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A Practical Approach to Genetic Inducible Fate Mapping: A Visual Guide to Mark and Track Cells In Vivo

A Practical Approach to Genetic Inducible Fate Mapping: A Visual Guide to Mark und Track Cells In Vivo

Full Text

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13:36 min

December 30, 2009

DOI: 10.3791/1687-v

Ashly Brown¹, Stephen Brown², Debra Ellisor², Nellwyn Hagan¹, Elizabeth Normand¹, Mark Zervas²

¹Department of Neuroscience, Division of Biology and Medicine,Brown University, ²Department of Molecular Biology, Cell Biology and Biochemistry, Division of Biology and Medicine,Brown University

Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.

Summary

Genetische Inducible Fate Mapping (GIFM) markiert und verfolgt Zellen mit feinen räumlichen und zeitlichen Steuerung

Transcript

Schicksalskarten werden durch Markieren und Verfolgen von Zellen in vivo erstellt, um zu bestimmen, wie Vorläuferzellen zu bestimmten Strukturen und Zelltypen in sich entwickelndem und adultem Gewebe beitragen. Ein weiterer Fortschritt in diesem Konzept ist die genetische induzierbare Schicksalskartierung oder GIBM, die Genexpression, Sulfat und Zellverhalten in vivo verknüpft, um Schicksalskarten auf der Grundlage der genetischen Abstammung zu erstellen. Hallo, mein Name ist Deborah Ellisor vom Mark Services Laboratory und der Abteilung für Molekularbiologie, Zellbiologie und Biochemie an der Brown University.

Heute werden meine Kollegen Ashley Brown, Liz Norman, Neen Hagen, Steve Brown und ich ein Verfahren zur genetischen Kartierung von Schicksalen demonstrieren. Wir verwenden dieses Verfahren im Labor, um die frühe Entwicklung des Gehirns zu untersuchen. Wir können diese Technik auch auf Geninaktivierungsstudien und Tiermodelle menschlicher Krankheiten anwenden.

Fangen wir also an: In X cre, E-R-M-G-F-P Embryonen. MGFP LAE ist ein Reporterallel, das in allen Zellen vorkommt, die durch graue Ovale X cre, er repräsentiert werden, wobei X für genregulatorische Elemente steht. Die Kontrolle der C-ER-Expression ist räumlich auf die blau dargestellte Expressionsdomäne des Gens X beschränkt, und das CRE-ER-Protein wird durch HSP 90 im Zytoplasma sequestriert.

In Abwesenheit von Tamoxifen ist der Reporter ausgeschaltet. Die Verabreichung von Tamoxifen führt zu schicksalskartierten Zellen in Domäne X, da CER von HSP freigesetzt wird, 90 in den Zellkern transloziert und die Stoppkassette aus dem Reporterallel entfernt. Permanente und vererbbare Rekombination stellt sicher, dass die Zellen konstitutiv MG FP LA Z exprimieren.Die Kombination von Reporterallel CER und Tamoxifen führt zur Markierung: Wenn eine Zellpopulation zunächst in einer primordialen Hirnregion des Embryos auf der Grundlage der Genexpression markiert wird, werden diese schicksalskartierten Zellen auch nach dem Löschen der ursprünglichen Genexpression, die zur Steuerung der CER verwendet wurde, verfolgt.

Auf diese Weise. Die endgültige Verteilung und das endgültige Schicksal einer genetisch definierten Zelllinie kann beim Erwachsenen identifiziert werden. Dieses Verfahren beginnt mit der Herstellung einer 20 Milligramm pro Milliliter Stängellösung von Tamoxifen, lösen Sie 200 Milligramm des Tamoxifens in 10 Millilitern Maisöl aus der Vorkriegszeit in einem Inhalationsfläschchen aus Glas.

Dann inkubieren Sie die Lösung zwei Stunden lang bei 37 Grad Celsius auf einem Tator-Wirbel. Die Lösung schützt die vorbereitete Tamoxifen-Stammlösung intermittierend vor Licht, indem sie das Fläschchen mit Folie umwickelt und bei vier Grad Celsius lagert. Der Vorrat kann bis zu einem Monat lang verwendet werden.

Für Schicksalskartierungsexperimente stellen Sie ein Zuchtpaar her, das aus einem Wildtyp-Swiss-Webster-Weibchen und einem Männchen besteht, das sowohl ein genspezifisches CreER-Allel als auch ein Reporterallel trägt. Für die Zwecke dieser Demonstration verwenden wir einen Gewinn für einen CreER MG FP-Rüden. Überprüfen Sie die Swiss Webster-Hündin jeden Morgen auf das Auftreten eines Vaginalpfropfens.

