Ein Multi-Parametric Islet Perifusion System innerhalb eines mikrofluidischen Perifusion Geräte

In dieser Präsentation stellen wir ein mikrofluidikbasiertes Augenlidperfusionssystem zur gleichzeitigen Messung der dynamischen Insulinsekretion, des Kalziumeinstroms und der mitochondrialen Potentialveränderungen von Pankreasösen als Reaktion auf insulinsekretierende Hunde vor. Das Perfusionssystem besteht aus einem dreischichtigen mikrofluidischen Gerät, Spritzenpumpen und einem Fraktionssammlerinsulin. Der durch Sekretagogen induzierte Kalziumeinstrom und die mitochondrialen Potentiale werden mit Hilfe eines Fluoreszenzmikroskops abgebildet.

Hallo, mein Name ist Ola, ein Waller aus dem Labor von Dr. Val Holter in der Abteilung für Transplantationschirurgie an der University of Illinois in Chicago. Hallo, ich bin Don Lee, ebenfalls aus dem Oktober-Labor. Hallo, ich bin Tricia Hart, ebenfalls aus Dr.Al Holster-Labor.

Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur simultanen Lidbildgebung mit Hilfe eines linearen Glukosegradienten. Wir haben dieses Verfahren in unserem Labor verwendet, um die Optik und Funktion der Ösen zu untersuchen. Also lasst uns loslegen.

Das für dieses Verfahren verwendete mikrofluidische Gerät besteht aus drei Schichten ausgehärtetem PDMS, das durch Standard-Photolithographie erzeugt wird. Die erste Schicht, die aus einem Silikonmaster erzeugt wird, hat die Vertiefungen des mikrofluidischen Geräts, die die Ösen sanft an Ort und Stelle halten, 150 Mikrometer tief und 500 Mikrometer im Durchmesser. Die zweite Schicht hat 500 Mikrometer hohe und zwei Millimeter breite Kanäle.

Die Mitte des Kanals wird erweitert, um den Durchfluss für einen besseren Lösungsaustausch zu verteilen. Im Inneren des Geräts wird ein drei Millimeter hohes und sieben Millimeter breites Loch in der Mitte der Schicht gestanzt. Die dritte Schicht ist eine dicke Platte aus PDMS. Um diese Schicht vorzubereiten, stanzen Sie auf beiden Seiten kleine Löcher, die mit dem Ein- und Auslass des Kanals ausgerichtet sind.

Auf der zweiten Schicht wird, sobald alle drei Schichten erzeugt wurden, die erste Schicht mit den Vertiefungen nach oben mit einem Glasobjektträger verbunden. Die zweite Schicht wird dann mit dem Kanalabstand nach oben mit der ersten Schicht verklebt. Zum Schluss wird die dritte Schicht mit der zweiten Schicht verklebt.

Sind die Schichten verklebt, ist das Gerät bereit für Experimente. Sterilisieren Sie das mikrofluidische Gerät mit einer 10-Milliliter-Spritze, die mit 70 % Ethanol gefüllt ist und mit Tai an den Schlauch des Geräts angeschlossen ist, indem Sie das Ethanol durch die Gerätekanäle fließen lassen. Dann wird mit dem gleichen Setup-Fluss deionisiertes Wasser verwendet, um das Ethanol auszuwaschen.

Sobald das Gerät sterilisiert wurde, stellen Sie es mit einem Tigon-Schlauch auf einen beheizten Mikroskoptisch und verbinden Sie die Spritzenpumpen mit Lösungen mit hohem und niedrigem Glukosegehalt mit einem Y-Anschluss. Verbinden Sie sich dann mit dem Einlass des mikrofluidischen Geräts. Verbinden Sie den Ausgang des mikrofluidischen Geräts mit einem Fraktionssammler

Stellen Sie sicher, dass der Schlauch auf einer 37 Grad Celsius heißen Platte aufliegt. Es ist sehr wichtig, die Lösungen während des gesamten Versuchs auf physiologischer Temperatur zu halten. Verwenden Sie als Nächstes das Laboransichtsprogramm, um den Glukosegradienten zu initiieren, der während des Experiments durch das mikrofluidische Netzwerk perfundiert wird.

Diese Software variiert die Durchflussrate von zwei Glukoselösungen. Durch die Ansteuerung der Spritzenpumpen können hier verschiedene Glukosegradientenprofile erstellt werden, lineare, glockenförmige und quadratische Glukosegradientenprofile. Im Vergleich zu den berechneten Erwartungswerten, die in diesem Experiment gezeigt werden, wird der lineare Gradient von zwei Millimolaren zu 25 Millimolaren Glukose mit einer variierenden Flussrate von 0,01 Millilitern pro Minute der beiden Glukoselösungen und einer konstanten Flussrate von 0,25 Millilitern pro Minute verwendet, die in das Gerät eintritt, nachdem die Lösungen gemischt wurden.

