Humanes Pseudoislet-System zur synchronen Bestimmung der Dynamik fluoreszierender Biosensoren und Hormonsekretionsprofile
3. November 2023
Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur synchronen Erfassung und Co-Registrierung von intrazellulären Signalereignissen und der Sekretion von Insulin und Glukagon durch primäre humane Pseudoinseln unter Verwendung der adenoviralen Verabreichung eines zyklischen Adenosinmonophosphat (cAMP)-Biosensors, eines cAMP-Differenzdetektors in situ (cADDis) und eines Mikroperifusionssystems.
Unser Labor arbeitet daran, Betazell-Dysfunktion und andere Augenlidanomalien bei Typ-1- und Typ-2-Diabetes zu verstehen, zu verhindern und umzukehren. Unsere Studien konzentrieren sich auf die Pathogenese des menschlichen Diabetes, indem wir Studien zur Biologie der menschlichen Bauchspeicheldrüse und Augenlider sowie zur Gesundheit und Krankheit integrieren. Menschliche Ösen sind sphärische 3D-Strukturen, und der Zugang zu Zellen über die gesamte Öse hinweg stellt einige experimentelle Herausforderungen dar.
Wenn wir beispielsweise versuchen, Biosensoren einzuführen, um die Signalübertragung von Augenzellen zu verstehen, überwindet unser Pseudo-Augenlidprotokoll diese Herausforderung, indem es genetische Manipulationen im Einzelzellzustand durchführt und diese transduzierten menschlichen Augenzellen für nachgelagerte Studien zu Pseudo-Augenlidern aggregiert. Unser Pseudo-Augenlidsystem ermöglicht es uns, Biosensoren in der gesamten Öse und nicht nur in der Augenlidoberfläche zu exprimieren. In Kombination mit unserer Lebendzell-Bildgebung und unserem Mikroperfusionssystem können wir dynamische intrazelluläre Prozesse mit nachgeschalteter Hormonsekretion sowohl messen als auch mitregistrieren.
Dieses Protokoll könnte angewendet werden, um eine Vielzahl wichtiger wissenschaftlicher Fragen zu beantworten. Zum Beispiel könnten Gen-Silencing-Strategien mit diesem Ansatz kombiniert werden, um den Einfluss eines interessierenden Gens auf die Augenlidfunktion und die damit verbundenen Signalwege zu verstehen, entweder global oder auf selbstspezifische Weise.
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Übersicht
Diese Studie befasst sich mit der Dysfunktion von Beta-Zellen und Inselzellabnormalitäten bei Diabetes und nutzt ein Pseudoinsel-Modellsystem zur synchronen Erfassung zellulärer Signalgebung und Hormonsekretion. Die Methode verwendet die adenovirale Expression eines cAMP-Biosensors in Kombination mit einem Mikroperfusionssystem, um dynamische Analysen der Insulin- und Glucagonantworten zu ermöglichen.
Wesentliche Studienkomponenten
Forschungsbereich
- Typ-1- und Typ-2-Diabetes
- Biologie menschlicher Inseln
- Dynamik der Zellsignalübertragung
Hintergrund
- Menschliche Inseln sind kugelförmige Strukturen, die experimentelle Herausforderungen darstellen.
- Das Pseudoinsel-Protokoll löst diese Herausforderungen für eine effektive Einführung von Biosensoren.
- Das Verständnis der Insel-Signalübertragung ist entscheidend für die Diabetesforschung.
Verwendete Methoden
- Adenovirale Expression von Biosensoren
- Primäres menschliches Pseudoinsel-Modell
- Mikroperfusionssystem zur Messung der Hormonsekretion
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche gleichzeitige Erfassung intrazellulärer Signalübertragung und Hormonfreisetzung.
- Möglichkeit der Analyse der Auswirkungen der Genstilllegung auf die Inselfunktion.
- Dynamische Überwachung von Sekretionsantworten in Echtzeit.
Schlussfolgerungen
- Diese Studie liefert ein robustes Protokoll zur Untersuchung der Inselhormonsignalübertragung.
- Sie hat bedeutende Implikationen für das Verständnis der Inselbiologie bei Diabetes.