Bestimmen Sie den Morgen des Tages des Vaginalplugs als 0,5 Tage nach dem Cotus und berechnen Sie das Datum der Verabreichung von Tamoxifen. Basierend auf diesem Ausgangspunkt in diesem Experiment wird Tamoxifen am embryonalen Tag 8.5 verabreicht. Ziehen Sie mit einer Ein-Milliliter-Spritze und einer Fütterungsnadel 200 Mikroliter der Tamoxifen-Stiellösung auf.

Halten Sie die zeitgesteuerte schwangere Schweizer Webster-Hündin fest, indem Sie den Nacken und den Rücken greifen, um den Kopf ruhigzustellen, und drehen Sie die Maus so um, dass die Bauchseite nach oben zeigt. Halte den Schwanz zwischen deinen freien Fingern, um den Körper in einer geraden Linie zu halten. Führen Sie anschließend die Zuführnadel in den Mundwinkel ein und führen Sie die Nadel vorsichtig parallel zum Gaumen, bis sich die Spitze der Zuführnadel ungefähr an der Position des Auges befindet.

Neigen Sie den Kopf vorsichtig nach hinten, um Zugang zur Speiseröhre zu erhalten. Führen Sie die Nadel an der Epiglottis vorbei und die Speiseröhre hinunter in Richtung Magen. Achten Sie darauf, nicht in die Luftröhre zu gelangen.

Sobald sich die Fütterungsnadel im Magen befindet, verabreichen Sie das Tamoxifen und entfernen Sie die Nadel. Bringen Sie dann das Weibchen bis zum Datum der Sektion in ihren Heimatkäfig zurück. Am Tag der Sektion werden E 12,5-Embryonen der zeitgesteuerten trächtigen Hündin frei präpariert und anschließend für die GFP-Markierung untersucht.

In einem GFP-positiven Embryo beobachten wir, dass vom Wind abgeleitete Neuronen zum Mittelhirn beitragen, das Hinterhirn und das Rückenmark verhätscheln. Der MG FP-Reporter beschriftet axonale Projektionen, die auch zu sehen sind. Embryonen, die GFP-positiv sind, zu Hause zu übertragen, in eine Petrischale mit PPS zu montieren und sie mit einem Bilderrahmen zu fotografieren. Nachdem die Embryonen fotografiert wurden, kneifen Sie mit einer Pinzette ein kleines Stück Schwanz von jedem Embryo ab und legen Sie jedes Stück in ein PCR-Röhrchen. Die Gewebe werden mittels PCR für beide Allele genotypisiert, um die Ergebnisse der Whole-Mount-Analyse zu bestätigen.

Mit den folgenden Verfahren können wir analysieren, wie die markierten Zellen aus embryonalen Regionen das erwachsene Gehirn besiedeln, bevor mit der Kraniotomie begonnen wird. Bestätigt durch eine Zehenklemme, dass die Maus vollständig innu. Die mit Nembutal Isierten führen Schnitte durch, um durch den Brustkorb Zugang zum Herzen zu erhalten.

Als nächstes platzieren Sie eine Schmetterlingsnadel in der Spitze oder linken Herzkammer des Herzens und befestigen sie mit der C-Klemme. Schaffen Sie mit einer Schere eine Flüssigkeitsaustrittsstelle im rechten Vorhof und perfundierten Sie dann mit 10 bis 15 Millilitern eiskalter Kochsalzlösung, bis die Flüssigkeit klar ist. Gefolgt von 20 bis 25 Millilitern 4%Paraform-Aldehyd.

Wenn die intrakardiale Profusion abgeschlossen ist, entfernen Sie den Kopf mit einer Schere, indem Sie die Wirbelsäule direkt über den Schultern durchschneiden. Führen Sie ein Skalpell entlang der dorsalen Mittellinie des Kopfes, rostral de cotle, um die Kopfhaut zu durchschneiden und den S-Schädel freizulegen. Kratzen Sie mit dem Skalpell überschüssiges Gewebe oder Muskeln an der Seite und am hinteren Teil des Schädels ab.

Punktieren Sie mit einer Pinzette den Schädel an der Mittellinie, nur rostral zu den Riechkolben und schaffen Sie ein kleines Loch, um die Spitzen der feinen Schere aufzunehmen. Führen Sie die feine Schere in dieses Loch ein und machen Sie zwei beidseitige Schnitte von der Mittellinie aus, die der Länge der Riechkolben folgen. Dieser Schnitt bricht den Schädel an der Schnittstelle von Nasenbein und Stirnbein und bietet einen guten Zugang für die Schere.

