Das Stroke Preclinical Assessment Network Multi-Labormodell des thromboembolischen Schlaganfalls mit Thrombolyse: TE-MCAo

Zusammenfassung

Zur Simulation eines thromboembolischen Schlaganfalls wurden Embolien, die aus heterologem Rattenblut hergestellt wurden, in die mittlere Großhirnarterie injiziert, gefolgt von der Verabreichung einer systemischen Thrombolyse zur Rekanalisation. Diese Version des Modells ist für den Einsatz in einem Multilabornetzwerk optimiert und unterstützt das Testen mehrerer Kandidatentherapien.

Zusammenfassung

Aktuelle translationale Nagerschlaganfallmodelle induzieren mittelmäßige Arterienverschlüsse (MCAo) mittels durch Nylonfilamente, injizierte Embolien, intraluminales Thrombin oder perivaskuläres Endothelin-1, um einen menschlichen Schlaganfall zu simulieren. Unter diesen Methoden ahmt die Thromboemboli-Injektion gefolgt von Thrombolyse die neuroinflammatorischen Ereignisse bei menschlichen Patienten am besten nach und ist möglicherweise der am häufigsten verwendeten inerten Nylonfilamentmethode vorzuziehen. Die standardmäßigen thromboembolischen Modelle, die in führenden Einzellaboren verwendet werden, können jedoch zeitaufwendig sein, variable Ergebnisse liefern und erfordern erhebliche Fähigkeiten zur Beherrschung. Um diese Einschränkungen zu beheben, entwickelten wir ein thromboembolisches MCAo-Modell, das auf die Gefäßverschlüsse abzielt und eine intravenöse Thrombolyse nutzt, um eine Rekanalisation zu erreichen, parallel zur systemischen Thrombolyse in klinischen Szenarien. Um die Anzahl der Tiere zu reduzieren, entwickelten wir eine Methode, um Blut von Spendertieren für spätere Embolienpräparation für mehrere Probanden zu lagern. Unsere Verwendung vorgefertigter Doccol-Mikrokatheter vereinfacht die Thrombusvorbereitung und -injektion, indem Thromboemboli in die Mikrokatheter vorgeladen werden, die dann in die innere Halsschlagader eingeführt werden. Um eine Rekanalisation zu erreichen, haben wir intravenöses Tenecteplase mit einer Dosis von 1,5 mg/kg injiziert. Um die Reproduzierbarkeit zu fördern, haben wir Standardarbeitsanweisungen, Schulungsvideos und praktische chirurgische Schulungsworkshops vorbereitet und im Feld getestet. Das Modell verwendet einen standardisierten chirurgischen Ansatz, der allen Forschern, die das weithin akzeptierte Nylonfilamentmodell verwenden, vertraut sein sollte. Der Durchgang des Mikrokatheters in die distale innere Carotisarterie, wobei die Pterygopalatinarterie vermieden wird, erfolgt ähnlich wie beim Einführen von Nylonfilamenten. Erholungs- und Nachschlaganfallbeurteilungen können mit typischen Verhaltens-, Röntgen- und histologischen Protokollen durchgeführt werden. Dieses Modell bietet einen praktischen, reproduzierbaren und zugänglichen Ansatz für Forscher, die ein thromboembolisches MCAo-Modell mit kontrollierter Rekanalisation suchen.

Einleitung

Schlaganfall ist weltweit eine der führenden Todes- und Behinderungsursachen¹. Viele Patienten profitieren von einer intravenösen Thrombolyse, und ausgewählte Patienten profitieren von einer mechanischen Thrombektomie. Da nicht alle Patienten rechtzeitig zur Thrombolyse oder Thrombektomie ins Krankenhaus kommen und nicht alle Patienten von einer vollständigen Genesung profitieren, besteht ein erheblicher Bedarf an weiterer Entwicklung zusätzlicher oder zusätzlicher zerebroprotektiver Therapien. Das am weitesten verbreitete Modell des ischämischen Schlaganfalls bei Nagetieren ist die Monofilament-Okklusion der mittleren Hirnarterie (MCA), gefolgt von vollständiger Reperfusion. Dieses Modell simuliert Large Vessel Occlusion (LVO) und modelliert Patienten mit großen Schlaganfällen, die sich einer erfolgreichen vollständigen mechanischen Thrombektomie unterziehen. Dieses Modell erfasst jedoch einen kleinen Prozentsatz der klinischen Schlaganfälle. Im Gegensatz dazu erleiden mehr Patienten thromboembolische Schlaganfälle infolge von Atherosklerose (in situ atherosklerotischer Plaque-Ruptur oder Atheroembolien infolge systemischer Erkrankung) und werden ausschließlich mit systemischer Thrombolyse behandelt, die das Nylonmodell nicht replizieren kann ^2,3. Außerdem fehlt dem Nylonfilament-MCAo-Modell die entzündliche Kaskade, die mit der thrombotischen Okklusion ^4,5 verbunden ist. Tiermodelle mit Thromboemboli gefolgt von systemischer thrombolytischer Verabreichung würden die Pathophysiologie und grundlegende Biologie widerspiegeln, die bei vielen Schlaganfallpatienten^{vorkommt 4,6}. Bislang sind jedoch Modelle von Thromboembolischen Schlaganfällen bei Nagetieren als komplex und schwer nachzubilden. In isolierten Laboren mit spezialisierten Experten kann ein thromboembolisches Modell mit angemessener Reproduzierbarkeit erreicht werden. Ein solches Modell eignet sich nicht leicht für eine breite Anwendung, wie es bei Multi-Labor-Projekten erforderlich ist.

