Erkennung von Bakteriophagen in Umweltproben

1. Erhalten Sie eine Stichprobe von Abwasser oder wasserhaltigen Coliphage.
2. Verdünnen Sie die Probe 01:10 und 1: 100 mit Tris-Puffer. Zu diesem Zweck 1,0 mL der Kultur auf 9 mL Tris-Puffer übertragen und dann eine zweite 10-divisibel Verdünnung.
3. Schmelzen Sie drei Röhren des weichen Agar (0,7 % Nähragar oder Trypticase-Soja-Agar pro 3 mL-Tube), indem man sie in einem Dampfbad oder Autoklaven.
4. Legen Sie die Agar in einem Wasserbad bei 45-48 ° C für 15 min damit die Temperatur des Nährbodens zur Anpassung an 45 ° C.
5. Die erste Röhre zugeben Sie 1 mL eine Log-Phase Bouillonkultur von E. Coli¹ und 1 mL der unverdünnten Probe.
6. Entfernen Sie den Schlauch aus dem Wasserbad und sanft Felsen zwischen den Händen, die Aufhängung für 2-3 s zu mischen.
7. Das Wasser aus dem Rohr mit einem Papiertuch abwischen und eine vorbereitete Petrischale mit Bottom-Agar (regelmäßige Nähragar oder Trypticase-Soja-Agar) Agar übergießen.
8. Drehen Sie schnell die Platte, um die obere Agar zu verbreiten. Achten Sie darauf, dass der Agar deckt die gesamte Fläche.
9. Wiederholen Sie die Schritte 5 bis 8 mit den anderen beiden Rohren weichen Agar, mit 1 mL Bakterien und 1 mL pro Probenverdünnung (Abbildung 2).
10. Nachdem der Agar erstarrt ist, kehren die Petrischalen und Inkubation bei 37 ° C für 48 h. klopfen keine Feuchtigkeit aus dem Deckel der Petrischale. Fällt ein Tropfen Feuchtigkeit auf einer Plakette verursacht das Virus über die Agar-Oberfläche verteilt.
11. Nach der Inkubation die Anzahl der Plaketten auf jeder Verdünnung (Abbildung 3) und die Konzentration von Phagen in der ursprünglichen Probe zu berechnen. Größere Unterschiede in der Größe oder Aussehen der Plaques aufnehmen.

Abbildung 2. Verfahren zur Herstellung von einer bakteriellen Rasen mit obere Agar für die Coliphage-Enumeration.

Abbildung 3. Phagen-Plaketten auf einem bakteriellen Rasen.

¹ E. Coli -Stamm ATCC 15597 in der Regel wird die größte Anzahl von Plaques von Abwasserproben produzieren. Es sollten über Nacht in einen 250-mL-Erlenmeyerkolben mit 100 mL des Nährstoffs oder Trypticase-Soja-Bouillon und unter Schütteln Bedingungen bei 35 ° c inkubierten angebaut werden 3 h vor der Phagen-Assay impfen 1 mL dieser Kultur in eine frische Flasche enthält 100 mL Nährstoff oder Trypticase-Soja-Bouillon und Ort in einem schütteln Wasserbad auf 35-37 ° C. Dadurch wird sichergestellt, dass die Bakterien in der Log-Phase des Wachstums.