Kit (Enhanced Chemiluminescence) gemäß den Anweisungen des Herstellers. Verwenden Sie ein Chemilumineszenz-Bildgebungssystem oder einen autoradiologischen Film.
   16. Quantifizieren Sie die HSP90α-Pegel in den Proben basierend auf der Signalintensität und berechnen Sie einen Normalisierungsfaktor für den Downstream-Pulldown.
       HINWEIS: Die Intensität des HSP90-Signals spiegelt die Menge des sondenzielbaren Epichaperoms in jeder Probe wider. Durch den Vergleich der Signalintensität zwischen den Proben und die Normalisierung auf eine Referenzprobe, die auf jedem Gel läuft, können die Eingangslautstärken für die Interaktomerfassung entsprechend angepasst werden. Die Quantifizierung kann mit Hilfe einer Densitometrie-Software durchgeführt werden. Fügen Sie immer ein Aliquot einer Referenzprobe auf jedes Gel ein, um eine Normalisierung über Blots hinweg zu ermöglichen.
3. Vorbereitung der PU-Raupe
   HINWEIS: PU-Kügelchen und Kontrollkügelchen können im eigenen Haus synthetisiert werden, wie bereits berichtet^21,25, oder beim Chiosis-Labor nach Abschluss eines Materialtransfervertrags (MTA) angefordert werden. Sie sollten bei -20 °C in Isopropanol gelagert werden.
   1. Entnehmen Sie ein Aliquot aus Polyurethan (PU)-Kügelchen oder Kontrollkügelchen direkt aus dem Isopropanol-Vorrat. Fügen Sie ca. 30 % Überschuss hinzu, um den Raupenverlust während des Waschens und der Handhabung auszugleichen.
   2. Entfernen Sie das Lagerlösungsmittel: Lassen Sie die Kügelchen sich absetzen, dann aspirieren Sie das Isopropanol. Geben Sie nativen Lysepuffer hinzu (1 mL für ein 1,5-ml-Röhrchen; 5 mL für ein konisches 15-mL-Röhrchen) und resuspendieren Sie es vollständig durch sanftes Pipettieren oder Inversion.
   3. Dreimal waschen und äquilibrieren: bei jedem Waschgang einen Wirbel zur Resuspendierung vortexen, zentrifugieren (1,5 mL Röhrchen: 10.000 × g, 1 min; 15 mL konisch: 3.000 × g, 5 min), dann den Überstand mit einer Vakuumleitung mit Pipettenspitze ansaugen, wobei darauf zu achten ist, dass das Pellet nicht gestört wird.
   4. Geben Sie nativen Lysepuffer in einem Volumenverhältnis von 1:1 zu den gewaschenen Kügelchen (Kügelchen:Puffer), um eine gleichmäßige Arbeitsraupenaufschlämmung zu erzeugen.
   5. Aliquotieren Sie 40 μl PU-Bead-Aufschlämmung (oder Kontrollbead) (z. B. 1:1 v/v-Kügelchen:Puffer) pro Probe in 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen. Verwenden Sie eine Pipettenspitze, bei der das Ende abgeschnitten ist, um eine einfache Bead-Abgabe zu ermöglichen.
      HINWEIS: PU-Kügelchen sind lichtempfindlich. Verwenden Sie dunkle oder in Folie umwickelte 1,5-ml-Röhrchen während der Pull-Down-Schritte. Aufgrund ihrer hydrophoben Oberflächenbeschichtung mit dem niedermolekularen Epichaperom-Bindemittel neigen PU-Kügelchen dazu, zu verklumpen und an Kunststoffoberflächen zu haften. Vorsichtig pipettieren und gründlich mischen, um eine gleichmäßige Resuspension zu gewährleisten. Es ist wichtig, gleiche Mengen an Bead-Slurry in jede Probe zu dosieren, um Schwankungen bei der Proteinerfassung zu vermeiden, die zu inkonsistenten oder nicht reproduzierbaren Ergebnissen führen können.
   6. Waschen Sie die Kügelchen dreimal mit nativem Lysepuffer, indem Sie 1 ml Puffer in jedes Röhrchen geben, vortexen, 1 Minute lang bei 10.000 × g zentrifugieren und den Überstand durch Aspiration verwerfen. Stellen Sie sicher, dass die Perlen zwischen jedem Waschen vollständig reaufgehängt sind.
      HINWEIS: Vermeiden Sie beim Ansaugen das Berühren der Perlen. Drücken Sie die Pipettenspitze vorsichtig gegen die Wand des Röhrchens, während Sie die Flüssigkeit entfernen.
   7. Entfernen Sie nach der letzten Wäsche den größten Teil der Flüssigkeit aus den Röhrchen und achten Sie darauf, das Perlenpellet nicht zu stören.
      HINWEIS: Gewaschene Perlen können einige Tage bei 4 °C gelagert werden. In der Regel werden die Kügelchen innerhalb von 1-2 Tagen nach der Zubereitung verwendet.
4. Interaktom-Pulldown
   HINWEIS: Der erste Schritt des Pulldowns ist ein Vorklärungsschritt unter Verwendung von Kontrollkügelchen, die an ein inertes kleines Molekül konjugiert sind, das die Epichaperome¹⁶ nicht bindet. Dieser Schritt entfernt unspezifisch interagierende Proteine, Aggregate und unlösliche Ablagerungen aus dem Lysat, wodurch die Spezifität des nachfolgenden PU-Bead-Pulldowns verbessert wird. Pre-Clearing reduziert die Hintergrundbindung und verbessert den Nachweis spezifischer Epichaperom-assoziierter Proteine.
   Das mit diesem Protokoll gewonnene Interaktom wird von MS analysiert, das sehr empfindlich auf experimentelle Verunreinigungen reagiert. Um eine genaue Proteinidentifizierung zu gewährleisten und die Datenqualität zu erhalten, verwenden Sie immer frisch zubereitete Puffer und Reagenzien, minimieren Sie die Exposition gegenüber Staub und Keratin und tragen Sie saubere, puderfreie Handschuhe, wenn Sie mit Proben, Verbrauchsmaterialien oder Geräten umgehen. Verwenden Sie MS-spezielle Glaswaren/Verbrauchsmaterialien für alle Pull-Down- und In-Gel-Verdauungsschritte und bewahren Sie alle Gegenstände, die für das Western-Blotting verwendet werden, physisch getrennt auf. Wenn Sie Glaswaren wiederverwenden, dekontaminieren Sie sie, indem Sie nacheinander mit 100 % Methanol, Reinstwasser, 80 % Essigsäure und Reinstwasser spülen und dann an der Luft trocknen. Verwenden Sie keine Reinigungsmittel; Selbst Spurenrückstände können LC-Säulen und Ionenquellen verschmutzen.
   1. Geben Sie die normalisierten Proteinextrakte (gemäß Schritt 1.2, berechnet auf der Grundlage der HSP90-Blot-Intensität) in einzelne 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen, die 40 μl der Kontrollkügelchenaufschlämmung enthalten (d. h. 20 μl Kügelchen + 20 μl Puffer), und stellen Sie das endgültige Volumen auf 250 μl ein, indem das entsprechende Volumen nativen Lysepuffers hinzugefügt wird.
      HINWEIS: Um probenspezifische Eingabevolumina zu bestimmen, verwenden Sie die Formel A1 = (60 / C1) × X1, wobei A1 das Volumen des normalisierten Gesamtproteins ist, das hinzugefügt werden soll (μL), C1 die gemessene Proteinkonzentration (μg/μl) und X1 der Normalisierungsfaktor ist, der aus dem HSP90-Blotting abgeleitet wird (wie in Schritt 1.2 beschrieben). Das Volumen des hinzuzufügenden zusätzlichen Puffers wird als 250 μL minus A1 berechnet. Wenn keine Normalisierung erforderlich ist, verwenden Sie 250 μg Gesamtprotein in 250 μl.
   2. Inkubieren Sie die Proben 30 Minuten lang bei 4 °C mit Drehung auf einem durchgehenden Rotator (10-15 U/min).
   3. Die Röhrchen werden 1 min lang bei 10.000 × g bei 4 °C zentrifugiert, um die Kontrollkügelchen zusammen mit aggregiertem oder unlöslichem Protein zu pelletieren.
   4. Den Überstand vorsichtig mit einer 1-ml-Pipette von den Kontrollkügelchen auffangen und in 1,5-ml-Röhrchen mit 40 μl der gewaschenen PU-Kügelchen-Aufschlämmung überführen.
   5. Inkubieren Sie die Proben 3 h lang bei 4 °C mit Drehung auf einem Ende-über-Ende-Rotator (10-15 U/min).
   6. Zentrifugieren Sie jedes Röhrchen 1 Minute lang bei 10.000 × g , aspirieren Sie den Überstand und waschen Sie die Kügelchen viermal mit 1 ml nativem Lysepuffer. Für jede Wäsche: Vortex, Zentrifuge und Aspirate unter Verwendung der in Schritt 1.3 beschriebenen Parameter.
      HINWEIS: In dieser Phase können die Proben für LC-MS/MS mit einem von zwei Arbeitsabläufen verarbeitet werden: (1) SDS-PAGE, gefolgt von einem In-Gel-Aufschluss oder (2) einem Auf-Bead-Verdau der eingefangenen Proteine.
      Für den In-Gel-Aufschluss-Workflow fahren Sie mit dem Protokoll wie beschrieben fort. Für den Aufschluss auf der Perle waschen Sie die Kügelchen zwei weitere Male mit kaltem PBS und fahren Sie sofort mit Abschnitt 3 fort. Frieren Sie die Kügelchen nicht ein, wenn Sie mit dem Aufschluss fortfahren. Die Proben müssen noch am selben Tag frisch verarbeitet werden. Das Einfrieren von beadgebundenen Proteinkomplexen kann die Verdauungseffizienz beeinträchtigen, indem es die Aggregation oder den Verlust der Proteinlöslichkeit fördert, was zu einer geringeren Peptidrückgewinnung und einer erhöhten Variabilität führt. Basierend auf den MS-Kernempfehlungen sollten die Proben am selben Tag frisch verarbeitet werden, um einen konsistenten Aufschluss auf der Perle zu gewährleisten.
5. Probenvorbereitung für den In-Gel-Aufschluss
   1. Geben Sie 25 μl 2× Laemmli-Probenpuffer zu den in Schritt 1.4.6 vorbereiteten Kügelproben, die in 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen enthalten sind.
      HINWEIS: Die Proben können zu diesem Zeitpunkt bis zu 24 Stunden bei -80 °C gelagert werden. Laden Sie immer das gesamte Probenvolumen in das SDS-PAGE-Gel für den In-Gel-Aufschluss, um die Proteomabdeckung zu maximieren und eine vollständige Darstellung des Interaktoms zu gewährleisten. Eine Teilbelastung wird nicht empfohlen. Wenn das Probenvolumen begrenzt ist und eine Teilbeladung unvermeidlich ist, sollte das verbleibende Material in Aliquoten gelagert werden, um Gefrier-Tau-Zyklen zu minimieren und die Integrität des Interaktoms zu erhalten.
   2. Erhitzen Sie jede Probe 3 Minuten lang auf 95 °C (mit dem zugesetzten 2× Laemmli-Probenpuffer, wie oben), um die Proteinkomplexe zu denaturieren und von den Kügelchen zu eluieren, bevor Sie sie auf SDS-PAGE laden. Das SDS und die Reduktionsmittel im Puffer stören PPIs und setzen Proteine aus der Matrix frei.
   3. Zentrifugieren Sie jedes Röhrchen bei 10.000 × g für 1 Minute bei RT.
   4. Laden Sie jeden Überstand auf vorgefertigte SDS-PAGE-Gele mit Gradienten.
   5. Lassen Sie die Gele in einem 1× TGS-Laufpuffer bei RT laufen und stoppen Sie den Lauf auf halbem Weg (~3,5-4 cm in das Gel bei 100 V, typischerweise 30-60 min Laufzeit).
   6. Entfernen Sie das Gel aus der Elektrophoreseeinheit und färben Sie es gemäß den Anweisungen des Herstellers mit Coomassie Brillantblau.
      HINWEIS: Das gefärbte Gel, das in einem Kunststoffbehälter in 5-7 ml Reinstwasser getaucht ist, kann zur Proteinidentifizierung zur MS-Einrichtung transportiert werden. Wenn nicht sofort verarbeitet, bei 4 °C in Reinstwasser bis zu 1-2 Wochen lagern. Abhängig von der Kerneinrichtung, die die Arbeit durchführte, und den experimentellen Zielen wurden zwei alternative proteomische Arbeitsabläufe verwendet: Abschnitt 2 beschreibt den In-Gel-Aufschluss, gefolgt von einer datenunabhängigen Erfassungsanalyse (DIA)-MS mit einem Quadrupolorbitrap-Massenspektrometer; Abschnitt 3 beschreibt ein On-Bead-Aufschlussprotokoll, das für die Mobilitätsspektrometrie gefangener Ionen mit paralleler Akkumulations-Serienfragmentierung (diaPASEF) optimiert ^ist26. Die Schritte können gegebenenfalls mit Querverweisen versehen werden.

