Erkennung von Bakteriophagen in Umweltproben

Viren sind infektiöse biologische Partikel, die für viele Krankheiten verantwortlich sind, von Erkältung und Grippe bis hin zu Hepatitis und HIV.

Viren sind biologische Partikel, die entweder aus einem DNA- oder RNA-Genom bestehen und von einer Proteinhülle umgeben sind, die als Kapsid bekannt ist, manchmal mit einer zusätzlichen Lipidhülle. Viren haben von sich aus keine metabolischen oder fortpflanzungsfähigen Fähigkeiten und müssen in lebende Zellen eindringen und deren zelluläre Maschinerie kapern, um weitere Kopien von sich selbst zu erstellen.

Sowohl prokaryotische Zellen, wie Bakterien, als auch eukaryotische Zellen, wie die des Menschen, können von bestimmten Klassen von Viren infiziert werden. Konkret handelt es sich bei Bakteriophagen um Viren, die Bakterien infizieren. Coliphagen sind zum Beispiel jene Phagen, die E. coli infizieren, ein weit verbreitetes Darmbakterium, von dem einige Stämme eine Lebensmittelvergiftung verursachen können und das ein Hinweis auf eine fäkale Kontamination der Wasserversorgung ist.

Obwohl nicht allgemein bekannt ist, dass Phagen selbst beim Menschen pathogen sind, gibt es Hinweise darauf, dass sie zuverlässige Surrogatindikatoren für krankheitserregende Enteroviren sind, die ebenfalls fäkal übertragen, aber schwer zu testen sind. Die Verfügbarkeit relativ schneller und kostengünstiger Methoden zur Zählung von Bakteriophagen macht sie zu einem attraktiven Werkzeug für die Beurteilung der fäkalen Kontamination in Umweltproben.

In diesem Video werden die Prinzipien der Phagenzählung vorgestellt. Demonstration eines Protokolls zur Quantifizierung von Phagen, bekannt als Plaque-Assay; und schließlich erforschen Sie verschiedene umweltwissenschaftliche Anwendungen für den Nachweis und die Zählung von Phagen und anderen Viren.

Bakteriophagen müssen, wie alle Viren, lebende Zellen, in diesem Fall Bakterien, parasitieren, um sich vermehren zu können.

Phagen tun dies, indem sie auf der bakteriellen Zelloberfläche landen und sich an ihr genetisches Material anheften und ihr genetisches Material in die Zelle injizieren. Im Inneren der Zelle wird das virale Genom repliziert und die Proteinkomponenten des viralen Kapsids werden hergestellt, beides unter Verwendung der biochemischen Maschinerie der Wirtszelle. Sobald die Phagenpartikel zusammengesetzt sind, werden sie von den Bakterien freigesetzt, oft indem sie den Wirt lysieren und ausbrechen, wodurch die Wirtszelle getötet wird.

Eine weit verbreitete Methode zur Bestimmung der Phagenkonzentration in einer Probe macht sich diese lytische Aktivität zunutze. Bei dieser Technik wird der Phagen aus der Probe mit Bakterien und weichem Agar vermischt. Diese Mischung wird auf Petrischalen mit normalem Agar als Substrat gegossen, und die oberste Schicht bildet eine Überlagerung.

Die Bakterien sind in einer so hohen Konzentration vorhanden, dass sie einen durchgehenden Rasen bilden. Die Bakterien sollten aus Kulturen gewonnen werden, die sich in der logarithmischen Wachstumsphase befinden, um sicherzustellen, dass jedes Bakterium, das die Phagen infizieren, am Leben ist und es den Phagen ermöglicht, Nachkommen zu produzieren.

Wenn ein Phagenpartikel ein Bakterium infiziert und lysiert, breiten sich die Phagennachkommen auf benachbarte Bakterienzellen aus und setzen die Infektion fort. Der weiche Agar schränkt die Diffusion der Phagenpartikel ein. Schließlich bildet sich ein Lichtungsbereich, der als Plaque bezeichnet wird.

Wird der Phagen auf eine ausreichend niedrige Konzentration verdünnt, dann können diskrete, einzelne Plaques auf dem Bakterienrasen beobachtet werden. Diese können gezählt und zur Berechnung der Anzahl der plaquebildenden Einheiten (PFUs) von Phagen pro ml der ursprünglichen Probe verwendet werden.

Nachdem Sie nun verstanden haben, wie Phagen Bakterien infizieren und wie diese Aktivität zur Messung der Phagenkonzentration genutzt werden kann, gehen wir ein Protokoll für die Verwendung eines Plaque-Assays zur Zählung von Phagen in Wasserproben aus der Umwelt durch.

Einen Tag vor der Durchführung des Assays inokulieren Sie eine Kolonie von E. coli Stamm ATCC 15597 in 100 ml Trypticase-Sojabrühe in einem 250-ml-Erlenmeyerkolben. Inkubieren Sie es mit Schütteln bei 35 ? C über Nacht.

