Name: Ein High-Throughput, High-Content, Liquid-basierter C. Elegans Pathosystem (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 44 s
Description: Lernen Sie ein Hochdurchsatz-Screening-Verfahren zur Untersuchung von Wirt-Pathogen-Interaktionen mit C. elegans und P. aeruginosa in flüssigem Format. Diese Methode unterstützt die Arzneimittelentwicklung durch effiziente Analyse von Virulenzfaktoren.

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Diese Studie wurde von der Krebsprävention und Research Institute of Texas (CPRIT) Award RR150044, Welch Foundation Research Grant C-1930, und von den nationalen Instituten der Gesundheit K22 AI110552 verliehen an NVK unterstützt. Die Geldgeber hatten keine Rolle beim Studiendesign, Datenerhebung und Analyse, Entscheidung, zu veröffentlichen oder der Manuskripterstellung.

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</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine Interessenkonflikte offenlegen.

Dieser Assay (oder ähnliche Tests wo andere Krankheitserreger für p. Aeruginosa oder E. Faecalisersetzt werden) eignet sich für eine Vielzahl von Zwecken, einschließlich der Arzneimittelforschung. Es ist auch nützlich für grundlegende biologische Fragestellungen, z. B. Virulenzfaktoren, die Aufklärung der Host Verteidigung Bahnen, Identifizierung und Bestimmung der regulatorischen Maschinen der Wirt-Erreger-Interaktion beteiligt.
Obwohl p. Aeruginosa flüssige Tötung-...