2. Proteinidentifizierung durch LC-MS/MS mit In-Gel-Proteinverdau

1. In-Gel-Reduktion und Alkylierung von cysteinylierten Proteinen
   1. Schneiden Sie den gefärbten Bereich jeder Coomassie-gefärbten Gelspur heraus und schneiden Sie ihn in etwa fünf gleich große Gelscheiben. Entfärben Sie jede Scheibe, indem Sie sie dreimal in 500 μl 50 % (v/v) Methanol für 1 min bei 37 °C inkubieren und bei 700 U/min auf einem temperaturgesteuerten Mikroröhrchenschüttler umrühren.
      HINWEIS: Jede Gelscheibe sollte nicht größer als ~1 cm × 0,5 cm × 1 cm sein, um eine effiziente Diffusion der Reagenzien in den nachfolgenden Schritten sowie einen effizienten In-Gel-Trypsinverdau über Nacht zu gewährleisten. Die Gelregion, die stark gefärbten Proteinen wie HSP90 und HSC70 entspricht, die direkte Bindemittel der chemischen Sonde und Kernkomponenten des Epichaperoms 15,16,23 darstellen, wird getrennt vom Rest des Gels herausgeschnitten. Ihre hohe Abundanz kann andernfalls die Detektion und Quantifizierung von Interaktoren mit geringerer Abundanz während der LC-MS/MS-Analyse beeinträchtigen.
   2. Inkubieren Sie jede Gelscheibe in 500 μl 5 mM Ammoniumbicarbonat (ABC), hergestellt in 30 % Acetonitril (ACN), bei 37 °C und schütteln Sie sie bei 700 U/min auf einem temperaturgesteuerten Mikroröhrchenschüttler für 15 Minuten, um Fleckenreste zu entfernen. Wiederholen Sie die Inkubation, bis die Gelscheibe vollständig entfärbt ist.
      HINWEIS: Jede verbleibende sichtbare Proteinfärbung kann die Peptidbindung an die C18-Matrix während des Peptidreinigungsschritts beeinträchtigen, wodurch die Wiederherstellung und die nachgeschaltete MS-Empfindlichkeit verringert werden.
   3. Entfernen und entsorgen Sie die ABC/ACN-Lösung mit einer Pipette mit feiner Spitze, wobei Sie darauf achten müssen, dass die Gelstücke nicht verloren gehen (d. h. die Gelstücke nicht zusammen mit der Flüssigkeit aspirieren). Geben Sie dann 500 μl 100 % ACN in jedes Röhrchen und stellen Sie sicher, dass die Gelstücke vollständig eingetaucht sind. Inkubieren Sie bei RT auf einem Orbitalschüttler bei 700 U/min für 10 Minuten oder bis die Gelstücke durchscheinend werden, schrumpfen und das Aussehen von weißem Papier annehmen.
      ACHTUNG: ACN ist brennbar und sollte in einem Abzug gehandhabt werden.
   4. Entfernen und entsorgen Sie das ACN mit einer Feinpipette aus jedem Röhrchen, wobei darauf zu achten ist, dass keine Gelstücke abgesaugt werden. 10 s lang kurz bei 1.000 × g zentrifugieren, um die Restflüssigkeit aufzufangen, und die restlichen Tröpfchen vorsichtig mit einer Feinpipette absaugen. Legen Sie die offenen Röhrchen für 10-15 Minuten in eine Vakuumzentrifuge bei RT oder bis die Gelscheiben trocken und starr sind.
      HINWEIS: Nicht zu lange trocknen. Überprüfen Sie regelmäßig, um Risse oder Überschrumpfung der Gelstücke zu vermeiden. Nach dem Trocknen die Gelstücke bis zum Aufschluss bei 4 °C in einem verschlossenen Röhrchen mit geringer Bindung oder Mikrozentrifugenröhrchen lagern; Gelgebundene und gereinigte Proteine sind bei einer Lagerung bei 4 °C bis zu mehreren Tagen stabil.
   5. Reduktion: Geben Sie ~100 μl 10 mM Dithiothreitol (DTT) (frisch aus 500 mM Stamm in 50 mM Ammoniumbicarbonat hergestellt) in jedes Probenröhrchen und stellen Sie sicher, dass die Gelstücke vollständig untergetaucht sind. Inkubieren Sie 45 Minuten lang bei 56 °C und rühren Sie bei 700 U/min auf einem temperaturgesteuerten Mikroröhrchenschüttler.
      ACHTUNG: DTT ist ein Reizstoff für die Haut und die Atemwege. Greifen Sie in eine chemische Abzugshaube und tragen Sie Handschuhe.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Röhrchen während der Inkubation fest verschlossen sind, um eine Verdunstung zu vermeiden und die DVB-T-Konzentration aufrechtzuerhalten.
   6. Alkylierung: Entfernen Sie die DTT-Lösung mit einer Pipette mit feiner Spitze aus jedem Röhrchen und achten Sie darauf, die Gelstücke nicht zu beschädigen. Geben Sie sofort ~100 μl 55 mM Iodacetamid (IAA) in 50 mM ABC hinzu, um die Gelscheiben vollständig zu bedecken. Bei RT mit Rühren bei 700 U/min für 30 min im Dunkeln inkubieren.
      ACHTUNG: IAA ist giftig und lichtempfindlich. Führen Sie alle Handhabungen in einem Abzug durch, während Sie Handschuhe tragen.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass das DTT vor der Zugabe von IAA vollständig entfernt wird, um ein Abschrecken der Alkylierungsreaktion zu vermeiden. Wickeln Sie die Röhrchen während der Inkubation in Aluminiumfolie ein oder verwenden Sie lichtblockierende Behälter, um den IAA-Abbau zu minimieren.
   7. Zentrifugieren Sie die Röhrchen kurz bei 1.000 × g für 5 s bei RT, um die Restflüssigkeit am Boden aufzufangen. Entfernen Sie den Überstand vorsichtig mit einer feinen Pipettenspitze (z. B. P10-Spitze), um eine Beschädigung der Gelstücke zu vermeiden. Kippen Sie das Röhrchen leicht und saugen Sie vom Rand aus an, um das Risiko des Ansaugens von Gelfragmenten zu minimieren.
   8. Äquilibrieren: Bedecken Sie die Gelstücke mit 500 μL 50 mM ABC in 30% ACN. 10 Minuten bei RT inkubieren und bei 700 U/min auf einem beheizten Orbitalschüttler bewegen. Dieser Schritt hilft, überschüssiges Alkylierungsreagenz zu entfernen und das Gel vor der Dehydrierung auszugleichen.
   9. Lösung entfernen: Bei 1.000 × g kurz 5 s schleudern und den Überstand mit einer Feinpipette wie oben beschrieben entsorgen.
   10. Erneut dehydrieren: Wiederholen Sie die Schritte 2.1.3 und 2.1.4, um die Gelstücke erneut mit 100 % ACN zu dehydrieren, gefolgt von einer Vakuumzentrifugation, bis sie trocken sind. Dieser Schritt gewährleistet eine optimale Peptidrückgewinnung während des enzymatischen Verdauungsverdaus.
2. In-Gel-Proteolyse und Peptidaufreinigung
   1. Verdauen Sie die getrockneten Gelproben durch Zugabe von Trypsin in MS-Qualität in einer Endkonzentration von 5 ng/μl in 50 mM ABC, um die Gelstücke vollständig zu rehydrieren (typischerweise 50-100 μl Gesamtvolumen oder genug, um Gelscheiben zu bedecken). Über Nacht bei 37 °C in 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen inkubieren, wobei darauf zu achten ist, dass die Röhrchen dicht verschlossen sind, um eine Verdunstung zu verhindern. Wenn möglich, vorsichtig rühren (z. B. 300 U/min auf einem temperaturgesteuerten Mikroröhrchenschüttler).
   2. Die Probe nach dem nächtlichen Aufschluss ansäuern, indem 10 % Ameisensäure (FA) tropfenweise hinzugefügt wird, um eine Endkonzentration von 1 % (v/v) zu erreichen (z. B. 1 μl 10 % FA zu 100 μl Aufschluss geben). Mischen Sie vorsichtig und beschallen Sie die Röhrchen dann 10 Minuten lang in einem RT-Wasserbad-Ultraschallgerät, um die Peptidextraktion zu verbessern.
   3. Entfernen Sie den peptidhaltigen Überstand vorsichtig mit einer Feinpipette (z. B. P10-Spitze mit schmaler Öffnung) und achten Sie darauf, die Gelmatrix nicht zu stören oder Gelfragmente zu aspirieren. Den gesammelten Überstand in ein 500-μl-Röhrchen mit geringer Bindung überführen und auf Eis legen.
   4. Geben Sie 5 % FA/50 % ACN (v/v) Lösung in jedes Röhrchen (typischerweise ~50-100 μl oder genug, um die Gelstücke vollständig zu bedecken) und rühren Sie vorsichtig bei RT (z. B. auf einem Shaker bei 70 U/min für 10-15 Minuten), um verbleibende Peptide zu extrahieren. Den Überstand vorsichtig auffangen und mit der ursprünglichen Peptidlösung aus Schritt 2.2.3 vermischen.
   5. Konzentrieren Sie den kombinierten Peptidextrakt mittels Vakuumzentrifugation bei RT (z. B. 1.000 × g für ~30 min), bis nur noch ein kleines Tröpfchen übrig bleibt. Lassen Sie die Probe nicht vollständig trocknen, da dies aufgrund des Anhaftens an den Röhrchenwänden zu Peptidverlusten führen kann. Verwenden Sie den teilgetrockneten Extrakt entweder sofort zum Entsalzen oder lagern Sie ihn bei -20 °C in einem verschlossenen, bindungsarmen Röhrchen.
   6. Entsalzen Sie die Peptide unter Verwendung von handgepackten, kleinmaßstabsgepackten C18-Pipettenspitzen (d. h. StageTips), die mit zwei gestapelten C18-Extraktionsscheiben hergestellt wurden, die in eine 200-μl-Pipettenspitze eingeführt wurden, wie zuvor^{beschrieben 27}, mit den folgenden Modifikationen:
   7. Aktivieren Sie die C18-Scheiben durch Zugabe von 40 μl Methanol. Zentrifugieren Sie die Pipettenspitze mit den Scheiben (die in eine leere 200-μl-Pipettenspitze eingesetzt und in ein 500-μl-Röhrchen gelegt werden) mit einer Tischzentrifuge bei 1.500 × g für 3 Minuten.
      HINWEIS: Lassen Sie die C18-Discs bei allen Schritten nicht trocknen. Das Trocknen beeinträchtigt die Peptidbindung und -elution. Die äußere 200-μl-Pipettenspitze (Hülse), die die handgepackte C18-Pipettenspitze in kleinem Maßstab hält, muss möglicherweise durch Abschneiden von ~ 1 cm vom Ende gekürzt werden, um sicherzustellen, dass die Zwei-Spitzen-in-Röhrchen-Baugruppe richtig in die Zentrifuge passt.
   8. Die Scheiben werden durch Zugabe von 0,1 % FA und Zentrifugieren wie oben äquilibriert.
   9. Tragen Sie die Peptidlösung, rekonstituiert in 20 μl 0,1 % FA, direkt auf die Oberseite der gestapelten Scheiben auf.
   10. Zentrifugieren Sie 5 Minuten lang bei 1.500 × g, um die Peptidbindung an die C18-Scheiben zu erleichtern.
   11. Waschen Sie die gebundenen Peptide, indem Sie 40 μl 0,1 % FA durch die Säule leiten.
   12. Eluieren Sie Peptide mit 40 μl 70 % ACN mit 0,1 % FA. Lagern Sie die eluierten Peptide in niedrig bindenden Röhrchen bei -80 °C bis zur LC-MS/MS-Analyse. Vermeiden Sie wiederholte Frost-Tau-Zyklen.
3. Nano-LC gekoppelt an MS-Analyse mittels DIA
   1. Konzentrieren Sie das entsalzte Peptideluat durch Vakuumzentrifugation (z. B. 20-30 min bei RT, 1.000 × g) und hinterlassen Sie ein kleines Tröpfchen. Rekonstituieren Sie die Peptide in 10 μl 0,1 % FA in Wasser in LC-MS-Qualität, indem Sie sanft auf und ab pipettieren und kurz vortexen. Drehen Sie kurz nach unten, um Flüssigkeit am Boden des Rohrs zu sammeln, bevor Sie fortfahren.
   2. Analysieren Sie 4 μL Aliquots der rekonstituierten Peptidprobe mittels nano-LC-MS/MS. Trennen Sie die Peptide auf einer selbstgepackten Umkehrphasensäule (75 μm ID × 2 cm, C18-Harz, 3 μm Partikelgröße), die bei 50 °C gehalten wird. Die Säule wird mit einer Druckbombe²⁸ vorbereitet, indem eine Aufschlämmung aus C18-Harz (in Methanol, 1:3 V/v) in eine Quarzglaskapillare mit integrierter 10 μm Sprühspitze (360 μm Außendurchmesser × 75 μm ID × 10 μm Spitze) gepackt wird. Verbinden Sie die Säule über Nanospray-Ionisation mit einem hochauflösenden Hybrid-Massenspektrometer (Quadrupol-Orbitrap-Typ), das DIA-Arbeitsabläufe unterstützt.
      HINWEIS: Eine Säulenlänge von 20 cm wird empfohlen, da sie eine optimale Trennung für Peptidmischungen bietet, die aus SDS-PAGE-Gelscheiben erzeugt werden.
   3. Halten Sie die analytische Säule mit einem Säulenofen oder Heizblock auf 50 °C, um eine konsistente Peptidretention und -trennung zu gewährleisten. Sorgen Sie für eine stabile Temperaturregelung während des gesamten Laufs, da Schwankungen die Reproduzierbarkeit beeinträchtigen können.
   4. Eluieren Sie Peptide mit einem linearen Gradienten von 3-40 % ACN in 0,1 % FA über 110 min bei einer Flussrate von 250 nL/min. Dieser Gradient ermöglicht eine effektive Peptidtrennung vor dem MS-Nachweis. Die Gesamtanalysezeit einschließlich Säulenäquilibrierung beträgt 120 Minuten.
   5. Erfassen Sie Daten im DIA-Modus mit einer hochauflösenden MS, wie zuvor beschrieben²⁹.
      1. Legen Sie fest, dass vollständige MS1-Vermessungsscans im Profilmodus mit einer Auflösung von 120.000 (bei m/z 200) über einen Scanbereich von 300 bis 1650 m/z erfasst werden. Nach jedem MS1-Scan wird die MS2-Fragmentierung von 30 sequenziellen Vorläuferfenstern (364-1370 Th) unter Verwendung eines gleitenden Isolationsfensterschemas durchgeführt.
      2. Führen Sie die Fragmentierung mit abgestuften normierten Kollisionsenergien von 25,5, 27,0 und 30,0 durch. Der standardmäßige maximale Ladezustand des Vorläufers ist 4. Stellen Sie die feste erste Masse in MS/MS-Scans auf 200 Da ein und erfassen Sie MS2-Spektren mit einer Auflösung von 30.000.
      3. Verwenden Sie eine Einstellung für die automatische Injektionszeit für MS2 und eine maximale Injektionszeit von 60 ms für MS1. Legen Sie sowohl für MS1- als auch für MS2-Scans das Ionenziel (AGC) auf 3e6 fest.
4. Relative Quantifizierung von affinitätserfassten Interaktomen
   HINWEIS: Um Proteine zu quantifizieren, die in DIA-MS-Analysen von affinitätserfassten Epichaperom-Interaktomen identifiziert wurden, verwenden Sie eine Softwareplattform, die DIA-Arbeitsabläufe unterstützt und eine zuverlässige Quantifizierung auf der Grundlage der Peptidintensität oder der spektralen Zählung ermöglicht. Dieses Protokoll verwendete MaxQuant (z.B. Version 2.5.1.0) und seinen MaxDIA Workflow^20,29 für die Peptid-/Proteinidentifizierung und die markierungsfreie intensitätsbasierte Quantifizierung. Bei der Suche wurde eine Köderstrategie mit umgekehrter Sequenz und 1 % FDR auf PSM/Peptid- und Proteinebene verwendet. Die Einträge "Reverse" und "Potential contaminant" wurden vor der Bioinformatik gefiltert. Es wurden keine Spike-Ins verwendet; Die Bereitschaft des Instruments wurde mit 250 ng HeLa-Verdau (und intermittierendem 10 fmol 6-Protein-Mix) verifiziert, die die internen ID- und RT-Stabilitätskriterien erfüllten.
   1. Analysieren Sie DIA-MS-Rohdaten mit konsistenten Parametern für alle Proben. Fügen Sie bis zu zwei fehlende Spaltungen hinzu und stellen Sie die Modifikationen wie folgt ein: fixiert, Carbamidomethylierung von Cystein; Oxidation von Methionin und Acetylierung des Proteins N-Terminus.
   2. Verwenden Sie eine in silico vorhergesagte Spektralbibliothek, die auf der UniProt-Datenbank für humane Proteine basiert (z. B. ~20.000 Einträge), um sicherzustellen, dass Köder- und Verunreinigungssequenzen für eine genaue Schätzung der False Discovery Rate (FDR) enthalten sind. Geben Sie den tryptischen Verdau an, es sei denn, es wurde ein alternatives Enzym verwendet. Eine validierte humane Spektralbibliothek (basierend auf der UniProt-Version vom 18.06.2020, 20.956 Einträge) ist auf dem Repositorium³⁰ des Max-Planck-Instituts für Biochemie verfügbar.
      HINWEIS: Als Alternative zu diesem Arbeitsablauf mit vorhergesagten Bibliotheken veranschaulicht Schritt 3.4 die bibliotheksfreie Verarbeitung, die zu einer vergleichbaren Identifizierung und Quantifizierung dieser Datensätze führte.
   3. Quantifizieren Sie die Proteinhäufigkeiten anhand von Intensitätswerten (keine Intensitäten der markierungsfreien Quantifizierung [LFQ]), da diese für nachgelagerte PPI-Netzwerkanalysen besser geeignet sind. Stellen Sie sicher, dass die Option LFQ deaktiviert ist, um Normalisierungsartefakte zu vermeiden, die Affinitätsanreicherungsdaten verzerren können. Verwenden Sie stattdessen rohe Intensitätswerte, die aus spektralen Peptidübereinstimmungen abgeleitet sind und die Interaktionsstärke und nicht die globale Proteinexpression widerspiegeln. Wenden Sie geeignete Filterkriterien an (z. B. mindestens ein einzigartiges Peptid pro Proteingruppe), um die Zuverlässigkeit der Proteinidentifizierung und -quantifizierung zu verbessern. Exportieren Sie die resultierende Proteinintensitätstabelle für nachfolgende statistische und netzwerkbasierte Analysen.
      HINWEIS: Im Gegensatz zu standardmäßigen proteomischen Arbeitsabläufen, bei denen die LFQ-Werte zur Normalisierung der Proteinbeladung über ganze Lysate beitragen, werden die Proteine hier durch Affinitätserfassung von Epichaperomen angereichert. Dieser Anreicherungsschritt führt zu einer biologischen Varianz, die durch die LFQ-Normalisierung verdeckt werden kann. Daher werden rohe Intensitätswerte bevorzugt, da sie die differentiellen Protein-Epichaperom-Wechselwirkungen unter verschiedenen Bedingungen besser widerspiegeln und das Signal erhalten, das für die nachgelagerte Analyse auf Netzwerkebene (z. B. dfPPI) benötigt wird. In früheren Studien mit Mascot-basierten Suchen ^16,18 wurden anstelle von Intensitäten auch MS/MS-Spektralzählwerte verwendet. In Affinitätserfassungs-Arbeitsabläufen wie diesem spiegeln spektrale Zählungen die Interaktionshäufigkeit wider und eignen sich gut zur Identifizierung unterschiedlich interagierender Proteine unter verschiedenen Bedingungen. Im Gegensatz zu LFQ-Werten gehen MS/MS-Zahlen nicht von einer globalen Normalisierung über das Proteom aus, wodurch die biologisch bedeutsame Varianz aus dem Epichaperom-Anreicherungsschritt erhalten bleibt.

