Hirnschnitt Stimulation mit einem mikrofluidischen Netzwerk-und Standard-Perfusionskammer

Das Hauptziel des Projekts, das wir Ihnen heute vorstellen werden, ist es, die Stimulation des Gehirnslashes räumlich und vorübergehend steuern zu können. Und ein weiterer wichtiger Punkt ist, dass wir mit einer einfachen Modifikation des bereits komplizierten elektrophysiologischen Aufbaus dieses mikrofluidische Gerät unter den verschiedenen Labors verbreiten können, die diese Stimulation des Gehirnlebens tatsächlich nutzen. Hallo, ich bin Java Chek Mohammad vom Edington Lab im Department of Bioengineering an der University of Illinois in Chicago.

Heute zeige ich Ihnen, wie wir ein einfaches, mikrofabriziertes mikrofluidisches Gerät zur Stimulation von Hirnschnitten anwenden werden. Das Brain-Slice-Gerät, das wir heute vorstellen werden, ist aus mehreren Gründen sehr nützlich, und der Hauptgrund dafür ist, dass es so modular ist, dass es ohne weitere Änderungen in den bestehenden elektrophysiologischen Aufbau integriert werden kann. Und es vermeidet die Verwendung von Schläuchen und Pumpen, die jedes mikrofluidische Gerät erschweren.

Und da wir das passive Pumpverfahren verwenden, benötigen wir keine Schläuche oder Pumpen. Und die dritte Sache ist, dass es sich nur um eine dünne Schicht PDMS-Membran handelt, die zwischen einem Deckglas und einer Standard-Profusionskammer liegt, die in einem Standard-Elektrophysiologie-Setup verwendet wird. Das Verfahren, das ich heute demonstrieren werde, beginnt mit einem C-Acht-Master, der mit dem Standard-SV-Acht-Lithographie-Verfahren hergestellt wird.

Und der Master, den wir heute hier haben, ist ein zweistufiger Master, mit einer Ebene, die das Design der Kanäle, der Mikrokanäle, und einer anderen Ebene für VR-Öffnungen, die über diese Kanäle gehen, damit die Lösungen, die durch die Kanäle fließen, aus den Via-Öffnungen herauskommen können. Wir stellen also diesen Master her, der sich auf einem Silikonwafer befindet, und dann verwenden wir Silikon oder das PDMS, um auf die Oberseite dieses Geräts zu gießen und die Strukturen, die sich auf diesem Wafer befinden, auf das PDMS zu formen. Wir werden also das PDMS auf dieses Gerät gießen lassen.

Und dann nehmen wir die PDMS-Membran, die nach dem Aushärten geformt und mit einem Deckglas verbunden wird. Und dann haben wir unser mikrofluidisches Gerät. Und dann werden wir eine Standard-Profusionskammer modifizieren, indem wir eine dünne Schicht PDMS auf dem Boden der Perfusionskammer anbringen.

Und sobald wir diese modifizierte Perfusionskammer haben, werden wir das mikrofluidische Gerät, das wir früher hergestellt haben, nehmen und es mit der Perfusionskammer verbinden. Es gibt zwei kritische Punkte bei der Herstellung des mikrofluidischen Geräts. Eine davon ist, dass vor dem Einsetzen des PDMS die Heizplatte ausgeschaltet werden sollte, damit das PDMS nicht sofort in die Warteschlange kommt, wenn wir es auf den Wafer gießen.

Und ein weiterer kritischer Punkt ist, dass die Abstandshalter, die wir an den vier Ecken des Siliziumwafers verwenden, eine Höhe haben sollten, die kleiner ist als die höchste Struktur auf dem Siliziumwafer. Damit soll sichergestellt werden, dass die VR-Öffnungen erhalten werden können, wenn wir den Aushärtungsprozess für das PDMS durchführen. Hier sind wir in diesem modularen Reinraum mit weichen Wänden, und das ist das Master, das wir mit einem Standard-C-Eight-Lithographie-Verfahren hergestellt haben.

Und es ist ein zweistufiger Master, wobei die erste Ebene das Design für die Kanäle mit vier Einlässen und einem Auslass hat. Und im mittleren Bereich aller vier Kanäle befinden sich Durchkontaktierungen oder Pos, die auf den Kanälen stehen. Und das sind die Ausrichtungsmarkierungen, die während des Herstellungsprozesses erstellt wurden.