Schneiden Sie entlang der sagittalen Nähte im Schädel und achten Sie darauf, dass die Scherenspitzen vom Gehirn weg abgewinkelt sind, um das darunter liegende Gewebe nicht zu beschädigen. Fassen Sie dann vorsichtig mit einer Pinzette nach dem Schädel und schälen Sie den Knochen entlang des medialen Schnitts ab, um das Gehirn freizulegen. Der Schädel kann in kleinen Stücken absplittern oder in größeren Abschnitten abbrechen.

Fahren Sie mit der Pinzette fort, um alle vorderen Parietalknochen, interparietalen und okzipitalen Knochen zu entfernen. Befreien Sie die Paraoculi, die sich entlang der lateralen Ränder des Gehirns auf Höhe des Kleinhirns befinden, indem Sie die kugelförmigen Knochen auf jeder Seite vorsichtig einklemmen. Schneide mit einer Schere vorsichtig den dorsalen Teil des Knochens ab, der den Hirnstamm umgibt.

Führen Sie eine Seite der Schere direkt unter der hinteren Kante des Knochens ein, beginnend an der Stelle, an der das Rückenmark durchtrennt wurde, und schneiden Sie in Richtung Kleinhirn. Um den Hirnstamm und das Kleinhirn zu befreien. Entferne mit der Pinzette den restlichen Knochen um den Hirnstamm herum.

Ziehen Sie vorsichtig die Knochen ab, drehen Sie den Kopf mit der Rückenseite nach unten und durchtrennen Sie mit der Pinzette die Hirnnerven und lösen Sie das Gehirn vom Schädel. Lege das Gehirn in eine Petrischale mit Eis. Cold PPS Beurteilen Sie das Gehirn eines Erwachsenen für die GFP-Markierung mit einem fluoreszierenden Präparierfernrohr und fotografieren Sie mit einem Bilderrahmen.

In diesem Beispiel wird das Mittelhirn zusätzlich zu seiner Verwendung für die Abstammungsanalyse während der Embryogenese durch GFP markiert, und beim Erwachsenen kann GIFM mit anderen Anwendungen kombiniert werden, die in der Entwicklungsbiologie üblich sind, wie z. B. Mikrodissektion und Gewebeexplantatexperimente. Zum Beispiel ist das ventrale Mesencephalon die Vorläuferzone für die Entwicklung von Dopamin-Neuronen, die das Gen Wind eins exprimieren. Die Isolierung des ventralen Mesencephalons durch Mikrodissektion ermöglicht somit die Etablierung eines in vitro Setting, um seine Entwicklung weiter zu untersuchen.

Dies ist nur ein Beispiel für die Verwendung von GIFM zur Isolierung einer durch die genetische Geschichte definierten Vorläuferzone von Interesse. Um dieses Verfahren zu beginnen, übertragen Sie die zuvor identifizierten GFP-positiven Embryonen mit einer feinen Schere in eiskaltes, steriles PBS in eine Zellkulturschale. Entferne den Kopfteil eines Embryos, indem du quer verhätschelt nach Rommy schneidest.

Entfernen Sie anschließend den rostralen Teil des Kopfes mit einem koronalen Schnitt durch das Cephalon. Dadurch wird eine röhrenartige Struktur freigelegt, in der der vierte Ventrikel durch das mesozephale Vesikel einen Kanal zwischen dorsalem und ventralem Gewebe bildet. Führen Sie die Scherenspitzen vorsichtig in den vierten Ventrikel ein und schneiden Sie entlang der dorsalen Mittellinie entlang der rostralen Öffnung, um die Röhre vollständig zu öffnen, wodurch eine offene Buchvorbereitung entsteht.

Das ventrale Mesencephalon wird nun medial freigelegt. Während die beiden dorsalen Hälften des Mesencephalons lateral liegen, kann es notwendig sein, verbleibendes nicht-neurales Gewebe unterhalb des ventralen Mesencephalons zu entfernen. Damit der Explan flach liegen kann, sollte der Explan nun einem Schmetterling ähneln, bei dem das dorsale Mesencephalon die Flügel und nur einer den Schwanz darstellt.

Um das ventrale Mesencephalon für Faxanalysen oder Zellkulturexperimente weiter zu isolieren, entfernen Sie die lateralen Aspekte des Gewebes. Jetzt zeigen wir einige repräsentative Ergebnisse von GIFM. In diesem Experiment werden WINT one exprimierende Zellen, die mit E 8,5 markiert sind, visualisiert, um zu bestimmen, wie wint one direct Zellen zu neuronalen Strukturen über die Entwicklung hinweg beitragen.

