Vorbereitung der Beschwerde Matrizen zur Quantifizierung von Cellular Kontraktion

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, elastische Matrizen zur Modulation und Quantifizierung zellulärer Kontraktion herzustellen. Dies wird zunächst erreicht, indem ein Deckglas aktiviert wird, um die Verankerung der Matrix zu ermöglichen. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, ein Polyacrylamidgel auf dem aktivierten Deckglas zu polymerisieren.

Der dritte Schritt des Verfahrens besteht darin, Zellen auf das Gel aufzuplatzieren und ihre Anheftung zu ermöglichen. Der letzte Schritt des Verfahrens ist die Abbildung des Gels, um Daten zu generieren, die mithilfe von Protokollen der Traktionskraftmikroskopie analysiert werden können. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die zeigen, wie Zellen über die Traktionskraftmikroskopie Zugkräfte auf ihre Matrix ausüben.

Hallo, ich bin Yvonne Eons aus dem Labor von Margaret ELL am Physik-Department und am Institut für Biophysikalische Dynamik an der University of Chicago. Ich bin Steven Winter, ebenfalls aus dem Guard-Labor. Heute möchten wir Ihnen ein Verfahren zur Herstellung nachgiebiger Matrizen zur Messung zellulärer Kontraktion vorstellen.

Wir verwenden diese Verfahren in unserem Labor, um kontraktile Aktin-Myosin-Netzwerke zu untersuchen. Beginnen wir also. Vor der Aktivierung der Deckgläser platzierten wir mehrere 22 mal 40 Millimeter große Deckgläser der Sorte 1,5 zuvor.

Spülen Sie mit 70 % Ethanol in einem Edelstahlgestell, sodass die Deckgläser mit Abstand zueinander und nicht berührend angeordnet sind. Bereiten Sie in einer chemischen Abzugsanlage eine 2 %ige Lösung von Three or Minor Profile Trimeth in Isopropanol in einer quadratischen Glaswanne vor. Geben Sie mithilfe einer Glas-Pastettenpipette das Three or Minoro Profile hinzu.

Trimethoxy aufgrund der Reaktivität mit Kunststoff die Deckgläser vollständig in diese Lösung eintauchen und 10 Minuten unter Rühren auf einem Rührgerät im Abzug inkubieren. Nach dem Einweichen der Deckgläser diese durch Eintauchen in zweifach destilliertes Wasser waschen. Den Wasserwechsel viermal durchführen, nach dem letzten Wechsel.

Geben Sie 10 Minuten Einweichzeit unter Rühren ein. Anschließend trocknen Sie die Deckgläser etwa 10 Minuten im Inkubator bei ca. 37 Grad Celsius. Nach dem Trocknen lassen Sie sie auf Raumtemperatur abkühlen.

Die Deckgläser 30 Minuten lang in eine 1 %ige Glutaraldehydlösung in doppelt destilliertem Wasser in einer quadratischen Glaswanne auf einem Rührer eintauchen. Darauf achten, dass eine saubere Wanne verwendet wird.

Andernfalls kann die Lösung danach trüb erscheinen. Spülen Sie die Deckgläser durch drei Wechsel mit zweifach destilliertem Wasser, jeweils 10 Minuten pro Wechsel unter Rühren. Danach bedecken Sie die Deckgläser mit Aluminiumfolie, um Staubansammlung zu vermeiden, und trocknen sie bei Raumtemperatur.

Nach dem Trocknen die Deckgläser bis zu zwei Monate lang an einem trockenen, staubfreien Ort aufbewahren. Um das Polyacrylamid- oder PAA-Gel vorzubereiten, stellen Sie zunächst Stammlösungen von Acrylamid-Bis-Acrylamid-Mix aus 40 % Acrylamid und 2 % Bis-Acrylamid her, wie im RI-Protokoll beschrieben.

Destillieren Sie die Acrylamidlösung 20 Minuten lang in einer Vakuumkammer. Dadurch wird der Sauerstoffgehalt im Gel verringert, was eine Polymerisation verhindert. Bereiten Sie in der Zwischenzeit eine 10 %ige Ammoniumpersulfat-Lösung oder eine PS-Lösung vor.