Hier stellen wir detaillierte Protokolle für eine aktualisierte und standardisierte thromboembolische Okklusion der mittleren Zerebralarterie (TE-MCAo) gefolgt von einem systemischen Thrombolysemodell bereit. Konkret vereinfachten wir die Thrombuspräparation, standardisierten die Thrombusbelastung in Katheter und validierten die Skalierbarkeit dieses Modells für Multilaborstudien. Wir entwickelten dieses Modell für den Einsatz im Stroke Preclinical Assessment Network (SPAN). Wir beabsichtigten jedoch, dass das Modell für jedes Netzwerk nützlich sein soll, das umfangreiche präklinische Netzwerkstudien mit neuen, Kandidatenbehandlungen durchführen möchte. Mit unserem standardisierten Modell konnten wir während des Studienzeitraums TE-MCAo in 6 Ratten pro Tag und Studienstandort induzieren.

SPAN und ähnliche Netzwerke sind als Reaktion auf wiederholte und anhaltende Versäumnisse gewachsen, vielversprechende Zerebroprotektantia aus dem präklinischen Umfeld in den klinischen Praxiserfolg zu übertragen⁷. Im Jahr 2019 initiierten die National Institutes of Neurological Disorders and Stroke (NINDS) SPAN⁸. SPAN zielt darauf ab, potenzielle Therapeutika effektiver zu screenen, indem Verzerrungen durch zentrale Maskierung, Randomisierung und automatisierte zentrale Ergebnisanalyse minimiert werden. SPAN 1 verwendete das Nylonfilamentmodell in seinen ersten beiden Versionen, da alle teilnehmenden Labore es bereits verwendeten, und es war einfach, 9 einzusetzen^. Um viele Aspekte von Thromboembolie und Thrombolyse getreuer zu modellieren, versuchte SPAN, das hier beschriebene TE-MCAo-Modell zu entwickeln. Dieses Modell wäre hilfreich für präklinische Chirurgen, die vom Nylonfilamentmodell auf das TE-MCAo-Modell umsteigen. Wir empfehlen, dass präklinische Labore 24/48 Stunden nach MCAo (oder TE-MCAo) mit einer bildgebenden Technik, z. B. Magnetresonanztomographie (MRT), das Vorhandensein eines Schlaganfalls bestätigen.

Das SPAN-Netzwerk wurde in früheren Studien⁹ vollständig beschrieben, und alle SPAN Standard Operating Procedures (SOPs) sind auf der SPAN-Website verfügbar. Kurz gesagt wird das Netzwerk von einem Koordinierungszentrum (CC) verwaltet, das die Arzneimittelverteilung, die Qualitätskontrolle der Daten, die Überprüfung der Protokolleinhaltung und die Netzwerkkommunikation übernimmt. Alle SOPs werden vom CC entworfen und nach Überprüfung von einem Lenkungsausschuss genehmigt. Bei SPAN erhalten alle Nagetiere bei Ankunft in den Forschungslaboren ein MRT-kompatibles, mit Barcode versehenes Ohrentag, und alle Probanden werden in die SPAN Research Electronic Data Capture (REDCap)-Datenbank registriert. Die Tiere werden vom CC mit Randomisierungstabellen randomisiert, die nach Standort und Geschlecht geschichtet sind. In SPAN 1 und SPAN 2 wurden mutmaßliche Therapeutika in sechs teilnehmenden Forschungslaboren auf ihre Wirksamkeit untersucht. Alle Testmedikamente wurden in identisch aussehenden Fläschchen verpackt, im Koordinierungszentrum beschriftet und zu Beginn des Projekts an Forschungslabore geliefert.

Protokoll

Alle teilnehmenden SPAN-Labore, einschließlich des Koordinierungszentrums an der USC, folgten den NIH- und AAALAC-Richtlinien für die humane und ethische Behandlung von Tieren. Die Genehmigung der lokalen IACUC wurde an allen Standorten eingeholt.

1. Thrombusvorbereitung

HINWEIS: Sämtliches Blut und Thrombus sollten gemäß allen lokalen institutionellen Richtlinien für Biohazards behandelt werden. Alle Materialien, die mit Blut in Kontakt kommen, sollten entweder als biologisch gefährlicher Abfall entsorgt oder – im Fall chirurgischer Instrumente – gründlich mit einem Autoklaven gereinigt und desinfiziert werden. Um den Einsatz von Blutspendertieren in dieser Studie zu reduzieren, entwickelten wir eine Methode zur Lagerung von Spenderblut, um bei Bedarf Thromboemboli herzustellen.

1. Frisches Spenderblut aus einer Arterie entnehmen Sie in ein 1,5-mL-Mikrozentrifugenrohr oder pädiatrische Ethylendiamin-Tetra-Essigsäure (EDTA)-Mikroröhren, die nur bis zum 500-μL-Niveau gefüllt werden.
   HINWEIS: Wir bevorzugen eine Femoralarterienkanüle für unsere Blutentnahmen, da die Oberschenkelarterie einen großen luminalen Durchmesser hat, der eine Katheterisierung ermöglicht, sie beidseitig ist und zwei separate Blutabnahmen ermöglicht, und es ist eine überlebensfähige Operation für die Nagetiere. Blut kann nach unserer Erfahrung bei 4 °C für 4 Wochen gelagert werden.
2. Fügen Sie 1 ml CaCl2-Lösung₍ 5 mg/mL) zu 500 μL des gespeicherten, antikoagulierten Blutes hinzu.
3. Unmittelbar nach der Umkehrung der Antikoagulation mit CaCl₂ wird Blut aus dem Mikrozentrifugenröhrchen mit sanfter Absaugung in einen 100 cm langen PE-50-Schlauch aspiriert.
   HINWEIS: Eine Verzögerung führt zu einer Blutgerinnung, bevor es in den PE-50-Schlauch aufgenommen werden kann.
4. Inkubieren Sie das gewickelte Rohr in vorerwärmtem phosphatgepuffertem Kochsalzlösungszustand (PBS) bei 37 °C für 2 Stunden in einem Tischofen.
   HINWEIS: Das Platzieren der Petrischale auf einer offenen Heizplatte führt aufgrund ungleichmäßiger Wärmeverteilung zu einem inkonsistenten Ergebnis.
5. Am Ende der 2-stündigen Inkubation wird das blutgefüllte PE-50-Rohr sofort auf 4 °C zur Lagerung übertragen. Sie bleibt für die nächsten Schritte zwischen 20 und 72 Stunden nutzbar.