3. Proteinidentifizierung mittels LC-MS/MS mit On-Bead-Proteinverdau

1. Aufschluss auf der Perle
   HINWEIS: Um eine optimale Proteinrückgewinnung zu gewährleisten und den Probenverlust während des On-Bead-Proteinverdaus für die MS-Analyse zu minimieren, ist es wichtig, Mikrozentrifugenröhrchen mit geringer Proteinbindung zu verwenden. Diese Röhrchen sind so konzipiert, dass sie die Proteinabsorption an den Röhrchenwänden reduzieren und dadurch die Probenrückgewinnung verbessern. Alle in diesem Abschnitt verwendeten Reagenzien sollten frisch mit Wasser und Chemikalien in LC-MS-Qualität zubereitet werden. Wenn Sie Proben an einen Proteomik-Kern senden, überprüfen Sie die örtlichen Richtlinien, da einige Einrichtungen möglicherweise verlangen, dass alle Puffer vor der Verwendung filtersterilisiert werden.
   1. Entfernen Sie alle PBS-Rückstände, die möglicherweise in der Tube aus Schritt 1.4.6 verbleiben. Resuspendieren Sie die Kügelchen in 80 μl 2 M Harnstoff, frisch zubereitet in 50 mM ABC, pH 8,5. Stellen Sie eine vollständige Durchmischung durch Pipettieren oder kurzes Vortexen sicher.
      HINWEIS: Passen Sie die Lautstärke proportional basierend auf der Perlenmenge und dem Typ an. Dieses Protokoll ist für 40 μL PU-Kügelchen-Schlämme optimiert.
   2. DTT wird zugegeben, um eine Endkonzentration von 1 mM zu erreichen.
      HINWEIS: Bereiten Sie unmittelbar vor der Verwendung eine frische 10 mM DTT-Lösung aus einer 1 M DTT-Stammlösung in LC-MS-Wasser vor, da DTT in Lösung zur Oxidation neigt. Geben Sie das gewünschte Volumen direkt in die Probe und mischen Sie es vorsichtig durch Pipettieren.
   3. Verschließen Sie das Röhrchen und inkubieren Sie es 30 Minuten lang bei 37 °C und schütteln Sie es bei 1.100 U/min auf einem beheizten Orbitalschüttler. Verschließen Sie die Deckel dicht, um die Verdunstung zu minimieren.
   4. Fügen Sie IAA hinzu, um eine Endkonzentration von 3,67 mM zu erreichen. Inkubieren Sie im Dunkeln bei RT für 45 min mit Schütteln bei 1.100 U/min.
      HINWEIS: Bereiten Sie unmittelbar vor der Verwendung eine frische 10 mM IAA-Brühe in LC-MS-Wasser vor. Geben Sie das erforderliche Volumen in die Probe und mischen Sie sie vorsichtig durch Pipettieren.
   5. Fügen Sie zusätzliches DTT hinzu, um nicht umgesetztes IAA zu löschen, wodurch eine Endkonzentration von 3,67 mM erreicht wird. Vorsichtig durch Pipettieren mischen.
      HINWEIS: Das Abschrecken von nicht umgesetztem IAA verhindert eine Überalkylierung, die die Proteaseaktivität und die Verdauungseffizienz beeinträchtigen kann. Bereiten Sie DVB-T frisch zu und berechnen Sie das Volumen auf der Grundlage des aktuellen Probenvolumens, um die Zielkonzentration zu erreichen.
   6. Geben Sie 750 ng 0,5 mg/ml Lys-C-Protease in MS-Qualität in die Probe. Inkubieren Sie 1 h lang bei 37 °C und schütteln Sie bei 1.150 U/min.
      HINWEIS: Bereiten Sie Lys-C vor, indem Sie es in Wasser in LC-MS-Qualität auflösen. Lagern Sie Enzymaliquote bei -80 °C und vermeiden Sie mehrfaches Einfrieren-Auftauen.
   7. Fügen Sie 750 ng 0,5 mg/ml frisch zubereitetes Trypsin in Sequenzierqualität hinzu. Über Nacht bei 37 °C und Schütteln bei 1.150 U/min inkubieren. Nicht länger als 16-18 Stunden inkubieren, um eine Überverdauung und einen Peptidabbau zu verhindern.
   8. Am nächsten Tag zentrifugieren Sie die Probe bei 1.000-5.000 × g für 1-5 min bei RT und übertragen Sie den Überstand durch Pipettieren in ein frisches 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen. Lege die Perlen weg.
   9. Stellen Sie den pH-Wert des Aufschlusses auf unter 3 ein, indem Sie tropfenweise 50 % Trifluoressigsäure (TFA) hinzufügen. Überprüfen Sie den pH-Wert mit pH-Indikatorstreifen.
      HINWEIS: Der typische pH-Bereich sollte ~2,5-3,0 betragen, und die Proben sollten vor der Entsalzung angesäuert werden.
      ACHTUNG: TFA ist ätzend und flüchtig. Setzen Sie einen Abzug ein und tragen Sie geeignete persönliche Schutzausrüstung (PSA).
2. Peptid-Entsalzung
   HINWEIS: Verwenden Sie für die Entsalzung und Reinigung von Peptiden kleine C18-gepackte Pipettenspitzen (z. B. StageTips)³¹. Bereiten Sie C18 StageTips vor, indem Sie drei Schichten C18-Material (z. B. C18-Festphasen-Extraktionsscheiben) in eine 200-μl-Pipettenspitze packen. Es können auch vorgefertigte, handelsübliche C18-Spinsäulen verwendet werden. Befolgen Sie das Protokoll des Herstellers für die Konditionierung, das Laden der Probe und die Peptidelution. Die Leistung (z. B. Retentionseffizienz, Wiederherstellungsausbeute) kann zwischen selbstgemachten und kommerziellen Geräten variieren. Kleine C18-gefüllte Pipettenspitzen sollten dicht gepackt werden, um einen Bypass-Fluss zu vermeiden.
   1. Konditionieren Sie die kleinen C18-gefüllten Pipettenspitzen nacheinander mit: (1) 100 μl Methanol. Bei 400 × g zentrifugieren und den Durchfluss verwerfen; (2) 100 μl 70 % ACN/0,1 % TFA. Bei 400 × g zentrifugieren und den Durchfluss verwerfen; (3) 100 μl 0,1 % TFA. Bei 400 × g zentrifugieren und den Durchfluss verwerfen. Wiederholen Sie diesen Schritt zweimal.
      HINWEIS: Die Konditionierung gewährleistet eine vollständige Benetzung des hydrophoben C18-Harzes. Für vorgefertigte, handelsübliche C18-Spinsäulen können auch Vakuumverteiler verwendet werden. Spezifische Handhabungsempfehlungen finden Sie in den Anweisungen des Herstellers.
   2. Laden Sie den angesäuerten Peptidverdau auf die konditionierten, mit C18 gefüllten Pipettenspitzen in kleinem Maßstab, indem Sie die Probe langsam direkt in die Spitze pipettieren. Zentrifugieren Sie bei 300 × g , damit der Aufschluss das Harz passieren kann, und verwerfen Sie den Durchfluss. Wenn das Probenvolumen die Kapazität überschreitet, in mehreren Runden laden.
      HINWEIS: Pipettieren Sie den Auftragschluss direkt auf das gepackte Harzbett und vermeiden Sie dabei Luftblasen. Wenn Sie Spitzen mit geringer Retention verwenden, berühren Sie die Innenwand der kleinen C18-verpackten Pipettenspitzen, um die Flüssigkeit langsam und gleichmäßig abzugeben.
   3. Pipettieren Sie 100 μl 0,1 % FA direkt in die kleine C18-Packungspipettenspitze, um sicherzustellen, dass die Lösung das C18-Material vollständig sättigt. Bei 400 × g zentrifugieren und den Durchfluss verwerfen. Wiederholen Sie diesen Schritt zweimal, um Salze und Störstoffe zu entfernen.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Flüssigkeit vor jedem Schleudern vollständig durch das C18-Material fließt. Vermeiden Sie das Einfangen von Luftblasen, indem Sie die Waschlösung langsam an der Wand der Pipettenspitze entlang dosieren.
   4. Eluieren Sie die gebundenen Peptide, indem Sie 50 μl 70 % ACN/0,1 % FA in die kleine C18-Packungspipettenspitze pipettieren. Zentrifugieren Sie bei 300 × g und sammeln Sie das Eluat in einem sauberen Mikrozentrifugenröhrchen mit geringer Bindung. Wiederholen Sie diesen Schritt zweimal, um eine vollständige Elution zu gewährleisten.
      HINWEIS: Möglicherweise sind mehrere Zentrifugationsrunden erforderlich, um das Eluat vollständig zurückzugewinnen. Wenn Restflüssigkeit an der Basis der Spitze eingeschlossen bleibt, klopfen Sie vorsichtig auf die kleine C18-gefüllte Pipettenspitze oder führen Sie kurze zusätzliche Umdrehungen durch, um das verbleibende Volumen aufzufangen. Kombinieren Sie die Eluate und überprüfen Sie das endgültige Volumen, bevor Sie fortfahren.
   5. Frieren Sie die eluierten Peptide ein und trocknen Sie sie mit einem Vakuumkonzentrator, bis sie trocken sind. Stellen Sie sicher, dass der Deckel locker sitzt, um das Entlüften zu ermöglichen, aber vermeiden Sie Spritzer.
   6. Rekonstituieren Sie die getrockneten Peptide, indem Sie 12 μl 0,1 % FA in LC-MS-Qualität Wasser direkt auf den Boden des Röhrchens geben. Wirbeln und beschallen Sie die Röhrchen vorsichtig, um die Peptide vollständig aufzulösen.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass das gesamte Pellet oder der getrocknete Film vollständig rekonstituiert ist. Bei der pipettenbasierten Auflösung besteht die Gefahr eines Peptidverlusts aufgrund von Anhaftung an den Spitzenoberflächen.
   7. Beschallen Sie die rekonstituierten Peptide 5 Minuten lang in einem mit kaltem Wasser gefüllten Badsonicator, um eine vollständige Auflösung zu gewährleisten und eine Überhitzung zu verhindern.
   8. Zentrifugieren Sie die Peptide bei 20.000 × g bei 4 °C für 10 min. Übertragen Sie den Peptidüberstand in ein geeignetes Autosampler-Fläschchen, um es auf das LC-MS-System zu laden. Verwenden Sie hochwertige, gaschromatographisch (GC) getestete Polypropylen-Fläschchen mit geringem Volumen und Septumkappen aus gebundenem Silikon/Polytetrafluorethylen (PTFE), um Probenverluste zu minimieren. Beschriften Sie die Fläschchen deutlich mit Proben-ID und Injektionsreihenfolge.
   9. Schätzen Sie die Peptidkonzentration mit einem Spektralphotometer bei 280 nm. Beachten Sie, dass es sich hierbei um einen ungefähren Hinweis handelt, der durch den Gehalt an aromatischen Rückständen oder Verunreinigungen beeinflusst werden kann. Alternativ können kolorimetrische Peptid-Assays für eine genauere Quantifizierung verwendet werden.
3. LC- und MS-Parameter
   HINWEIS: Die folgenden LC- und MS-Parameter sind für das Nano-LC-System optimiert, das mit dem im aktuellen Protokoll verwendeten Massenspektrometer gekoppelt ist. Bei anderen Nano-LC-Systemen und Massenspektrometern sollten die Parameter entsprechend angepasst werden.
   1. Bereiten Sie die mobilen Phasen wöchentlich vor, um die LC-MS-Kompatibilität sicherzustellen und die Kontamination zu minimieren: (1) Mobile Phase A: Geben Sie 1 ml LC-MS-Klasse FA zu 1 l LC-MS-Wasser und (2) Mobile Phase B: Fügen Sie 1 ml LC-MS-Klasse FA zu 1 l LC-MS-Klasse ACN hinzu.
