A Practical Approach to Genetic Inducible Fate Mapping: A Visual Guide to Mark und Track Cells In Vivo

Fate-Maps werden erstellt, indem Zellen in vivo markiert und verfolgt werden, um zu bestimmen, wie Vorläuferzellen zu bestimmten Strukturen und Zelltypen in sich entwickelndem und adultem Gewebe beitragen. Eine Weiterentwicklung dieses Konzepts ist die genetisch induzierbare Fate-Mapping- oder GIFM-Methode, die Genexpression und Zellverhalten in vivo verknüpft, um Fate-Maps basierend auf genetischer Abstammung zu erstellen. Hallo, mein Name ist Deborah Ellisor vom Mark-Services-Laboratorium und der Abteilung für Molekularbiologie, Zellbiologie und Biochemie der Brown University.

Heute werden meine Kollegen Ashley Brown, Liz Norman Neen Hagen, Steve Brown und ich ein Verfahren zur genetisch induzierbaren Fate-Mapping-Darstellung demonstrieren. Wir verwenden dieses Verfahren im Labor, um die frühe Gehirnentwicklung zu untersuchen. Diese Technik kann außerdem auf Gen-Inaktivierungsstudien und tierische Modelle menschlicher Krankheiten angewendet werden.

Beginnen wir also mit X cre, E-R-M-G-F-P-Embryonen. MGFP LAE ist ein Reporterallel, das in allen Zellen vorhanden ist, dargestellt durch graue Ovale X cre, er, wobei X für genregulatorische Elemente steht. Die Kontrolle der C ER-Expression ist räumlich auf den Expressionsbereich des Gens X, dargestellt in Blau, beschränkt, und das CRE ER-Protein wird durch HSP 90 im Zytoplasma sequestriert.

Bei Abwesenheit von Tamoxifen ist der Reporter ausgeschaltet. Die Gabe von Tamoxifen führt zu einer Zelllinienmarkierung im Bereich X, da CER von HSP90 freigesetzt wird, in den Zellkern transloziert und die Stop-Kassette aus dem Reporterallel entfernt. Eine dauerhafte und vererbbare Rekombination gewährleistet, dass die Zellen kontinuierlich MG FP LA Z exprimieren. Die Kombination aus dem Reporterallel CER und Tamoxifen ermöglicht die Markierung von Zellpopulationen, die ursprünglich anhand der Genexpression in einer primordialen Hirnregion des Embryos markiert wurden; diese Zelllinien können verfolgt werden, auch nachdem die anfängliche Genexpression, die CER aktiviert hat, erloschen ist.

Auf diese Weise können die endgültige Verteilung und das terminale Schicksal einer genetisch definierten Zelllinie im erwachsenen Organismus identifiziert werden. Dieses Verfahren beginnt mit der Herstellung einer 20 Milligramm pro Milliliter Stammösung von Tamoxifen, indem 200 Milligramm Tamoxifen in 10 Milliliter vorgewärmtem Maiskeimöl in einem Glasinhalationsfläschchen gelöst werden.

Anschließend die Lösung zwei Stunden lang bei 37 Grad Celsius auf einem Tator-Vortex inkubieren. Die Lösung zeitweilig vor Licht schützen, indem das Gefäß mit Aluminiumfolie umwickelt wird, und die vorbereitete Tamoxifen-Stammlösung bei vier Grad Celsius lagern. Die Stammlösung kann bis zu einem Monat verwendet werden.

Bei Experimenten zur Zelllinienverfolgung (Fate Mapping) wird ein Zuchtpaar aus einer weiblichen Wildtyp-Schweizer Webster-Maus und einem männlichen Tier, das sowohl ein genspezifisches CreER-Allel als auch ein Reporterallel trägt, angelegt. Für die vorliegende Demonstration verwenden wir einen win:1-CreER-MG-FP-Männchen. Überprüfen Sie jedes Morgen das weibliche Schweizer Webster-Tier auf das Vorhandensein eines Vaginalpfropfens.

Weisen Sie dem Morgen des Tages, an dem der Vaginalpfropf beobachtet wurde, 0,5 Tage post coitum zu und berechnen Sie den Zeitpunkt der Tamoxifenverabreichung. Basierend auf diesem Ausgangspunkt wird in diesem Experiment Tamoxifen am embryonalen Tag 8,5 verabreicht. Ziehen Sie mit einer Ein-Milliliter-Spritze und einer Fütterungskanüle für Tiere 200 Mikroliter der Tamoxifen-Stammlösung auf.