Die Identifikation und Entwicklung von wirksamen, Breitspektrum-Antibiotika, nun vor fast einem Jahrhundert führte zu einem Wendepunkt im Gesundheitswesen gab es eine weit verbreitete Überzeugung, dass infektiöse Krankheit wäre eine Geißel der Vergangenheit. Innerhalb von wenigen Jahrzehnten begann dieser Optimismus zu schwinden als Erreger nach Erreger Resistenzmechanismen entwickelt, die diese einmal wunderbaren Behandlungen begrenzt. Eine Zeitlang schien das Wettrüsten zwischen Drug Discovery Bemühungen und die Erreger ausgeglichen. Der Missbrauch von Antibiotika hat jedoch vor kurzem bei der Entstehung von Pan-resistente Stämme von Klebsiella Pneumoniae, Acinetobacter Baumanii, Serratia Marcescensund p. Aeruginosa1gipfelte, 2,3,4.
P. Aeruginosa ist ein opportunistisch, Gram negative, Multi-Host Erreger, eine schwere Bedrohung für Patienten mit schweren Verbrennungen, diejenigen, die sind immungeschwächte oder Mukoviszidose. Es wird auch zunehmend als ein Erreger in schweren Nosokomialinfektionen, vor allem durch die laufende Übernahme von Antibiotikaresistenzen identifiziert. Um zu beginnen, um dieser Bedrohung zu begegnen, haben wir den gut dokumentierten C. Elegans-p. Aeruginosa Infektion System5verwendet. Unser Labor hat genutzt, dieses System zu entwickeln eine Liquid-basierter, Hochdurchsatz-, High-Content Screening-Plattform um neue Verbindungen zu identifizieren, die die Fähigkeit des Erregers, die Host-6töten zu begrenzen. Faszinierend, scheinen diese Verbindungen mindestens drei allgemeine Kategorien, einschließlich Antibiotika7 und Virulenz Inhibitoren8anzugehören. Andere High-Content-Droge-Entdeckung-Assays in C. Elegans für Mycobacterium Tuberculosum, Chlamydia Trachomatis, Yersinia Pestis, Listeria Monocytogenes, Francisella Tularensis, Staphylococcus Aureus, Candida Albicans, gemeldet wurden und Enterococcus Faecalis, unter anderem9,10,11,12,13,14,15,16. Diese Arten von Tests haben mehrere allgemein anerkannten Vorteile, wie die Begrenzung falsche positive Treffer, die möglicherweise giftig für beide der Host und der Erreger, erhöhte Wahrscheinlichkeit der Bioverfügbarkeit im Vergleich zu einem chemischen Bildschirm und Hits jenseits zu identifizieren einfach die Begrenzung mikrobiellen Wachstums, wie Anti-Virulents, immun stimulierende Moleküle oder Verbindungen, die sonst das Gleichgewicht der Wirt-Pathogen Interaktionen zu Gunsten der ehemaligen kippen. Darüber hinaus sind die Verbindungen entdeckt in diesen Bildschirmen oft wirksam bei Säugetieren Gastgeber.
Es ist erwähnenswert, dass mindestens zwei anderen Assays17,18 sind zur Durchführung von Hochdurchsatz-Bildschirme in C. Elegans in Flüssigkeit. Jeder dieser Tests ist jedoch eine Änderung, die die prototypische intestinale Kolonisation Assay, bekannt als langsam-Tötung, in Flüssigkeit, durchgeführt werden kann Erhöhung des Durchsatzes und ermöglicht Verbindungen leichter untersucht werden. Achten Sie darauf, dass Charakterisierung schlüssig nachgewiesen, dass die Mechanismen der bakteriellen Virulenz dieser Assays und unsere Liquid-basierter Bildschirm7unterschiedlich sind. Da beide Arten von Virulenz bei Säugetieren Systemen beobachtet werden, ist es wichtig zu überlegen, welche Virulenz Determinante für den Experimentator Interessen vor Assay Auswahl am relevantesten ist.
Hier zeigen wir eine optimierte Version der Liquid-basierter C. Elegans-P. Aeruginosa Assay. Wir berichten auch die Anpassung der unsere Liquid-basierter Assay-Methode, um den grampositiven bakteriellen Erreger beherbergen Enterococcus Faecalis. Wie p. Aeruginosaist E. Faecalis zunehmend als schwere nosokomiale Bedrohung mit einer wachsenden Bewaffnung der Antibiotikaresistenz Wege1erkannt. Obwohl eine frühere Methode für Hochdurchsatz-Screening von E. Faecalis 14vorhanden ist, erfordert es Preinfection mit dem Erreger, die das Verfahren kompliziert und erhöht die Wahrscheinlichkeit einer Kontaminierung Ausrüstung wie die COPAS-FlowSort. Unser Protokoll überflüssig vor Infektion, das Sicherheitsprofil zu verbessern. Zu guter Letzt berichten wir über ein Mittel, mit denen entweder diese Assays kombiniert werden können, mit der Fütterung RNAi, so dass der Benutzer suchen für Host-Faktoren, die eine bei der Schaffung Rolle oder Widerstandskraft gegen Infektionen.