2. Katheterbelastung

1. Schließen Sie das aufgewickelte PE-50-Rohr (Innendurchmesser: 0,58 mm) an eine 3- oder 5-cm³-Spritze mit Kochsalzlösung an und stoßen Sie den Thrombus vorsichtig in eine Petrischale mit PBS aus.
   HINWEIS: Dies kann erhebliche Gewalt erfordern. Halte den Druck auf die Verbindungsstelle zurück, damit Katheter und Spritze beim Extrudieren nicht gelöst werden. Der PE-50-Katheter kann bei Bedarf in kleinere Segmente (10–50 cm) geschnitten werden, um die Extrudion zu erleichtern.
2. Schneiden Sie Thrombusabschnitte von etwa 6 cm Länge mit einer Rasierklinge ab.
3. Waschen Sie jedes Thrombussegment, indem Sie es vorsichtig in einen PE-50-Katheter ziehen und fünfmal vollständig ausstoßen.
4. Waschen Sie anschließend den Thrombus, indem Sie ihn vorsichtig in einen PE-10-Katheter (Innendurchmesser: 0,279 mm) ziehen und ihn 15 Mal vollständig ausstoßen.
   HINWEIS: Wenn während dieses Schritts häufige Brüche auftreten, sollten Sie eine Vergrößerung mit einem Operationsmikroskop oder einer chirurgischen Lupe verwenden, um sicherzustellen, dass der Thrombus in einer Linie mit der Katheteröffnung aspiriert wird.
5. OPTIONAL: Evan's Blue verwenden, um Thromben zu visualisieren
   1. Bereite 4 % Evan's Blue in 1x PBS-Lösung vor.
   2. Geben Sie 200 μL des 4%igen Evan's Blue in eine Petrischale mit 10 ml 1x PBS. Dies wird die konzentriertere Lösung = Evans blaue Verdünnung #1 sein.
   3. Nimm 400 μL Evan's Blue Dilution #1 und vermische sie in eine separate Petrischale, gefüllt mit 20 ml 1x PBS. Dies ist eine verdünnte Lösung von Evans Blue = Evan's Blue Dilution # 2.
   4. Geben Sie das Gerinnsel für 1 Sekunden in die konzentriertere Evan's Blue Petrischale (Verdünnung #1) und übertragen Sie sie dann in die verdünnte Evan's Blue Petrischale (Verdünnung #2).
6. Laden Sie einen gewaschenen Thrombus in vorgefertigte Mikrokatheter (Innendurchmesser: 0,2 mm, Außendurchmesser: 0,360 mm, Länge: 300 mm, verbunden mit einem weiblichen Luer-Lock) ohne Luftembolien mit der Nass-zu-Nass-Methode.
   HINWEIS: Wir empfehlen für diesen Schritt eine Vergrößerung (z. B. 2,5-fache Luppen).
7. Sobald der Thrombus vollständig geladen ist, extrudieren Sie genügend Thrombus, sodass genau 5,0 cm im Mikrokatheter verbleiben. Schneiden Sie den Überschuss mit einer Rasierklinge ab.
   HINWEIS: Die Länge des belasteten Thrombus kann je nach Größe des gewünschten Schlags auf verschiedene Anwendungen angepasst werden.
8. Markieren Sie den Mikrokatheter 16 mm von der Spitze entfernt, um das Ausmaß des Katheters zu markieren, das intraluminal über die Bifurkation der Halsschlagader hinausgetragen werden soll.

3. Tierchirurgie und Anästhesie

1. Anästhesie mit 4 % Isofluran in einer 30:70 Sauerstoff-Distickstoff-Mischung induzieren und die Anästhesie mit 1–2 % Isofluran im gleichen Gasgemisch aufrechterhalten.
2. Geben Sie Analgetika Carprofen 5 mg/kg subkutan und Atropin 0,05 mg/kg intraperitoneal, um das Tierkomfort intraoperativ zu gewährleisten.
   HINWEIS: Viele Chirurgen infundieren die Schnittstelle mit 1,0 ml Bupivakain (2,5 mg/mL).
3. Halten Sie die Körpertemperatur während der gesamten Operation bei 37 ± 0,5 °C mit einem Heizkissen, das mit einer rektalen Temperatursonde gesteuert wird.