Und jetzt zeige ich Ihnen, wie ich es entfernen und die PDMS-Aushärtung durchführen werde. Aufgrund des Kantenperleffekts ist die Dicke im äußeren Umfang des Wafers größer als bei den eigentlichen Geräten in der Mitte des Papiers. Was wir also tun werden, ist, diese Ausrichtungsmarkierungen mit der Reserv-Klinge zu entfernen und dann, um die Gewichte aufzunehmen, diese Abstandshalter verwenden, die 140 Mikrometer hoch sind, und wir werden sie in vier Ecken des Wafers platzieren.

Du musst also darauf achten, dass die Rasierklinge nicht in die Nähe der eigentlichen Geräte kommt. Jetzt werde ich diese SVA-Partikel mit dem Luftstaubwedel entfernen und der Wafer ist nun bereit für die PDMS-Formvorbereitung. Aber bevor wir das tun, müssen wir diese Abstandshalter anbringen, die 140 Mikrometer hoch sind.

Also werde ich die vier Bänder an den vier Ecken des Wafers platzieren. Dann stelle ich sicher, dass das Klebeband richtig auf dem Wafer haftet. Der Grund, warum das Band 140 Mikrometer hoch war, ist also, dass der zweistufige Master mit den Kanälen und dem VS 150 Mikrometer hoch ist.

Und wenn wir das Gewicht während der PDMS-Aushärtung auf das PDMS legen, wollen wir sicherstellen, dass das PDMS-Blech flach herauskommt. Deshalb verwenden wir an den Ecken vier Abstandshalter mit gleichen Höhen. Jetzt werde ich zeigen, wie wir PDMS codieren und aushärten, um die Geräte herzustellen.

Aber bevor ich das tue, möchte ich Ihnen zeigen, wie wir die PDMS-Lösung vorbereitet haben. Also nehmen wir 10 Teile der Basis und einen Teil des Härters und mischen es aufgrund des Mischprozesses gründlich durch. Sie sehen, dass wir viele Blasen in der PDMS-Lösung erzeugen, um diese Blasen zu entfernen, wir werden das PDMS in die Trockenheit legen, nachdem wir das PDMS 10 Minuten lang in die Trockenheit gelegt haben, gibt es keine Blasen.

Und jetzt ist das PDMS bereit, für die Aushärtung verwendet zu werden. Jetzt zeige ich Ihnen, wie wir das PDMS auf den Wafer aufbringen und aushärten, um die PDMS-Membran zu erhalten. Ich lege also das PDMS auf den Wafer und verwende dann diese Transparenz, um das PDMS abzudecken.

Und das wird uns helfen, das Gerät sup zu entfernen, das Gerät von der Transparenz zu trennen, und dann werde ich die Gewichte auf die Transparenz legen. Und der Grund, warum wir die Gewichte verwenden, ist, eine gleichmäßige Dicke des PDMS zu erhalten. Und ein weiterer kritischer Punkt ist die Beschaffung der Durchkontaktierungsöffnungen.

Wo immer es also VS gibt, wollen wir keine PDMS und die Gewichte werden uns dabei helfen. Wie Sie hier sehen können, ist die Heizplatte ausgeschaltet und der Grund dafür ist, dass wir nicht möchten, dass das PDMS sofort aushärtet, also lassen wir es aus. Und dann müssen Sie sicherstellen, dass der Wafer flach ist, bevor Sie das PDMS portieren.

Und jetzt können wir das PDMS portieren, das wir zuvor vorbereitet haben. Stellen Sie sicher, dass Sie das PDMS nahe genug am Wafer dosieren, damit keine Blasen entstehen. Und der kritischste Punkt hier ist die Art und Weise, wie Sie die Transparenz auf das PDMS legen.

Sie müssen darauf achten, dass Sie durch das Platzieren des Blechs keine Blasen erzeugen. Und jetzt werde ich eines dieser Glaslabore platzieren und das überschüssige PDMS-PDMS aus dem Weg räumen lassen. Ich platziere drei weitere Glaslabore und um sicherzustellen, dass sich die Glaslabore nicht für diesen speziellen Master bewegen.

Und für diese besonderen Merkmale haben wir herausgefunden, dass die Platzierung dieser vier Glaslabore das VS. Und um das PDMS-überschüssige PDMS zwischen der Transparenz und dem Wafer aus dem Weg gehen zu lassen. Wir warten ein bis zwei Minuten und dann können wir die Heizplatte für verschiedene Master und für verschiedene Designs starten, Sie müssen möglicherweise die Anzahl der Glaslabore erhöhen oder die Anzahl der Glaslabore verringern, um die Via-Öffnungen zu erhalten. Jetzt ist die Kochplatte bereit zum Einschalten und ich stelle eine Temperatur von 75 Grad ein.

