RNAi-Fütterung in Flüssigkultur: Eine Hochdurchsatzmethode zur Unterdrückung der Genexpression in C. elegans

- Zu Beginn fügen Sie Carbenicillin und ein millimolares IPTG hinzu, um Kulturflaschen mit S-Basalmedien zu kontrollieren und zu testen. Schleudern Sie ein Röhrchen mit Larven im ersten Wachstumsstadium, auch L1-Larven genannt, für einige Minuten. Entfernen Sie nun den Überstand und geben Sie zwei Mikroliter L1s auf eine Agarplatte. Legen Sie die Platte unter ein Präpariermikroskop und zählen Sie die Anzahl der Larven.

RNAi-Bakterien, die ein unspezifisches RNAi-Plasmid tragen, in den Kontrollkolben und Bakterien mit Gen-Targeting-RNAi in den Testkolben geben. Die Menge der hinzugefügten Bakterien sollte proportional zur Anzahl der Würmer sein.

Lassen Sie die Larven unter ständigem Schütteln wachsen, um eine ausreichende Sauerstoffversorgung zu gewährleisten. Die Larven ernähren sich von den Bakterien. Im Inneren der Larve bindet die kleine interferierende RNA an die komplementäre mRNA, die vom Zielgen produziert wird, und hemmt die Proteinexpression. Untersuchen Sie schließlich die Würmer auf Ihren Phänotyp, der Sie interessiert.

Im Beispielprotokoll werden wir L1-Larven in Flüssigkultur mit RNAi behandeln, die auf das daf-2-Gen abzielt.

- Zu Beginn der Behandlung geben Sie 207,45 Milliliter S-Basalmedium mit zusätzlichen Reagenzien, wie im begleitenden Textprotokoll beschrieben, in einen 2.800-Milliliter-Fernbach-Kulturkolben. Es wird eine Endkonzentration von 50 μg je Milliliter Carbenicillin und 1 Millimolar IPTG zugegeben und der Kolben mit einem Membranschraubverschluss verschlossen

Nehmen Sie die L1 aus dem 25 Grad Celsius heißen Inkubator und geben Sie sie in 15 Milliliter Röhrchen. Zentrifugieren Sie die L1s drei Minuten lang bei 1.900 mal g. Nach dem Schleudern den Überstand entfernen. Zählen Sie unter einem Mikroskop die L1s pro zwei Mikroliter und mitteln Sie die Zahlen, die aus mindestens neun Tropfen gewonnen wurden.

Als nächstes geben Sie 50.000 Würmer für die Sammlung junger Würmer und 100.000 Würmer für die Sammlung gealterter Würmer in vier Fernbach-Kulturfläschchen, die im vorherigen Schritt vorbereitet wurden. Fügen Sie dann Kontroll-RNAi-Bakterien und RNAi-Bakterien für das interessierende Gen proportional zur Anzahl der Würmer hinzu.

Nach der Zugabe von Bakterien die Wurmkultur mit S basal abschließen, um das Gesamtvolumen auf 300 Milliliter zu bringen. Inkubieren Sie die Wurmkultur bei 25 Grad Celsius in einem Schüttelinkubator mit 150 U/min bis zur Entnahme.