      HINWEIS: Verwenden Sie nur Lösungsmittel und Säuren in LC-MS-Qualität. Bereiten Sie beide Phasen in sauberen Glasflaschen vor und entgasen Sie, wenn das LC-System dies erfordert. Entsorgen Sie ungenutzte Phasen wöchentlich, um mikrobielles Wachstum oder Zersetzung zu vermeiden.
   2. Installieren Sie eine 25 cm lange Kapillarsäule aus Quarzglas mit einem Innendurchmesser von 75 μm, die mit 1,7 μm C18-Umkehrphasenpartikeln gefüllt ist.
      HINWEIS: Behandeln Sie die Säulen mit Vorsicht, um das Einbringen von Luftblasen oder die Beschädigung des Verpackungsmaterials zu vermeiden. Befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers für den Einbau und die Äquilibrierung der Säule.
   3. Konditionieren Sie die Säule, indem Sie die Durchflussrate schrittweise von 50 nL/min auf 300 nL/min mit 3 % mobiler Phase B erhöhen.
      HINWEIS: Dieser Schritt stellt sicher, dass die stationäre Phase vor der Probeninjektion ordnungsgemäß benetzt und äquilibriert wird. Überwachen Sie den Säulendruck während des Rampens der Durchflussrate. Plötzliche Druckspitzen können auf Luftblasen oder eine Verstopfung der Säule hinweisen. Die Äquilibrierung kann als abgeschlossen angesehen werden, wenn sich der Ausgangsdruck stabilisiert.
   4. Halten Sie die Temperatur der Säule bei 50 °C, um eine optimale chromatographische Leistung zu gewährleisten.
   5. Injizieren Sie 100 ng eines tryptischen HeLa-Zell-Verdaus als Qualitätskontrollstandard (QC), um die Systemleistung zu bewerten.
      HINWEIS: Diese QC-Injektion dient als Benchmark zur Bewertung der Konsistenz der LC-Retentionszeit, der MS-Sensitivität und der Proteomabdeckung über Läufe hinweg. Vergleichen Sie die Anzahl der Proteinidentifizierungen, die Reproduzierbarkeit der Reproduzierzeit und die Signalintensität mit einem Referenz-QC-Datensatz, um die Systembereitschaft vor der Analyse experimenteller Proben zu bestätigen. Verwenden Sie kommerzielle HeLa-Aufschlussstandards, die in bekannten Konzentrationen hergestellt wurden, um die Reproduzierbarkeit über alle Experimente hinweg zu gewährleisten.
   6. Verwenden Sie eine Gradientenelution von 2 % bis 35 % mobiler Phase B über 90 min bei einer Flussrate von 300 nL/min. Der 90-minütige Gradient ermöglicht eine hochauflösende Peptidtrennung, die für komplexe Proteome geeignet ist. Halten Sie die Neigung nach dem Gradienten 7 Minuten lang bei 95 % mobiler Phase B, um die Säule zu waschen.
      HINWEIS: Nehmen Sie vor der nächsten Injektion einen Re-Equilibrierungsschritt (z. B. Rückkehr zu 2 % B für 10-15 min) vor, um die Reproduzierbarkeit der Säule über alle Läufe hinweg zu gewährleisten. Vermeiden Sie abrupte Gradientenänderungen, die sich auf die Stabilität der Retentionszeit und die Peakform auswirken können.
   7. Führen Sie die MS-Analyse mit einem Massenspektrometer durch, das mit einer Nanoflow-kompatiblen Elektrospray-Ionisationsquelle (z. B. CaptiveSpray-Stil) ausgestattet ist.
      HINWEIS: Die CaptiveSpray-Ionenquelle bietet stabiles Elektrospray bei niedrigen Nanoflussraten und verbessert so die Ionisationseffizienz und -empfindlichkeit. Für Labore, die alternative Massenspektrometer verwenden, passen Sie die Erfassungs- und Ionisationsparameter entsprechend an. Stellen Sie sicher, dass die richtige Abstimmung und Kalibrierung vor der Analyse erfolgt, um Genauigkeit und Auflösung zu erhalten. Positionieren Sie den Sprühstrahler richtig und überwachen Sie die Sprühstabilität während des Laufs, um Signalaussetzer zu vermeiden.
   8. Es wird ein datenunabhängiges ErfassungsdiaPASEF-Verfahren³² verwendet. Für Anwender, die mit diaPASEF nicht vertraut sind, konsultieren Sie die technische Dokumentation des Herstellers oder aktuelle Protokolle, die die Arbeitsabläufe für die Mobilitätsspektrometrie gefangener Ionen (TIMS)-DIA³³ beschreiben, um sie für verschiedene Probentypen oder Gradientenlängen zu optimieren.
      HINWEIS: diaPASEF kombiniert TIMS mit DIA, um die Sequenzierungsgeschwindigkeit und -empfindlichkeit zu erhöhen, indem Vorläufer- und Fragmentionen in der Mobilitätsdimension³⁴ ausgerichtet werden. Stellen Sie sicher, dass das TIMS-Gerät ordnungsgemäß kalibriert und mit dem Quadrupol synchronisiert ist, um eine Fehlausrichtung der Ionenmobilität und der Massenfenster zu vermeiden.
   9. Verwenden Sie die folgenden Geräteeinstellungen: (1) Massenbereich: 100 bis 1700 m/z; (2) Ionenmobilitätsbereich: 0,60-1,60 V·s/cm²; (3) Kollisionsenergie: 20-59 eV, rampiert; (4) Rampenzeit: 100 ms; (5) Akkumulationszeit: 100 ms; (6) Massenbereich für diaPASEF: 400-1201 Da; (7) Breite des Massenfensters: 26 Da mit 1 Da Überlappung; (8) Anzahl der Massenschritte pro Zyklus: 32; (9) Zykluszeit: ~1,8 s
      HINWEIS: Diese Einstellungen sind optimiert, um die Abdeckungstiefe und die Scangeschwindigkeit in Einklang zu bringen. Kleinere Anpassungen (z. B. Fensterbreite oder Anzahl der Schritte) können je nach Probenkomplexität, Gradientenlänge und LC-MS-Systemleistung erforderlich sein. Die Identifizierung von über 7.500 Proteinen für den HeLa-Verdau deutet auf eine optimale Systemleistung hin. Die Anzahl der Identifikationen kann je nach Instrument variieren und sollte entsprechend bewertet werden.
   10. Laden Sie 300-400 ng Peptidprobe pro Injektion, um eine Überlastung der Analysesäule zu vermeiden. Eine Überlastung kann zu einer Peakverbreiterung, Ionenunterdrückung und verminderter Reproduzierbarkeit führen. Bestätigen Sie die Peptidkonzentration vor der Injektion mit einem Spektralphotometer oder kolorimetrischen Peptidassay, um Schwankungen zwischen den Läufen zu vermeiden.
   11. Führen Sie leere Injektionen zwischen Probengruppen durch, um eine Verschleppung zu vermeiden. Verwenden Sie 100 % mobile Phase A (Wasser mit 0,1 % FA) als Injektionsrohling. Dadurch werden restliche Peptide aus der Säule gespült und die Kontamination zwischen den Durchläufen reduziert. Überwachen Sie die Ausgangs- und Hintergrundionen, um eine angemessene Reinigung zu bestätigen.
4. DIA Datenanalyse
   1. Nutzen Sie eine geeignete Software, die die Datenanalyse mit dem directDIA workflow³⁵ und die bibliotheksfreie Verarbeitung von DIA-Proteomik-Daten unterstützt. Führen Sie die Proteinidentifizierung und -quantifizierung auf der Grundlage einer UniProt FASTA-Datenbank³⁶ mit Standard-Suchparametern und Standard-Quantifizierungseinstellungen durch.
      HINWEIS: Alle Parameter, einschließlich Enzymspezifität, Modifikationseinstellungen, FDR-Schwellenwerte und Ergebnisse nach der Analyse, sind in der Zusatzdatei 1 aufgeführt. Alternative DIA-Analyseplattformen wie DIA-NN³⁷ können ebenfalls verwendet werden, wenn sie ähnliche Arbeitsabläufe und Ausgaben unterstützen.
   2. Führen Sie bibliotheksfreie directDIA mit q-Wert-Cutoffs aus, die 1 % FDR auf Vorläufer-, Peptid- und Proteingruppenebene entsprechen. Schließen Sie die Identifizierung von Ködern vor der nachgelagerten Analyse aus.
      HINWEIS: Es wurden keine iRT-Standards hinzugefügt. Die Leistung wurde mit HeLa-Digest-Läufen anhand vordefinierter Kriterien für die Identifizierung und die Stabilität der Retentionszeit verglichen.

Ergebnisse

Nach der erfolgreichen Ausführung des Protokolls sollten die Nutzer qualitativ hochwertige Interaktionsdatensätze erhalten, die für die nachgelagerte dfPPI-Analyse geeignet sind. Die Proteinidentifizierung erfolgt anhand von DIA-Daten bei 1 % FDR (PSM- und Proteinspiegel), und die Quantifizierung erfolgt anhand von Rohintensitäten oder MS/MS-Spektralzahlen (nicht LFQ). Zu den erwarteten QC-Signaturen gehören: enges Clustering technischer Replikate nach PCA, mediane Vorläufer-/Protein-CVs von etwa 10-12%, hierarchisches Clustering, das eher auf biologischem Ursprung als auf Replikation basiert, und robuste Anreicherung auf Pfadebene auf g:Profiler/Reactome.

Erzeugung von PU-Bead-Sonden und Aktivitätsvalidierung vor dem Einsatz

PU-Kügelchen werden hergestellt, indem ein Epichaperom-bindendes niedermolekulares Analogon an NHS-aktivierte Agarose gekoppelt wird, wie zuvor beschrieben²⁵. Eine Standard-25-ml-Harzpackung ergibt ~25 ml PU-Kügelchen, die als 1:1-Aufschlämmung in Isopropanol gelagert werden. Aliquot in Low-Bind-Röhrchen geben und bei -20 °C lichtgeschützt lagern (z. B. in Alufolie einwickeln). Unter diesen Bedingungen bleibt eine Charge ≥12 Monate lang stabil. Vor der Anwendung Isopropanol entfernen und die Kügelchen in nativem Bindungspuffer äquilibrieren (Schritt 1.3). Jede Charge wird bei der Synthese und danach periodisch mit zwei Assays qualifiziert (Abbildung 2): (i) Biologische Spezifität durch abgestimmte Pulldowns von einem Epichaperom-hohen Lysat (z. B. MDA-MB-468) und einem Epichaperom-niedrigen Lysat (z. B. ASPC1) unter identischen Bedingungen (40 μl Bead-Slurry mit 250 μg Gesamtprotein; 3 h bei 4 °C; native Waschungen), Elutierung/Denaturierung und Immunoblot für HSP90, HSC70 und HOP. Akzeptanz: starke Anreicherung in der Epichaperom-hohen Probe mit minimalem Signal in der niedrigen Probe; Bandenintensitätsverhältnisse, die mit einer Referenzcharge vergleichbar sind (±20-30%). (ii) Parallele Abscheidungen aus einem Epichaperom-hohen Lysat mit Epichaperom und PU-Kügelchen im Vergleich zu übereinstimmenden inerten Kontrollkügelchen, Ladung gleicher Eluatvolumina auf SDS-PAGE und Coomassie-Färbung. Akzeptanz: PU-Kügelchen zeigen eine reichhaltige, hochmolekulare Ladung mit minimalem Hintergrund in der Kontrollperlenspur. Eine 25-ml-Charge unterstützt ~600 Erfassungen mit 40 μl pro Probe; Ziehen Sie sich häufig zurück, wenn die Spezifität oder das Ladungsprofil nach dem erneuten Waschen/Neuausbalancieren nicht mehr akzeptiert wird.

