JoVE Science Education

Environmental Sciences

Environmental Microbiology

Erkennung von Bakteriophagen in Umweltproben

JoVE Science Education
Environmental Microbiology

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

JoVE Science Education Environmental Microbiology

Detection of Bacteriophages in Environmental Samples

2.6: Community DNA Extraction from Bacterial Colonies

2.13: Culturing and Enumerating Bacteria from Soil Samples

40,551 Views

•

09:17 min

•

April 30, 2023

Overview

Quelle: Labors von Dr. Ian Pfeffer und Dr. Charles Gerba – Arizona University
Demonstrierende Autor: Alex Wassimi

Viren sind eine einzigartige Gruppe von biologischen Einheiten, die eukaryotische und prokaryotische Organismen zu infizieren. Sie sind obligate Parasiten, die keine metabolische Kapazität, und um zu replizieren, setzen auf Host-Stoffwechsel, virale Drehteile in Wirtszellen selbst zusammensetzen.

Viren sind ultramikroskopischer – zu klein, um mit dem Lichtmikroskop nur mit größerer Auflösung des Elektronenmikroskops sichtbar angezeigt werden. Ein Viruspartikel besteht aus einer Nukleinsäure-Genom, entweder DNA oder RNA, umgeben von einem Protein-Mantel, bekannt als ein Kapsid, bestehend aus Protein-Untereinheiten oder Capsomers. In einigen komplexeren Viren das Kapsid wird von einer zusätzlichen Lipid Hülle umgeben, und einige haben Spike-ähnliche Oberfläche Anhängsel oder Schwänzen.

Enterischen Viren sind Viren, die den Darm-Trakt von Menschen und Tieren anstecken genannt. Sie werden im Kot ausgeschieden und von häuslichem Abwasser isoliert werden können. Viren, die Bakterien infizieren werden Bakteriophagen genannt, und die coliforme Bakterien infizieren, werden genannt Coliphages (Abbildung 1). Die Phagen coliforme Bakterien sind überall gefunden, dass coliforme Bakterien gefunden werden.

Abbildung 1. Coliphage T2.

Principles

Bakteriophagen werden in Umweltwissenschaften studiert, denn sie sind ein wichtiger Bestandteil der biologischen Systeme. Sie sind die am häufigsten vorkommende biologisches Wesen auf der Erde und sind wichtig, weil sie helfen Kontrolle Bakterienpopulationen, Nahrungsnetz Prozesse, Stoffkreisläufe, sowie verbessern prokaryotische Vielfalt durch horizontalen Gentransfer. Außerdem gibt es Hinweise darauf, dass die Phagen zuverlässige Surrogat Indikatoren für die krankheitsverursachenden enterischen Viren sind, die auch fecally übertragen werden-aber schwer zu bestimmen. Die Verfügbarkeit von relativ schnelle und kostengünstige Methoden zum Auflisten von Bakteriophagen macht ihnen ein attraktives Instrument für die Beurteilung der fäkale Verunreinigungen in Umweltproben.

Coliphages im Wasser werden durch Zugabe eines Musters zu weich oder Overlay-Agar zusammen mit einer Kultur von E. Coli in der Log-Phase des Wachstums untersucht. Die Phagen der Bakterienzelle beimessen und lyse der Bakterien. Die Bakterien produzieren einen konfluierende Rasen des Wachstums mit Ausnahme der Bereiche, wo die Phagen gewachsen ist und die Bakterien lysiert. Diese resultierende klare Bereiche werden als Plaques bezeichnet. Eine weiche Agar-Overlay wird verwendet, um die körperliche Verbreitung von Viren einzuschränken, sodass nach Lyse aus einem Bakterium, sie nur zu den benachbarten Bakterienzellen verbreiten können.

Um optimale Plaque-Bildung zu erhalten ist es wichtig, dass die Host Bakterien in der Log-Phase des Wachstums. Dies sorgt dafür, dass die Phagen befestigen, um lebende Bakterien und Nachkommen zu produzieren. Dies erfordert, dass eine Kultur der Host Bakterien jeden Tag bereit sein, die ein Test durchgeführt wird. Eine Kultur wird in der Regel am Vortag der Assay inkubiert, so dass es in der stationären Phase. Am Tag des Tests, die Kultur wird verwendet, um eine Brühe, impfen die ausgebrütet wird, um genügend Host-Bakterien in der Log-Phase zum Test zu erhalten (Dies erfordert in der Regel 2-3 h Inkubation in einem schütteln Wasserbad auf 35-37 ° C).