<table><tbody><tr><td>COPAS FP BioSorter</td><td>Union Biometrica</td><td></td><td>Großobjekt-Durchflusszytometer/Wurmsortierer</td></tr><tr><td>Cytation 5</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EL406 Waschmaschinenspender</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Multitron Pro</td><td>Infors HT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>24 Deep-Well RB Block</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>CS15124</td><td></td></tr><tr><td>384-Well Platte</td><td>Greiner Bio-One</td><td>MPG-781091</td><td></td></tr><tr><td>Nematoden-Wachstumsmedien (NGM)</td><td></td><td></td><td>Menge pro Liter: 18 Gramm Agar, 3 Gramm NaCl, 2,5 Gramm Pepton, 1 ml CaCl2 (1 M), 1 ml MgSO4 (1 M), 25 ml Phospatpuffer und 973 ml Milli-Q-Wasserplatten</td></tr> <tr><td></td><td></td><td>mit langsamer Abtötung (SK)</td><td>Menge pro Liter: 18 Gramm Agar, 3 Gramm NaCl, 3,5 Gramm Pepton, 1 mL CaCl2 (1 M), 1 mL MgSO4 (1 M), 25 mL Phospatpuffer und 973 mL Milli-Q Wasser</td></tr><tr><td>Slow Killing (SK) Medium</td><td></td><td></td><td>Menge pro Liter: &nbsp; 3 Gramm NaCl, 3,5 Gramm Pepton, 1 ml CaCl2 (1 M), 1 ml MgSO4 (1 M), 25 ml Phosphatpuffer und 973 ml Milli-Q-Wasser</td></tr><tr><td>Lysogen-Bouillon (LB)</td><td>USBiological Life Sciences</td><td>L1520</td><td></td></tr><tr><td>Brian Heart Infusionsbrühe (BHI)</td><td>Research Products International Corp</td><td>50-488-526</td><td></td></tr><tr><td>Wurmbleichlösung</td><td></td><td></td><td>Menge pro 100 ml: 10 ml 5 M NaOH-Lösung, 20 ml 5%ige Natriumhypochloritlösung und 70 ml steriles Wasser</td></tr><tr><td>S Basalmenge</td><td></td><td></td><td>pro Liter: 5,85 Gramm NaCl, 6 Gramm KH2PO4, 1 Gramm K2HPO4, und 1 Liter Milli-Q Wasser</td></tr><tr><td>Agar</td><td>USBiological Life Sciences</td><td>A0930</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>USBiological Life Sciences</td><td>S5000</td><td></td></tr><tr><td>Pepton</td><td>USBiological Life Sciences</td><td>P3300</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>USBiological Life Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Fisher</td><td>Scientific M63-500</td><td></td></tr><tr><td>Phospatpuffermenge</td><td></td><td></td><td>pro Liter: 132 mL K2HPO4 (1M) und 868 mL KH2PO4 (1M)</td></tr><tr><td>KH2PO4Acros</td> <td>Organics</td><td>7778-77-0</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>USBiological Life Sciences</td><td>P5100</td><td></td></tr><tr><td>5%ige Natriumhypochloritlösung</td><td>BICCA</td><td>7495.5-32</td><td></td></tr><tr><td>NaOH-Lösung</td><td>Fisher Scientific</td><td>SS255-1</td><td></td></tr><tr><td>Breathe-easy</td><td>Diversified Biotech</td><td>BEM-1</td><td></td></tr><tr><td>SYTOX Orange Nukleinsäure-Färbung</td><td>Fisher Scientific</td><td>S11368</td><td></td></tr><tr><td>Bakterienstämme</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>P. aeruginosa (PA14)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>E. faecalis(OG1RF)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>E. coli Superfood (OP50)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>E. coli RNAi exprimierende Bakterien (HT115)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>WormStämme </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>glp-4(bn2) (Beanan und Strome, 1992, PMID: 1289064)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PINK-1::GFP Reporter (Kang et al., 2018, PMID: 29532717)</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ein high-throughput, high-content, liquid-basierter c. elegans pathosystem

A High-throughput, High-content, Liquid-based C. elegans Pathosystem

Die Zahl der neuen Medikamente identifiziert durch traditionelle, in-vitro- Bildschirme hat nachgelassen, den Erfolg dieses Ansatzes bei der Suche nach neuen Waffen gegen mehrere Resistenzen reduzieren. Dies führte zu dem Schluss, dass Forscher nicht nur Notwendigkeit, neue Medikamente zu finden, sondern auch neue Wege zu finden, sie zu entwickeln müssen. Methoden gehören des vielversprechendsten Kandidat ganzen Organismus, in Vivo Tests dieser Verwendung Hochdurchsatz-, phänotypische auslesen und beherbergt, die von Caenorhabditis Elegans , Danio Rerioreichen. Diese Hosts haben mehrere leistungsstarke Vorteile, einschließlich dramatische Kürzungen in falsche positive Treffer, wie Verbindungen, die giftig für die Host- und/oder Biounavailable sind in der Regel bis in das Einstiegsbild vor kostspieligen folgen gelöscht werden.
Hier zeigen wir, wie unser Test verwendet wurde, um Host-Variation in den gut dokumentierten C. Eleganszu verhören –Pseudomonas Aeruginosa flüssige Tötung Pathosystem. Wir zeigen auch mehrere Erweiterungen dieser gut ausgearbeitete Technik. Wir sind beispielsweise Hochdurchsatz-genetische Bildschirme mit RNAi in 24 oder 96-Well Plattenformate Abfrage Host Faktoren in diesem Wirt-Pathogen Interaktionen durchführen zu können. Mit Hilfe dieser Assay, können gesamte Genom-Bildschirme in nur wenigen Monaten abgeschlossen werden die drastisch vereinfachen kann die Aufgabe Drogeziele potentiell ohne mühsame biochemische Reinigung Ansätze zu ermitteln.
Außerdem berichten wir hier eine Variation unserer Methode, die der gram-positiven Bakterium Enterococcus Faecalis für gramnegative Erreger p. Aeruginosaersetzt. Ähnlich wie bei p. Aeruginosader Fall ist, ist die Tötung von E. Faecalis zeitabhängig. Im Gegensatz zu früheren C. Elegans—E. Faecalis -Assays, unsere Assay für E. Faecalis ohne Preinfection auskommt, Verbesserung seiner Sicherheitsprofil und reduzieren die Wahrscheinlichkeit von kontaminierenden Flüssigkeiten Handhabungsgeräte. Der Test ist sehr robust, ~ 95 % Sterbeziffern 96 h Post Infektion zeigen.