Repräsentative Ergebnisse von In-Gel- und On-Bead-Protokollen

In einem Pilot-Kopf-an-Kopf-Vergleich an Epichaperom-Zellen mit hohem MDA-MB-468-Gehalt erzeugten In-Gel- und On-Bead-Workflows hochgradig übereinstimmende Interaktome: 4.616 von 6.333 Proteinen (73 %) wurden auf Proteingruppenebene geteilt, wobei 1.275 (20 %) nur durch In-Gel und 442 (7 %) nur durch On-Bead nachgewiesen wurden. Die Übereinstimmung auf Pfadebene war sogar noch höher: Von 860 Reactorome-Begriffen waren 727 (85 %) häufig, wobei 81 (9 %) für In-Gel und 52 (6 %) für On-Bead spezifisch waren. Die medianen Proteinintensitäten waren für In-Gel ~3× höher als für On-Bead, was mit der Gel-Elutionskonzentration übereinstimmt, aber dies hatte keinen wesentlichen Einfluss auf die Konkordanz des Signalwegs.

Beispiel für Kohortenskala und QC-Signaturen

Als Beispiel haben wir zwölf biologische Proben analysiert (Abbildung 3). Vier Proben wurden eluiert und durch In-Gel-Aufschluss verarbeitet; Acht Proben wurden einer Affinitätsreinigung von Epichaperomkomplexen unterzogen, gefolgt von einem On-Bead-Aufschluss und nano-LC-MS/MS in technischem Duplikat. Erwartete QC-Signaturen wurden beobachtet: enges Clustering von technischen Replikaten nach PCA, mediane Vorläufer-/Protein-CVs von ~10-12%, hierarchisches Clustering, das eher durch biologischen Ursprung als durch Replikation getrieben wird, und robuste Anreicherung auf Pfadebene auf g:Profiler/Reactome. Diese Ergebnisse verdeutlichen die Reproduzierbarkeit über Workflow-Komponenten hinweg, eine breite Detektion von Epichaperom-aktivierten Proteinen und eine klare funktionelle Interpretierbarkeit differentieller Interaktoren auf Signalwegebene. Die aus beiden Workflows abgeleiteten Signalanreicherungen stimmten mit unseren veröffentlichten dfPPI-Ergebnissen für diese Linie überein, die durch mehrere biochemische und funktionelle orthogonale Assays validiert^{wurden 17}.

Qualität des Inputmaterials und Aufschluss

Ein repräsentatives Coomassie-gefärbtes SDS-PAGE-Gel ist für vier der Proben dargestellt, die durch In-Gel-Aufschluss verarbeitet wurden (Abbildung 3A). Das Gel veranschaulicht die reproduzierbare Proteinerfassung und die konsistente Verteilung der Banden über die Lanes und bestätigt damit die erfolgreiche Anreicherung von Proteinkomplexen aus nativen Lysaten vor der Massenspektrometrie. Diese denaturierten Interaktomprofile zeigen, dass der Schritt der Affinitätserfassung einen ausreichenden und konsistenten Proteininput für die nachgelagerte MS-Analyse liefert.

Die erfassten Interaktome zeigen eine breite Proteinabdeckung über alle Molekulargewichte, was die erfolgreiche Anreicherung von Proteinassemblierungen aus nativen Lysaten widerspiegelt. Entscheidend ist, dass diese Rückgewinnung nicht auf reichlich vorhandene Proteine beschränkt ist, sondern auch Interaktoren mit geringerer Abundanz umfasst, die die für die Analyse auf Systemebene erforderliche Komplexität und Tiefe bieten.

Kontrollen und Spezifität in großem Maßstab

In diesem Workflow verwenden wir Kontrollperlen nur für das Vorablöschen (siehe Schritte 1.3 und 1.4). Wir führen keine routinemäßigen "Inertsonden"-Vergleichserfassungen für jede Bioprobe durch. Bei großen klinischen Kohorten verbrauchen inerte Captures wertvolles Material, bieten aber nur einen geringen Interpretationswert für dfPPI, da die nachgelagerte Statistik auf der Ebene des Netzwerks/Signalwegs und nicht auf der Ebene eines einzelnen Proteins arbeitet. Zufällige oder harzklebrige Verunreinigungen treten nicht koordiniert zwischen Mitgliedern desselben Signalwegs auf und überleben daher keine Anreicherungstests auf Pfadebene oder Konsistenzfilter auf Kohortenebene. In der Praxis wird die Spezifität durch (i) Pre-Clearing, (ii) enge Replikatreproduzierbarkeit (PCA/CV) und (iii) Stabilität des Signalwegs über Schwellenwerte und erneute Probenahme hinweg sichergestellt. In der Vergangenheit haben wir Experimente mit Inert-Capture- und Soluble-Competitor-Blockexperimenten (PU-H71) ausgewertet und festgestellt, dass sie die Ergebnisse des dfPPI-Signalwegs nicht veränderten 16,17,21, während sie unersetzliches klinisches Material konsumierten; Daher reservieren wir sie nur für die Pilotenverifizierung. Für Gruppen, die explizite Run-Level-Checks bevorzugen, beachten wir, dass beide Optionen mit dem Protokoll kompatibel sind, aber für dfPPI-Analysen auf Kohortenebene nicht erforderlich sind.

Anzahl replizieren

Die Pathway-Inferenz in dfPPI ist mengenbasiert und erfordert keine feste Replikatzahl. Bei robusten Erfassungen kann eine einzelne Stichprobe pro Bedingung zu explorativen Pathway-Aufrufen führen. Für Bestätigungsanalysen empfehlen wir ≥3 biologische Replikate pro Bedingung für kultivierte Zellen (mit doppelten LC-MS/MS-Injektionen, wenn möglich) und kohortengeeignete Ns für menschliches Gewebe (typischerweise ≥5-10 pro Gruppe für die Entdeckung, größer, wenn nach Kovariaten stratifiziert wird). Wir beurteilen die Stabilität durch Replikat-Clustering (PCA), mediane Vorläufer-CV (Ziel ~10-15%) und Bootstrap/Resampling der Anreicherungsergebnisse.

Technische Reproduzierbarkeit über Auflagen hinweg

Die technische Reproduzierbarkeit wurde anhand der Hauptkomponentenanalyse (PCA) (Abbildung 3B) von Peptidintensitätsdaten aus on-bead-verdauten Proben (acht Mausgehirne, doppelt ausgeführt) bewertet. Replikate werden für jede biologische Probe eng geclustert, während verschiedene Proben entlang der ersten beiden Hauptkomponenten sauber getrennt werden. Die ersten beiden Hauptkomponenten erklärten 28,6 % bzw. 22,0 % der Gesamtvarianz und verteilten die Proben nach biologischen Unterschieden und nicht nach technischem Rauschen. Diese Struktur spiegelt eine hohe analytische Konsistenz wider und bestätigt, dass die Methode biologisch relevante Unterschiede beibehält, was entscheidend ist, um dfPPI in die Lage zu versetzen, zustandsspezifische Netzwerk-Rewiring zu erkennen.

Konsistenz der Detektion über Proben hinweg

Die Verteilungen des Variationskoeffizienten (CV) für die Ionenintensitäten der Vorläufer zeigen, dass die überwiegende Mehrheit der Merkmale unter 20 % CV fällt, wobei die Medianwerte unter allen Bedingungen zwischen 9,7 % und 11,9 % liegen (Abbildung 3C). Diese Ergebnisse bestätigen den konsistenten MS-Nachweis und die Peptidrückgewinnung über alle Replikate hinweg.

Dynamikbereich und Proteomabdeckung

Die hierarchische Clusterbildung der Abundanzwerte logarithmisch transformierter Proteine (Abbildung 3D) zeigte eine starke Trennung der Proben und die Beibehaltung der Variation zwischen den Proben, während sie auch den breiten dynamischen Bereich widerspiegelte, der in den MS-Läufen erfasst wurde. Die Proteinintensitäten reichten von Interaktoren mit geringer Abundanz bis hin zu hochangereicherten Proteingruppen, wie durch den Blau-Gelb-Gradienten visualisiert. Die Daten bestätigen, dass das Protokoll den Nachweis verschiedener Proteinanordnungen und -interaktoren ermöglicht, wobei sowohl Kern- als auch Peripheriekomponenten erfasst werden.

Funktionale Interpretation über dfPPI

Um die Interpretation und Reproduzierbarkeit zu unterstützen, stellen wir zwei komplementäre Ressourcen für dfPPI-Datensatzanalysen zur Verfügung: (i) eine interaktive Shiny-Webanwendung (https://epichaperomics.mskcc.org/ auf https://dfppi.mskcc.org aktualisiert) und (ii) offene, skriptfähige Workflows und Cytoscape-Sitzungsdateien, die mit früheren dfPPI-Studien veröffentlicht wurden (GitHub/Zenodo)38,39,40,41. Die App nimmt Rohintensitäts- oder MS/MS-Spektralzähltabellen auf, führt Qualitätskontrollen durch (Replikat-Clustering, Missing-Value-Prüfungen), optionales Rauschen/Batch-Handling (Kovariatenregression), identifiziert differentiell aktivierte Proteine und liefert Pfad-/Netzwerkauslesungen über interaktive Diagramme und herunterladbare Berichte - ohne dass eine Codierung erforderlich ist.

dfPPI behandelt gemessene Intensitäten oder spektrale Zählungen als Proxys für die "Epichaperom-Interaktion". Benutzer wählen ein differenzielles Konnektivitätsmodell (DC) aus, das von einem einfachen zweiseitigen t-Test (Standard) bis hin zu kovariatenfähigen linearen Modellen reicht. Der DC-Schritt kann auch übersprungen werden. Nach DC legen Benutzer Fold-Change- und p-Wert-Schwellenwerte fest (Standardwerte spiegeln frühere dfPPI-Arbeiten wider, z. B. FC > 1,0, nominale p ≤ 0,25), um Kandidaten zur Anreicherung zu übergeben. Es stehen zwei Anreicherungs-Engines zur Verfügung: rangbasierte GSEA (auf vorzeichenbehafteten Statistiken) und Überrepräsentation (hypergeometrisch) über g:Profiler mit Korrektur durch mehrere Tests. Für einen Chaperon-zentrierten Kontext bietet die Pipeline auch eine Interaktom-Anreicherungsanalyse (iEA), um zu testen, ob direkte Interaktoren von Chaperon-Gerüstproteinen unter den differentiell aktivierten Proteinen überrepräsentiert sind. Netzwerkansichten gewichten Knoten/Kanten nach Effektgröße und/oder statistischer Unterstützung, was die Visualisierung einer koordinierten Neuverdrahtung anstelle von Einzelproteineffekten ermöglicht. Für Benutzer, die skriptgesteuerte Workflows bevorzugen, sind der zugrunde liegende R-Code und die Cytoscape-Sitzungsdateien, die zur Erstellung von Netzwerkkarten und -abbildungen verwendet werden, öffentlich verfügbar (z. B. GitHub/Zenodo)38,39,40,41 mit den zugehörigen Publikationen 17,18,19,20 und können lokal ausgeführt oder für neue Datensätze angepasst werden.

Ein permissiver Cutoff (Fold-Change-> 1,0; nominaler p ≤ 0,25) wird empfohlen, um die durch die Affinitätsanreicherung eingeführten Wechselwirkungszustandssignale beizubehalten. Dann verlagern wir die statistische Kontrolle auf die Ebene des Signalwegs: Kandidatenproteine werden mit g:Profiler auf Anreicherung über kuratierte Ontologien (z. B. GO, Reactome) getestet, und die durch mehrere Tests angepassten p-Werte des Signalwegs bestimmen die Signifikanz und das Ranking. Dieses Design spiegelt das Ziel von dfPPI wider - koordinierte Netzwerk-Rewiring zu erkennen, nicht die differentielle Expression einzelner Proteine - und vermeidet eine proteomweite Normalisierung, die Anreicherungssignale in Pull-Down-Datensätzen verschleiern kann. Wie in früheren dfPPI-Studien ^17,20 gezeigt wurde, führen mildere Schwellenwerte auf Proteinebene zu stabilen, krankheitsrelevanten Signalwegaufrufen, während andere Modelle (z. B. lineare Modelle mit empirischer Bayes-Schrumpfung) verwendet werden können, wenn die Varianz oder die Chargenkovariaten dies rechtfertigen, ohne die Kernsignalweg-zentrierte Inferenz zu verändern.

Der Affinitätseinfang reichert unweigerlich "klebrige" Proteine (z. B. Keratine, Zytoskelettproteine, ribosomale Proteine) an, und PU-Kügelchen können auch allgemeine Chaperon-Interaktoren einfangen. In dfPPI treiben diese die Biologie aus mehreren Gründen nicht voran. Zunächst werden durch die Vorreinigung und strenge Waschungen die meisten unspezifischen Bindemittel entfernt. Zweitens zeigen generische Bindemittel, einschließlich vieler Chaperon-Interaktoren, Faltungsänderungen nahe 1,0 über alle Bedingungen und/oder inkonsistente Detektion und versagen daher bei FC/p-Wert-Screenings. Drittens ist die Anreicherung des Signalwegs mengenbasiert und hintergrundabhängig: Die Signifikanz wird anhand des experimentspezifisch detektierten Proteoms berechnet und erfordert mehrere Mitglieder desselben Signalwegs, um zu kovariieren. Zufällige oder hochgradige Kontaminanten sind über viele Begriffe verteilt und bilden daher keine kohärenten, FDR-signifikanten Anreicherungen. Kein einzelnes Protein - ob verunreinigt oder anderweitig - kann einen Signalweg aufrufen. Viertens interpretiert dfPPI die Kohärenz auf Netzwerkebene, nicht einzelne Proteine; Signalwegaufrufe müssen die Korrektur mehrerer Tests (z. B. g:Profiler-angepasste p-Werte), minimale Gensatzgrößen und Replikatkonsistenz überstehen. Zusammen mit abgestimmten inerten Bead-Preclears und der Common-Contaminant-Filterung macht dieses Framework dfPPI robust gegenüber dem Hintergrund: Selbst wenn Hunderte von nicht-informativen Proteinen vorhanden sind, verändern sie die Rangfolge des Signalwegs nicht, da die Anreicherung von der Anzahl der konkordanten Proteine innerhalb eines Signalwegs abhängt, nicht von der Gesamtlänge der Proteinliste. Darüber hinaus hat jede bisher veröffentlichte dfPPI-Studie die Vorhersagen auf Pfad- und Netzwerkebene durch umfangreiche experimentelle Validierung bestätigt (z. B. gezielte Biochemie, Signalauslesungen, genetische oder pharmakologische Störungen)16,17,18,19,20 und zeigt, dass dfPPI-Outputs nicht nur verrauschte Proteinlisten, sondern reproduzierbare Karten der krankheitsrelevanten PPI-Netzwerkdysfunktion sind.