Procedure

Erhalten Sie eine Stichprobe von Abwasser oder wasserhaltigen Coliphage.
Verdünnen Sie die Probe 01:10 und 1: 100 mit Tris-Puffer. Zu diesem Zweck 1,0 mL der Kultur auf 9 mL Tris-Puffer übertragen und dann eine zweite 10-divisibel Verdünnung.
Schmelzen Sie drei Röhren des weichen Agar (0,7 % Nähragar oder Trypticase-Soja-Agar pro 3 mL-Tube), indem man sie in einem Dampfbad oder Autoklaven.
Legen Sie die Agar in einem Wasserbad bei 45-48 ° C für 15 min damit die Temperatur des Nährbodens zur Anpassung an 45 ° C.
Die erste Röhre zugeben Sie 1 mL eine Log-Phase Bouillonkultur von E. Coli¹ und 1 mL der unverdünnten Probe.
Entfernen Sie den Schlauch aus dem Wasserbad und sanft Felsen zwischen den Händen, die Aufhängung für 2-3 s zu mischen.
Das Wasser aus dem Rohr mit einem Papiertuch abwischen und eine vorbereitete Petrischale mit Bottom-Agar (regelmäßige Nähragar oder Trypticase-Soja-Agar) Agar übergießen.
Drehen Sie schnell die Platte, um die obere Agar zu verbreiten. Achten Sie darauf, dass der Agar deckt die gesamte Fläche.
Wiederholen Sie die Schritte 5 bis 8 mit den anderen beiden Rohren weichen Agar, mit 1 mL Bakterien und 1 mL pro Probenverdünnung (Abbildung 2).
Nachdem der Agar erstarrt ist, kehren die Petrischalen und Inkubation bei 37 ° C für 48 h. klopfen keine Feuchtigkeit aus dem Deckel der Petrischale. Fällt ein Tropfen Feuchtigkeit auf einer Plakette verursacht das Virus über die Agar-Oberfläche verteilt.
Nach der Inkubation die Anzahl der Plaketten auf jeder Verdünnung (Abbildung 3) und die Konzentration von Phagen in der ursprünglichen Probe zu berechnen. Größere Unterschiede in der Größe oder Aussehen der Plaques aufnehmen.

Abbildung 2. Verfahren zur Herstellung von einer bakteriellen Rasen mit obere Agar für die Coliphage-Enumeration.

Abbildung 3. Phagen-Plaketten auf einem bakteriellen Rasen.

¹ E. Coli -Stamm ATCC 15597 in der Regel wird die größte Anzahl von Plaques von Abwasserproben produzieren. Es sollten über Nacht in einen 250-mL-Erlenmeyerkolben mit 100 mL des Nährstoffs oder Trypticase-Soja-Bouillon und unter Schütteln Bedingungen bei 35 ° c inkubierten angebaut werden 3 h vor der Phagen-Assay impfen 1 mL dieser Kultur in eine frische Flasche enthält 100 mL Nährstoff oder Trypticase-Soja-Bouillon und Ort in einem schütteln Wasserbad auf 35-37 ° C. Dadurch wird sichergestellt, dass die Bakterien in der Log-Phase des Wachstums.

Viren sind infektiöse biologische Partikel, die verantwortlich für viele Krankheiten, Erkältung und Grippe, Hepatitis und HIV.

Viren sind biologische Partikel bestehend aus DNA oder RNA-Genom, gewickelt in einer Protein-Mantel bekannt als ein Kapsid, manchmal mit einem zusätzlichen Lipid Umschlag. Viren müssen haben keine metabolische oder reproduktive Fähigkeit auf eigene Faust, und dringen in lebenden Zellen und entführen ihre zellulären Maschinerie um weitere Kopien von sich selbst machen.

