Name: Ein High-Throughput, High-Content, Liquid-basierter C. Elegans Pathosystem (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 44 s
Description: Lernen Sie ein Hochdurchsatz-Screening-Verfahren zur Untersuchung von Wirt-Pathogen-Interaktionen mit C. elegans und P. aeruginosa in flüssigem Format. Diese Methode unterstützt die Arzneimittelentwicklung durch effiziente Analyse von Virulenzfaktoren.

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Diese Studie wurde von der Krebsprävention und Research Institute of Texas (CPRIT) Award RR150044, Welch Foundation Research Grant C-1930, und von den nationalen Instituten der Gesundheit K22 AI110552 verliehen an NVK unterstützt. Die Geldgeber hatten keine Rolle beim Studiendesign, Datenerhebung und Analyse, Entscheidung, zu veröffentlichen oder der Manuskripterstellung.

<ol><li>Falagas, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pandrug-resistant+Klebsiella+pneumoniae%2C+Pseudomonas+aeruginosa+and+Acinetobacter+baumannii+infections%3A+Characteristics+and+outcome+in+a+series+of+28+patients%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Antimicrobial+Agents%22%5BJournal%5D)">Pandrug-resistant Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa and Acinetobacter baumannii infections: Characteristics and outcome in a series of 28 patients.</a> International Journal of Antimicrobial Agents. 32 (5), 450-454 (2008).</li>
<li>Hsueh, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pandrug-resistant+Acinetobacter+baumannii+causing+nosocomial+infections+in+a+university+hospital%2C+Taiwan%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Pandrug-resistant Acinetobacter baumannii causing nosocomial infections in a university hospital, Taiwan.</a> Emerging Infectious Diseases. 8 (8), 827-832 (2002).</li>
<li>Wang, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pandrug-resistant+Pseudomonas+aeruginosa+among+hospitalised+patients%3A+clinical+features%2C+risk-factors+and+outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Microbiology+and+Infection%22%5BJournal%5D)">Pandrug-resistant Pseudomonas aeruginosa among hospitalised patients: clinical features, risk-factors and outcomes.</a> Clinical Microbiology and Infection. 12 (1), 63-68 (2006).</li>
<li>Yao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Draft+genome+sequences+of+pandrug-resistant+Serratia+marcescens+clinical+isolates+harboring+blaNDM-1%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Announcements%22%5BJournal%5D)">Draft genome sequences of pandrug-resistant Serratia marcescens clinical isolates harboring blaNDM-1.</a> Genome Announcements. 5 (3), (2017).</li>
<li>Utari, P. D., Quax, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+reveals+novel+Pseudomonas+aeruginosa+virulence+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans reveals novel Pseudomonas aeruginosa virulence mechanism.</a> Trends in Microbiology. 21 (7), 315-316 (2013).</li>
<li>Conery, A. L., Larkins-Ford, J., Ausubel, F. M., Kirienko, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+screening+for+novel+anti-infectives+using+a+C.+elegans+pathogenesis+model%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">High-throughput screening for novel anti-infectives using a C. elegans pathogenesis model.</a> Current Protocols in Chemical Biology. 6 (1), 25-37 (2014).</li>
<li>Kirienko, N. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+disrupts+Caenorhabditis+elegans+iron+homeostasis%2C+causing+a+hypoxic+response+and+death%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+%26+Microbe%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa disrupts Caenorhabditis elegans iron homeostasis, causing a hypoxic response and death.</a> Cell Host & Microbe. 13 (4), 406-416 (2013).</li>
<li>Kirienko, D. R., Revtovich, A. V., Kirienko, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-content%2C+phenotypic+screen+identifies+fluorouridine+as+an+inhibitor+of+pyoverdine+biosynthesis+and+pseudomonas+aeruginosa+virulence%5BTitle%5D)+AND+%22mSphere%22%5BJournal%5D)">A high-content, phenotypic screen identifies fluorouridine as an inhibitor of pyoverdine biosynthesis and pseudomonas aeruginosa virulence.</a> mSphere. 1 (4), (2016).</li>
<li>Manning, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high+content+microscopy+assay+to+determine+drug+activity+against+intracellular+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">A high content microscopy assay to determine drug activity against intracellular Mycobacterium tuberculosis.</a> Methods. 127, 3-11 (2017).</li>