3 h vor dem Assay 1 ml der E. coli-Kultur über Nacht in eine frische 100 ml Brühe impfen. Legen Sie diese neue Kultur in ein Schüttelwasserbad mit einer Temperatur zwischen 35 und 37 °C. Dadurch wird sichergestellt, dass sich die Bakterien zu Beginn des Assays in der logarithmischen Wachstumsphase befinden.

Um den Plaque-Assay zu starten, nehmen Sie 10- und 100-fache serielle Verdünnungen der Wasserprobe mit 9 ml Tris-Puffer vor.

Schmelzen Sie in einem Dampfbad drei 5-ml-Röhrchen mit 0,7 % Softtop-Agar, entweder Trypticase-Soja oder Nährstoff-Agar. Nach dem Schmelzen in ein Wasserbad bei 45 bis 48 ? C für mindestens 15 Minuten, bis die Temperatur des Agars auf 45 °C sinkt.

In das erste Röhrchen mit weichem Agar geben Sie 1 ml der zuvor vorbereiteten E. coli-Kultur in logarithmischer Phase und 1 ml der unverdünnten Wasserprobe. Nehmen Sie den Schlauch aus dem Wasserbad und schaukeln Sie vorsichtig zwischen Ihren Händen für 2-3 s, um die Suspension zu mischen.

Gießen Sie den weichen Agar über eine zuvor vorbereitete Petrischale mit Trypticase-Soja oder Nähragar. Drehen Sie die Platte schnell, um sie zu verteilen, und achten Sie darauf, dass sie die gesamte Oberfläche bedeckt.

Wiederholen Sie die Inokulation und Beschichtung für die beiden anderen Röhrchen mit jeweils 1 ml der verdünnten Proben.

Sobald das obere Agar erstarrt ist, drehen Sie die Schalen um und inkubieren Sie sie bei 37 ? C für 48 h.

Nach der Inkubation die Anzahl der Plagen auf jedem Teller zählen. Berechnen Sie aus der Zählung die Phagenkonzentration in der ursprünglichen Probe

Wenn beispielsweise 9 Plaques aus der 10-fachen Verdünnungsplatte gewonnen wurden, dann gibt es 9 mal 10 geteilt durch 1 ml oder 90 PFUs/ml Coliphage in der ursprünglichen Wasserprobe.

Nachdem Sie nun gesehen haben, wie Phagen-Plaque-Assays durchgeführt werden, sehen wir uns an, wie Plaque-Assays verwendet werden können, um Phagen und andere Arten von Viren aus einer Vielzahl von Quellen aufzuzählen.

Plaque-Assay-basierte Methoden können verwendet werden, um Bakteriophagen aus verschiedenen Umweltproben wie dem Boden zu isolieren. In diesem Beispiel sammelten die Forscher zunächst Phagen durch Filtration aus dem Boden. Der Phagen wurde dann verwendet, um das gängige Bodenbakterium Arthrobacter in einem Plaque-Assay zu infizieren. Die Phagen wurden aus einzelnen Plaques entnommen und auf neue Agarplatten gestreift und dann mit bakterienhaltigem Top-Agar überzogen. Die Phagenkonzentration nimmt entlang der Länge des Streifens ab, so dass diskrete Plaques, die wahrscheinlich von einer einzigen Phagenart gebildet werden, erhalten werden können. Diese einzelnen Plaques könnten dann ausgewählt werden, um die darin enthaltenen Phagen weiter zu analysieren.

Neben Bakteriophagen können Plaque-Assays auch mit anderen Viren durchgeführt werden, einschließlich solcher, die Säugetiere infizieren, wie z. B. Influenza. Dazu werden Säugetierzellen zunächst als Monoschichten in Gewebekulturschalen gezüchtet. Medien, die die Viren enthalten, werden dann zu den Zellen hinzugefügt, um eine Infektion zu ermöglichen, bevor die Zellen mit einem immobilisierenden Medium wie der gelartigen Agarose überlagert werden. Nach einer Inkubationszeit, die bis zu zwei Wochen dauern kann, werden die infizierten Zellen fixiert und gefärbt, damit die Plaques sichtbar gemacht und gezählt werden können.

Zusätzlich zu den Proben, die aus der Umwelt entnommen wurden, sind Plaque-Assays nützlich, um Viren in Gewebeproben von infizierten Personen nachzuweisen und zu zählen. Hier gewannen und homogenisierten Forscher Lungengewebe von Mäusen, die mit Gamma-Herpesviren infiziert waren. Dieses virushaltige Homogenat wurde dann verwendet, um Säugetierzellkulturen zu infizieren. Die Anzahl der Plaques konnte dann gezählt werden, um eine Schätzung des Virustiters im infizierten Lungengewebe zu erhalten.

Sie haben gerade das Video von JoVE über den Nachweis von Bakteriophagen in Umweltproben gesehen. Sie sollten nun die grundlegende Biologie von Phagen verstehen, wie man einen Plaque-Assay durchführt, um Phagen in einer Umweltprobe zu quantifizieren, und wie Plaque-Assays verwendet werden können, um Phagen und andere Viren in Umwelt- oder klinischen Proben zu untersuchen. Wie immer vielen Dank fürs Zuschauen!