4. Entnahme von Spenderblut

1. Sammeln Sie das Spenderblut mittels Femoralarteriekatheterisation. Das biologische Geschlecht des Spenders und der Empfänger abzustimmen.
2. Wenn Blut am selben Tag verwendet werden soll:
   1. Bereite drei 1,5-mL-Zentrifugenröhren vor. Markiere jede Röhre bei 500 μL mit einem unauslöschlichen Laborstift.
   2. Bereiten Sie drei Sätze PE-50-Rohre vor, jeweils 100 cm lang, die mit einer 23-Gauge-Stumpfnadel an eine 1,0-ml-Spritze angeschlossen sind.
3. Wenn Blut für die spätere Verwendung gespeichert werden soll, bereiten Sie sechs pädiatrische EDTA-Mikroröhren vor. Lockere die Kappen, damit sie später leichter verwendet werden können.
4. Bereiten Sie ein 10,0 cm langes PE-50-Rohr vor, das an einem Ende mit einer gummibedeckten Klemme geklemmt und am anderen Ende stumpf abgeschrägt ist.
   1. Um eine gummibeschuhte Klemme herzustellen, setzen Sie eine Zapfe einer Standard-hämostatischen Klemme in das PE-100-Rohr ein und trimmen Sie es passend. Wiederholen auf der anderen Seite.
   2. Um den PE-50 stumpf zu gestalten, schneiden Sie zuerst das Ende in einem abgeschrägten Winkel ab. Dann schneide ich die Spitze der Fasenspitze mit einer Mikroschere ab.
      HINWEIS: Es ist wichtig, dass die Spitze entfernt wird, um eine Durchbohrung der Rückwand der Arterie nach dem Einsetzen zu vermeiden, aber wenn zu viel von der Spitze entfernt wird, erschwert der Verlust des Abschrägungseffekts das intraluminale Einsetzen des Katheters sehr stark.
5. Führen Sie einen Standardschnitt an der Oberschenkelarterie durch.
6. Bereite das Tier vor (rasiere den inneren Oberschenkelbereich), positioniere es in dorsaler Rückenliegende auf dem Operationstisch. Sterilisieren Sie die Haut mit 3 Waschphasen mit 70 % Ethanol, gefolgt von einer Wäsche mit Betadin oder einer anderen antiseptischen Lösung.
7. Sichern Sie die Hinterbeine gespreizt mit weichen Fesseln.
8. Machen Sie einen vertikalen Schnitt an der Innenseite des Oberschenkels von etwa 1,5–2 cm Länge entlang der natürlichen Falte des Leistenschnitts mit dem Bein. Dieser Schnitt ist orthogonal zum erwarteten anatomischen Verlauf der Oberschenkelarterie.
9. Mit stumpfer Dissektion seziert man vorsichtig bis zu den Oberschenkelgefäßen. Trennen Sie vorsichtig die Oberschenkelarterie von der Vene und dem Nerv, die im selben Bündel verlaufen.
10. Distal verschließen Sie die Oberschenkelarterie mit einer 5-0-Seidenligatur und verwenden Sie die Enden der Naht, um distal mit Hämostaten eine leichte Spannung zu erzeugen.
11. Skelettisieren Sie die Femoralarterie so weit wie möglich proximal und verfolgen Sie die Arterie bis zu ihrem retroperitonealen Ursprung. Führe locker eine 5-0-Seidenschlaufe um die Oberschenkelarterie und benutze die Schwänze erneut, um sanfte Spannung am proximalen Ende der Arterie zu erzeugen. Zieh den Seidenknoten an dieser Stelle nicht fest. Diese Spannung sorgt für eine Hämostase, nachdem die Arteriotomie durchgeführt wurde.
    HINWEIS: Die Schleife kann mit einer Aneurysmaklemme weiter proximal bewegt werden.
12. Etwa zwei Drittel der Entfernung von der proximalen Nahtschleife legt man ein Stück Seidennaht unter die Arterie und führt mit einer Mikroschere eine kleine Arteriotomie distal zur losen Naht durch. Die lose Naht wird nach der Kanulation festgebunden, um den intraluminalen Katheter zu sichern.
13. Mit scharfer Pinzette hebt man die obere Öffnung der Arteriotomie an und führt den stumpfen, abgeschrägten Katheter in die Öffnung ein. Schieben Sie den Katheter so weit proximal wie möglich vor.
    HINWEIS: Zwischen dem Katheter und der inneren Gefäßwand kann Reibung auftreten. Zwei Dinge können dabei helfen: 1) Die Außenseite des Katheterendes mit seröser Flüssigkeit von der Innenseite des Beins bedecken, kurz bevor sie ins Gefäß eingeführt wird, und 2) mit stumpfen, rilligen Zangen, um die Außenseite des Gefäßes zu halten und gleichzeitig den Katheter vorzuschieben. Das verhindert, dass das Gefäß einfach zusammen mit dem Katheter vorrückt.
14. Sobald die Spitze des Katheters fast bis zur proximalen Schleife vorgeschoben wurde, entlasten Sie die Spannung von den Enden dieser Naht. Blutungen sollten durch die enge Passform des Katheters im Gefäß verhindert werden.
15. Schieben Sie den Katheter so weit vor, dass die lose Schleife, wenn sie festgezogen wird, den Katheter umschließt. Ziehen Sie die Naht vorsichtig fest und achten Sie darauf, dass die Naht nicht so festgezogen ist, dass der Katheter verstopft wird. Achten Sie außerdem darauf, dass die Naht nicht am Abschrägen des Katheters liegt, da dieses Kathetersegment konisch zuläuft.
16. Löse die gummibedeckte Klemme. Der Katheter sollte sich sofort mit Blut füllen.
17. Füllen Sie die offenen Zentrifugenröhren oder die pädiatrischen EDTA-Mikroröhren und geben Sie in beide Sammelbehälter nicht mehr als 500 μL auf.
18. Sobald die Mikroröhren gefüllt sind, entfern Sie den PE-50-Katheter aus der Oberschenkelarterie, ligatizieren Sie das proximale Ende und schließen Sie den Schnitt mit einer unterbrochenen 5-0-Prolennaht.
19. Wenn später Blut verwendet werden soll, setzen Sie die Kappen auf die gefüllten pädiatrischen EDTA-Schläuche und lagern Sie sie bei 4 °C.
20. Wenn der Thrombus für die Anwendung am selben Tag vorbereitet werden soll, fahren Sie zu Schritt 1.2 oben fort.
21. Wiederholen Sie das sofort mit den verbleibenden Zentrifugenröhren.
22. Arterielle Blutspender können nach der Erholung von der Anästhesie wieder ins Vivarium zurückkehren, wenn eine einseitige Katheterisierung durchgeführt wurde. Die kontralaterale Oberschenkelarterie könnte später katheterisiert werden, aber nach einer beidseitigen Femurarterienkatheterisation sollten die Spender gemäß den IACUC-Vorschriften eingeschläfert werden.

5. TE-MCAo

HINWEIS: Der TE-MCAo-Ansatz verwendet den standardmäßigen Schnitt auf der Halsschlagader der Halsschlagader. Die Wahl der Narkose und der Reduktionsansatz liegt beim Nutzer. Das Protokoll beginnt hier an dem Punkt, an dem der Chirurg bereits die arteriöse Halsschlagader (CCA), die arterie carotis interna (ICA) und die arterie arteria carotis external (ECA) isoliert hat.