Häufig gestellte Fragen
Ausführliche Bedeutung für die Industrie
Das humane Pseudo-Insel-System ermöglicht eine synchrone, quantitative Beurteilung der intrazellulären Signalübertragung und Hormonsekretion in primären menschlichen Inselzellen und trägt damit zur Lösung eines kritischen Engpasses bei der Validierung von Diabeteszielen bei. Durch die Möglichkeit der genetischen Modifikation und Integration von Biosensoren in der gesamten dreidimensionalen Inselstruktur verbessert diese Plattform das Vorhersagevertrauen in mechanistischen Studien und unterstützt risikoadjustierte Portfolioentscheidungen in der Forschung zu Stoffwechselerkrankungen. Die Kombination von Live-Cell-Imaging und Mikroperfusion-Workflows positioniert sie als wiederverwendbare Ressource für frühe Entdeckungs- und translationsmedizinische Forschungspipelines.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen durch die Verknüpfung intrazellulärer Signalgebung mit der Hormonsekretion in menschlichen Inselzellen.
- Unterstützt die biologische Risikominderung durch Gen-Silencing oder auf Biosensoren basierende Aufklärung von Signalwegen in einem physiologisch relevanten 3D-Kontext.
- Stärkt die Vorhersagesicherheit und funktionelle Zielstrukturvalidierung für Programme zu Diabetes und Stoffwechselerkrankungen.
Screening und Assay-Entwicklung
- Bereitet validierte Pseudoinsel-Systeme für die nachgeschaltete Wirkstoff-Screening und mechanistische Assays vor.
- Standardisiert Assay-Bedingungen für reproduzierbare, quantitative Messung der Hormonsekretion und Biosensor-Dynamik.
- Ermöglicht eine skalierbare, multiplexfähige Evaluierung von kandidatenbasierten Interventionen in einem menschenrelevanten Modell.
Translationale und präklinische Forschung
- Stimmt in vitro-Befunde mit der krankheitsrelevanten Biologie menschlicher Inseln für die translationale Biomarkerentwicklung ab.
- Ermöglicht Kontinuität von der Entdeckung bis zur präklinischen Validierung, indem die mechanistische Entschärfung von Risiken in primärem humanem Gewebe ermöglicht wird.
- Unterstützt risikoadjustierte Entscheidungen zur Weiterentwicklung durch Integration funktioneller und Signalantworten.
Pipeline- und Workflow-Integration
Dieses System verbindet die frühe Entdeckung, die Zielvalidierung und die präklinische Forschung, indem es die hypothesengetriebene Untersuchung der Inselzell-Signalübertragung und -funktion in einem einzigen Arbeitsablauf ermöglicht.
- Entdeckungsbasierte Biologie: Unterstützt die Überprüfung mechanistischer Hypothesen und die Aufklärung von Signalwegen durch gleichzeitige Biosensor- und Hormonmessungen.
- Screening: Bietet assaysbereite, reproduzierbare Pseudoinsel-Modelle zur quantitativen Bewertung von Interventionen.
- Analytik: Ermöglicht dynamische, quantitative Messungen der cAMP-Signalübertragung und der Hormonsekretion für eine robuste Vergleichbarkeit von Bedingungen.
- Translationale Forschung: Verbindet mechanistische Erkenntnisse aus In-vitro-Modellen mit der Biologie menschlicher Erkrankungen und unterstützt die Abstimmung von Biomarkern.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Bietet eine standardisierte, anpassungsfähige Plattform für den wiederholten Einsatz in verschiedenen Forschungsprogrammen zu Stoffwechselerkrankungen.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit und verringert mechanistische Unschärfen bei der Validierung von Diabetes-Zielen.
- Operativer Wert: Verbessert Standardisierung, Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit funktioneller Inselzelltests.
- Strategischer Wert: Verbessert die Qualität von Go/No-Go-Entscheidungen und die Kapitalnutzungseffizienz durch Integration funktioneller und Signalisierungsdaten.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht risikoadjustierte Priorisierung und Weiterentwicklung von Wirkstoffen gegen Stoffwechselerkrankungen.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in der Gewinnung menschlicher Inseln, genetischen Modifikationen und Live-Cell-Imaging.
- Setzt Zugang zu konfokaler Mikroskopie, Mikroperfusionssystemen und quantitativer Hormonanalytik voraus.
- Erfordert eine standardisierte Vorgehensweise zwischen verschiedenen Arbeitsgruppen bei der Herstellung von Pseudoinseln und der Durchführung von Assays.
- Möglicherweise ist eine Anpassung an verschiedene Spenderquellen oder Krankheitsmodelle notwendig.
- Die Durchsatzrate und Skalierbarkeit sind durch die Verfügbarkeit von Primärgewebe und die technische Komplexität begrenzt.
