Ein High-Throughput, High-Content, Liquid-basierter C. Elegans Pathosystem

Diese Methode kann Fragen der Interaktion zwischen Wirts-Erregern und der Wirkstoffforschung beantworten, wie z.B. die Bedeutung verschiedener Virulenzfaktoren und die Fähigkeit kleiner Moleküle, sich mit der Genese zu verbessern. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie in einem flüssigen Format mit kleinen Volumina stattfindet. Beginnen Sie mit der Arbeit in einer BSL 2-Biosicherheitswerkbank und streichen Sie P.aeruginosa aus einem gefrorenen Fond auf eine LB-Agar-Platte.

Inkubieren Sie die Platte 16 bis 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius und lagern Sie sie dann bis zu einer Woche lang bei vier Grad Celsius. Verwenden Sie zwei Tage vor dem Einrichten der Assay-Platten eine einzelne Kolonie aus der Platte, um drei bis fünf Milliliter sterile LB-Brühe zu impfen. Inkubieren Sie die Kultur 12 bis 16 Stunden lang bei 37 Grad Celsius.

Nach der Aufbereitung des Slow Kill oder SK Mediums gemäß Textprotokoll mit 350 Millilitern p. Aeruginosa aus der frischen Übernacht-LB-Kultur jeweils 10 Zentimeter SK Platte aussäen. Verwenden Sie einen sterilen Bakterienstreuer, um die Bakterien gleichmäßig zu verteilen, und lassen Sie die Platten in der Biosicherheitswerkbank trocknen.

Inkubieren Sie die Platten dann 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius. Um mehrere RNAi-Bakterienstämme parallel in einer einzigen Vertiefung einer 24-Well-Deep-Well-Platte zu testen, inokulieren Sie eine einzelne Kolonie aus jedem Klon zuvor hergestellter RNAi-haltiger Bakterien in vier Milliliter Carbenicillin-supplementiertes LB. Legen Sie die Platten 16 Stunden lang bei 37 Grad Celsius und 950 U/min in einen für Multi-Well-Platten optimierten Schüttelinkubator und sammeln Sie die Bakterien dann durch Zentrifugation bei 2.000 g für 5 Minuten. Dekantieren Sie den Überstand, indem Sie die Platte umdrehen und kräftig schütteln.

Mit 100 Mikrolitern S Basal resuspendieren die RNAi-Bakterien. Pipettieren Sie die resuspendierten Bakterien in eine angemessene Anzahl von Vertiefungen einer mit IPTG und Carbenicillin ergänzten Multi-Well-NGM-Platte und lassen Sie die Platte trocknen. Nach der Vorbereitung von L1-Würmern gemäß dem Textprotokoll bereiten Sie die Platten für grundlegende Experimente vor, indem Sie etwa 5.000 Würmer pro 10-Zentimeter-Platte pipettieren, die mit RNAi- oder OP50-Superfood besiedelt sind.

Um ein RNAi-Screening einzurichten, pipettieren Sie etwa 300 Würmer pro Vertiefung in einer 24-Well-Platte, die mit RNAi besiedelt ist. Wenn der verwendete Stamm temperatursteril ist, inkubieren Sie die Würmer etwa 16 Stunden lang bei 15 Grad Celsius und übertragen Sie sie dann für 44 Stunden auf 25 Grad Celsius, um die Entwicklung abzuschließen und die Embryogenese zu verhindern. Um einen Flüssigkeitsabtötungsassay durchzuführen, verwenden Sie einen Zellschaber, um das P.aeruginosa von einer SK-Platte zu entfernen, und resuspendieren Sie die Bakterien in etwa 5 Millilitern S.Basal.

Mit Hilfe eines Spektralphotometers wird der OD 600 der Bakteriensuspension gemessen. Bereiten Sie 24 Milliliter verdünnte Brühe von P.Aeruginosa in S.Basal bei einem OD 600 gleich 09 vor, fügen Sie dann 21 Milliliter flüssiges SK-Medium hinzu und übertragen Sie mit einer Mehrkanalpipette 45 Mikroliter Bakterien und Medien in jede Vertiefung einer 384-Well-Platte. Waschen Sie die Würmer von ihrer Quelle aus in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen und lassen Sie sie sich unter der Schwerkraft absetzen.

Aspirieren Sie den Überstand auf 5 Milliliter, verwenden Sie dann insgesamt 50 Milliliter S.Basal, um die Würmer zu resuspendieren, und wiederholen Sie die Wäsche noch zweimal. Sortieren Sie mit einem Wurmsortierer etwa 22 Würmer in jede Vertiefung einer 384-Well-Platte, gemäß dem Textprotokoll, verwenden Sie dann eine gasdurchlässige Folie, um die Platte zu versiegeln und sie 24 bis 48 Stunden lang bei 25 Grad Celsius zu inkubieren. Verwenden Sie zum gewünschten Zeitpunkt einen Mikrotiterplatten-Wascher und S.Basal, um die 384-Well-Platte insgesamt 5 Mal zu waschen.