Prokaryotische Zellen, wie Bakterien, und eukaryotischen Zellen, wie die des Menschen, können durch bestimmte Klassen von Viren infiziert werden. Insbesondere sind Bakteriophagen Viren, die Bakterien infizieren. Coliphages sind beispielsweise die Phagen, die E. Coli, einem gemeinsamen Darm-Bakterium infizieren, manche Virusstämme Lebensmittelvergiftung verursachen können, und das ist ein Indikator für fäkale Verunreinigung des zufließenden Wassers.

Während Phagen sich nicht allgemein bekannt sind, beim Menschen pathogen sein, gibt es Hinweise darauf, dass sie zuverlässige Surrogat Indikatoren für die krankheitsverursachenden sind Enteroviren, die auch fecally übertragen werden-aber schwer zu bestimmen. Die Verfügbarkeit von relativ schnelle und kostengünstige Methoden zum Auflisten von Bakteriophagen macht ihnen ein attraktives Instrument für die Beurteilung der fäkale Verunreinigungen in Umweltproben.

Dieses Video wird die Prinzipien hinter Phagen-Enumeration einzuführen; zeigen Sie ein Protokoll zur Quantifizierung der Phagen, bekannt als die Plaque-Assay; und zu guter Letzt erkunden Sie mehrere Umweltwissenschaften-Anwendungen für den Nachweis und Zählung der Phagen und andere Viren.

Bakteriophagen, wie alle Viren müssen lebende Zellen, in diesem Fall Bakterien, parasitieren, um sich zu vermehren.

Phagen dazu landen und Anfügen an die Oberfläche der Bakterienzelle und injiziert ihr genetisches Material in die Zelle. Einmal innerhalb der Zelle das virale Genom repliziert wird und die Eiweißbausteinen der viralen Kapsid produziert werden, beide unter Verwendung von biochemischen Maschinerie der Wirtszelle. Sobald die Phagen Partikel montiert sind, sind sie von den Bakterien oft veröffentlicht durch Lyse des Hosts und platzen, in den Prozess die Wirtszelle zu töten.

Eine weit verbreitete Methode zur Bestimmung der Phagen-Konzentration in einer Probe nutzt diese lytische Aktivität. Bei dieser Technik wird das Bakterium aus der Probe mit Bakterien und weiche Agar vermischt. Diese Mischung wird auf Petrischalen mit regelmäßigen Agar ein Substrat und die oberste Schicht bildet eine Überlagerung gegossen.

Die Bakterien sind in einer hohen Konzentration, dass sie einen kontinuierliche Rasen bilden. Die Bakterien erhalten Sie vom Kultur, die in der Log-Phase des Wachstums, um sicherzustellen, dass jedes Bakterium, die die Phagen zu infizieren lebendig ist und ermöglicht die Phagen, nachkommen zu produzieren.

Wenn ein Teilchen Phagen infiziert und lyses ein Bakterium, werden Phagen Nachkommen verbreitete sich in der Nähe von Bakterienzellen und die Infektion weiter. Die weiche Agar schränkt die Diffusion der Phagen Partikel. Schließlich wird eine Fläche von Clearing, bekannt als ein Plaque gebildet werden.

Wenn das Bakterium eine niedrig genug Konzentration verdünnt wird, können diskretere, individuelle Plaketten auf dem bakteriellen Rasen beobachtet werden. Diese können gezählt und verwendet, um die Anzahl der Plaque-Bildung von Einheiten oder PFUs des Phagen pro mL der ursprünglichen Probe zu berechnen.

Nun, Sie wissen wie Phagen Bakterien infizieren und wie diese Aktivität verwendet werden kann, um Phagen-Konzentration zu messen, gehen Sie wir durch ein Protokoll für die Verwendung eines Plaque-Assays Phagen in ökologischen Wasserproben auflisten.

Impfen Sie einen Tag vor der Durchführung der Test eine Kolonie von E. Coli -Stamm ATCC 15597 in 100 mL Trypticase-Soja-Brühe in einen 250-mL-Erlenmeyerkolben. Inkubieren Sie es unter Schütteln bei 35 ° C über Nacht.

3 h vor der Assay impfen 1 mL der Nacht E. Coli Kultur in eine frische 100 mL Brühe. Legen Sie diese neue Kultur in einem schütteln Wasserbad bei einer Temperatur zwischen 35 und 37 ° C. Dadurch wird sichergestellt, dass die Bakterien in der Log-Phase des Wachstums, sind wenn der Test beginnt.