1. Decke die CCA frei und ziehe sie mit einer 3-0 Seidenligatur zurück. Mach dasselbe für die ECA und die ICA.
2. Mit einer Ligatur oder Kauterisation wird die Okzipitalarterie freigelegt und verschlossen.
3. Die Arterie pterygopalatine (PPA) freilegen und zurückziehen oder verschließen.
   HINWEIS: Mit genügend Erfahrung kann dieser Schritt ausgelassen werden. Wir empfehlen, diesen Schritt beim Erlernen des Verfahrens immer durchzuführen.
4. Mit sanftem Rückzug bewegen Sie ECA und ICA in eine "T"-Konfiguration.
5. Binden Sie die CCA-Ligatur erst ab, nachdem alle oben genannten Schritte abgeschlossen sind.
6. Führe eine Arteriotomie in der ECA (Zea Longa CCA Open Methodology¹⁰) mit Mikroschere durch.
7. Mit der in Schritt 4.4.2 beschriebenen stumpfen Fasenmethode bereitet man die Spitze eines der bereits belasteten Mikrokatheter vor (Innendurchmesser: 0,2 mm, Außendurchmesser: 0,360 mm, Länge: 300 mm, verbunden mit dem weiblichen Luer-Lock).
8. Führen Sie vorsichtig den Mikrokatheter mit vorgeladenem Thrombus in den ECA ein. Lockern Sie die ICA-Begrenzungsschleife und schieben Sie den Mikrokatheter intrakraniell auf 16 mm an der Karotisbifurkation unter direkter Visualisierung, um eine unbeabsichtigte Kanulierung der extrakraniellen PPA zu vermeiden.
   HINWEIS: Wenn der Katheter bevorzugt, in den CCA einzutreten, kann sanfter Druck mit einem spitzen Baumwollspitzenapplikator helfen, den vorrückenden Katheter in den ICA zu orientieren.
9. Befestigen Sie den intraluminalen Mikrokatheter mit 3-0 Seide an ICA und CCA und achten Sie darauf, nicht zu stark anzuziehen.
10. Injizieren Sie 20 μL mit einer motorisierten Spritzenpumpe mit einer Geschwindigkeit von 10 μL/min für eine Dauer von 2 Minuten.
    HINWEIS: Typischerweise bewegt sich die Spritzenpumpe zunächst nicht, bis ausreichend Druck aufgebaut ist.
11. Injizieren Sie zusätzlich 20 μL sterile Kochsalzlösung mit denselben Pumpeneinstellungen.
    HINWEIS: Während der Untersuchung des Blutflusses mittels Laser-gesprenkelten Bildgebung fanden wir 100 % Erfolg mit einer 20-μL-Spülung.
12. Entfernen Sie den Mikrokatheter und verbinden Sie die ECA dauerhaft mit einer Naht proximal zur Arteriotomiestelle. Entfernen Sie alle Fixierschleifen. Achten Sie sorgfältig auf Blutverluste und sichern Sie bei Bedarf zusätzliche Ligaturen.
13. Schließen Sie den Hautschnitt vorübergehend mit Klammern oder einer laufenden 5-0-Prolenennaht.
14. Nehmen Sie das Tier aus der Narkose und setzen Sie es in einen warmen Erholungskäfig.
15. Optional: Labore können Laser-Doppler-Flowmetrie verwenden, um eine erfolgreiche MCA-Verschlussmessung zu bestätigen. Alternativ kann die Magnetresonanztomographie bei 24 oder 48 Stunden durchgeführt werden, um einen Hirninfarkt zu bestätigen und zu quantifizieren.
    HINWEIS: Viele Nutzer bevorzugen es, am Abschluss der Operation 1,5 ml Kochsalzlösung oder laktierte Ringer-Lösung subkutan zu verabreichen.

6. Systemische Thrombolyse

HINWEIS: Tenecteplase (TNK, 1,5 mg/mL) kann für den Einsatz als systemische Thrombolyse erworben werden. Nutzer bevorzugen möglicherweise andere lytische Mittel. Einzelne 50-mg-Fläschchen werden mit 50 ml destilliertem Wasser rekonstituiert, und anschließend werden 2,5 ml präzise in 3,0-ml-Fläschchen aliquotiert. Die Aliquots können bei -20 °C eingefroren werden, um später verwendet zu werden. Die Stabilität eines rekonstituierten rekombinanten Gewebe-Plasminogenaktivators, der bei -20 °C gelagert wird, beträgt 60 Tage¹¹.

1. Für jedes Subjekt ein eingefrorenes Aliquot von TNK auftauen. Tau etwa 15 Minuten bei Zimmertemperatur auf.
2. Mit einer 1 ml Spritze nehmen Sie genau 1,5 mg/kg ab. Zum Beispiel benötigt eine 300-g-Ratte 0,45 mg.
3. Betäuben Sie das Tier erneut und entfernen Sie den temporären Hautverschluss.
4. Legen Sie jeden Ast der äußeren Jugularvene frei.
   HINWEIS: Die Schwanzvene könnte verwendet werden, wenn das Labor mit diesem Weg vertrauter ist. Wir bevorzugten die Vene Jugularis, da SPAN-Chirurgen mit der mobilisierten externen Jugularvene komfortabler sind und dies in unserem Filamentmodell routinemäßig durchgeführt wird.
5. Mit einer 30- oder 32-G-Nadel wird das TNK durch direkten Stich in die Vene verabreicht.
   HINWEIS: Anfangs möchten Nutzer die Ader zwischen 3-0 Seidenschlaufen isolieren. Mit Übung wird das nicht mehr nötig sein.
6. Schließen Sie den Schnitt mit unterbrochenem 5-0 Prolene oder einer anderen nicht resorbierbaren Naht.
7. Bringen Sie das Tier wie in Schritt 5.14 zurück in den Erholungs-Käfig.