Und sobald die Temperatur von 75 Grad erreicht ist, können wir den Timer auf eine Stunde stellen und das PDMS aushärten lassen. Nachdem wir das PDMS eine Stunde lang aushärten lassen, können wir die Heizplatte ausschalten und auf 50 Grad Celsius abkühlen lassen. Der Grund dafür ist, dass das SEA nicht reißt.

Wenn wir es sofort von 75 Grad auf Raumtemperatur entfernen, können wir es jetzt ausschalten und warten, bis es auf 50 Grad Celsius heruntergefahren ist. Jetzt, da die Temperatur der Heizplatte auf 50 Grad Celsius gesunken ist, können wir die Gewichte von der Transparenz entfernen. Jetzt können wir den Wafer aus dem Hot Player entfernen und er ist bereit zum Schneiden.

Jetzt ist das PDMS-Blech bereit, von dem A C Eight Master entfernt zu werden, und wir müssen die Aluminiumfolie entfernen. Dann müssen wir das Transparenzblatt entfernen. Wir haben hier die Standard-Perfusionskammer.

Wir haben es so modifiziert, dass wir es ausrichten können. Die Löcher, Einlass- und Auslassöffnungen des mikrofluidischen Geräts. Dies sind also die vier Einlassanschlüsse und ein Auslassanschluss an der PDMS-Membran.

Und diese sollten zu den vier Einlässen und einem Auslass an der Perfusionskammer passen. Jetzt schiebe ich die Perfusionskammer und richte sie dann an den Löchern auf der PDMS-Membran aus. Jetzt, da sie ausgerichtet sind, kann es geschnitten werden.

Jetzt können Sie die Kammer herausnehmen und eine Sonde verwenden. Stellen Sie sicher, dass alle Kanten der PDMS-Membran frei entfernt werden können. Sobald wir das getan haben, können wir einen Gefrierschrank verwenden, um die PDMS-Membran zu entfernen und sicherzustellen, dass Sie das PDMS sehr langsam bewegen, wenn Sie das PDMS von der Oberseite des Geräts entfernen, damit Sie die PDMS-Membran nicht zerreißen.

Jetzt lege ich die PDMS-Membran mit den Hohlräumen, die mit den SC acht Mastern gebildet werden, darauf und stelle sicher, dass sie flach ist. Und der Grund, warum wir das tun, ist, dass das PDMS bei der Herstellung der Löcher, der Einlass- und Auslassöffnungen an der Seite nicht rau ist. Das wird mit dem Deckglas verklebt.

Wir müssen also sicherstellen, dass sich die Hohlräume auf der Oberseite befinden. Jetzt können wir die Einlass- und Auslassöffnungen so machen, dass wir die Löcher deutlich sehen können. Wir haben einen schwarzen Hintergrund eingefügt.

Jetzt werde ich die Einlass- und Auslassanschlüsse erstellen, um sicherzustellen, dass am Anschluss kein PDMS mehr vorhanden ist. So ist es, entfernen Sie alle PDMS. Nun übertragen wir die PDMS-Membran auf ein weiteres Transparentblatt.

So können wir das Blech und den Deckglas mit Plasma behandeln und so ablegen, dass die Hohlräume wieder oben sind. Sobald also diese Oberfläche mit Plasma behandelt wird und das Deckglas mit Plasma behandelt wird, können wir diese beiden Oberflächen zusammenbringen, um das mikrofluidische Netzwerk zu bilden, um die Luftblasen zwischen den PDMS-Platten zu entfernen. Und die Transparenz kann mit Klebeband versehen werden.

Dadurch wird sichergestellt, dass die PDMS-Platte flach ist und die Verklebung viel besser erfolgt. Verwenden Sie dann wieder das Klebeband auf der Oberseite, um Staub von der PDMS-Membran zu entfernen. Jetzt können wir das Deckglas anbringen, das wir mit der PDMS-Membran verbinden werden.

Und jetzt sind diese beiden PDMS und das Glas bereit für die Plasmabehandlung. Wir werden das PDMS und das Deckglas mit diesem mikrowellenmodifizierten Plasmasystem plasmabehandeln, bei dem Sie sehen können, dass diese Glaskammer es uns ermöglicht, das Plasma in dieser Mikrowelle zu erzeugen. Und lassen Sie mich die Proben hineinlegen, um ein Vakuum in der Kammer zu erzeugen.

