Encyclopedia of Experiments: Biology
Ein Abonnement für JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt ansehen zu können. Melden Sie sich an oder starten Sie Ihre kostenlose Testversion.
Transcript
Please note that all translations are automatically generated.
- Til at begynde med tilsættes carbenicillin og en millimolar IPTG til kontrol og testkulturflasker indeholdende S basal media. Spin et rør, der indeholder larver i vækststadie et, også kaldet L1 larver, i et par minutter. Fjern nu supernatanten og læg to mikroliter L1'er på en agarplade. Placer pladen under et dissekerende mikroskop og tæl antallet af larver.
Tilføj RNAi bakterier transporterer en ikke-specifik RNAi plasmid til kontrol kolben og bakterier med gen-målretning RNAi til test kolben. Mængden af bakterier tilsættes bør stå i forhold til antallet af orme.
Lad larverne vokse med kontinuerlig rysten for at sikre korrekt iltning. Larverne lever af bakterierne. Inde i larven binder det lille forstyrrende RNA sig til det komplementære mRNA produceret af det målrettede gen og hæmmer proteinudtryk. Endelig undersøge ormene for din fænotype af interesse.
I eksempelprotokollen vil vi behandle L1 larver med RNAi rettet mod daf-2-genet i flydende kultur.
- Til at begynde behandlingen tilsættes 207,45 milliliter S basale medier med yderligere reagenser som beskrevet i den ledsagende tekstprotokol til en 2.800 milliliter Fernbach-dyrkningskolbe. Tilsæt en endelig koncentration på 50 mikrogram pr. milliliter carbenicillin og 1 millimolar IPTG, og luk kolben med en membranskruehætte.
Tag L1'erne ud af 25 grader Celsius inkubatoren og overfør dem til 15 milliliter rør. Centrifuge L1'erne ved 1.900 gange g i tre minutter. Efter spinding skal du fjerne supernatanten.
Dernæst tilsættes 50.000 orme til den unge ormsamling og 100.000 orme til den gamle ormsamling i fire Fernbach-kulturkolber tilberedt i det foregående trin. Tilføj derefter kontrol RNAi-bakterier og RNAi-bakterier for interessegenet proportionalt med antallet af orme.
Efter tilsætning af bakterier, komplet orm kultur med S basal at bringe det samlede volumen til 300 milliliter. Inkuber ormen kultur ved 25 grader Celsius i en rystende inkubator med 150 RPM indtil indsamling.