Zebrafisch-Optogenetik: Aktivierung genetisch veränderter somatosensorischer Neuronen zur Untersuchung von Verhaltensreaktionen von Larven

- Bei Zebrafischlarven kann ein visueller Reiz somatosensorische Neuronen aktivieren und eine Fluchtreaktion auslösen. Es gibt zwei Arten solcher Neuronen, die in der Larve vorkommen: Trigeminus- und Rohon-Bart-Neuronen. Wir können die Aktivität dieser Neuronen manipulieren, indem wir sie so modifizieren, dass sie transgene lichtempfindliche Ionenkanäle exprimieren. Dieser Ansatz wird als Optogenetik bezeichnet.

Um diese Technik durchzuführen, montieren Sie eine transgene Larve mit der Rückenseite nach oben in Agarosegel und legen Sie sie unter ein Präpariermikroskop. Verwende eine Rasierklinge, um einen keilförmigen Teil der Agarose um das Eigelb und den Schwanz herum zu lösen. Füllen Sie diesen Bereich mit Eiwasser. Ziehe die Agarose vom Rüssel und Schwanz der Larve weg.

Positionieren Sie die Spitze eines optischen Kabels in der Nähe des Stammes, an dem sich der Zellkörper des Rohon-Beard-Neurons befindet. Geben Sie einen Impuls aus blauem Laserlicht ab. Bei Einwirkung des blauen Lichts öffnen sich die transgenen lichtempfindlichen Ionenkanäle in der Membran des Neurons, wodurch Ionen eindringen können, wodurch ein Aktionspotential ausgelöst wird, das die Fluchtreaktion auslöst. Zeichnen Sie das Verhalten der Larve mit einer Hochgeschwindigkeitskamera auf.

Im Beispielprotokoll werden wir die Larven bestücken, um das Rohon-Beard-Neuron zu aktivieren, eine Channelrhodopsin-Variante zu exprimieren und die Verhaltensreaktion zu beobachten.

- Stellen Sie 1,5 % niedrigschmelzende Agarose in doppelt destilliertem Wasser her und lagern Sie sie in einem 42 Grad Celsius heißen Block, um ein Verfestigen zu verhindern. Übertragen Sie eine der Larven vor dem Screening mit einer Pasteurpipette aus Glas in ein Röhrchen mit 1,5 % niedrigschmelzender Agarose mit so wenig blauem Embryowasser wie möglich. Dann geben Sie die Larve in einem Tropfen Agarose auf eine kleine Petrischale.

Positionieren Sie die Larve unter einem Präpariermikroskop mit der Rückenseite nach oben. Wenn die Agarose fest ist, schneide mit einer dünnen Rasierklinge die Agarose von beiden Seiten der Larve ab. Füllen Sie den Bereich um die Agarose mit blauem Embryowasser.

Machen Sie dann zwei diagonale Schnitte von beiden Seiten des Eigelbs und achten Sie darauf, die Larve nicht einzuschneiden. Ziehen Sie anschließend die Agarose vom Rüssel und dem Schwanz der Larve weg.

Montieren Sie nun die Hochgeschwindigkeitskamera auf das Präparierfernrohr und verbinden Sie die Kamera mit dem Computer. Schalten Sie dann den Computer und die Hochgeschwindigkeitskamera ein. Öffnen Sie die Videobildsoftware und passen Sie die Kameraeinstellungen an. Verbinden Sie als Nächstes das Glasfaserkabel, den Laser und den Stimulator miteinander. Schalten Sie dann den Stimulator ein und stellen Sie ihn auf maximal 5 Volt und eine Impulsdauer von 5 Millisekunden ein. Schalten Sie anschließend den Laser ein.

Verwenden Sie als Nächstes das Fluoreszenz-Präpariermikroskop, um die Spitze des optischen Kabels in der Nähe eines Neuronenzellkörpers mit ChEF-tdTomato-Expression zu positionieren. Geben Sie einen Impuls aus blauem Licht ab, um das sensorische Neuron zu aktivieren. Zeichnen Sie dann die Antworten mit einer Hochgeschwindigkeitskamera auf, die auf 500 oder 1.000 Bilder pro Sekunde eingestellt ist, und wiederholen Sie die Experimente mit mindestens 1 Minute zwischen den Aktivierungen, um eine Gewöhnung zu vermeiden.

Um die Larve zu befreien, hebeln Sie die Agarose mit einer Pinzette auseinander und achten Sie darauf, das Tier nicht zu verletzen. Übertragen Sie es dann in frisches blaues Embryowasser. Die Tiere können sich weiterentwickeln und das Verfahren kann in älteren Stadien wiederholt werden. Der Embryo könnte auch für eine hochauflösende konfokale Bildgebung der aktivierten Zelle wieder montiert werden, um das Verhalten mit der Zellstruktur zu korrelieren.