Halten Sie die befruchtete Swiss Webster-Maus fest, indem Sie das Nacken- und Rückenfell greifen, um den Kopf zu immobilisieren, und drehen Sie die Maus um, sodass die Bauchseite nach oben zeigt. Halten Sie den Schwanz mit den freien Fingern fest, um den Körper in einer geraden Linie zu halten. Setzen Sie danach die Fütterungskanüle in den Mundwinkel ein und führen Sie die Kanüle vorsichtig parallel zum Gaumen, bis sich die Spitze der Fütterungskanüle ungefähr auf Höhe des Auges befindet.

Neigen Sie den Kopf vorsichtig nach hinten, um Zugang zur Speiseröhre zu erhalten. Führen Sie die Nadel am Epiglottis vorbei und entlang der Speiseröhre in Richtung Magen. Achten Sie darauf, nicht in die Luftröhre einzudringen.

Sobald sich die Fütterungskanüle im Magen befindet, das Tamoxifen verabreichen und die Kanüle entfernen. Anschließend die weibliche Maus in ihren Heimkäfig zurückbringen, bis zum Tag der Sektion. Am Tag der Sektion werden E 12,5-Embryonen der zeitlich befruchteten Weibchen freigehäutet und anschließend auf GFP-Markierung untersucht.

In einem GFP-positiven Embryo beobachten wir, dass aus Wind-1-stammende Neuronen zum Mittelhirn, zum hinderen Gehirn und zum Rückenmark beitragen. Der MG-FP-Reporter markiert axonale Projektionen, die ebenfalls in Transferembryos sichtbar sind, die GFP-positiv sind. Montieren Sie diese auf einem Objektträger in einer Petrischale mit PPS und fotografieren Sie sie mithilfe eines Bilderrahmens. Nachdem die Embryos fotografiert wurden, verwenden Sie Pinzette, um von jedem Embryo ein kleines Stück des Schwanzes abzuzupfen, und legen Sie jedes Stück in ein PCR-Röhrchen. Das Gewebe wird mittels PCR für beide Allele genotypisiert, um die Ergebnisse der Ganzpräparat-Analyse zu bestätigen.

Die folgenden Verfahren ermöglichen es uns zu analysieren, wie die markierten Zellen, die aus embryonalen Regionen stammen, das erwachsene Gehirn besiedeln, bevor die Kraniotomie begonnen wird. Bestätigen Sie durch einen Zehenquetschtest, dass die Maus vollständig anästhesiert ist. Führen Sie nach der Anästhesie mit Nembutal Inzisionen durch, um über den Rippenkorb Zugang zum Herzen zu erhalten.

Bringen Sie als Nächstes eine Butterfly-Kanüle in die Herzspitze oder den linken Ventrikel ein und sichern Sie diese mit der C-Klemme. Erstellen Sie mit einer Schere eine Austrittsstelle für die Flüssigkeit im rechten Vorhof und spülen Sie dann mit 10 bis 15 Milliliter eiskalter Kochsalzlösung, bis die Flüssigkeit klar abläuft. Anschließend spülen Sie mit 20 bis 25 Milliliter 4 % Paraformaldehyd.

Wenn die intrakardiale Perfusion abgeschlossen ist, entfernen Sie den Kopf mit einer Schere, indem Sie die Wirbelsäule knapp oberhalb der Schultern durchtrennen. Führen Sie ein Skalpell entlang der dorsalen Mittellinie des Kopfes von kaudal nach kranial, um die Kopfhaut zu durchtrennen und den Schädel freizulegen. Entfernen Sie mit dem Skalpell überschüssiges Gewebe oder Muskel an den Seiten und am Hinterhaupt des Schädels.

Stechen Sie mit einer Pinzette an der Mittellinie, knapp kaudal der Riechkolben, in den Schädel ein und erzeugen Sie ein kleines Loch, um die Spitzen einer feinen Schere einzuführen. Führen Sie die feine Schere in dieses Loch ein und führen Sie zwei bilaterale Schnitte von der Mittellinie entlang der Länge der Riechkolben durch. Dieser Schnitt durchtrennt den Schädel am Übergang zwischen Nasenbein und Stirnbein und ermöglicht einen guten Zugang für die Schere.

Schneiden Sie entlang der sagittalen Nähte im Schädel, wobei Sie darauf achten sollten, die Scheren Spitzen von dem Gehirn wegzuwinkeln, um das darunterliegende Gewebe nicht zu beschädigen. Fassen Sie anschließend den Schädel vorsichtig mit einer Pinzette an und lösen Sie das Knochengewebe entlang des medialen Einschnitts ab, um das Gehirn freizulegen. Der Schädel kann in kleinen Stücken abplatzen oder in größeren Segmenten abbrechen.