<li>Marwaha, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-acylated+derivatives+of+sulfamethoxazole+and+sulfafurazole+inhibit+intracellular+growth+of+Chlamydia+trachomatis%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">N-acylated derivatives of sulfamethoxazole and sulfafurazole inhibit intracellular growth of Chlamydia trachomatis.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 58 (5), 2968-2971 (2014).</li>
<li>Kota, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrating+high-content+imaging+and+chemical+genetics+to+probe+host+cellular+pathways+critical+for+Yersinia+pestis+infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Integrating high-content imaging and chemical genetics to probe host cellular pathways critical for Yersinia pestis infection.</a> PLoS One. 8 (1), e55167(2013).</li>
<li>Arif, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+cell+infection+caused+by+Listeria+monocytogenes+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Quantification of cell infection caused by Listeria monocytogenes invasion.</a> Journal of Biotechnology. 154 (1), 76-83 (2011).</li>
<li>Jayamani, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+Francisella+tularensis-Caenorhabditis+elegans+pathosystem+for+the+evaluation+of+therapeutic+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Characterization of a Francisella tularensis-Caenorhabditis elegans pathosystem for the evaluation of therapeutic compounds.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 61 (9), (2017).</li>
<li>Moy, T. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+screen+for+novel+antimicrobials+using+a+whole+animal+infection+model%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">High-throughput screen for novel antimicrobials using a whole animal infection model.</a> ACS Chemical Biology. 4 (7), 527-533 (2009).</li>
<li>Rajamuthiah, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+animal+automated+platform+for+drug+discovery+against+multi-drug+resistant+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Whole animal automated platform for drug discovery against multi-drug resistant Staphylococcus aureus.</a> PLoS One. 9 (2), e89189(2014).</li>
<li>Breger, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antifungal+chemical+compounds+identified+using+a+C.+elegans+pathogenicity+assay%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Antifungal chemical compounds identified using a C. elegans pathogenicity assay.</a> PLoS Pathogens. 3 (2), e18(2007).</li>
<li>Garvis, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+semi-automated+liquid+screen+reveals+a+specialized+role+for+the+chemotaxis+gene+cheB2+in+Pseudomonas+aeruginosa+virulence%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans semi-automated liquid screen reveals a specialized role for the chemotaxis gene cheB2 in Pseudomonas aeruginosa virulence.</a> PLoS Pathogens. 5 (8), e1000540(2009).</li>
<li>Zhou, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+and+novel+screening+model+for+assessing+the+bioactivity+of+extracts+against+multidrug-resistant+Pseudomonas+aeruginosa+using+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Bioscience%2C+Biotechnology%2C+and+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">An efficient and novel screening model for assessing the bioactivity of extracts against multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa using Caenorhabditis elegans.</a> Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 75 (9), 1746-1751 (2011).</li>
<li>Leung, C. K., Deonarine, A., Strange, K., Choe, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+screening+and+biosensing+with+fluorescent+C.+elegans+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visual+Experiments%22%5BJournal%5D)">High-throughput screening and biosensing with fluorescent C. elegans strains.</a> Journal of Visual Experiments. (51), (2011).</li>
<li>Kirienko, N. V., Ausubel, F. M., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitophagy+confers+resistance+to+siderophore-mediated+killing+by+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Mitophagy confers resistance to siderophore-mediated killing by Pseudomonas aeruginosa.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (6), 1821-1826 (2015).</li>