7. Statistische Methoden

1. Für die Erstellung deskriptiver Statistiken verwenden Sie Mittelwert und Standardabweichung für normalverteilte numerische Daten sowie den Median- und Interquartilbereich für nicht-normalverteilte Daten. Stellen Sie kategoriale Daten als Frequenzverteilungen dar. Für die Hypothesenprüfung wenden Sie den t-Test oder ANOVA an, je nach Bedarf für normalverteilte parametrische Daten; Andernfalls führen Sie keine Hypothesentests durch.

Ergebnisse

Abbildung 1: Blutentnahme von Spendertieren und Thrombuspräparation. Das Blut wurde vom Spendertier durch eine Femoralarterienkatheterisation entnommen und in eine Mikrozentrifugenröhre mit (kann bis zu 4 Wochen gelagert werden) oder ohne EDTA (gleiche Tagesanwendung) übertragen. Zur Herstellung des Thrombos wurde Calciumchloridlösung in die gespeicherten Blutröhren gegeben und sofort in einen PE-50-Katheter aspiriert. Das aufgerollte PE-50-Rohr wurde in vorgewärmtem, phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) bei 37 °C für 2 Stunden in einem Tischofen inkubiert. Nach 2 Stunden wurde das mit Blut gefüllte PE-50-Rohr sofort auf 4°C zur Lagerung umgeladen. Weitere Informationen finden Sie in Abschnitt 1 des Protokolls. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 2: Thrombus in den Katheter zur Injektion einladen. (A) Am Tag der MCAo-Operation wurde ein Thrombus aus dem PE-50-Schlauch in eine Petrischale mit PBS extrudiert. (B) Auf der Petrischale wurde der Thrombus mit einer Rasierklinge auf etwa 6 cm Länge geschnitten. (C) Der Thrombus wurde mit PBS gewaschen, indem er in ein PE-50-Rohr gezogen, fünfmal ausgestoßen und dann 15 Mal in ein PE-10-Rohr ausgestoßen wurde. (D) Thrombus wurde in eine Petrischale mit konzentrierter Evan's Blue-Lösung übertragen. (E) Thrombus wurde in eine Petrischale mit verdünnter Evan's Blue-Lösung übergeben und in einen vorgefertigten Mikrokatheter geladen. (F) Der Mikrokatheter wurde durch die innere Halsschlagader der Ratte vorgeschoben, bis 16 mm von der Katheterspitze aus der Karotisbifurkation der Arterie Halsschlagader gemischt und mit einer motorisierten Spritzenpumpe injiziert wurden. Weitere Informationen finden Sie Abschnitt 2 im Protokoll. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen. 

In einer Pilotmachbarkeitsstudie nahmen wir 135 Probanden in 6 Forschungslaboren ein. Obwohl die Probanden auf eine von acht Behandlungen randomisiert wurden, berichten wir hier nur auf aggregierten Daten, um die Machbarkeit des Modells zu veranschaulichen. Von 135 eingeschriebenen Probanden wurde TNK in der richtigen Dosierung und zur richtigen Zeit bei 132 (98 %) verabreicht. Das MRT wurde 3 Tage nach TE-MCAo bei 102 (75 %) aufgrund des Tiertodes vor dem Scan in 33 (24 %) durchgeführt. Der Tierverlust vor Tag 3 war in allen 6 Laboren konstant (Tabelle 1), was darauf hindeutet, dass das Modell an mehreren Standorten eingesetzt werden kann. Die mittlere ± SD-Größe der Läsionen betrug 13 ± 16 % (der Läsionsbereich umfasst Ischämie und Ödem als Prozentsatz der ipsilateralen Hemisphäre) mit einigen Variabilitäten zwischen den Laboren (Tabelle 2). Repräsentative MRT-Bilder und postmortale Embolien sind in ergänzender Abbildung 1 zu sehen.

	Labor
Variable	AG	DK	IW	MG	SD	YL
Stichprobengröße (N)	23	30	11	28	24	19
MRT erledigt	19	24	9	23	14	13

Tabelle 1: Machbarkeit nach Labor. Die Studienlabore waren Augusta University (AG), Duke (DK), University of Iowa (IW), Massachusetts General Hospital (MG), University of San Diego (SD) und Yale University (YL). Die Anzahl der eingeschriebenen Tiere (N) und die Anzahl der überlebenden Tiere, die am Tag 3 nach dem Schlaganfall durchgeführt wurden, sind aufgeführt. Diese Daten unterstützen die Machbarkeit des Modells.

Standort	Stichprobengröße (N)	Läsionsvolumen (%) Mittelwert ± SD	Midline Shift Index (%) Mean ± SD
AG	19	11 ± 14	11 ± 12
DK	24	18 ± 17	19 ± 13
IW	9	08 ± 13	13 ± 12
MG	23	09 ± 11	15 ± 17
SD	13	14 ± 21	04 ± 19
YL	12	18 ± 22	14 ± 15

Tabelle 2: Volumen der Läsion, die bei den MRT-Scans am Tag 3 gesehen wurde, nach Standort. Um die Reproduzierbarkeit des Modells an sechs Studienstandorten zu belegen, wurden das Läsionsvolumen (Ischämie plus Ödem) und die Mittellinienverschiebung verglichen. Das Läsionsvolumen wird als flächenmäßiger Prozentsatz der ipsilateralen Hemisphäre angegeben. Mittellinienverschiebung wird als linearer Prozentsatz der maximalen Breite des intrakraniellen Raums angegeben. Die Daten bestätigen die Heterogenität zwischen den Laboren.

Ergänzende Abbildung 1: Repräsentative Bilder. (A-E) Verschiedene Multi-Echo-, Multi-Scan-(MEMS)-Bilder von Rattenhirnen, aufgenommen 48 Stunden nach TE-MCAo. Die Schnitte sind etwa 1 mm vor der Bregma ausgerichtet. (F-J) Mehrere Exemplare von Embolien, die am MCA-Ursprung abgelegt wurden. Bitte klicken Sie hier, um diese Abbildung herunterzuladen.

