Larvale ringklierdissectie: isolatie van ontwikkelingsedocriene organen van Drosophila

- Om de ringklier te ontleden, heb je een ontleedmicroscoop, twee tangen, een fijne maatnaald nodig om als ontledingsmes te dienen en een gebufferde oplossing. Vind de ringklier door de kop van de larven te identificeren, die de mondhaken bevat. Reis langs de lengte van de larven om de hersenen te vinden, die zich tussen de thorax en de buiksecties bevindt. De ringklier is kleiner dan de hersenen en bevindt zich bovenop.

De larvale ringklier is een complexe endocriene structuur die drie verschillende endocriene organen bevat. Het corpus allatum bevindt zich in het midden van de ringklier en produceert juveniel hormoon, dat de ontwikkeling en veroudering reguleert. De prothoracale klier omringt het corpus allatum en vormt het grootste deel van de structuur. Ecdyson, een hormoon dat betrokken is bij het mouten van insecten, wordt gemaakt door deze klier.

In dit voorbeeld zullen we larvale hersenen en ringklieren ontleden voor immunohistochie.

- Na het bereiden van de larven begint u de cursusdissectie in een schotel van drie centimeter gevuld met PBS onder een ontledende microscoop. Pak eerst de mondhaak vast met een tang. Snijd vervolgens met een microschaar het lichaam op ongeveer een derde van de lengte van de voorste punt. Houd vervolgens de voorste lengte vast met één tang en gebruik een tweede paar om de punt van het hoofd voorzichtig in het lichaam te duwen om uiteindelijk het larvelichaam binnenstebuiten te keren.

Bereid tot 20 larven op deze manier binnen 10 minuten voor en breng ze vervolgens over in fixatieve oplossing. Was na 30 minuten de preparaten en ga verder met immunostaining. Gebruik na het immunostaineren van de larven een wegwerppipet om de monsters over te brengen naar een schaal gevuld met 0,3% PBT.

Pak onder een ontleedmicroscoop de nagelriem of mondhaak vast met één tang. Gebruik vervolgens een 27-gauge naald die als een mes aan een spuit van één milliliter is bevestigd om het hersenringklier-oogschijfcomplex uit de lichaamssparel te verwijderen door de voorste punt van de slokdarm en oogschijven weg te snijden.

Vervolgens, met behulp van een tang, zorgvuldig scheiden van de slokdarm en de darm van de hersenen- ringklier- oogschijf complex. Trek de darm naar de achterste kant, omdat de slokdarm gaat door de hersenen boven de ventrale zenuwkoord. Ten slotte, om de hersenen-ring klier complex te isoleren, snijdt u zorgvuldig de verbindingen tussen de hersenschijf, oogschijven en beenschijven met een naaldmes.

- Het is heel essentieel om tijdens dissectie fijne tangen met scherpe randen te gebruiken. Ik raad je ook ten zeerste aan om een tang te slijpen met een Arkansas slijpsteen om hun randen zonder gaten bij elkaar te brengen.

- Om de monsters over te brengen, gebruikt u een micropipet met een brede boorpunt. Deponeer de monsters op het midden van de glazen glijbaan. Gebruik vervolgens een tang om de monsters op hun ventrale zijkanten te plaatsen, zodat de ringklier, die zich aan de dorsale kant van de hersenen bevindt, in beeld kan worden gebracht. Kantel vervolgens de dia en veeg zoveel mogelijk van de overtollige PBT af. Plaats vervolgens een druppel montagereagens in de buurt van de monsters en gebruik een tang om langzaam een afdeklip over het reagens te laten zakken.