<li>Kirienko, N. V., Cezairliyan, B. O., Ausubel, F. M., Powell, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+PA14+pathogenesis+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa PA14 pathogenesis in Caenorhabditis elegans.</a> Methods in Molecular Biology. 1149, 653-669 (2014).</li>
<li>Kang, D., Kirienko, D. R., Webster, P., Fisher, A. L., Kirienko, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyoverdine%2C+a+siderophore+from+Pseudomonas+aeruginosa%2C+translocates+into+C.+elegans%2C+removes+iron%2C+and+activates+a+distinct+host+response%5BTitle%5D)+AND+%22Virulence%22%5BJournal%5D)">Pyoverdine, a siderophore from Pseudomonas aeruginosa, translocates into C. elegans, removes iron, and activates a distinct host response.</a> Virulence. , 1-41 (2018).</li>
<li>Garsin, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-lived+C.+elegans+daf-2+mutants+are+resistant+to+bacterial+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Long-lived C. elegans daf-2 mutants are resistant to bacterial pathogens.</a> Science. 300 (5627), 1921(2003).</li>
<li>Estes, K. A., Dunbar, T. L., Powell, J. R., Ausubel, F. M., Troemel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((bZIP+transcription+factor+zip-2+mediates+an+early+response+to+Pseudomonas+aeruginosa+infection+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">bZIP transcription factor zip-2 mediates an early response to Pseudomonas aeruginosa infection in Caenorhabditis elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (5), 2153-2158 (2010).</li>
<li>Tjahjono, E., Kirienko, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conserved+mitochondrial+surveillance+pathway+is+required+for+defense+against+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">A conserved mitochondrial surveillance pathway is required for defense against Pseudomonas aeruginosa.</a> PLoS Genetics. 13 (6), e1006876(2017).</li>
<li>Moy, T. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+novel+antimicrobials+using+a+live-animal+infection+model%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Identification of novel antimicrobials using a live-animal infection model.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (27), 10414-10419 (2006).</li>
<li>Henderson, S. T., Bonafe, M., Johnson, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((daf-16+protects+the+nematode+Caenorhabditis+elegans+during+food+deprivation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journals+of+Gerontology.+Series+A%2C+Biological+Sciences+and+Medical+Sciences%22%5BJournal%5D)">daf-16 protects the nematode Caenorhabditis elegans during food deprivation.</a> The Journals of Gerontology. Series A, Biological Sciences and Medical Sciences. 61 (5), 444-460 (2006).</li>
<li>Beanan, M. J., Strome, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+germ-line+proliferation+mutation+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Characterization of a germ-line proliferation mutation in C. elegans.</a> Development. 116 (3), 755-766 (1992).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine Interessenkonflikte offenlegen.

Dieser Assay (oder ähnliche Tests wo andere Krankheitserreger für p. Aeruginosa oder E. Faecalisersetzt werden) eignet sich für eine Vielzahl von Zwecken, einschließlich der Arzneimittelforschung. Es ist auch nützlich für grundlegende biologische Fragestellungen, z. B. Virulenzfaktoren, die Aufklärung der Host Verteidigung Bahnen, Identifizierung und Bestimmung der regulatorischen Maschinen der Wirt-Erreger-Interaktion beteiligt.
Obwohl p. Aeruginosa flüssige Tötung-...

Die Identifikation und Entwicklung von wirksamen, Breitspektrum-Antibiotika, nun vor fast einem Jahrhundert führte zu einem Wendepunkt im Gesundheitswesen gab es eine weit verbreitete Überzeugung, dass infektiöse Krankheit wäre eine Geißel der Vergangenheit. Innerhalb von wenigen Jahrzehnten begann dieser Optimismus zu schwinden als Erreger nach Erreger Resistenzmechanismen entwickelt, die diese einmal wunderbaren Behandlungen begrenzt. Eine Zeitlang schien das Wettrüsten zwischen Drug Discovery Bemühungen und die Erreger ausgeglichen. Der Missbrauch von Antibiotika hat jedoch vor kurzem bei der Entstehung von Pan-resistente Stämme von Klebsiella Pneumoniae, Acinetobacter Baumanii, Serratia Marcescensund p. Aeruginosa1gipfelte, 2,3,4.
