RNAi-Fütterung in Flüssigkultur: Eine Hochdurchsatzmethode zur Unterdrückung der Genexpression in C. elegans

- Zu Beginn fügen Sie Carbenicillin und ein millimolares IPTG hinzu, um Kulturflaschen mit S-Basalmedien zu kontrollieren und zu testen. Schleudern Sie ein Röhrchen mit Larven im ersten Wachstumsstadium, auch L1-Larven genannt, für einige Minuten. Entfernen Sie nun den Überstand und geben Sie zwei Mikroliter L1s auf eine Agarplatte. Legen Sie die Platte unter ein Präpariermikroskop und zählen Sie die Anzahl der Larven.

RNAi-Bakterien, die ein unspezifisches RNAi-Plasmid tragen, in den Kontrollkolben und Bakterien mit Gen-Targeting-RNAi in den Testkolben geben. Die Menge der hinzugefügten Bakterien sollte proportional zur Anzahl der Würmer sein.

Lassen Sie die Larven unter ständigem Schütteln wachsen, um eine ausreichende Sauerstoffversorgung zu gewährleisten. Die Larven ernähren sich von den Bakterien. Im Inneren der Larve bindet die kleine interferierende RNA an die komplementäre mRNA, die vom Zielgen produziert wird, und hemmt die Proteinexpression. Untersuchen Sie schließlich die Würmer auf Ihren Phänotyp, der Sie interessiert.

Im Beispielprotokoll werden wir L1-Larven in Flüssigkultur mit RNAi behandeln, die auf das daf-2-Gen abzielt.

- Zu Beginn der Behandlung geben Sie 207,45