Um die funktionale Landschaft zu bewerten, die mit dem dfPPI-Datensatz aus Abbildung 3D erfasst wurde, haben wir eine Anreicherungsanalyse mit g:Profiler⁴² durchgeführt (Abbildung 3E). Die Ergebnisse zeigen eine robuste Annotationsabdeckung über alle wichtigen funktionellen Ontologien hinweg, einschließlich der biologischen Prozesse der Genontologie (GO-BP), der molekularen Funktion (GO-MF) und der zellulären Komponente (GO-CC) sowie kuratierter Signalwegressourcen wie Reactome, KEGG und WikiPathways. Diese repräsentative Analyse verdeutlicht eine wesentliche Stärke des dfPPI-Ansatzes: seine Fähigkeit, biologisch bedeutsame Signalwegassoziationen über verschiedene Annotationstypen hinweg aufzudecken, selbst aus relativ kleinen Stichprobengrößen. Die hier beobachtete breite Reactorome-Abdeckung spiegelt wahrscheinlich die Tatsache wider, dass dfPPI auf einer Neuverdrahtung von Proteinnetzwerken auf Interaktionsebene basiert, die direkt auf Mehrkomponentenprozesse und Signalkaskaden abgebildet werden, die in der Struktur von Reactome gut repräsentiert sind. Da dfPPI eher Veränderungen in der Konnektivität als in der Expression nutzt, eignet es sich besonders gut, um funktionelle Verschiebungen auf Systemebene zu erkennen, die von der Transkriptomik oder der reinen Abundanzproteomik möglicherweise übersehen werden. Dieses Ergebnis stimmt mit anderen Arbeiten überein, in denen Reactome durchweg die kohärentesten und krankheitsrelevantesten Anreicherungen aus den dfPPI-abgeleiteten Proteinsätzen 14,15,16,17,18,20,21 lieferte.

Das Reaktom ist um Multiproteinprozesse und -komplexe herum organisiert (Signaltransduktionskaskaden, Zellzyklusmodule, Stoffwechselanordnungen). Da dfPPI Epichaperom-aktivierte Interaktoren anreichert - d.h. Gruppen von Proteinen, die funktionell zu Krankheitsgerüsten mitrekrutiert werden - enthält sein Output von Natur aus kohäsive Signalwegmodule und keine isolierten Hits. Diese koordinierte Abscheidung führt zu einer breiten, hochsignifikanten Reaktomabdeckung über verwandte Subpfade und Hierarchien hinweg. Im Gegensatz dazu berichten abundanzzentrierte Omics (Transkriptomik; globale Proteomik) über Expressionsänderungen, nicht über Interaktionszustände; Einzelköder-AP-MS oder Proximity-Labelling liefern lokale Nachbarschaften um jeweils einen gentechnisch hergestellten Köder; und Crosslinking/Co-Fraktionierung sorgen oft für eine spärliche Konnektivität. Keines davon allein erzeugt routinemäßig die kontextselektierten Sets auf Systemebene, die dfPPI aus einer einzigen, endogenen Erfassung in Zellen oder Gewebe zurückgibt. Das Ergebnis ist eine Anreicherung des Signalwegs, die sowohl breit (mehrere Reaktom-Zweige leuchten auf) als auch mechanistisch kohärent ist (Proteine verschieben sich zusammen, weil ihre Wechselwirkungen - nicht nur ihre Mengen - durch Epichaperome neu verdrahtet werden). Wir stellen jedoch fest, dass dfPPI komplementär und kein Ersatz ist: Jede Interaktomics-Methode hat unterschiedliche Stärken und Grenzen, und die optimale Wahl (oder Kombination) sollte von der biologischen Fragestellung, den Probeneinschränkungen und der erforderlichen Auflösung bestimmt werden.

Zusammengenommen bestätigen diese Ergebnisse, dass das Protokoll reproduzierbare, biologisch informative Datensätze liefert, die zur Aufdeckung des differentiellen Interaktom-Remodelings über Krankheitszustände oder experimentelle Störungen hinweg verwendet werden können. Die dfPPI-Ausgabe eignet sich gut für die Integration mit Pathway Enrichment-Frameworks und ermöglicht die Abbildung von funktionellen Rewiring-Ereignissen, die mit standardmäßigen abundanzbasierten Methoden nicht erkennbar sind.

Abbildung 1: Überblick über die dfPPI-Plattform. (A) Die dfPPI-Plattform (Dysfunctional Protein-Protein Interactome) ermöglicht die Identifizierung krankheitsspezifischer PPI-Netzwerk-Dysfunktionen durch einen chemoproteomischen Workflow. Abschnitt 1 umfasst die Probenvorbereitung und die Interaktomerfassung mit chemischen Sonden, die auf Epichaperom abzielen und auf Affinitätsmatrizen (z. B. PU-Kügelchen) immobilisiert sind. In den Abschnitten 2 und 3 werden zwei kompatible Aufschluss-Workflows skizziert - auf der Perle oder im Gel -, gefolgt von einem markierungsfreien LC-MS/MS zur Identifizierung des Interaktoms. Computergestützte Analysen, einschließlich statistischer Modellierung und Pathway Enrichment, werden mit der dfPPI-Bioinformatik-Pipeline durchgeführt, die in diesem Protokoll nicht behandelt wird, aber unter https://epichaperomics.mskcc.org/ frei verfügbar ist. (B) Prinzip des dfPPI. In krankheitsrelevanten Kontexten bilden endogene Epichaperome supramolekulare Gerüste, die PPI-Netzwerke reorganisieren. Epichaperom-gerichtete chemische Sonden (z. B. PU-Kügelchen oder Äquivalente) fangen diese Gerüste zusammen mit ihren gebundenen Interaktoren direkt aus intakten Zellen oder aus nativen Lysaten ein, was zu einem Multi-Bait-Pull-Down in einem einzigen Experiment führt. Abgestimmte Steuerungen (z. B. Inertraupenkontrolle und/oder Wettbewerb mit freier Sonde) können parallel bearbeitet werden. Das eingefangene Material wird eluiert und auf der Perle oder im Gel verdaut, mittels LC-MS/MS analysiert und Proteine werden quantifiziert (Intensität oder MS/MS-Spektralzahlen). Das resultierende Interaktom wird verwendet, um differentielle Interaktoren über Bedingungen hinweg zu berechnen und eine Pfad-/Netzwerkanreicherung durchzuführen, wodurch kontextspezifische PPI-Dysfunktionen auf Systemebene aufgedeckt werden. Der Workflow erfordert keine genetische Markierung oder Überexpression, ist sowohl mit Zellen als auch mit Geweben kompatibel und lässt sich auf Kohortenstudien skalieren. Umgekehrt konzentriert sich die traditionelle Affinitätsreinigungs-MS auf jeweils einen markierten Köder, wodurch eine lokale Nachbarschaft pro Konstrukt erzeugt wird und typischerweise viele Konstrukte/Läufe erforderlich sind, um ein Netzwerk zu beproben. Im Gegensatz dazu verwendet dfPPI endogene Epichaperome als Köder, die viele dysfunktionale PPIs gleichzeitig aus dem nativen System erfassen, was die Entdeckung einer krankheitsspezifischen Netzwerkneuverdrahtung beschleunigt und Auslesungen auf Pfadebene aus einer einzigen Erfassung liefert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Validierung der PU-Bead-Charge und Capture-Spezifität. (A) Biologische Spezifität und Chargenkonsistenz. MDA-MB-468 (Epichaperom-hoch) und ASPC1 (Epichaperom-niedrig) Zellen wurden in nativem Puffer (20 mM Tris, pH 7,4; 20 mM KCl; 5 mM MgCl₂; 0,01% NP-40; Protease-/Phosphatase-Inhibitoren) lysiert. Für jeden Fang wurden 40 μl PU-Bead-Slurry mit 250 μg Gesamtprotein (1 μg/μL) für 3 h bei 4 °C mit Rotation inkubiert. Die Perlen wurden in nativem Puffer gewaschen; Die Komplexe wurden in ~100 μl SDS-Probenpuffer denaturiert/eluiert. 5-10 μl jedes Eluats wurden durch SDS-PAGE aufgelöst und für HSP90, HSC70 und HOP immunblottiert. Die Eingabelysate werden als Referenz angezeigt. Zwei PU-Perlenpartien (Charge 1, frisch; Charge 2, gealtert) ergaben eine starke Anreicherung in MDA-MB-468 und ein minimales Signal in ASPC1, was eine erhaltene Spezifität und Chargenkonsistenz zeigt. (B) Globale Fracht versus Kontrollperlen. MDA-MB-468-Lysate wurden wie in (A) entweder mit PU-Kügelchen oder passenden Kontrollkügelchen verarbeitet. ~20 μL jedes Eluats wurden geladen, getrennt durch SDS-PAGE und Coomassie-gefärbt. PU-Kügelchen gewinnen eine komplexe, hohe MW-Ladung zurück, die für epichaperomgebundene Anordnungen charakteristisch ist, während Kontrollkügelchen einen minimalen Hintergrund aufweisen. Molekulargewichtsmarker (kDa) sind angegeben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Repräsentative Ergebnisse aus dfPPI-Affinitätserfassung, Interaktomidentifikation und bioinformatischen Analysen. (A) Coomassie-gefärbtes SDS-PAGE-Gel von Proteinen, die aus PU-bead-Affinitätsfängen von Epichaperom-gebundenen Interaktomen aus vier repräsentativen menschlichen Gehirnproben (PT1-PT4) eluiert wurden. Bead-gebundene Proteinanordnungen wurden durch Kochen in SDS-Probenpuffer denaturiert, mit SDS-PAGE aufgelöst und gefärbt, um die Interaktom-Wiederfindung über Molekulargewichte hinweg zu beurteilen. Jede Probe wurde in eine separate Spur geladen, mit einer leeren Spur zwischen den Proben, um Kreuzkontaminationen zu minimieren. Ein schwaches Signal, das gelegentlich in diesen leeren Fahrspuren beobachtet wird, deutet auf einen geringfügigen Probenüberlauf während der Elektrophorese hin. Diese Gele sind repräsentativ für Proben, die an die MS-Einrichtung geschickt wurden, wo jede Spur in fünf Scheiben für den In-Gel-Verdau und die Proteinidentifizierung durch MS unterteilt wurde. (B) Die Hauptkomponentenanalyse (PCA) der identifizierten Proteinintensitäten aus on-bead-verdauten Epichaperom-Interaktomen aus acht repräsentativen Maushirnproben (in Duplikaten durchgeführt) zeigt eine enge Häufung technischer Replikate und eine klare biologische Trennung entlang PC1 und PC2. Dies bestätigt eine hohe technische Reproduzierbarkeit und eine ausreichende biologische Varianz für eine robuste dfPPI-Analyse. Die Datenstruktur zeigt, dass Unterschiede auf Interaktionsebene - nicht technische Artefakte - die Probentrennung vorantreiben und eine solide Grundlage für die nachgelagerte Modellierung des differentiellen Interaktoms bieten, ohne dass eine künstliche Normalisierung erforderlich ist. (C) Die Verteilungen des Variationskoeffizienten (CV) für die Ionenintensitäten der Vorläufer in den acht Stichprobengruppen zeigen eine durchweg geringe Varianz, wobei die medianen CVs zwischen 9,7 % und 11,9 % liegen (gekennzeichnet durch vertikale gestrichelte Linien). Diese niedrigen CVs unterstreichen die Reproduzierbarkeit und Robustheit der MS-Detektions- und Quantifizierungspipeline. Die Konsistenz unterstützt die Verwendung von Rohintensitäts- oder MS/MS-Werten als zuverlässige Eingaben für die dfPPI-Analyse, bei der die Varianz in der Interaktionsstärke - nicht die globale Proteinexpression - das biologische Signal von Interesse ist. (D) Hierarchische Clustering-Heatmap der logarithmischen_{2-transformierten} Proteinintensitätswerte über alle Proben hinweg (mit technischen Duplikaten). Die Proben gruppieren sich nach biologischem Ursprung und nicht nach Replikation, was die robuste Erfassung von Epichaperom-gebundenen Interaktomen und die Beibehaltung der biologisch relevanten Varianz bestätigt. Der breite Dynamikbereich und die konsistente Detektion über Proteine hinweg unterstützen die Qualität der Datensätze für die dfPPI-Analyse. Der Maßstabsbalken stellt die Intensitätswerte des_{logarithmisch} 2-transformierten Proteins dar, die von 2 (blau, geringe Abundanz) bis 14 (gelb, hohe Abundanz) reichen. (E) Manhattan-Diagramm der Signalanreicherungsanalyse, die an differentiell interagierenden Proteinen durchgeführt wurde, die durch dfPPI identifiziert wurden. Die Anreicherung wurde mit g:Profiler durchgeführt, und signifikante Terme werden durch −log₁₀(p-Wert) dargestellt, eingefärbt durch Annotationsquelle: GO Molecular Function (GO:MF), GO Biological Process (GO:BP), GO Cellular Component (GO:CC), KEGG, Reactome, WikiPathways und Human Phenotype Ontology (HP). Diese Ausgabe stellt den Kernnutzen von dfPPI dar: die Aufdeckung biologisch bedeutsamer funktioneller Signalwege, die durch Epichaperom-getriebenes Interaktom-Remodeling gestört werden. Die breite Abdeckung der Annotationen unterstreicht die Erkenntnisse, die durch diesen Ansatz auf Systemebene erzielt werden können. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Methode	Was es erfasst	Große Stärken	Wesentliche Einschränkungen	Typische Verwendung	Skalierbarkeit (Kohorten)
AP-MS (Affinitätsreinigung – MS)	Direkte/nahezu direkte Wechselwirkungen eines einzelnen Köders	Hohe Spezifität; quantitativ; gut für komplexe Kompositionen	Erfordert Köder/Tag/Antikörper; einen Köder nach dem anderen; Kann vorübergehend / schwach fehlen	Definieren Sie Partner eines Proteins von Interesse	Niedrig–mittel (viele Köder erforderlich)
Proximity-Etikettierung (z. B. BioID/APEX-Varianten)	Proteine in der nanoskaligen Umgebung eines Köders im Zeitverlauf	Erfasst vorübergehende/schwache Nachbarn; Wirkt in lebenden Zellen	Gentechnik; Off-Target-Etikettierung; Parameter-lastig	Lokale Nachbarschaftskarten; Dynamik	Niedrig–moderat (Engineering pro Köder)
XL-MS (vernetzende MS)	Räumliche Nähe/Kontakte innerhalb/zwischen Proteinen	Strukturelle Beschränkungen; erfasst transiente Kontakte	Komplexe Analyse; geringere Proteombreite; Probenspezifisch	Strukturelle/kontextuelle Topologie	Niedrig (spezialisiert)
Co-Fraktionierung/MS (CF-MS)	Co-Elution von nativen Assemblys	Kein Tagging; Native Assemblys	Arbeitsintensiv; komplexe Schlussfolgerung; Eingeschränkte Empfindlichkeit	Globale komplexe Landschaft	Mäßig
CETSA/TPP	Co-Stabilitäts-/Co-Aggregationsprofile	Etikettenfrei; Native Bedingungen	Indirekte für PPIs; Einschränkungen der Löslichkeit	Gezieltes Engagement; Thermische Verschiebungen	Mäßig
dfPPI (Epichaperomik)	Neuverdrahtung von Interaktionen auf Netzwerkebene, die von endogenen Epichaperomen als Multiplex-Köder erfasst werden	Endogen; keine Markierung; eine Aufnahme befragt Tausende von dysfunktionalen PPIs; Signal-/Netzwerkanzeigen; gewebeverträglich; kohortenfreundlich	Anwendbar nur auf den Krankheitskontext; spezialisierte Sonden (PU-Kügelchen, YK5-B); Nicht für generische komplexe Ermittlungen vorgesehen	Remodellierung des Krankheitskontext-Interaktoms, Priorisierung von Signalwegen, Hypothesengenerierung	Hoch (Hunderte von Proben möglich)