P. Aeruginosa ist ein opportunistisch, Gram negative, Multi-Host Erreger, eine schwere Bedrohung für Patienten mit schweren Verbrennungen, diejenigen, die sind immungeschwächte oder Mukoviszidose. Es wird auch zunehmend als ein Erreger in schweren Nosokomialinfektionen, vor allem durch die laufende Übernahme von Antibiotikaresistenzen identifiziert. Um zu beginnen, um dieser Bedrohung zu begegnen, haben wir den gut dokumentierten C. Elegans-p. Aeruginosa Infektion System5verwendet. Unser Labor hat genutzt, dieses System zu entwickeln eine Liquid-basierter, Hochdurchsatz-, High-Content Screening-Plattform um neue Verbindungen zu identifizieren, die die Fähigkeit des Erregers, die Host-6töten zu begrenzen. Faszinierend, scheinen diese Verbindungen mindestens drei allgemeine Kategorien, einschließlich Antibiotika7 und Virulenz Inhibitoren8anzugehören. Andere High-Content-Droge-Entdeckung-Assays in C. Elegans für Mycobacterium Tuberculosum, Chlamydia Trachomatis, Yersinia Pestis, Listeria Monocytogenes, Francisella Tularensis, Staphylococcus Aureus, Candida Albicans, gemeldet wurden und Enterococcus Faecalis, unter anderem9,10,11,12,13,14,15,16. Diese Arten von Tests haben mehrere allgemein anerkannten Vorteile, wie die Begrenzung falsche positive Treffer, die möglicherweise giftig für beide der Host und der Erreger, erhöhte Wahrscheinlichkeit der Bioverfügbarkeit im Vergleich zu einem chemischen Bildschirm und Hits jenseits zu identifizieren einfach die Begrenzung mikrobiellen Wachstums, wie Anti-Virulents, immun stimulierende Moleküle oder Verbindungen, die sonst das Gleichgewicht der Wirt-Pathogen Interaktionen zu Gunsten der ehemaligen kippen. Darüber hinaus sind die Verbindungen entdeckt in diesen Bildschirmen oft wirksam bei Säugetieren Gastgeber.
Es ist erwähnenswert, dass mindestens zwei anderen Assays17,18 sind zur Durchführung von Hochdurchsatz-Bildschirme in C. Elegans in Flüssigkeit. Jeder dieser Tests ist jedoch eine Änderung, die die prototypische intestinale Kolonisation Assay, bekannt als langsam-Tötung, in Flüssigkeit, durchgeführt werden kann Erhöhung des Durchsatzes und ermöglicht Verbindungen leichter untersucht werden. Achten Sie darauf, dass Charakterisierung schlüssig nachgewiesen, dass die Mechanismen der bakteriellen Virulenz dieser Assays und unsere Liquid-basierter Bildschirm7unterschiedlich sind. Da beide Arten von Virulenz bei Säugetieren Systemen beobachtet werden, ist es wichtig zu überlegen, welche Virulenz Determinante für den Experimentator Interessen vor Assay Auswahl am relevantesten ist.
Hier zeigen wir eine optimierte Version der Liquid-basierter C. Elegans-P. Aeruginosa Assay. Wir berichten auch die Anpassung der unsere Liquid-basierter Assay-Methode, um den grampositiven bakteriellen Erreger beherbergen Enterococcus Faecalis. Wie p. Aeruginosaist E. Faecalis zunehmend als schwere nosokomiale Bedrohung mit einer wachsenden Bewaffnung der Antibiotikaresistenz Wege1erkannt. Obwohl eine frühere Methode für Hochdurchsatz-Screening von E. Faecalis 14vorhanden ist, erfordert es Preinfection mit dem Erreger, die das Verfahren kompliziert und erhöht die Wahrscheinlichkeit einer Kontaminierung Ausrüstung wie die COPAS-FlowSort. Unser Protokoll überflüssig vor Infektion, das Sicherheitsprofil zu verbessern. Zu guter Letzt berichten wir über ein Mittel, mit denen entweder diese Assays kombiniert werden können, mit der Fütterung RNAi, so dass der Benutzer suchen für Host-Faktoren, die eine bei der Schaffung Rolle oder Widerstandskraft gegen Infektionen.