Jetzt kann ich Sauerstoff einfließen lassen. Jetzt ist das Plasmasystem einsatzbereit und ich werde 10 % Leistung und 10 Sekunden für dieses spezielle System verwenden, um das Plasma zu visualisieren. Während die Plasmabehandlung im Gange war, drehten wir auf, drehten die Leistung auf hundert Prozent auf und schalteten das Licht aus.

Und jetzt können Sie das Plasma sehen: Unmittelbar nach der Plasmabehandlung. Sie müssen die beiden Oberflächen, den Kuhschlupf und das PDMS, verkleben, da sonst die PDMS-Oberfläche durch die Plasmabehandlung ihre Hydrophilie verliert. Sobald Sie den Kuhslip platziert haben, stellen Sie sicher, dass die gesamte Oberfläche ohne Luftblasen miteinander verbunden ist.

Sollten Luftblasen vorhanden sein, können Sie diese entfernen. Jetzt legst du es für fünf Minuten beiseite und lässt es verbinden. Hier haben wir also die modifizierte Perfusionskammer, in der wir den Boden der Kammer mit PDMS modifiziert haben.

Und das wurde schon früher gemacht. Also platzierten wir eine Transparenz auf einer Heizplatte auf einer Kochplatte, die ausgeschaltet war. Und dann haben wir das P-D-M-S-P-D-M-S eingegossen, das auf ähnliche Weise wie zuvor gezeigt zubereitet wurde.

Und dann haben wir die Perfusionskammer auf das PDMS gelegt und dann ein einzelnes Gewicht, wie hier gezeigt, platziert und wir haben es 30 Minuten oder 75 Grad Celsius aushärten lassen. Und jetzt zeige ich, während wir darauf warten, dass das PDMS und die Deckglasverklebung stattfinden, können wir die Kammer vorbereiten. So können wir die Kammer und das mikrofluidische Gerät verbinden.

Wir müssen also überschüssiges PDMS dort entfernen, wo wir es nicht benötigen. Entfernen Sie die Transparenz, dann PDMS, Dann müssen wir das PDMS von den Einlass- und Auslassanschlüssen entfernen. Jetzt ist die Kammer bereit, mit dem mikrofluidischen Gerät, das wir zuvor vorbereitet haben, verbunden zu werden.

Jetzt, da wir fünf Minuten gewartet haben, ist das mikrofluidische Gerät bereit, von der Transparenz getrennt zu werden, aber Sie müssen sicherstellen, dass Sie die Transparenz langsam entfernen. Das PDMS und der Deckslip trennen sich also nicht. Jetzt, da die Perfusionskammer fertig ist, müssen wir die Unterseite der Kammer, in der wir gerade das PDMS zitiert haben, und die Oberseite des mikrofluidischen Geräts, auf dem sich das PDMS befindet, plasmabehandeln.

Jetzt legen wir also beide, diese beiden Teile in die Plasmakammer und führen die Plasmabehandlung bei 10% Leistung für 10 Sekunden durch. Jetzt wurden beide Oberflächen mit dem Plasma behandelt und sind bereit für die Verklebung. Bevor Sie verkleben, müssen Sie sicherstellen, dass die Einlass- und Auslassöffnungen an der Kammer mit dem mikrofluidischen Gerät ausgerichtet sind.

Und da die Merkmale, die wir ausrichten, groß genug sind, benötigen wir keine spezielle Ausrüstung und können dies mit bloßem Auge tun. Sobald Sie die Kammer ausgerichtet und platziert haben, stellen Sie sicher, dass alle Oberflächen in Kontakt sind, und lassen Sie sie dann fünf Minuten lang ruhen. Die Verklebung ist also nach fünf Minuten Wartezeit gut genug für die Experimente.

Nachdem sich das mikrofluidische Gerät mit der Kammer verbunden hat, werden wir die Kanäle in der Kanaloberfläche hydrophil machen. Wenn wir also tatsächlich die A-CFS-Lösung oder andere Neurotransmitter fließen lassen, können die Lösungen leichter durchfließen. Was ich also tun werde, ist, dieses ganze Gerät in das Plasma zu legen und es eine Minute lang bei 10% zu behandeln, damit die gesamten inneren Kanaloberflächen hydrophil werden.

Und dann werde ich es mit Wasser auffüllen und es dann in die Elektrophysiologie bringen, damit wir die eigentlichen Experimente durchführen können. Okay, jetzt sind wir bereit, zum Elektrophysiologie-Setup zu gehen und dieses Gerät tatsächlich mit dem Gehirnschnitt zu verwenden. Hallo, mein Name ist uo.