Diskussion

Wir verfeinerten das thromboembolische Nagetiermodell des ischämischen Schlaganfalls für den Einsatz in einem multilaboratorischen präklinischen Testnetzwerk, SPAN. Wir haben die Anzahl der verwendeten Tiere erheblich reduziert, indem wir eine Methode entwickelten, um Spenderblut für spätere Zwecke zu lagern. Wir haben außerdem die Vorbereitung von Thromboemboli und den chirurgischen Ansatz vereinfacht, um die Durchführung mehrerer MCAo-Eingriffe an einem Tag zu erleichtern. Unser Ziel ist es, dass der TE-MCAo das gleiche Maß an Benutzerkomfort und chirurgischen Volumina erreicht wie mit der weit verbreiteten Nylonfilamentversion des MCAo. Um dieses Ergebnis zu erzielen, haben wir zwei persönliche Chirurgen-Schulungen durchgeführt, und alle an dieser Studie beteiligten Chirurgen hatten bereits mehrere Monate, wenn nicht Jahre, Erfahrung mit dem standardisierten Filamentmodell. Wir haben die Machbarkeit in sechs verschiedenen Forschungslaboren nachgewiesen und eine ausgezeichnete Protokolleinhaltung festgestellt.

Bei der Entscheidung, dieses Protokoll umzusetzen, sollte ein Forscher die folgenden Punkte berücksichtigen, die den Erfolg des Protokolls bestimmen. Erstens beeinflusst sorgfältige Sorgfalt bei der Blutentnahme die erfolgreiche Thrombusbildung. Arterielles, nicht venöses, Blut sollte entnommen werden, um eine vorzeitige Gerinnung zu vermeiden. Zweitens ist es wichtig, mehr Blut zu sammeln, als nötig zu sein scheint. Manchmal kann ein Exemplar über Nacht nicht thrombosieren, während die anderen es tun. Drittens empfehlen wir dringend, die Katheterfüllung mit optischer Vergrößerung durchzuführen, entweder chirurgische Loupes mit Stirnlampe oder eine Lupe mit Beleuchtung. Viertens ist eine vorsichtige und sorgfältige Zerlegung von CCA, ICA und ECA unerlässlich, um Risse und intravaskuläre Thrombosen zu vermeiden. Außerdem ist es wichtig, die PPA zu visualisieren, um sicherzustellen, dass der Entbindungskatheter ordnungsgemäß in den ICA eintritt. Fünftens ist es selten, dass bei Nagetieren durch die Injektion von Thrombolytika Nebenwirkungen festgestellt werden. In unseren Studien stellten wir nach der TNK-Injektion keine unerwünschten Ereignisse wie Angioödem oder periphere Blutungen fest. Das heißt nicht, dass es unmöglich ist, aber uns sind keine Berichte über systemische Nebenwirkungen von Thrombolytika bei Nagetieren bekannt. Ein Forscher, der dieses Protokoll zum ersten Mal anwenden möchte, wird durchaus raten, einen der hier als Mitautoren genannten Forscher zu konsultieren, da wir persönliche Anweisungen als sehr hilfreich empfanden.

Bei der Auswahl eines Tierkrankheitsmodells für die Erprobung von Kandidatentherapien ist es wichtig, die Patientengruppe genau darzustellen, für die das Medikament vorgesehen ist. Fokale ischämische Schlaganfallmodelle umfassen Rose-Bengal-photothrombotische Modelle, kortikale Pialarterienokklusion und stereotaktische Endothelin-1-Injektion 13,14,15. Diese Modelle haben den Vorteil, hochreproduzierbare Läsionen in vorhersehbaren Bereichen des Kortex zu erzeugen. Dieser Vorteil macht sie in Studien zu zellulären Mechanismen oder bei der Korrelation der Läsionenorte mit Verhaltensergebnissen bevorzugt. Zusätzliche Kosten, Komplexität und fehlende Reperfusionskomponente machen sie für Drogentests weniger nützlich.

Die MCAo mit intraluminalem Monofilament oder Thromboembolismus sind die etablierten bevorzugten Modelle für große Gefäßokklusion (LVO)10,16,17. Das siliziumbeschichtete Monofilamentmodell ist einfach auszuführen und weit verbreitet. Obwohl Standort und Größe der Läsion weniger vorhersehbar sind, wird diese Heterogenität bei groß angelegten Drogentests als Vorteil angesehen, da menschliche Schlaganfälle ebenfalls recht heterogen^sind. Ein Nachteil der Monofilamentmethode ist, dass die Okklusion biologisch inert ist. Bei Patienten erzeugen Thromben und Thrombolyse eine entzündliche Kaskade, die mit der Freisetzung von Thrombin, Plasminogen und anderen Thrombuselementen 20,21,22 assoziiert ist. Um diese Einschränkung zu überwinden, haben viele Modelle der Thromboembolie in Studien zu Kaninchen-, Schweine-, Hunde- und nicht-menschlichen Primaten vorgeschlagen: 23,24,25,26,27. Diese Studien sind komplex und erfordern im Allgemeinen spezialisierte Expertise. Dennoch versuchten wir, das thromboembolische Modell für unser multilaborantes, präklinisches Testnetzwerk anzupassen. Dies erforderte, dass wir die Thromboemboli-Präparation vereinfachen, den chirurgischen Ansatz straffen und die Anzahl der benötigten Tiere deutlich reduzieren. Wir entwickelten ein thromboembolisches Modell, das TE-MCAo, das erfolgreich in sechs verschiedenen Laboren mit ausgezeichneter Protokolltreue (Tabelle 1) und relativ konsistenter Läsionengröße (Tabelle 2) eingesetzt werden konnte. Der Durchsatz war ausreichend und lag im Durchschnitt bei 6 Probanden pro Woche.