Setzen Sie die Pinzette ein, um alle frontalen Parietal-, Interparietal- und Okzipitalknochen zu entfernen. Lösen Sie die an den seitlichen Rändern des Gehirns auf Höhe des Kleinhirns gelegenen Paraoculi, indem Sie vorsichtig die kugelförmigen Knochen auf jeder Seite einklemmen. Schneiden Sie mit einer Schere vorsichtig den dorsalen Teil des Knochens durch, der den Hirnstamm umgibt.

Führen Sie eine Seite der Schere direkt unterhalb der dorsalen Kante des Knochens ein, beginnend dort, wo das Rückenmark durchtrennt wurde, und schneiden Sie in Richtung Kleinhirn, um den Hirnstamm und das Kleinhirn freizulegen. Entfernen Sie den verbleibenden Knochen um den Hirnstamm mit der Pinzette.

Ziehen Sie die Knochen vorsichtig auseinander, drehen Sie den Kopf mit der dorsalen Seite nach unten und durchtrennen Sie mit der Pinzette die Hirnnerven, um das Gehirn aus dem Schädel zu lösen. Legen Sie das Gehirn in eine Petrischale mit Eis. Kaltes PPS: Untersuchen Sie das erwachsene Gehirn auf GFP-Markierung unter Verwendung eines fluoreszierenden Stereomikroskops und fotografieren Sie es mithilfe eines Bilderrahmens.

In diesem Beispiel wird das Mittelhirn durch GFP markiert und zusätzlich zur Linienanalyse während der Embryogenese genutzt; im adulten Zustand kann die GIFM mit anderen in der Entwicklungsbiologie üblichen Anwendungen kombiniert werden, wie beispielsweise Mikrodissektion und Gewebsexplantat-Experimenten. Beispielsweise stellt das ventrale Mesencephalon die Vorläuferzone für die Entwicklung dopaminerger Neuronen dar, die das Gen wind one exprimieren. Daher ermöglicht die Isolierung des ventralen Mesencephalons mittels Mikrodissektion die Schaffung eines in-vitro-Systems, um dessen Entwicklung weiter zu untersuchen.

Dies stellt nur ein Beispiel für die Verwendung von GIFM dar, um eine Vorläuferzone von Interesse zu isolieren, die durch die genetische Geschichte definiert ist. Um dieses Verfahren zu beginnen, überführen Sie die zuvor identifizierten GFP-positiven Embryonen mithilfe einer feinen Schere in eine Zellkulturschale mit eiskaltem sterilen PBS. Entfernen Sie den Kopfbereich eines Embryos, indem Sie quer zur Rommy abgetrennt schneiden.

Als Nächstes entfernen Sie den rostralen Kopfanteil durch einen koronalen Schnitt durch das Cephalon. Dadurch wird eine röhrenförmige Struktur freigelegt, in der das vierte Ventrikel durch das Mesozephalikvesikel einen Kanal zwischen dorsalen und ventralen Geweben bildet. Führen Sie vorsichtig die Scherenspitzen in das vierte Ventrikel ein und schneiden Sie entlang der dorsalen Mittellinie bis zum Rostro-Ende, um die Röhre vollständig zu öffnen, wodurch eine „Open-Book“-Präparation entsteht.

Das ventrale Mesencephalon wird nun medial freigelegt. Während die beiden dorsalen Hälften des Mesencephalons lateral liegen bleiben, kann es notwendig sein, verbliebene nicht-neurale Gewebe unterhalb des ventralen Mesencephalons zu entfernen. Damit das Explantat flach liegen kann, sollte es nun einer Butterfly-Form ähneln, bei der das dorsale Mesencephalon die Flügel und der Thrombus den Schwanz darstellt.

Um das ventrale Mesencephalon für Fax-Analysen oder Zellkulturs experimente weiter zu isolieren, entfernen Sie die lateralen Anteile des Gewebes. Nun zeigen wir einige repräsentative Ergebnisse der GIFM. In diesem Experiment werden WINT-eins-exprimierende Zellen, die bis zum Zeitpunkt E 8,5 markiert sind, visualisiert, um zu bestimmen, wie WINT-eins-dirigierte Zellen zur Entwicklung neuronaler Strukturen beitragen.