<table><tbody><tr><td>COPAS FP BioSorter</td><td>Union Biometrica</td><td></td><td>Großobjekt-Durchflusszytometer/Wurmsortierer</td></tr><tr><td>Cytation 5</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EL406 Waschmaschinenspender</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Multitron Pro</td><td>Infors HT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>24 Deep-Well RB Block</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>CS15124</td><td></td></tr><tr><td>384-Well Platte</td><td>Greiner Bio-One</td><td>MPG-781091</td><td></td></tr><tr><td>Nematoden-Wachstumsmedien (NGM)</td><td></td><td></td><td>Menge pro Liter: 18 Gramm Agar, 3 Gramm NaCl, 2,5 Gramm Pepton, 1 ml CaCl2 (1 M), 1 ml MgSO4 (1 M), 25 ml Phospatpuffer und 973 ml Milli-Q-Wasserplatten</td></tr> <tr><td></td><td></td><td>mit langsamer Abtötung (SK)</td><td>Menge pro Liter: 18 Gramm Agar, 3 Gramm NaCl, 3,5 Gramm Pepton, 1 mL CaCl2 (1 M), 1 mL MgSO4 (1 M), 25 mL Phospatpuffer und 973 mL Milli-Q Wasser</td></tr><tr><td>Slow Killing (SK) Medium</td><td></td><td></td><td>Menge pro Liter: &nbsp; 3 Gramm NaCl, 3,5 Gramm Pepton, 1 ml CaCl2 (1 M), 1 ml MgSO4 (1 M), 25 ml Phosphatpuffer und 973 ml Milli-Q-Wasser</td></tr><tr><td>Lysogen-Bouillon (LB)</td><td>USBiological Life Sciences</td><td>L1520</td><td></td></tr><tr><td>Brian Heart Infusionsbrühe (BHI)</td><td>Research Products International Corp</td><td>50-488-526</td><td></td></tr><tr><td>Wurmbleichlösung</td><td></td><td></td><td>Menge pro 100 ml: 10 ml 5 M NaOH-Lösung, 20 ml 5%ige Natriumhypochloritlösung und 70 ml steriles Wasser</td></tr><tr><td>S Basalmenge</td><td></td><td></td><td>pro Liter: 5,85 Gramm NaCl, 6 Gramm KH2PO4, 1 Gramm K2HPO4, und 1 Liter Milli-Q Wasser</td></tr><tr><td>Agar</td><td>USBiological Life Sciences</td><td>A0930</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>USBiological Life Sciences</td><td>S5000</td><td></td></tr><tr><td>Pepton</td><td>USBiological Life Sciences</td><td>P3300</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>USBiological Life Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Fisher</td><td>Scientific M63-500</td><td></td></tr><tr><td>Phospatpuffermenge</td><td></td><td></td><td>pro Liter: 132 mL K2HPO4 (1M) und 868 mL KH2PO4 (1M)</td></tr><tr><td>KH2PO4Acros</td> <td>Organics</td><td>7778-77-0</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>USBiological Life Sciences</td><td>P5100</td><td></td></tr><tr><td>5%ige Natriumhypochloritlösung</td><td>BICCA</td><td>7495.5-32</td><td></td></tr><tr><td>NaOH-Lösung</td><td>Fisher Scientific</td><td>SS255-1</td><td></td></tr><tr><td>Breathe-easy</td><td>Diversified Biotech</td><td>BEM-1</td><td></td></tr><tr><td>SYTOX Orange Nukleinsäure-Färbung</td><td>Fisher Scientific</td><td>S11368</td><td></td></tr><tr><td>Bakterienstämme</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>P. aeruginosa (PA14)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>E. faecalis(OG1RF)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>E. coli Superfood (OP50)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>E. coli RNAi exprimierende Bakterien (HT115)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>WormStämme </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>glp-4(bn2) (Beanan und Strome, 1992, PMID: 1289064)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PINK-1::GFP Reporter (Kang et al., 2018, PMID: 29532717)</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ein high-throughput, high-content, liquid-basierter c. elegans pathosystem

A High-throughput, High-content, Liquid-based C. elegans Pathosystem

Die Zahl der neuen Medikamente identifiziert durch traditionelle, in-vitro- Bildschirme hat nachgelassen, den Erfolg dieses Ansatzes bei der Suche nach neuen Waffen gegen mehrere Resistenzen reduzieren. Dies führte zu dem Schluss, dass Forscher nicht nur Notwendigkeit, neue Medikamente zu finden, sondern auch neue Wege zu finden, sie zu entwickeln müssen. Methoden gehören des vielversprechendsten Kandidat ganzen Organismus, in Vivo Tests dieser Verwendung Hochdurchsatz-, phänotypische auslesen und beherbergt, die von Caenorhabditis Elegans , Danio Rerioreichen. Diese Hosts haben mehrere leistungsstarke Vorteile, einschließlich dramatische Kürzungen in falsche positive Treffer, wie Verbindungen, die giftig für die Host- und/oder Biounavailable sind in der Regel bis in das Einstiegsbild vor kostspieligen folgen gelöscht werden.