Es gibt mehrere Fehlerbehebungsschritte, die nützlich sein können. Das Versagen von Blut zur Thrombose ist die häufigste Ursache für Protokollversagen und ist meist auf eine Kontamination des Präparationskatheter mit EDTA oder Heparin zurückzuführen, wenn es auf den Operationstisch gelegt wird. Wir empfehlen eine sorgfältige Sammelmethode. Wir empfehlen außerdem, die Calciumchloridlösung, die zur Inaktivierung des EDTA verwendet wird, alle Wochen oder alle zwei Wochen frisch herzustellen. Nach dem Eluieren des Thrombos aus dem Zubereitungskatheter kann es schwierig sein, den Thrombus in die erforderlichen 5 cm Fragmente zu schneiden. Einige Thromben sind empfindlich und brechen leicht. Wir empfehlen, die Gerinnsel mit optischer Vergrößerung vorzubereiten und im Extremfall zu einem anderen Spenderthrombus überzugehen. Das Aspirieren und Elutieren von Thromben erfordert ein moderates Maß an Können; Daher empfehlen wir eine ziemlich lange Einarbeitungszeit. Stellen Sie mit optischer Vergrößerung sicher, dass die Spitze des Aspirationskatheters frei von Verhakungen ist. Thromben können im Einnistungskatheter eingeklemmt werden – wir empfehlen einen sanften Wechsel zwischen Aspiration und Elution. Für Chirurgen, die mit dem typischen MCAo-Filamentmodell Erfahrung haben, kann die Identifizierung des PPA ein neuer Schritt sein. Wir empfehlen dringend, die Thromben mit Evan's Blue zu kennzeichnen, damit der Katheter beim Aufstieg durch die ICA verfolgt und verfolgt werden kann. Die Bifurkation des ICA/PPA kann durch sorgfältige, tiefe Dissektion nach dem ICA leicht lokalisiert werden und befindet sich zuverlässig tief in einem dünnen Ast des internen Karotisnervs.

Dieses Protokoll bringt einige Einschränkungen mit sich. Es ist ein chirurgisches Können erforderlich, um die Kanüle der Halsschlagadern der Nagetiere durchzuführen. Dies gilt jedoch ebenso für das Filamentmodell. Auch der Umgang mit den Blutthromben erfordert chirurgische Fähigkeiten. Wie bei allen thromboembolischen Modellen gibt es eine geringere erfolgreiche Infarktrate im Vergleich zum Filamentmodell. Wenn das Ziel der Untersuchung häufigere Infarktvorfälle sind, wäre das Filamentmodell vorzuziehen. Wenn das Ziel hingegen eine Replikation von Thrombus und Thrombolyse ist, ist dieses Modell wünschenswert.

Dieses Modell ist dazu gedacht, potenzielle Gehirnschutzmittel mit einem Modell zu testen, das Thrombus und Thrombolyse treu einsetzt. Zukünftige Richtungen könnten auch Studien zur adjuvanten Therapie umfassen, die das No-Reflow-Phänomen ins Visier nehmen. Viele haben für diesen Zweck Antikoagulanzien und Thrombozytenhemmer vorgeschlagen.

Abschließend lässt sich sagen, dass das hier vorgestellte TE-MCAo-Protokoll so angepasst ist, dass es in mehreren Laboren eingesetzt werden kann. Wir vereinfachten die Herstellung von Thromben und optimierten den chirurgischen Ansatz. Wir entwickelten eine Methode zur Lagerung von Spenderblut, wodurch die Anzahl der benötigten Tiere deutlich reduziert wurde.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
1 ml Spritze	BD	309628
10x Loupes
1cc-Spritze	Terumo	SS-01T
23g stumpfe Nadel	Grainger	5FVK7
3,0-cm³-Spritze	BD	309656
3:0 Seidenligatur
30g Nadel	BD	305128
5-0 Prolenennaht	Ethicon	8698	Um den Hautschnitt zu schließen
5-0 Seidenligatur	Ethicon	A182
Aneurysmaklemme
Atropinsulfat	Vet One	NDC86136-006-10	Reduzieren Sie die Bronchialsekretionen
Stumpfe Rillenzangen
Bupivacain	Xelia Pharmaceuticals	NDC70594-118-01	Lokalanästhesie
Calciumchlorid	Sigma	C7902
Carprofen	Zoetis Inc	NADA #141-199	Analgetikum
Zentrifugenröhren	Eppendorf	22364111	Zur Blutentnahme
Ethanol	Koptec	UN1170
Evan' s Blau	Sigma	E2129
Heizpolster	Harvard-Apparat	K021-435
Hämostatische Klemme
Isoflurane	Vet One	NDC13985-528-60
Made By Me Ultimative Webschleifen	Horizontgruppen	Nicht anwendbar	Weiche Fesseln
Mikro-Schere	F.S.T.	15000-00
Mikrokatheter	Doccol Corporation	PE-FL-360-200-300	Vorgefertigte Injektionskatheter
PE-10-Katheter	BD	427401
PE-100-Rohre	Intramedic	7426
PE-50-Rohre	BD	427410
Pädiatrische EDTA-Sonden	BD Microtainer	K2E-363706	Spendenblut speichern
Petrischale	Eppendorf	30702115
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung	Fisher	B2438
Prävantik	PDI Inc.	NDC10189-1080-1	Antiseptikum
Wattestäbchen	VWR	89031-288
Rasierklinge	AccuTec Pro	71960
Kochsalzlösung	Hospira, Inc.	NDC 0409-4888-02
Schere	F.S.T.	14958-11
Scharfe Pinzette
Spritzenpumpe	New Era Pumps Inc.	BS-300
Tischofen	Boekel	132000
Tenecteplase (TNK)	Genentech, San Francisco	NDC50242-120-47	Thrombolyse
Ohrenanhänger	RapID-Labor, San Francisco, CA	RapID-Tags