Anschließend ein mal drei Zoll große Objektträger mit Rain-X-Tüchern abwischen, um die Oberfläche des Objektträgers hydrophob zu machen. Entfernen Sie jeglichen Staub mit einem Kim-Tuch, um eine glatte Geloberfläche sicherzustellen. Bedecken Sie den Objektträger mit Aluminiumfolie und stellen Sie ihn beiseite.

Entfernen Sie dann die Acrylamidlösung aus der Vakuumkammer und geben Sie fluoreszierende Kügelchen hinzu. Geben Sie zum Starten der Gel-Polymerisation 0,75 Mikroliter TM E und 2,5 Mikroliter 10 %iger PS zu. Mischen Sie die Lösung kurz durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren. Tragen Sie anschließend 10 bis 12 Mikroliter der Acrylamidlösung auf die zuvor vorbereitete hydrophobe Objektträgerplatte auf.

Legen Sie einen aktivierten Deckgläser der Größe 22 mal 40 Millimeter auf den Tropfen. Die Gel-Lösung sollte das gesamte Deckglas bedecken. Glätten Sie eventuell in der Lösung entstehende Blasen aus.

Lassen Sie die Gel-Lösung etwa 10 Minuten bei Raumtemperatur polymerisieren. Nach der Polymerisation löst sich das Gel vom Rand der Deckglasabdeckung. Entfernen Sie mit der feinen Spitze einer Pinzette vorsichtig die Abdeckung von der Oberfläche des Objektträgers, wobei das Gel daran befestigt bleibt.

Legen Sie das Gel in eine Petrischale mit doppelt destilliertem Wasser, um eine hydratisierte Geloberfläche aufrechtzuerhalten, um die extrazelluläre Matrix oder ECM-Proteine an das Gel zu vernetzen. Bereiten Sie zunächst 40 Mikroliter Arbeitsaliquote von Sulfur San Par vor, indem Sie SULF San Par-Pulver in wasserfreiem Dimethylsulfoxid oder DMSO auflösen. Entfernen Sie anschließend das doppelt destillierte Wasser von der Geloberfläche, indem Sie kurz unseren Deckglas-Zentrifugenspinner verwenden.

Darauf achten, dass das Gel unmittelbar vor der Verwendung nicht austrocknet. Die DMSO-Aliquote von Sulfur Sampa in zweifach destilliertem Wasser verdünnen und die Mitte der Geloberfläche mit etwa 200 Mikrolitern beschichten. Anschließend die Geloberfläche in einem UV-Vernetzungs-Ofen UV-Licht aussetzen.

Nach der UV-Bestrahlung tauchen Sie die Deckgläser in ein Becherglas mit frischem zweifach destilliertem Wasser. Entfernen Sie jegliche Flüssigkeit von der Geloberfläche mithilfe eines Deckglas-Spinners. Geben Sie dann 50 Mikroliter kaltes Fibronectin auf das Param und platzieren Sie dieses in einem Petrischalenbehälter.

Drehen Sie den Deckgläser um und legen Sie die Gel-Seite auf das Fibronectin. Lassen Sie die Deckgläser eine bis zwei Stunden bei Raumtemperatur oder über Nacht bei vier Grad Celsius reagieren. Anschließend erfolgt die Inkubation in einer sterilen Zellkulturhaube.

Legen Sie die Deckgläser in sechs Zentimeter große Zellkulturschalen mit PBS, um die Deckgläser zu beschichten. Waschen Sie die Deckgläser unter sterilen Bedingungen nach der Beschichtung mehrfach gründlich mit frischem PBS aus. Sterilisieren Sie die Deckgläser durch Bestrahlung mit UV-Licht für 30 Minuten.

Anschließend die Deckgläser vor dem Aufbringen der Zellen 30 bis 45 Minuten in Zellkulturmedium inkubieren. Danach ein 22 mal 30 Millimeter großes Deckglas mit Vakuumfett auf dem oberen Deckglas-Halter einer konfokalen Imaging-Kammer von Warner Instruments befestigen. Eine gummiartige Dichtung für die Kammerbildung auf das Deckglas legen, wobei sowohl der Einlass- als auch der Auslass-Polyethylenschlauch zugänglich bleiben müssen.