Hier zeigen wir, wie unser Test verwendet wurde, um Host-Variation in den gut dokumentierten C. Eleganszu verhören –Pseudomonas Aeruginosa flüssige Tötung Pathosystem. Wir zeigen auch mehrere Erweiterungen dieser gut ausgearbeitete Technik. Wir sind beispielsweise Hochdurchsatz-genetische Bildschirme mit RNAi in 24 oder 96-Well Plattenformate Abfrage Host Faktoren in diesem Wirt-Pathogen Interaktionen durchführen zu können. Mit Hilfe dieser Assay, können gesamte Genom-Bildschirme in nur wenigen Monaten abgeschlossen werden die drastisch vereinfachen kann die Aufgabe Drogeziele potentiell ohne mühsame biochemische Reinigung Ansätze zu ermitteln.
Außerdem berichten wir hier eine Variation unserer Methode, die der gram-positiven Bakterium Enterococcus Faecalis für gramnegative Erreger p. Aeruginosaersetzt. Ähnlich wie bei p. Aeruginosader Fall ist, ist die Tötung von E. Faecalis zeitabhängig. Im Gegensatz zu früheren C. Elegans—E. Faecalis -Assays, unsere Assay für E. Faecalis ohne Preinfection auskommt, Verbesserung seiner Sicherheitsprofil und reduzieren die Wahrscheinlichkeit von kontaminierenden Flüssigkeiten Handhabungsgeräte. Der Test ist sehr robust, ~ 95 % Sterbeziffern 96 h Post Infektion zeigen.

Wichtige Parameter für die Testleistung
Ein richtiges Verständnis der zugrunde liegenden dieser Assay Biologie ist notwendig für die Problembehandlung und Optimierung der Assay. Zu diesem Zweck verweisen wir zunächst auf einige wichtige Papiere, die Aufklärung der Mechanismen der Pathogenese von p. Aeruginosa-vermittelte Tötung in liquid7,20. Unter der ...

Hier beschreiben wir eine Protokoll, die ist ein anpassungsfähiges, ganze Host, High-Content-Screening-Tool, das genutzt werden kann, um Wirt-Pathogen Interaktionen zu untersuchen und für die Wirkstoffforschung verwendet werden.

Ein High-Throughput, High-Content, Liquid-basierter C. Elegans Pathosystem

The number of new drugs identified by traditional, in vitro screens has waned, reducing the success of this approach in the search for new weapons to ...

Diese Methode kann Fragen der Interaktion zwischen Wirts-Erregern und der Wirkstoffforschung beantworten, wie z.B. die Bedeutung verschiedener Virulenzfaktoren und die Fähigkeit kleiner Moleküle, sich mit der Genese zu verbessern. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie in einem flüssigen Format mit kleinen Volumina stattfindet. Beginnen Sie mit der Arbeit in einer BSL 2-Biosicherheitswerkbank und streichen Sie P.aeruginosa aus einem gefrorenen Fond auf eine LB-Agar-Platte.Inkubieren Sie die Platte 16 bis 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius und lagern Sie sie dann bis zu einer Woche lang bei vier Grad Celsius. Verwenden Sie zwei Tage vor dem Einrichten der Assay-Platten eine einzelne Kolonie aus der Platte, um drei bis fünf Milliliter sterile LB-Brühe zu impfen. Inkubieren Sie die Kultur 12 bis 16 Stunden lang bei 37 Grad Celsius.Nach der Aufbereitung des Slow Kill oder SK Mediums gemäß Textprotokoll mit 350 Millilitern p. Aeruginosa aus der frischen Übernacht-LB-Kultur jeweils 10 Zentimeter SK Platte aussäen. Verwenden Sie einen sterilen Bakterienstreuer, um die Bakterien gleichmäßig zu verteilen, und lassen Sie die Platten in der Biosicherheitswerkbank trocknen.Inkubieren Sie die Platten dann 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius. Um mehrere RNAi-Bakterienstämme parallel