Um die Plaque-Assay zu starten, machen Sie 10 und 100 fache Verdünnungsreihen der Wasserprobe, mit 9 mL Tris-Puffer.

Mit einem Dampfbad, Schmelzen Sie drei 5-mL-Röhrchen von 0,7 % weiche obere Agar, entweder Trypticase-Soja oder Nährstoff-Agar. Einmal geschmolzen, legen Sie in einem Wasserbad bei 45 bis 48 ° C für mindestens 15 min für die Agar Temperatur bis 45 ° c sinkt

Das erste Rohr weich Agar fügen Sie hinzu, 1 mL der vorbereiteten Log-Phase E. Coli Kultur und 1 mL der unverdünnten Wasserprobe. Entfernen Sie den Schlauch aus dem Wasserbad und sanft Rock zwischen Ihren Händen für 2-3 s, die Aussetzung zu mischen.

Eine zuvor vorbereiteten Petrischale mit Trypticase-Soja oder Nährstoff-Agar übergießen Sie weichen Agar. Drehen Sie schnell die Platte zu verbreiten, um sicherzustellen, dass es die gesamte Oberfläche bedeckt.

Wiederholen Sie die Impfung und Beschichtung für die anderen zwei Röhren, mit 1 mL einer verdünnten Proben.

Sobald die obere Agar erstarrt ist, invertieren Sie die Gerichte zu und inkubieren sie bei 37 ° C für 48 h.

Nach der Inkubation die Anzahl der Plagen auf jeder Platte. Berechnen Sie von der Zählung die Phagen-Konzentration in der Originalprobe

Zum Beispiel, wenn 9 Plaketten aus der 10-divisibel Verdünnung Platte gewonnen wurden, dann gibt es 9 mal 10 geteilt durch 1 mL oder 90 PFUs/mL des Coliphage in der ursprünglichen Wasserprobe.

Nun, Sie gesehen haben, wie PHAGEN-Plaque-Tests durchgeführt werden, schauen Sie sich bitte an die Verwendung von Plaque-Assays Phagen und andere Arten von Viren aus den unterschiedlichsten Quellen auflisten.

Plaque-Assay-basierte Methoden lässt sich die Bakteriophagen aus verschiedenen Umweltproben wie Boden zu isolieren. In diesem Beispiel gesammelt Forscher zuerst Phagen aus dem Boden durch Filtration. Die Phagen wurde dann verwendet, um die gemeinsamen Bodenbakterien Arthrobacter in einem Plaque-Assay zu infizieren. Phagen waren holte vom einzelnen Plaketten auf neue Agarplatten gestreift und dann mit Bakterien-haltigen obere Agar überlagert. Phagen-Konzentration sinkt entlang der Länge des Streifens damit diskrete Plaques, wahrscheinlich von einer einzigen Art von Phagen, gebildet erzielt werden könnte. Diese einzelnen Plaques könnte dann abgeholt werden, um die Phagen innerhalb weiter zu analysieren.

Plaque-Assays können zusätzlich Bakteriophagen auch mit anderen Viren, einschließlich derjenigen, wie Influenza, durchgeführt werden, die Säugetiere infizieren. Zu diesem Zweck sind Säugerzellen zunächst als Monolayer in Gewebekultur Gerichten erwachsen. Medien, die die Viren werden dann zu den Zellen zu ermöglichen-Infektion auftreten, bevor die Zellen mit einem fixierenden Medium wie die Gel-artige Agarose überlagert werden, hinzugefügt. Nach einer Inkubationszeit, die bis zu zwei Wochen dauern könnte, sind die infizierten Zellen fixiert und gefärbt, um die Plaketten, visualisiert und gezählt werden können.

Zu guter Letzt eignen sich neben Proben aus der Umgebung, Plaque-Assays für die Erkennung und Aufzählen von Viren in Gewebeproben von infizierten Personen. Hier, Forscher und homogenisierte Lungengewebe von Mäusen mit Gamma-Herpesviren infiziert. Dieser Virus-haltigen Homogenat wurde dann zur Säugetier-Zellkultur zu infizieren. Die Zahl der Plaketten könnte dann gezählt werden, um eine Schätzung für die virale Titer in den infizierten Lungengewebe zu bieten.