Wichtige Parameter für die Testleistung
Ein richtiges Verständnis der zugrunde liegenden dieser Assay Biologie ist notwendig für die Problembehandlung und Optimierung der Assay. Zu diesem Zweck verweisen wir zunächst auf einige wichtige Papiere, die Aufklärung der Mechanismen der Pathogenese von p. Aeruginosa-vermittelte Tötung in liquid7,20. Unter der ...

Hier beschreiben wir eine Protokoll, die ist ein anpassungsfähiges, ganze Host, High-Content-Screening-Tool, das genutzt werden kann, um Wirt-Pathogen Interaktionen zu untersuchen und für die Wirkstoffforschung verwendet werden.

Ein High-Throughput, High-Content, Liquid-basierter C. Elegans Pathosystem

The number of new drugs identified by traditional, in vitro screens has waned, reducing the success of this approach in the search for new weapons to ...

Diese Methode kann Fragen der Interaktion zwischen Wirts-Erregern und der Wirkstoffforschung beantworten, wie z.B. die Bedeutung verschiedener Virulenzfaktoren und die Fähigkeit kleiner Moleküle, sich mit der Genese zu verbessern. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie in einem flüssigen Format mit kleinen Volumina stattfindet. Beginnen Sie mit der Arbeit in einer BSL 2-Biosicherheitswerkbank und streichen Sie P.aeruginosa aus einem gefrorenen Fond auf eine LB-Agar-Platte.Inkubieren Sie die Platte 16 bis 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius und lagern Sie sie dann bis zu einer Woche lang bei vier Grad Celsius. Verwenden Sie zwei Tage vor dem Einrichten der Assay-Platten eine einzelne Kolonie aus der Platte, um drei bis fünf Milliliter sterile LB-Brühe zu impfen. Inkubieren Sie die Kultur 12 bis 16 Stunden lang bei 37 Grad Celsius.Nach der Aufbereitung des Slow Kill oder SK Mediums gemäß Textprotokoll mit 350 Millilitern p. Aeruginosa aus der frischen Übernacht-LB-Kultur jeweils 10 Zentimeter SK Platte aussäen. Verwenden Sie einen sterilen Bakterienstreuer, um die Bakterien gleichmäßig zu verteilen, und lassen Sie die Platten in der Biosicherheitswerkbank trocknen.In

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Dieser Artikel beschreibt die Verhaltensreaktion von Zebrafischen auf toxische Verbindungen, indem er die Fortbewegung der Larven überwacht. Das Protokoll befasst sich außerdem mit einem Beispiel für die Reaktion von Zebrafischlarven auf Umweltschadstoffe.