in einer einzigen Vertiefung einer 24-Well-Deep-Well-Platte zu testen, inokulieren Sie eine einzelne Kolonie aus jedem Klon zuvor hergestellter RNAi-haltiger Bakterien in vier Milliliter Carbenicillin-supplementiertes LB. Legen Sie die Platten 16 Stunden lang bei 37 Grad Celsius und 950 U/min in einen für Multi-Well-Platten optimierten Schüttelinkubator und sammeln Sie die Bakterien dann durch Zentrifugation bei 2.000 g für 5 Minuten. Dekantieren Sie den Überstand, indem Sie die Platte umdrehen und kräftig schütteln.Mit 100 Mikrolitern S Basal resuspendieren die RNAi-Bakterien. Pipettieren Sie die resuspendierten Bakterien in eine angemessene Anzahl von Vertiefungen einer mit IPTG und Carbenicillin ergänzten Multi-Well-NGM-Platte und lassen Sie die Platte trocknen. Nach der Vorbereitung von L1-Würmern gemäß dem Textprotokoll bereiten Sie die Platten für grundlegende Experimente vor, indem Sie etwa 5.000 Würmer pro 10-Zentimeter-Platte pipettieren, die mit RNAi- oder OP50-Superfood besiedelt sind.Um ein RNAi-Screening einzurichten, pipettieren Sie etwa 300 Würmer pro Vertiefung in einer 24-Well-Platte, die mit RNAi besiedelt ist. Wenn der verwendete Stamm temperatursteril ist, inkubieren Sie die Würmer etwa 16 Stunden lang bei 15 Grad Celsius und übertragen Sie sie dann für 44 Stunden auf 25 Grad Celsius, um die Entwicklung abzuschließen und die Embryogenese zu verhindern. Um einen Flüssigkeitsabtötungsassay durchzuführen, verwenden Sie einen Zellschaber, um das P.aeruginosa von einer SK-Platte zu entfernen, und resuspendieren Sie die Bakterien in etwa 5 Millilitern S.Basal.Mit Hilfe eines Spektralphotometers wird der OD 600 der Bakteriensuspension gemessen. Bereiten Sie 24 Milliliter verdünnte Brühe von P.Aeruginosa in S.Basal bei einem OD 600 gleich 09 vor, fügen Sie dann 21 Milliliter flüssiges SK-Medium hinzu und übertragen Sie mit einer Mehrkanalpipette 45 Mikroliter Bakterien und Medien in jede Vertiefung einer 384-Well-Platte. Waschen Sie die Würmer von ihrer Quelle aus in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen und lassen Sie sie sich unter der Schwerkraft absetzen.Aspirieren Sie den Überstand auf 5 Milliliter, verwenden Sie dann insgesamt 50 Milliliter S.Basal, um die Würmer zu resuspendieren, und wiederholen Sie die Wäsche noch zweimal. Sortieren Sie mit einem Wurmsortierer etwa 22 Würmer in jede Vertiefung einer 384-Well-Platte, gemäß dem Textprotokoll, verwenden Sie dann eine gasdurchlässige Folie, um die Platte zu versiegeln und sie 24 bis 48 Stunden lang bei 25 Grad Celsius zu inkubieren. Verwenden Sie zum gewünschten Zeitpunkt einen Mikrotiterplatten-Wascher und S.Basal, um die 384-Well-Platte insgesamt 5 Mal zu waschen.Einer der einfachsten Fehler besteht darin, die 384-Well-Platte zu aspirieren, bevor sich die Würmer vollständig abgesetzt haben. Es braucht Übung, um genau zu sehen, ob sich die Würmer vollständig angesiedelt haben. Nach der letzten Wäsche den Überstand auf 20 Mikroliter ansaugen.Fügen Sie dann 50 Mikroliter 98 mikromolare Nukleinsäurefärbung pro Vertiefung hinzu, um eine Endkonzentration von 0,7 Mikromolar zu erhalten. Inkubieren Sie die Platte 12 bis 16 Stunden lang bei Raumtemperatur. Waschen Sie die Platten nach der gewünschten Inkubationszeit mit dem Mikrotiterplatten-Wascher mindestens dreimal.Verwenden Sie für eine Datenerfassung ein Spektralphotometer oder ein automatisiertes