Sie haben nur Jupiters Video auf den Nachweis von Bakteriophagen in Umweltproben beobachtet. Sie sollten jetzt verstehen die grundlegende Biologie des Phagen, wie einen Plaque-Assay zur Phagen in einer ökologischen Probe quantitate durchführen und Verwendung von Plaque-Assays Phagen und andere Viren in Umwelt- oder klinischen Proben zu untersuchen. Wie immer vielen Dank für das ansehen!

Results

Verdünnung der Probe Abwasser = 10^-1

Anzahl der Plaketten erhalten = 9

Daher Phagen Konzentration im Abwasser Probe
10 x 9 ÷ = 1 mL
= 90 Plaque-bildenden Einheiten / mL

Rohabwasser enthält in der Regel 10³ – 10⁴ Coliphage pro mL, mit einer Reichweite von 10² – 10⁸ pro mL.

Applications and Summary

Es gibt viele Einsatzmöglichkeiten der Coliphages als Umweltindikatoren. Dazu gehören ihre Verwendung als Indikatoren für Abwasser Kontamination, Effizienz der Wasser- und Abwasserbehandlung sowie enterischen Viren und Bakterien in der Umwelt überleben. Die Verwendung von Bakteriophagen als Indikatoren für das Vorhandensein und das Verhalten der magensaftresistenten Bakterien und tierischen Viren seit jeher attraktiv wegen der Leichtigkeit, der Erkennung und low-cost Phagen-Assays zugeordnet. Darüber hinaus können sie in Umweltproben innerhalb von 24 h im Vergleich zu Tagen oder Wochen auf enterischen Viren quantifiziert werden.

¹ E. Coli -Stamm ATCC 15597 in der Regel wird die größte Anzahl von Plaques von Abwasserproben produzieren. Es sollten über Nacht in einen 250-mL-Erlenmeyerkolben mit 100 mL des Nährstoffs oder Trypticase-Soja-Bouillon und unter Schütteln Bedingungen bei 35 ° c inkubierten angebaut werden 3 h vor der Phagen-Assay impfen 1 mL dieser Kultur in eine frische Flasche enthält 100 mL Nährstoff oder Trypticase-Soja-Bouillon und Ort in einem schütteln Wasserbad auf 35-37 ° C. Dadurch wird sichergestellt, dass die Bakterien in der Log-Phase des Wachstums.

Transcript

Viruses are infectious biological particles that are responsible for many diseases, cold and flu, to hepatitis and HIV.

Viruses are biological particles consisting of either a DNA or RNA genome, wrapped inside a protein coat known as a capsid, sometimes with an additional lipid envelope. Viruses have no metabolic or reproductive ability on their own, and must invade living cells and hijack their cellular machinery in order to make more copies of themselves.

Both prokaryotic cells, such as bacteria, and eukaryotic cells, such as those of humans, can be infected by specific classes of viruses. Specifically, bacteriophages are viruses that infect bacteria. For example, coliphages are those phages that infect E. coli, a common gut bacterium, some strains of which can cause food poisoning, and which is an indication of fecal contamination of the water supply.

While phages themselves are not generally known to be pathogenic in humans, there is evidence that they are reliable surrogate indicators for disease-causing enteroviruses that are also fecally-transmitted but difficult to assay. The availability of relatively quick and inexpensive methods to enumerate bacteriophages makes them an attractive tool for the assessment of fecal contamination in environmental samples.

This video will introduce the principles behind phage enumeration; demonstrate a protocol for quantifying phages, known as the plaque assay; and finally, explore several environmental science applications for the detection and counting of phages and other viruses.

Bacteriophages, like all viruses, must parasitize living cells, in this case bacteria, in order to reproduce.

Phages do so by landing and attaching to the bacterial cell surface and injecting their genetic materials into the cell. Once inside the cell, the viral genome is replicated and the protein components of the viral capsid are produced, both using the host cell’s biochemical machinery. Once the phage particles are assembled, they are released from the bacteria, often by lysing the host and bursting out, killing the host cell in the process.

A widely used method for determining phage concentration in a sample takes advantage of this lytic activity. In this technique, the phage from the sample is mixed with bacteria and soft agar. This mixture is poured onto Petri dishes with regular agar as a substrate, and the top layer forms an overlay.