Larven-Lokomotions-Assay: Hochdurchsatzmethode zur Untersuchung der neurologischen Verhaltenstoxizität einer Verbindung in Zebrafischlarven

Quelle: Anderson, Q. L. et al. Ein Pathosystem von C. elegans mit hohem Durchsatz und hohem Gehalt auf Flüssigkeitsbasis. J. Vis. Exp. (2018)Dieses Video zeigt eine Hochdurchsatz-Screening-Methode mit Caenorhabditis elegans , um Gen-Knockdowns während Wirt-Pathogen-Interaktionen zu untersuchen. Es beschreibt das Verfahren zur Aufbereitung von Knockdown-Würmern und deren Übertragung auf Testplatten, um die Auswirkungen der erregerinduzierten Wurmabtötung zu bewerten.

Ein flüssiger Multiwell-Assay für das Screening von C. elegans-Knockdowns

Quelle: Anderson, Q. L., et al. Ein Pathosystem von C. elegans mit hohem Durchsatz und hohem Gehalt auf Flüssigkeitsbasis. J. Vis. Exp. (2018)Das Video zeigt einen flüssigkeitsbasierten Assay, bei dem genetisch veränderte C . elegans-Larven in einer Mikroplatte pathogenen Bakterien ausgesetzt werden. Bakterielle Toxine, die in das Medium ausgeschieden werden, führen zu Stress und Tod des Wirts. Ein Fluoreszenzfarbstoff färbt tote Würmer und ermöglicht so eine bildgebende Quantifizierung der...

Bewertung der durch pathogene Bakterien induzierten Mortalität bei Larven von C. elegans

Wir beschreiben die detaillierten Schritte eines chemischen Hochdurchsatz-Assays im Fadenwurm Caenorhabditis elegans, der zur Beurteilung der Keimbahntoxizität verwendet wird. In diesem Assay wird die Störung der Keimbahnfunktion nach chemischer Exposition mit einem fluoreszierenden Reporter überwacht, der spezifisch für aneuploide Embryonen ist.

Umfassende Beurteilung der Keimbahn Chemical Toxicity Mit der Nematode<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Hier stellen wir einen kombinatorischen Ansatz vor, bei dem hochauflösende Mikroskopie, Rechenwerkzeuge und Einzellen-Beschriftungen in lebenden C. eleganischen Embryonen verwendet werden, um die Einzelzellendynamik während der Neuroentwicklung zu verstehen.

Isotrope Licht-Sheet-Mikroskopie und automatisierte Zelllineage-Analysen zu Katalog-Caenorhabditis elegans Embryogenese mit subzellulärer Auflösung

Diese Arbeit beschreibt ein semi-high-throughput-Protokoll, das eine gleichzeitige 3D-Zeitraffer-Bildgebung der Embryogenese in 80–100 C. elegans Embryonen in einem einzigen Nachtlauf ermöglicht. Darüber hinaus sind Bildverarbeitungs- und Visualisierungstools enthalten, um die Datenanalyse zu optimieren. Die Kombination dieser Methoden mit kundenspezifischen Reporterstämmen ermöglicht eine detaillierte Überwachung der Embryogenese.

Ein Instrument zur Analyse der C. elegans Embryonal development

Dieses Protokoll beschreibt die mikrofluidische Zeitraffer-Bildgebung von C. elegans über die gesamte postembryonale Entwicklung.

Hochauflösende Bildgebung von C. elegans in allen Larvenstadien

Hier finden Sie eine Anleitung zur effektiven Nutzung von SegElegans, einem von uns entwickelten Deep-Learning-System zur automatisierten Segmentierung einzelner Würmer in Weitfeldmikroskopiebildern, für die anschließende Verwendung in Bildanalysesoftware wie ImageJ. Wir bieten Möglichkeiten, das System sowohl online als auch offline zu nutzen.

Automatisierte Analyse von C. elegans-Fluoreszenzbildern mit SegElegans

Lernen Sie ein Hochdurchsatz-Screening-Verfahren zur Untersuchung von Wirt-Pathogen-Interaktionen mit C. elegans und P. aeruginosa in flüssigem Format. Diese Methode unterstützt die Arzneimittelentwicklung durch effiziente Analyse von Virulenzfaktoren.

Ein High-Throughput, High-Content, Liquid-basierter C. Elegans Pathosystem

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