Mikroskop, um sowohl Durchlicht als auch Fluoreszenz abzubilden. Fügen Sie einen Milliliter S Basal pro Vertiefung einer 24-Well-Platte hinzu, die 300 Würmer pro Vertiefung enthält. Rühren Sie die Würmer vorsichtig durch Schütteln der Platte und geben Sie die Würmer dann auf eine leere, sterile 24-Deep-Well-Platte.Lassen Sie die Würmer sich durch die Schwerkraft ansiedeln, etwa fünf Minuten. Aspirieren Sie den Überstand, lassen Sie etwa einen Milliliter pro Vertiefung übrig, und fügen Sie dann 7 Milliliter S Basal in jede Vertiefung hinzu. Wiederholen Sie die Wäsche noch zwei weitere Male und saugen Sie dann nach der letzten Wäsche alle bis auf etwa 400 Mikroliter Überstand an.Nachdem Sie die Bakterien in 384-Well-Platten pipettiert haben, um Hunger zu vermeiden, sortieren Sie mit der Resampler-Funktion des Wurmsortierers 22 Würmer in jede Vertiefung einer 384-Well-Platte. Fügen Sie schließlich nach dem Sortieren kleine Moleküle oder andere experimentspezifische Materialien hinzu. Wie in dieser Grafik dargestellt, wird eine zeitabhängige Tötung von C.elegans nur in Gegenwart von P.aeruginosa beobachtet, wenn die in diesem Video beschriebenen Schritte befolgt werden.Im Gegensatz dazu wird in Ermangelung wichtiger bakterieller Nahrungsergänzungsmittel wenig bis gar keine Abtötung beobachtet. Wie hier gezeigt, ist die zweistufige Inkubation von P. aeruginosa bei 37 Grad Celsius und dann 25 Grad Celsius, die für herkömmliche Slow Killing Assays entscheidend ist und ursprünglich bei der Flüssigtötung implementiert wurde, in diesem Assay entbehrlich. Das Protokoll toleriert einen breiten Bereich der anfänglichen Bakterienkonzentrationen, von nur einem OD 600 bis zu 0025, und zeigt immer noch eine zeit- und konzentrationsabhängige Abtötung, obwohl sich der Zeitpunkt verschiebt.Darüber hinaus reichen häufig bereits vier Bohrungen aus, um statistisch signifikante Daten zu erhalten. Ein Beispiel für den Nutzen der Verarbeitung wird hier gezeigt, wenn das Signal-Rausch-Verhältnis hoch ist, da in diesem Beispiel die Analyse einfach ist und die Unterscheidung zwischen positiven und negativen Bedingungen trivial ist. In diesen Fällen können auch schwache Treffer leicht identifiziert werden.Einmal gemeistert, kann diese Technik in etwa 60 bis 75 Minuten Handarbeit pro 384-Well-Platte durchgeführt werden, ohne Sortieren. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, alle Komponenten zu Ihren Medien hinzuzufügen, da sonst die Virulenz beeinträchtigt wird. Dieser Assay vereinfacht die Anwendung des auf dem Phänotyp des gesamten Organismus basierenden Screenings auf die Wirkstoffforschung in der Wirt-Pathogen-Forschung.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man flüssigkeitsbasierte C elegans-Pathogenese-Assays durchführt. Dieses Verfahren kann durch Substitution mit anderen Krankheitserregern, wie z. B. E.Faecalis, durch P.Aeruginosa modifiziert werden, was die Suche nach Behandlungen für andere bakterielle Infektionen erleichtert. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit infektiösen Bakterien wie P.Aeruginosa oder E.Faecalis gefährlich sein kann.Bei der Durchführung dieses Verfahrens sollten immer geeignete Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden, wie z. B. eine angemessene Schulung, eine gute persönliche Schutzausrüstung und die richtige Technik.

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