Nachdem Sie das entsprechende Verlaufsprofil ausgewählt haben, testen Sie die Stabilität des Verlaufs. Starten Sie zunächst das Verlaufssystem. Starten Sie dann den Fraktionssammler und sammeln Sie Perfusion acht in einem Milliliter Eend Orph-Röhren.

Testen Sie dann mit einem Blutzuckermessgerät die Glukosekonzentration in jedem Röhrchen mit Excel. Analysieren Sie die vom Blutzuckermessgerät erhaltenen Ergebnisse. Ersetzen Sie anschließend die Spritze mit hohem Glukosegehalt durch eine Spritze mit 0,5 % BSA-Lösung in Krebsringerpuffer PERFUSE 50 Milliliter durch das Gerät mit einer Geschwindigkeit von einem Milliliter pro Minute.

Dadurch wird eine unspezifische Resorption von Insulin an die Mikrokanalwände verhindert, um die Genauigkeit bei der späteren Messung des sekretierten Insulinspiegels nach der Perfusion mit BSA zu gewährleisten. Ersetzen Sie es durch die hohe Glukoselösung reus. Suspendieren Sie 25 bis 30 handverlesene Mausösen in einem zwei Millimolare Glukose-Krebs-Ringer-Puffer, der den Kalzium-Indikatorfarbstoff fira 2:00 AM und den mitochondrialen Potential-Indikatorfarbstoff rumine 1 2 3 enthält, und inkubieren Sie 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius.

Trennen Sie das Gerät nach der Inkubation vom Perfusionssystem und laden Sie die Ösen vorsichtig in das mikrofluidische Gerät, indem Sie die Spitze der Pipette, die die Inselzellen enthält, in die Einlassöffnung einführen und die Inselzellen nach dem Laden langsam abgeben und das Gerät wieder mit dem Perfusionssystem verbinden. Achten Sie darauf, keine Blasen einzuführen. Starten Sie als Nächstes die Spritzenpumpe, um die Ösen mit KRB zu perfundieren, das zwei Millimolare Glukose enthält.

In diesem Schritt wird der überschüssige Farbstoff aus dem Medium gewaschen, die Anregungs- und Emissionsfiltersätze sowie die Belichtungszeiten festgelegt, die während des Experiments verwendet werden sollen. Stellen Sie dann den Fraktionssammler so ein, dass er in Abständen von einer Minute sammelt, während Sie die Ösen mit der glukosearmen Lösung verwenden. Verwenden Sie das Region-of-Interest- oder ROI-Tool der einfachen PCI-Imaging-Software, um die Bereiche oder Ösen zu definieren, die Sie abbilden möchten.

Kreisen Sie außerdem den Hintergrundbereich ein, der subtrahiert wird, nachdem die Zellen 10 Minuten lang gewaschen wurden, starten Sie den Glukosegradientenfraktionssammler und starten Sie die Zeitrafferbildgebung. Schalten Sie nach 30 Minuten die Software und die Spritzenpumpe mit hohem Glukosegehalt aus. Fahren Sie mit der Perfusion mit niedrigem Glukosespiegel fort, um die Wirkung des hohen Glukosespiegels auszuwaschen.

Stoppen Sie nach 10 Minuten den Fluss von niedrigem Glukosespiegel, indem Sie die Spritzenpumpe ausschalten. Exportieren Sie die Daten nach der Perfusion zur Analyse nach Excel. Die Menge an Insulin, die in das Perfu Eight ausgeschieden wird, kann mit Hilfe von ELA-Mausösen bestimmt werden.

Wurden mit einem linearen Gradienten von zwei bis 25 millimolaren Glukose perfundiert, wie hier gezeigt. Der Kalziumeinstrom und die Insulinsekretion werden nach etwa 13 Minuten Perfusion ausgelöst, was sechs Millimolaren entspricht. Traubenzucker. Veränderungen der mitochondrialen Potentiale werden früher beobachtet, wie erwartet nach etwa 11 Minuten.

Diese Daten zeigen den Vorteil der Verwendung dieses mikrofluidischen Netzwerks zur Charakterisierung der Ösenphysiologie. Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie Sie unser mikrofluidisches Parafusionsgerät für die Untersuchung der Ösenphysiologie verwenden können. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, darauf zu achten, dass sich keine Blasen im Gerät befinden, da dies dazu führen kann, dass sich die Ösen während eines Experiments bewegen.

Außerdem kann der Windschatten bis zu einem ml pro Minute eingestellt werden, ohne die Ösen zu stören. Das war's also. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Glück bei Ihrem Experiment.