Zum Beispiel zeigen wint one C EER MG FP Embryonen bei E 12,5 GFP-Fluoreszenz vor allem im Mittelhirn, im hinteren Hinterhirn und im Rückenmark, bei hoher Vergrößerung werden feine neuronale Projektionen innervierend gesehen. Die markierten Zellen der Mittelhirnwand, der Körperwand, der Gliedmaßen und der kranialen Gesichtsregion können ebenfalls immunhistochemisch auf zellulärer Ebene sichtbar gemacht und analysiert werden. Wie in diesem ein Mikrometer dicken optischen Schnitt eines E 12,5-Embryos zu sehen ist, der durch Tamoxifen-Verabreichung bei E 8,5 markiert wurde, zeigt die rote und die GFP-Antikörpermarkierung in grün die schicksalskartierten Zellen im ventralen Mittelhirn an.

Hier haben wir kombinierte Zellen sind aufgrund der Natur des bedingten MGFP-Reporters im erwachsenen Gehirn doppelt positiv. Die Dichte von reifem Gewebe kann die GFP-Fluoreszenz, die von internen Gehirnstrukturen ausgeht, verschleiern. Daher zeigt die Whole-Mount-Fluoreszenzmikroskopie nur eine schwache GFP-Fluoreszenz in der überlegenen CUI des Erwachsenen, der den Sieg beurteilt.

Eine Linie, die bei Erwachsenen mit Elektronenmikroskopie bei E 8,5 markiert ist, zeigt, dass die WIN one-Linie zu Mittelhirnstrukturen führt, einschließlich der oberen und unteren Cui. In diesem Bild mit höherer Vergrößerung, das aus dem ventralen Mittelhirn in der Nähe von dopaminergen Neuronen aufgenommen wurde, sind nukleäre beta-cal-positive Zellen und ein reicher GFP-positiver Axonplexus zu sehen, wobei die Kontrastmarkierung bei E 9,5 zu einer signifikanten GFP-Markierung führt, die im unteren Colus des Mittelhirns durch Fluoreszenz des gesamten Mount leicht beobachtet werden kann. Die mit E 9,5 markierte WINT-Linie ist in den adulten Schnitten im unteren Kaulu konzentriert, wie mit dem Mikroskop mit geringer Vergrößerung zu sehen ist.

In diesem Bild mit höherer Vergrößerung, das aus dem ventralen Mittelhirn in dopaminergen Neuronen aufgenommen wurde, sind nukleäre Beta-Gel-positive Zellen und ein reichhaltiger GFP-positiver Axonplexus zu sehen. Während sie gewinnen, werden die von E 8,5 gegenüber E 9,5 markierten Neuronen zunehmend daran gehindert, zum dorsalen Mittelhirn beizutragen. Die WIN one-Linie leistet weiterhin einen Beitrag zum ventralen Mittelhirn.

Wir haben Ihnen gerade das Verfahren für genetisch induzierbare Schicksalskartierung gezeigt, um Zelllinien in vivo zu markieren und zu verfolgen. Dies ermöglicht es uns, Zellen anhand ihrer genetischen Abstammung zu markieren und sie über die Zeit zu verfolgen, auch wenn die Genexpression ausgelöscht wurde. Mit der Verabreichung von Tamoxifen im Alter von achteinhalb Jahren haben wir gezeigt, dass der Bereich mit dem Witz neben dem gesamten Mittelhirn beim Erwachsenen auch zum sich entwickelnden Mittelhirn beiträgt.

Im Gegensatz dazu führt die Verabreichung von Tamoxifen im Alter von neuneinhalb Jahren, wenn der Bereich um eine Domäne eingeschränkt wird, zu einem eingeschränkteren Beitrag zum sich entwickelnden Mittelhirn während der Embryogenese, der bis in den Erwachsenen hinein bestehen bleibt. Bei diesem Verfahren ist zu berücksichtigen, dass das System Zellen mosaikartig markiert und daher möglicherweise nicht jede Zelle in einer bestimmten Struktur beschriftet wird. Dies ist wahrscheinlich auf die verwendete CRE-er-Linie oder das bedingte Reporterallel zurückzuführen.

Wichtig ist, dass, obwohl die Zellmarkierung ein Mosaik ist, das Muster und die Verteilung der Marzellen sehr gut reproduzierbar sind. Wir haben festgestellt, dass die Verabreichung von Tamoxifen durch orale Sonde im Vergleich zur Verabreichung durch interperitoneale Injektion vorteilhaft ist, da sie Entzündungen im interperitonealen Raum sowie mechanische Schäden an den Embryonen minimiert. Das war's also.

Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.

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