Dadurch ergibt sich ein Abstand von 150 bis 1000 Mikrometern zwischen dem oberen Deckglas und dem mit Gel beschichteten 22 mal 40 Millimeter großen Deckglas, abhängig von der Größe der verwendeten Dichtung. Befüllen Sie dann Spritzen, die warmes Zellmedium enthalten, über das Anschluss-Kit in die Zulaufschläuche und prüfen Sie, ob das Medium durch die Schläuche und auf das obere Deckglas fließt. Tragen Sie Vakuumfett auf den Boden der Kammer auf und platzieren Sie ein mit Gel beschichtetes 22 mal 40 Millimeter großes Deckglas mit der Zellseite nach oben.

Geben Sie das warme Medium auf die Zellen. Setzen Sie den oberen Deckglas-Halter mit den Kammerdichtungen auf die Kammerbasis, wobei die Dichtungen ihn von dem mit Gel beschichteten Deckglas trennen. Stellen Sie sicher, dass die Positionierstifte in der Kammerbasis in den Positionierlöchern des oberen Deckglases sitzen.

Bringen Sie die Druckplatte an der Kammerbasis an und verwenden Sie den Druckplattenschlüssel, um die Druckplatte einzuschrauben und zu befestigen. Überprüfen Sie den Durchfluss des Mediums durch die Schläuche und die Kammer, um mögliche Lecks in der Kammer zu erkennen, und um freie Bereiche des Mediums auf der Zelloberfläche zu vermeiden.

Platzieren Sie die konfokale Bildgebungskammer auf dem Bühnenadapter, der sich in einem Mikroskophalter befindet, um Bilder von fluoreszenzmarkierten Proteinen und in das Gel-Substrat eingebetteten fluoreszierenden Kügelchen mittels eines konfokalen Fluoreszenzmikroskops aufzunehmen, um eine Aufnahme der ungezogenen Position der Kügelchen im Gel-Perfusat zu erhalten. Trennen Sie die zellulären Adhäsionen vom Gel, um die Aufnahme der fluoreszierenden Kügelchen im gleichen Bildfeld zu machen, in dem sich die Zellen befinden. Wenn das Protokoll korrekt befolgt wird, ist die Gel-Oberfläche relativ flach und glatt, wobei die fluoreszierenden Kügelchen gleichmäßig im gesamten Gel verteilt sind.

Die ECM kann ebenfalls durch Fibronectin-Immunfluoreszenz sichtbar gemacht werden. Falls die Gelkontraktion am Ort der fokalen Adhäsionen gemessen wird, sollten die Abbildung des Gels und der Zellen in der konfokalen optischen Ebene der focalen Adhäsionen durchgeführt werden. Hier werden fokale Adhäsionen im Anziehungskraftexperiment in einer humanen Osteosarkom- oder U2-OS-Zelle, die mit GFP pxi markiert ist, sichtbar gemacht.

Die Kontraktion eines Gels kann durch die Verschiebung eingebetteter fluoreszierender Kügelchen unterhalb fokaler Adhäsionen veranschaulicht werden. Der Vergleich von belasteten Kügelchen in grün und unbelasteten Kügelchenpositionen in rot ermöglicht hier die Quantifizierung der Substratverschiebung des Gels unter Kontraktion. Dies ist ein repräsentatives Ergebnis einer ausgebreiteten Zelle, die durch Trypsin von der Geloberfläche gelöst wird. Dies ist ein repräsentatives Ergebnis beim Vergleich belasteter und unbelasteter Kügelchenpositionen.

Der Einsatz fortschrittlicher computergestützter Algorithmen kann Zugspannungen liefern, die mit der Verschiebung der Kügelchen und dem Elastizitätsmodul der Gele assoziiert sind. Diese Spannungen werden hier mittels einer Farbskala und Vektoren dargestellt, wobei wärmere Farben auf der Wärmekarte und größere Pfeile stärkere Kräfte anzeigen. Soeben haben wir Ihnen gezeigt, wie man nachgiebige Matrizen zur Messung der zellulären Kontraktion bei dieser Methode herstellt.

Es ist wichtig, vorauszuplanen, damit die zeitempfindlichen Schritte schnell durchgeführt werden können. Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.