The bacteria are at such a high concentration that they form a continuous lawn. The bacteria should be obtained from culture that is in the log phase of growth, to ensure that every bacterium that the phages infect is alive and allows the phage to produce progeny.

When a phage particle infects and lyses a bacterium, the phage progeny will spread to nearby bacterial cells and continue the infection. The soft agar restricts the diffusion of the phage particles. Eventually, an area of clearing, known as a plaque, will be formed.

If the phage is diluted to a low enough concentration, then discrete, individual plaques can be observed on the bacterial lawn. These can be counted and used to calculate the number of plaque-forming units, or PFUs, of phage per mL of the original sample.

Now that you understand how phages infect bacteria and how this activity can be used to measure phage concentration, let’s go through a protocol for using a plaque assay to enumerate phages in environmental water samples.

One day before performing the assay, inoculate a colony of E. coli strain ATCC 15597 into 100 mL of trypticase soy broth in a 250-mL Erlenmeyer flask. Incubate it with shaking at 35 °C overnight.

3 h before the assay, inoculate 1 mL of the overnight E. coli culture into a fresh 100 mL of broth. Place this new culture into a shaking water bath at a temperature between 35 and 37 °C. This ensures that the bacteria are in the log phase of growth when the assay begins.

To start the plaque assay, make 10- and 100-fold serial dilutions of the water sample, using 9 mL of Tris buffer.

Using a steam bath, melt three 5-mL tubes of 0.7% soft top agar, either trypticase soy or nutrient agar. Once melted, place in a water bath at 45 to 48 °C for at least 15 min for the agar’s temperature to drop to 45 °C.

To the first tube of soft agar, add 1 mL of the previously prepared log-phase E. coli culture and 1 mL of the undiluted water sample. Remove the tube from the water bath and gently rock between your hands for 2-3 s to mix the suspension.

Pour the soft agar over a previously prepared Petri dish with trypticase soy or nutrient agar. Quickly rotate the plate to spread, making sure that it covers the entire surface.

Repeat the inoculation and plating for the other two tubes, using 1 mL of each of the diluted samples.

Once the top agar has solidified, invert the dishes and incubate them at 37 °C for 48 h.

After the incubation, count the number of plagues on each plate. From the count, calculate the phage concentration in the original sample

For example, if 9 plaques were obtained from the 10-fold dilution plate, then there are 9 times 10 divided by 1 mL, or 90 PFUs/mL of coliphage in the original water sample.

Now that you have seen how phage plaque assays are performed, let’s look at how plaque assays can be used to enumerate phage and other types of viruses from a variety of sources.

Plaque assay-based methods can be used to isolate bacteriophage from different environmental samples such as soil. In this example, researchers first collected phage from soil by filtration. The phage was then used to infect the common soil bacteria Arthrobacter in a plaque assay. Phages were picked from individual plaques and streaked onto new agar plates, and then overlaid with bacteria-containing top agar. Phage concentration decreases along the length of the streak, so that discrete plaques, likely formed by a single type of phage, might be obtained. These individual plaques could then be picked to further analyze the phages within.

In addition to bacteriophages, plaque assays can also be performed with other viruses, including those, such as influenza, that infect mammals. To do this, mammalian cells are first grown up as monolayers in tissue culture dishes. Media containing the viruses are then added to the cells to allow infection to occur, before the cells are overlaid with an immobilizing medium such as the gel-like agarose. After an incubation period that could last up to two weeks, the infected cells are fixed and stained to allow the plaques to be visualized and counted.

Finally, in addition to samples collected from the environment, plaque assays are useful for detecting and enumerating viruses in tissue samples from infected individuals. Here, researchers obtained and homogenized lung tissues from mice infected with gamma-herpesviruses. This virus-containing homogenate was then used to infect mammalian cell culture. The number of plaques could then be counted to provide an estimate for the viral titer in the infected lung tissues.

You have just watched JoVE’s video on the detection of bacteriophages in environmental samples. You should now understand the basic biology of phages, how to perform a plaque assay to quantitate phages in an environmental sample, and how plaque assays can be used to study phages and other viruses in environmental or clinical samples. As always, thanks for watching!