Tabelle 1: Vergleich von PPI-Mapping-Ansätzen und dfPPI. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Ergänzende Datei 1: Vollständige Parametereinstellungen für Spectronaut. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Diskussion

Das hier beschriebene Protokoll ermöglicht die Kartierung von dysfunktionalen PPIs in nativen biologischen Proben unter Verwendung der dfPPI-Plattform. Im Gegensatz zu herkömmlichen Methoden, die auf Dysfunktionen aus Abundanz- oder Expressionsänderungen schließen, erfasst diese Plattform die Neuverdrahtung von Netzwerken auf struktureller Ebene, indem krankheitsspezifische Interaktoren durch Affinitätsreinigung mit Epichaperom-Targeting-Sonden isoliert werden, gefolgt von markierungsfreier, intensitätsbasierter quantitativer MS. Obwohl sich die aktuelle Anwendung auf postmortales Hirngewebe konzentriert, ist die Methode breit anwendbar auf andere Probentypen und Krankheitsmodelle, einschließlich kultivierter Zellen und Gewebe aus Modellen von Krebs, Neurodegeneration und Immundysfunktion 16,17,18,19,20,22,23.

dfPPI beruht auf Sonden, die Epichaperome kinetisch auswählen und die Anordnungen mit ihren gebundenen Interaktoren einfangen. PU-Kügelchen (abgeleitet von Epichaperom-bindenden Chemotypen wie PU-H71/PU-AD) binden HSP90-kernige Epichaperome nicht-kovalent, aber mit langer Verweilzeit, ein Kennzeichen der kinetischen Selektivität für die Epichaperom-Konformation gegenüber herkömmlichen Chaperonkomplexen²³. YK5-B ist eine biotinylierte, kovalente Sonde, die auf HSC70 in Epichaperomen gerichtet ist und die In-Zell-Erfassung vor der Lyse ermöglicht und endogene PPIs konserviert¹⁷. Die Selektivität beruht auf krankheitsassoziierten PTMs, die HSP90/HSC70-Konformationen und Taschenchemie umgestalten und Epichaperom-Anordnungen stabilisieren 14,23,43,44; Diese Änderungen führen zu einer hochaffinen, langsamen_{K-Off-Bindung} für nichtkovalente Sonden⁴⁵ vom PU-Typ (und ermöglichen einen kovalenten Einfang mit HSC70-gerichtetem YK5-B), wodurch Epichaperomkomplexe kinetisch erhalten bleiben und ihre direkten und indirekten Interaktoren für LC-MS/MS CO-ISOLIERT werden. In der Praxis sind PU-Kügelchen optimal für Lysat-/Homogenat-Arbeitsabläufe, während YK5-B die Erfassung lebender Zellen unterstützt; Beide behalten kontextabhängige Assemblys bei, die durch LC-MS/MS identifiziert und für die nachgelagerte dfPPI-Analyse verwendet werden können.

Für dfPPI ist spezielles Fachwissen in der Chemie erforderlich, um die Capture-Sonden zu synthetisieren. Diese Anforderung gilt jedoch nicht nur für dfPPI: Weit verbreitete PPI-Methoden (AP-MS, Proximity-Labeling, XL-MS) beruhen ebenfalls auf spezialisierten Fähigkeiten – z. B. Klonierung/Engineering von markierten Ködern, Generierung stabiler Zelllinien, Markierungs-/Vernetzungsoptimierung und komplexe bioinformatische Pipelines. Im Gegensatz dazu vermeidet dfPPI genetische Manipulation und Köderüberexpression, wirkt direkt auf native Zellen oder Gewebe (einschließlich knapper klinischer Bioproben) und verwendet Standard-Affinity-Capture- und LC-MS-Workflows, die in Proteomik-Kernen bereits üblich sind. Um die Adoptionsbarrieren zu senken, sind validierte PU-Kügelchen und passende Kontrollkügelchen über MTA aus dem Chiosis-Labor erhältlich, und die Handhabungs-/QS-Schritte sind in den Schritten 1.3 und 1.4 vollständig spezifiziert. Schließlich wird die Analyse durch eine webbasierte dfPPI-App unterstützt, die die erforderlichen Statistiken und Pfad-/Netzwerkauslesungen implementiert und so den Aufwand für die Bioinformatik reduziert (d. h. für Benutzer ohne Programmierhintergrund und nur mit grundlegenden Bioinformatikkenntnissen).

AP-MS, XL-MS, Proximity-Labeling, Co-Fraktionierung und CETSA/TPP beantworten jeweils unterschiedliche Fragestellungen (direkte Binder, räumliche Nähe, Nachbarschaftsmarkierung, Co-Assemblierung oder thermische Co-Stabilität). dfPPI ist die Methode der Wahl, wenn das Ziel darin besteht, endogenes, kontextabhängiges Rewiring bei Krankheiten abzubilden - insbesondere in nativen Geweben oder großen klinischen Kohorten, in denen eine genetische Markierung nicht möglich ist, und wenn Auslesungen auf Pfad-/Netzwerkebene aus einer einzigen Erfassung gewünscht werden. dfPPI verwendet Epichaperome als Multiplex-Köder, um koordinierte Interaktionsänderungen zwischen vielen Proteinen in einem einzigen Pull-Down zu erfassen und so eine skalierbare LC-MS/MS-Identifizierung und Signalweg-zentrierte Analyse aus Primärmaterial zu ermöglichen. In der Praxis kann dfPPI eine nachgelagerte, köderfokussierte Validierung (z. B. AP-MS auf bestimmten Knoten) durchführen, während herkömmliche Methoden die Topologie (direkte Kontakte, räumliche Einschränkungen) für Komplexe verfeinern können, die durch dfPPI hervorgehoben werden. In Tabelle 1 finden Sie einen direkten Vergleich.

Mehrere kritische Schritte beeinflussen den Erfolg des Workflows. Zunächst einmal sind hochwertige Proteinextrakte unerlässlich. Dies erfordert einen sorgfältigen Umgang mit Geweben oder Zellen - idealerweise schockgefroren und bei -80 °C gelagert -, um die Proteolyse zu minimieren und native Komplexe zu erhalten. Die Einbeziehung sowohl von Protease- als auch von Phosphatase-Inhibitoren ist nicht verhandelbar: Die Integrität des Epichaperoms, die in diesem Assay als funktioneller "Köder" fungiert, hängt von spezifischen posttranslationalen Modifikationen von Kernkomponenten wie HSP90^{ab 23,43}. So ist beispielsweise die Phosphorylierung von Ser226 und Ser255 essentiell für die Stabilisierung der Epichaperom-Konformation und die Erhaltung ihrer Gerüstfunktion²³. Das Weglassen von Phosphatase-Inhibitoren birgt die Gefahr eines strukturellen Zusammenbruchs und des Verlusts der biologischen Spezifität.

Ein weiterer wichtiger Faktor ist die Qualität und Handhabung der Affinitätsmatrix der PU-Kügelchen. Kügelchen sollten in 100% Isopropanol bei -20 °C gelagert und innerhalb eines definierten Aktivitätsfensters, idealerweise innerhalb von 1-2 Jahren, verwendet werden. Die Aktivität sollte vor kritischen Experimenten validiert werden, da gealterte Kügelchen eine verminderte Bindungskapazität oder erhöhte unspezifische Wechselwirkungen aufweisen können. Die Inkubationszeit und der Proteineintrag müssen ebenfalls optimiert werden: Eine Überinkubation kann den Hintergrund erhöhen, während eine unzureichende Proteinzufuhr die Nachweistiefe beeinträchtigen kann. Wir empfehlen 3-stündige Inkubationen und Pilot-Pulldowns, um den geeigneten Eingang für jeden Probentyp zu kalibrieren.

Zwei Verdauungsstrategien sind mit diesem Protokoll kompatibel: On-Bead und In-Gel. Während beide Workflows reproduzierbare Ergebnisse liefern, bietet jeder Kompromisse. Der In-Gel-Verdau kann Verunreinigungen wie Keratin einführen und erfordert zusätzliche Handhabungsschritte. Der Aufschluss auf der Raupe rationalisiert den Arbeitsablauf und wird im Allgemeinen bevorzugt, wenn der Probendurchsatz oder die Eingabemenge begrenzt ist. Die Proteasemengen müssen jedoch auf der Grundlage des Gesamtproteineintrags kalibriert werden: Obwohl die Methode für 750 ng Trypsin ausgelegt ist, kann es bei hohen Proteinspiegeln zu einer unvollständigen Verdauung kommen, was zu verpassten Spaltungen und einer verminderten Peptidrückgewinnung führt. Es ist ratsam, die Verdauungseffizienz zu beurteilen und den Enzymeintrag entsprechend anzupassen. Alle Aufschlussschritte sollten in Röhrchen mit geringer Bindung unter Verwendung frisch zubereiteter, kontaminationsfreier Reagenzien durchgeführt werden, um die Konsistenz zu gewährleisten und den Hintergrund zu minimieren.

Die Proteinbeladung pro LC-MS-Injektion hängt vom Erfassungsablauf, der Peptidausbeute und der Säulenkapazität ab. Für On-Bead-Aufschlüsse, die auf Standard-Nano-LC C18-Säulen (~50-75 μm ID, ~15-25 cm) analysiert werden, laden wir in der Regel 300-500 ng pro Injektion; Wir haben keine Leistungssteigerungen über ~400-500 ng beobachtet, während höhere Lasten eine Ionenunterdrückung und eine Peakverbreiterung riskieren. Für In-Gel-Workflows (z. B. fünf Scheiben pro Bahn) injizieren wir in der Regel ~25 % des entsalzten Materials pro Scheibe und Replikat und behalten ~50 % als Backup für die Reinjektion, falls erforderlich. Messen Sie in allen Fällen die Peptidkonzentration vor der Injektion, überprüfen Sie die lineare Reaktion mit einem QC-Aufschluss und stimmen Sie die Last so ab, dass die chromatographische Peakform und die Identifikationstiefe ohne Überlastung erhalten bleiben.

Die markierungsfreie Quantifizierung mittels DIA ist in der Proteomik aufgrund ihrer Reproduzierbarkeit und Tiefe weit verbreitet⁴⁶. Im Zusammenhang mit Affinity-Capture-Experimenten wie diesem, bei denen das Ziel darin besteht, Proteine zu identifizieren, die mit Epichaperom-Gerüsten interagieren, anstatt die globale Proteinhäufigkeit zu messen, sind Normalisierungsstrategien wie MaxLFQ jedoch nicht geeignet. Diese Ansätze gehen von einer einheitlichen Eingabe und proteomweiten Ähnlichkeit aus, die durch den diesem Protokoll intrinsischen Anreicherungsschritt verletzt werden. Stattdessen liefern Intensitätswerte oder MS/MS-Spektralzählungen eine ausreichende und biologisch aussagekräftige Quantifizierung für die nachgelagerte Funktionsanalyse. Diese Metriken spiegeln die relative Interaktionsstärke oder Häufigkeit von Proteinen mit Epichaperomen unter verschiedenen Bedingungen wider. Wie in früheren Studien^gezeigt 16,17,18,20 eignen sich diese Werte gut für Interaktomanalysen auf Systemebene wie dfPPI, die veränderte biologische Signalwege identifizieren, ohne sich auf eine proteomweite Normalisierung zu verlassen. Durch die Beibehaltung der wahren biologischen Varianz, die durch Krankheit oder Behandlung eingeführt wird, ermöglicht die intensitäts- oder MS/MS-basierte Quantifizierung eine genaue und robuste Kartierung von PPI-Netzwerkdysfunktionen.

Obwohl die Affinitätserfassung den Suchraum im Vergleich zum gesamten Lysat reduziert, enthalten dfPPI-Pulldowns immer noch Hunderte bis Tausende von Proteinen, die einen breiten dynamischen Bereich abdecken, sowie co-angereicherten Hintergrund. Bei Vergleichen auf der Kohortenskala führt die stochastische Vorläuferauswahl von DDA zu fehlenden Werten und variabler Stichprobe von Interaktoren mit geringer Abundanz¹⁸. DIA fragmentiert systematisch alle Ionen in vordefinierten Fenstern und bietet so eine größere Tiefe, weniger fehlende Werte und höhere Reproduzierbarkeitseigenschaften von Lauf zu Lauf, die entscheidend sind, wenn die Downstream-Inferenz auf Pfad-/Netzwerkebene und nicht auf Einzelproteinebene erfolgt. Aus diesem Grund standardisieren wir DIA für dfPPI.