Ich arbeite mit Dr. Arrington und Dr. Fall vom Department of Bioengineering an der University of Illinois zusammen. Und jetzt werde ich mit dem kostenlosen Mikrogerät arbeiten, das über diese Plattform herübergebracht und einfach gefressen hat. Auf der einen Seite können wir die üppigen Schläuche sehen.

Auf der anderen Seite sehen wir den Saugschlauch. Das Gerät wird also mit einer Liquorlösung durchblutet, die mit 95 % Sauerstoff und 5 % CO2 gefüllt ist. Jetzt, da das Micro-V-Gerät fertig ist, werde ich mir die Gehirnlizenz besorgen und sie dann über das Mikrogerät legen.

Jetzt lege ich die Gehirnscheibe, äh, auf die Oberseite der kreisförmigen Öffnungen, und dann werde ich den Anker verwenden, um die Gehirnscheibe ruhig zu stellen. Jetzt, da die Gehirnscheibe immobilisiert wird, werde ich eh Neurotransmitter verwenden, um sie zu stimulieren. Genau hier haben wir vier Einlässe, also werde ich Neurotransmitter in jeden Einlass geben, indem ich das passive Pumpen von diesen vier Einlässen bis zu diesem Auslass verwende.

Und jetzt wird Dr.Fall über dieses Gerät sprechen. Was ist für uns so wichtig? Hallo, ich bin Chris Fall und wir machen Gehirnphysiologie.

Und der Grund, warum wir Gehirnschnitte verwenden müssen, ist der Zugang mit Mikroelektroden und Bildgebungstechnologie. Und bis jetzt ist die einzige Möglichkeit, die Neurotransmitterumgebung für diese Gehirnschnitte zu verändern, den Fluss über die gesamte Scheibe zu ändern oder die Neurotransmitter mit einer sehr kleinen Mikropipette direkt aufzublasen. Daher sind wir wirklich begeistert, mit der Eddington's Group zusammenzuarbeiten.

Diese neue Technologie wird es uns ermöglichen, große Bereiche des Gehirns anzusprechen und die Neurotransmitter-Umgebung lokal zu verändern. Und dann können wir jetzt gleichzeitig mit unseren, mit unseren Elektroden und unserer bildgebenden Technologie hineingehen und vielleicht irgendwann Multi-Elektroden-Aufzeichnungsgeräte in dieselbe Einheit einbauen. Okay, hier sehen Sie also eine, eine Scheibe Mausverstauchung in dem mikrofluidischen Gerät.

Und man merkt schon mit dem Auge, dass das Gehirn aus vielen verschiedenen Regionen besteht. Diese Regionen machen unterschiedliche Dinge. Und beim lebenden Tier hätten diese verschiedenen Regionen des Gehirns unterschiedliche neuromodulatorische und Neurotransmittertonus.

Und wir wollen in der Lage sein, dies in unserer Schnittkammer zu replizieren, während wir elektrophysiologische und bildgebende Aufzeichnungen machen. Und so ist es wirklich super, diese unterschiedlichen Bereiche mit unterschiedlichen Neurotransmittern in unterschiedlichen Konzentrationen und mit unterschiedlichen Zeitverläufen ansprechen zu können. Und obwohl wir Neurotransmitter nicht wirklich visualisieren können, können wir Ihnen hier ein Beispiel für Fluoreszenzfarbstoff zeigen, der in verschiedenen Regionen in die Gehirnscheibe gepumpt wird.

Hier sehen Sie einen Film, in dem wir fluoreszierenden Farbstoff durch die Kanäle des Geräts fließen lassen und uns nur vorstellen, wie er aus den Poren kommt, die hergestellt wurden. Und schon bei diesem frühen Prototyp sieht man, wie präzise die räumliche Auflösung mit der Strömung ist. Während wir uns den Film ansehen, sehen Sie, wie der Farbstoff in die Kanäle und dann aus den Löchern fließt, und dann spülen wir diesen Farbstoff heraus, um Ihnen eine Vorstellung davon zu geben, wie die zeitliche Auflösung des Flusses ist.

Vielen Dank, dass Sie heute bei uns sind. Ich denke, dass wir in der Lage waren zu zeigen, wie Mikrofluidik und Mikromaschinen mit traditionellen physiologischen Techniken verbunden werden können, um uns zu helfen, zu verstehen, wie das Gehirn funktioniert. Danke.