Einer der einfachsten Fehler besteht darin, die 384-Well-Platte zu aspirieren, bevor sich die Würmer vollständig abgesetzt haben. Es braucht Übung, um genau zu sehen, ob sich die Würmer vollständig angesiedelt haben. Nach der letzten Wäsche den Überstand auf 20 Mikroliter ansaugen.

Fügen Sie dann 50 Mikroliter 98 mikromolare Nukleinsäurefärbung pro Vertiefung hinzu, um eine Endkonzentration von 0,7 Mikromolar zu erhalten. Inkubieren Sie die Platte 12 bis 16 Stunden lang bei Raumtemperatur. Waschen Sie die Platten nach der gewünschten Inkubationszeit mit dem Mikrotiterplatten-Wascher mindestens dreimal.

Verwenden Sie für eine Datenerfassung ein Spektralphotometer oder ein automatisiertes Mikroskop, um sowohl Durchlicht als auch Fluoreszenz abzubilden. Fügen Sie einen Milliliter S Basal pro Vertiefung einer 24-Well-Platte hinzu, die 300 Würmer pro Vertiefung enthält. Rühren Sie die Würmer vorsichtig durch Schütteln der Platte und geben Sie die Würmer dann auf eine leere, sterile 24-Deep-Well-Platte.

Lassen Sie die Würmer sich durch die Schwerkraft ansiedeln, etwa fünf Minuten. Aspirieren Sie den Überstand, lassen Sie etwa einen Milliliter pro Vertiefung übrig, und fügen Sie dann 7 Milliliter S Basal in jede Vertiefung hinzu. Wiederholen Sie die Wäsche noch zwei weitere Male und saugen Sie dann nach der letzten Wäsche alle bis auf etwa 400 Mikroliter Überstand an.

Nachdem Sie die Bakterien in 384-Well-Platten pipettiert haben, um Hunger zu vermeiden, sortieren Sie mit der Resampler-Funktion des Wurmsortierers 22 Würmer in jede Vertiefung einer 384-Well-Platte. Fügen Sie schließlich nach dem Sortieren kleine Moleküle oder andere experimentspezifische Materialien hinzu. Wie in dieser Grafik dargestellt, wird eine zeitabhängige Tötung von C.elegans nur in Gegenwart von P.aeruginosa beobachtet, wenn die in diesem Video beschriebenen Schritte befolgt werden.

Im Gegensatz dazu wird in Ermangelung wichtiger bakterieller Nahrungsergänzungsmittel wenig bis gar keine Abtötung beobachtet. Wie hier gezeigt, ist die zweistufige Inkubation von P. aeruginosa bei 37 Grad Celsius und dann 25 Grad Celsius, die für herkömmliche Slow Killing Assays entscheidend ist und ursprünglich bei der Flüssigtötung implementiert wurde, in diesem Assay entbehrlich. Das Protokoll toleriert einen breiten Bereich der anfänglichen Bakterienkonzentrationen, von nur einem OD 600 bis zu 0025, und zeigt immer noch eine zeit- und konzentrationsabhängige Abtötung, obwohl sich der Zeitpunkt verschiebt.

Darüber hinaus reichen häufig bereits vier Bohrungen aus, um statistisch signifikante Daten zu erhalten. Ein Beispiel für den Nutzen der Verarbeitung wird hier gezeigt, wenn das Signal-Rausch-Verhältnis hoch ist, da in diesem Beispiel die Analyse einfach ist und die Unterscheidung zwischen positiven und negativen Bedingungen trivial ist. In diesen Fällen können auch schwache Treffer leicht identifiziert werden.

Einmal gemeistert, kann diese Technik in etwa 60 bis 75 Minuten Handarbeit pro 384-Well-Platte durchgeführt werden, ohne Sortieren. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, alle Komponenten zu Ihren Medien hinzuzufügen, da sonst die Virulenz beeinträchtigt wird. Dieser Assay vereinfacht die Anwendung des auf dem Phänotyp des gesamten Organismus basierenden Screenings auf die Wirkstoffforschung in der Wirt-Pathogen-Forschung.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man flüssigkeitsbasierte C elegans-Pathogenese-Assays durchführt. Dieses Verfahren kann durch Substitution mit anderen Krankheitserregern, wie z. B. E.Faecalis, durch P.Aeruginosa modifiziert werden, was die Suche nach Behandlungen für andere bakterielle Infektionen erleichtert. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit infektiösen Bakterien wie P.Aeruginosa oder E.Faecalis gefährlich sein kann.

Bei der Durchführung dieses Verfahrens sollten immer geeignete Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden, wie z. B. eine angemessene Schulung, eine gute persönliche Schutzausrüstung und die richtige Technik.