Beispielsweise zeigen C EER MG FP-Embryonen bei E 12,5 nach einer Tamoxifen-Gabe bei E 8,5 bei hoher Vergrößerung eine GFP-Fluoreszenz hauptsächlich im Mittelhirn, im hinteren Bereich des Nachhirns und im Rückenmark; feine neuronale Fortsätze sind sichtbar, die innervieren. Markierte Zellen im Mittelhirn, in der Körperwand, in den Gliedmaßen sowie im kraniofazialen Bereich können ebenfalls auf zellulärer Ebene mithilfe der Immunhistochemie sichtbar gemacht und analysiert werden. Wie in diesem einen Mikrometer dicken optischen Schnitt eines bei E 12,5 markierten Embryos gezeigt, weisen die rot markierte Antikörperfärbung gegen nukleäres Beta-Galaktosid und die grün markierte Antikörperfärbung gegen GFP auf fate-mapped Zellen im ventralen Mittelhirn hin.

Hier sind die kombinierten Zellen doppelt positiv aufgrund der Art des konditionalen MGFP-Reporters im erwachsenen Gehirn. Die Dichte des reifen Gewebes kann die GFP-Fluoreszenz, die von inneren Gehirnstrukturen ausgeht, verdecken. Daher zeigt die Fluoreszenzmikroskopie von Ganzpräparaten nur schwache GFP-Fluoreszenz im oberen CUI des erwachsenen Gehirns bei der Beurteilung des Sieges.

Eine Linie, die am E 8,5 in adulten Schnitten mit Mikroskopie geringer Vergrößerung markiert wurde, zeigt, dass die WIN-Ein-Linie Mittelhirnstrukturen hervorbringt, einschließlich der oberen und unteren Colliculi. In diesem Bild mit höherer Vergrößerung, das aus dem ventralen Mittelhirn in der Nähe dopaminerger Neuronen stammt, sind kernlokalisierter Beta-Catenin-positiver Zellen und ein reiches GFP-positives axonales Plexus sichtbar. Im Gegensatz dazu führt die Markierung am E 9,5 zu einer umfangreichen GFP-Färbung, die im unteren Colliculus des Mittelhirns mittels Ganzpräparat-Fluoreszenz leicht beobachtet werden kann. Die WINT-Ein-Linie, die am E 9,5 in adulten Schnitten markiert wurde, konzentriert sich gemäß Mikroskopie geringer Vergrößerung im unteren Colliculus.

In diesem Bild mit höherer Vergrößerung, das aus dem ventralen Mittelhirn dopaminergen Neuronen entnommen wurde, sind kernständige, Beta-Gal-positiven Zellen und ein reiches, GFP-positive axonales Plexus sichtbar. Während also aus WIN1-abstammende Neuronen, die bis E8,5 im Vergleich zu E9,5 markiert sind, progressiv daran gehindert werden, zum dorsalen Mittelhirn beizutragen, bleibt die WIN1-Linie weiterhin an der Bildung des ventralen Mittelhirns beteiligt.

Wir haben Ihnen soeben die Vorgehensweise der genetisch induzierbaren Fate-Mapping zur Markierung und Verfolgung von Zelllinien in vivo gezeigt. Dies ermöglicht es uns, Zellen basierend auf ihrer genetischen Herkunft zu markieren und sie über die Zeit hinweg zu verfolgen, selbst nachdem die Genexpression erloschen ist. Durch die Gabe von Tamoxifen zu einem Zeitpunkt von acht einhalb haben wir gezeigt, dass die wit-one-Domäne neben dem gesamten Mittelhirn im Erwachsenenstadium auch am sich entwickelnden Mittelhirn beteiligt ist.

Im Gegensatz dazu führt die Verabreichung von Tamoxifen zu einem Zeitpunkt von neun einhalb, wenn die wit1-Domäne bereits eingeschränkt ist, zu einer stärker begrenzten Beteiligung an der Entwicklung des Mittelhirns während der Embryogenese, die bis ins Erwachsenenalter anhält. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist zu berücksichtigen, dass das System Zellen mosaikartig markiert und daher möglicherweise nicht alle Zellen einer bestimmten Struktur gefärbt werden. Dies liegt wahrscheinlich an der verwendeten CRE-ER-Linie oder dem verwendeten konditionalen Reporterallel.

Wichtig ist, dass, obwohl die Zellmarkierung mosaikartig ist, das Muster und die Verteilung der mar-Zellen hochgradig reproduzierbar ist. Wir haben festgestellt, dass die Verabreichung von Tamoxifen per oraler Gavage im Vergleich zur Applikation per intraperitonealer Injektion vorteilhaft ist, da sie die Entzündung im intraperitonealen Raum sowie mechanische Schäden an den Embryonen minimiert. Das war's also.

Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.