Wie bei allen Affinitätserfassungsmethoden ist die unspezifische Proteinbindung ein inhärenter Aspekt. Proteine können aufgrund von Klebrigkeit am Harz, hoher Häufigkeit oder Aggregation zurückgehalten werden. Während solche unspezifischen Interaktoren in dem Pull-down-Eluat auftreten können, untergräbt ihr Vorhandensein nicht das nachgelagerte analytische Ziel dieses Protokolls¹⁷. Der dfPPI-Workflow ist nicht darauf ausgelegt, binäre Wechselwirkungen zu definieren, sondern Muster der PPI-Neuverdrahtung auf Systemebene zu extrahieren. Funktionelle Anreicherungsanalysen werden an differentiellen Interaktoren durchgeführt und nutzen netzwerkbasierte Statistiken, um koordinierte Veränderungen auf Signalwegebene aufzudecken. Wie in früheren Arbeiten¹⁷ gezeigt, minimiert dieser Ansatz auf Systemebene die Auswirkungen isolierter unspezifischer Proteine und ermöglicht es, robuste biologische Schlussfolgerungen aus Daten auf Kohortenebene zu ziehen.

Im Vergleich zu herkömmlichen Interaktom-Mapping-Ansätzen wie Co-Immunpräzipitation, Proximity-Labelling oder Cross-Linking bietet die dfPPI-Plattform einen entscheidenden Vorteil: Sie erfasst das funktionelle Interaktom-Remodeling unter krankheitsrelevanten Bedingungen, ohne dass Bait Engineering oder Überexpression erforderlich sind. Da die Methode Proteinkomplexe isoliert, die um supramolekulare Epichaperome gebildet werden, erkennt sie emergente Proteinanordnungen, die in gesunden Systemen nicht vorhanden sind, und ermöglicht so die Entdeckung neuer Krankheitstreiber. Der Ansatz ist skalierbar und anpassungsfähig über Gewebe, Spezies und Krankheitszustände hinweg und hat bereits einzigartige Einblicke in den Proteom-Umbau bei Krebs und Neurodegeneration geliefert. Als solche bietet diese Methode ein leistungsfähiges Werkzeug, um funktionelle Netzwerke aufzudecken, die bei menschlichen Krankheiten gestört sind.

Abgesehen von den hier aufgeführten Beispielen ist dfPPI gut positioniert für (i) große klinische Kohorten, um Patienten nach Netzwerkdysfunktion zu stratifizieren und pharmakodynamische Biomarker zu entdecken, die über die Zielbindung und die Korrektur des Signalwegs berichten; (ii) Längsschnittstichproben (z. B. vor/nach der Therapie, Krankheitsstadien), um die Verläufe der Neuverdrahtung zu verfolgen und die Responder vorherzusagen; (iii) Integration mit Phosphoproteomik und anderen PTM-fähigen Omics, um Änderungen des Interaktionszustands mit der vorgelagerten Signalübertragung zu verknüpfen; (iv) ortsaufgelöste Fänge aus mikropräparierten Regionen (Tumor-Normal-Grenzflächen, Gehirnsubregionen) zur Kartierung der Pathobiologie des lokalen Netzwerks; (v) Störungsscreenings (genetisch oder zusammengesetzt), bei denen dfPPI-Messwerte verwertbare Knoten und Wirkmechanismen benennen; und (vi) Graphen-/KI-Modellierung, die krankheitsspezifische Netzwerkmerkmale aus dfPPI-Karten für die Prognose und das Therapiedesign lernt. Methodisch werden Miniaturisierung, Automatisierung (z. B. 96-Well-Formate) und standardisierte Qualitätskontrolle Hochdurchsatz-Pipelines für translationale Studien und klinische Studien ermöglichen. Schließlich können dfPPI-Outputs gezielte Follow-ups - AP-MS, XL-MS oder Proximity-Labelling - auslösen, um die Topologie priorisierter Module aufzulösen, was die Komplementarität der Methode innerhalb des Interaktomics-Toolkits unterstreicht.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
2-Mercapptoethanol	Sigma-Aldrich	M6250	Toxisch, Brennbar
Acetonitril (ACN) Optima	Fisher Scientific	A955-1	LC/MS-Klasse (entflammbar)
Affi-Gel 10 aktivierte Affinitätschromatographie-Medien	Bio-Rad	1536099	Verwendet zur Herstellung von PU-Perlen und Kontrollkugeln (entflammbar)
Ammoniumbicarbonat (ABC)	Sigma-Aldrich	09830-500G
Aurora Ultimate 25x75 C18 UHPLC-Säule	IonOpticks	AUR3-25075C18-CSI
Autoradiographischer Film	EWEN-PARKER X-RAY CORP	EBA45	Alternative zur chemilumineszenten Signalerkennung nach Western Blot
Biomasher Mikrogewebehomogenisator	DWK Life Sciences Kimble	7496250010	Verwendet zur Homogenisierung von eingefrorenem Gehirngewebe zur Proteinextraktion
Bromophenolblau	Fisher-Bioreagenz	BP115-25
Zentrifuge für 1,5-mL-Röhren	Eppendorf	5424
Zentrifuge für 1,5-mL-Röhren;	Eppendorf	5417R	Mit Temperaturregelung
Zentrifuge für 15-50 mL Röhren	Eppendorf	5810R	Verwendung für konische Röhren
ChemiDoc MP Bildgebungssystem	Bio-Rad	17001402	Verwendet für die Gel-/Blot-Densitometrie
Säulenofen	Sonation GmBH, Deutschland	ES071/ES072	Hält die nanoLC-Säule bei 50 °F aufrecht; C für konsistente Retention
Konische Röhren (15 mL)	Fisher Scientific	352096
Kontrollkugeln	Chiosis-Labor	N/A	Taldone et al. (PMID:  21459002)
Coomassie G-250 Beize (Bio-sicher)	Bio-Rad	1610786
Dunkle Eppendorf-Röhren (1,5 mL)	USA Scientific	1415-2507
Dithiothreitol (DTT)	Roche	10197777001	Aufreizend
Easy nLC 1000	Thermo Fisher Scientific	Easy nLC 1000	LC-System verwendet mit Q Exactive HF
Empore Festphasen-Extraktionsscheiben	3M-Kompanie	2215-C18 (Oktadecyl)	Verwendet zur Herstellung von StageTips zur Peptidentsalzung; Aktiviert mit 100 % Methanol
Verbessertes Chemilumineszenz-(ECL)-Kit	Thermo Fisher Scientific	32209
Eppendorf-Röhren (1,5 mL)	Fisher Scientific	05-408-129
Ameisensäure (FA) Optima	Fisher Scientific	A117-10X1 AMPERE	LC/MS-Grad
g:Profiler (e111_eg58_p18_f463989d)	BIIT Group-Tartu & Uuml; Likool	https://biit.cs.ut.ee/gprofiler/gost	Pfadanreicherung
Glycerin	Fisher-Bioreagenz	BP229-1	Molekularbiologie-Bewertung
Glycin	Fisher-Bioreagenz	BP381-5	Kristallines Pulver
Ziegen-Maus-Anti-Maus-HRP-konjugierte sekundäre Antikörper (RRID: AB_2619742)	Südliche Biotechnologie	1030-05	Sekundär für den H90-10-Antikörper
Ziegen-Anti-Kaninchen-HRP-konjugierter Sekundärantikörper (RRID: AB_2632593)	Südliche Biotechnologie	4010-05	Sekundär für die HSP90Α und HOP-Antikörper
Ziegen-Antiratten-HRP-konjugierte Sekundärantikörper (RRID: AB_2716837)	Südliche Biotechnologie	3030-05	Sekundär für den HSC70-Antikörper
Beheizter Orbitalshaker	Eppendorf	ThermoMixer C (2231001127)
HeLa-Proteinverdauung Standard-Pierce	Thermo Fisher Scientific	88329	Verwendet für die LC-MS QC-Bewertung
HOP-Antikörper (RRID: AB_10828378)	Zellsignalübertragung	5670	Für PU-Perlen QC
HSC70-Antikörper (RRID: AB_10617277)	Enzo	SPA-815	Für PU-Perlen QC
HSP90 (H90-10) Antikörper (RRID: AB_854214)	StressMarq	SMC-107	Für PU-Perlen QC
HSP90-Alpha-Antikörper (RRID: AB_303423)	Abcam	Ab2928	Für die Normalisierung gemäß Abschnitt 1.2
Menschliche Zelllinie: ASPC1 (RRID:CVCL_0152)	ATCC	CRL-1682	Kontrollzelllinie, Epichaperom-Low/Chaperon-High
Menschliche Zelllinie: MDA-MB-468 (RRID: CVCL_0419)	ATCC	HTB-132	Kontrollzelllinie, Epichaperom-High/Chaperon-High
ImageJ (v1.54p)	Wayne Rasband	https://imagej.net/ij/	Densitometrie
Iodoacetamid (IAA)	Sigma-Aldrich	I1149-5G	Giftig
Mikrozentrifugenröhren mit niedriger Proteinbindung	Sarstedt	72.706.600
Lys-C-Protease	Promega	VA1170	LC/MS-Grad
Magnesiumchlorid	Sigma-Aldrich	63068	Molekularbiologie-Bewertung
MaxQuant (v2.1.1.0)	Max-Planck-Institut für Biochemie	https://www.maxquant.org/	MaxDIA-Workflow für Peptid-/Protein-Identifikation und labelfreie intensitätsbasierte Quantifizierung
Methanol	Fisher Chemical	A454-4	HPLC-Qualität, brennbar, giftig
Mini Protease Inhibitor Cocktail Tablett (vollständig)	Roche	4693124001
Mini Trans Blot Elektrophoretische Transferzelle	Bio-Rad	1703930
Mini-Gel-Elektrophorese-Tank	Thermo Fisher Scientific	A25977	Verwendet für Novex-Fertiggele
Mini-PROTEAN Tetra Vertikale Elektrophoresezelle	Bio-Rad	1658004	Verwendet für Mini-PROTEAN Precast Protein Gels oder handgegossene Gele
Mini-PROTEAN  TGX Precast Protein Gels (4 & Dash; 20%)	Bio-Rad	4561094
NanoDrop	Agilent	BioTek Synergy H1	Verwendet zur Abschätzung der Peptidkonzentration vor der LC-MS-Injektion
NanoElute 2	Bruker	https://flextra.hu/images/keszulekek/daltonics/nanoelute-brosura_eng.pdf	Verwendung im diaPASEF-Arbeitsablauf
Nanospray Flex Quelle	Thermo Fisher Scientific	ES071	Für Nanospray-ESI-Kopplung
Neues Ziel PicoTip Emmiter/PicoFrit SELF/P	New Objective Inc.	PF360-75-10-N-5	Gefüllt mit C18-Schlamm bis zu 20 cm Länge
Nitrocellulosemembran	Cytiva Amersham	10600006
Fettfreie Trockenmilch	Laborwissenschaft	M0841
Novex 8 % Tris-Glycine Fertiggele	Thermo Fisher Scientific	XP00080BOX
NP-40	Roche	11754599001
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)	Gibco	10010023
PhosSTOP Phosphataseinhibitor-Cocktail-Tablette	Roche	4906837001
Pierce BCA Protein-Assay-Kit	Thermo Fisher Scientific	23225
Plastikbehälter	Fisher Scientific	FB0875711A
Bahnsteig-Kippe	Corning	6705
Kaliumchlorid	Fisher-Bioreagenz	BP366-1	Weiße Kristalle
PowerPac Universalstromversorgung	Bio-Rad	1645070
Precision Plus Protein Kaleidoscope Vorgefärbter Proteinstandard	Bio-Rad	1610375
PU-Beads	Chiosis-Labor	N/A	Taldone et al. (PMID:  21459002)
Q Exaktives HF-Orbitrap-Massenspektrometer	Thermo Fisher Scientific	https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/CMD/brochures/BR-64052-LC-MS-Q-Exactive-HF-Orbitrap-BR64052-EN.pdf	Verwendung für DIA-MS
ReproSil-Pur 120 C18-AQ, 3 & Micro; m	Dr. Maisch GmbH, Deutschland	R13.aq	Siliziummedium zur Peptidtrennung; Schlamm aus Pulver/Methanol (1:3, V/V)
Rotationseinheit (End-over-End-Rotator)	Barnstead  International	400110
Sep-Pak C18 Patronen (100 mg)	Waters Corporation	WAT023590
Natriumdodecylsulfat (SDS)	Fisher-Bioreagenz	BP166-500	Elektrophorese-Grad
Sonicator	Branson	2510
SpectraMax Paradigm Multi-Mode-Mikroplattenleser	Molekulare Bauelemente	SpectraMax-Paradigma
Spectronaut	Biognosys	https://biognosys.com/software/spectronaut/	directDIA-Arbeitsablauf
SpeedVac-Konzentrator	Thermo Fisher Scientific	Savant SPD111V
Saugvakuum	Kardinalgesundheit	CDL-65651-320
TimsTOF HT-Massenspektrometer	Bruker	https://www.bruker.com/en/products-and-solutions/mass-spectrometry/timstof/timstof-ht.html	Verwendung für die DiaPASEF-Analyse
Trifluoressigsäure (TFA) Optima	Sigma-Aldrich	T6508-10AMP	LC/MS-Qualität (korrosiv, brennbar)
Tris	Fisher-Bioreagenz	BP152-5	Kristallines Pulver; Molekularbiologie-Bewertung
Tris, pH 6,8 (1 M)	Teknova	T1068
Tris, pH 7,5 (1 M)	Fisher-Bioreagenz	BP1757-500	Molekularbiologie-Bewertung
Tris-gepufferter Kochsalzlösung (20x TBS) Puffer	VWR, Lebenswissenschaften	97064-338
Tris-Glycin-SDS (TGS 10x) laufender Gelpuffer	Fisher-Bioreagenz	BP13414	Elektrophorese
Trypsin	Promega	V5111	Sequenzierungsgrad
Trypsin Gold	Promega	V5280
Tween 20	Fisher-Bioreagenz	BP337-100
Harnstoff	Sigma-Aldrich	U0631-500G
Wirbel	Fisher Scientific	02-215-414
Wasser	Fisher Scientific	W6-1	LC/MS-Grad