Name: Vorbereitung der Beschwerde Matrizen zur Quantifizierung von Cellular Kontraktion (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-14T17:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 38 s
Description: Lernen Sie die Herstellung nachgiebiger Matrizen zur Quantifizierung zellulärer Kontraktion mittels Traction Force Microscopy. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Zell-Matrix-Interaktionen und deren Einfluss auf das Zellverhalten.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wir danken dem Labor von Ulrich Schwarz für Computational Tracking-Software in die Quantifizierung von zellulären Zugkräfte (Sabass et al., 2008) verwendet. Diese Arbeit wurde durch ein Burroughs Wellcome Career Award und NIH Director der Pioneer Award (DP10D00354) zu ML Gardel und Medical Scientist National Research Service Award (5 T32 GM07281) auf SP Winter unterstützt.

<ol><li>Damljanovic, V., Lajerholm, B. C., Jacobson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bulk+and+micropatterned+conjugation+of+extracellular+matrix+proteins+to+characterized+polyacrylamid+substrates+for+cell+mechanotransduction+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Bulk and micropatterned conjugation of extracellular matrix proteins to characterized polyacrylamid substrates for cell mechanotransduction assays.</a> Biotechniques. 39 (6), 847-851 (2005).</li>
<li>Engler, A., Bacakova, L. N. ewman, Hategan, C., Griffin, A., M, D. D. ischer <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substrate+compliance+versus+ligand+in+cell+on+gel+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Substrate compliance versus ligand in cell on gel responses.</a> Biophys J. 86 ((1 Pt 1)), 617-628 (2004).</li>
<li>Gardel, M. L., Sabass, B., Ji, L., Danuser, G., Schwarz, U. S., Waterman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traction+stress+in+focal+adhesions+correlates+biphasically+with+actin+retrograde+flow+speed%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Traction stress in focal adhesions correlates biphasically with actin retrograde flow speed.</a> J Cell Biol. 183, 999-1005 (2008).</li>
<li>Rajagopalan, P., Marganski, W. A., Brown, X. Q., Wong, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+comparison+of+the+spread+area%2C+contractility%2C+and+migration+of+balb%2Fc+3T3+fibroblasts+adhered+to+fibronectin-+and+RGD-modified+substrata%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Direct comparison of the spread area, contractility, and migration of balb/c 3T3 fibroblasts adhered to fibronectin- and RGD-modified substrata.</a> Biophys J. 87 (4), 2818-2827 (2004).</li>
<li>Reinhart-King, C. A., Dembo, M., Hammer, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamics+and+mechanics+of+endothelial+cell+spreading%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">The dynamics and mechanics of endothelial cell spreading.</a> Biophys J. 89, 676-689 (2005).</li>
<li>Stricker, J., Sabass, B., Schwarz, U. S., Gardel, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+traction+force+microscopy+for+micron-sized+focal+adhesions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys%3A+Condensed+Matter%22%5BJournal%5D)">Optimization of traction force microscopy for micron-sized focal adhesions.</a> J. Phys: Condensed Matter. 22, 194104-194114 (2010).</li>
<li>Sabass, B., Gardel, M. L., Waterman, C. M., Schwarz, U. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+traction+force+microscopy+based+on+experimental+and+computational+advances%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">High resolution traction force microscopy based on experimental and computational advances.</a> Biophys J. 94, 207-220 (2008).</li>
<li>Yeung, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+substrate+stiffness+on+cell+morphology%2C+cytoskeletal+structure%2C+and+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Motil+Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Effects of substrate stiffness on cell morphology, cytoskeletal structure, and adhesion.</a> Cell Motil Cytoskeleton. 60 (1), 24-34 (2005).</li>
<li>Waterman-Storer, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule%2Forganelle+motility+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Microtubule/organelle motility assays.</a> Curr Protoc Cell Biol. , 13.1.1-13.1.21 (1998).</li>
</ol>

Das hier beschriebene Verfahren für den Aufbau einer Zugkraft-Mikroskopie (TFM) Experiment, zusammen mit der Umsetzung der Computational Tracking-Routinen (Sabass et al., 2008), ermöglicht die Quantifizierung von zellulären Kräfte mit Mikrometer-Skala räumlicher Auflösung. Zur Optimierung der experimentellen Protokoll, ist es entscheidend, eine reine und gleichmäßige Gelsubstrat mit gleichmäßigen Beschichtung von ECM-Liganden zu bilden. Wir diskutieren mögliche Fallstricke unter: Non-U...

<table><tbody><tr><td>3-Aminopropyltrimethoxysilan</td><td>Aldrich</td><td>28, 177-8</td><td></td></tr><tr><td>40 % Acrylamid</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0140</td><td></td></tr><tr><td>2 % Bis-Acrylamid</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1404</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP 150-20</td><td></td></tr><tr><td>Ammoniumpersulfat</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP179</td><td></td></tr><tr><td>40 nm fluoreszierende Mikrokügelchen</td><td>Invitrogen</td><td>F8789</td><td></td></tr><tr><td>Sulfo-SANPAH</td><td>Pierce, Thermo Scientific</td><td>22589</td><td></td></tr><tr><td>Konfokale Abbildungskammer (RC-30)</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0320</td><td></td></tr><tr><td>Deckglas-Zentrifuge</td><td>selbstgebaut</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>UV-Lampe CL1000</td><td>UVP Inc.</td><td>95-0228-01</td><td></td></tr><tr><td>Edelstahlgestell</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72239-04</td><td></td></tr><tr><td>Acryloyl-X, SE (6-((Acryloyl)amino)hexansäure)</td><td>Invitrogen</td><td>A-20770</td><td></td></tr><tr><td>Hydrazinhydrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>225819</td><td></td></tr><tr><td>Natriummetaperiodat</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>20504</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A416-4</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2006</td><td></td></tr><tr><td>Kollagen</td><td>BD Biosciences</td><td>354236</td><td></td></tr><tr><td>Deckgläser (#1,5)</td><td>Corning</td><td>2940&amp;#8208;224</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehyd</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>16120</td><td></td></tr><tr><td>Rain-X</td><td>SOPUS Products</td><td>www.rainx.com</td><td></td></tr><tr><td>Essigsäure</td><td>Acros Organics</td><td>64-19-7</td><td></td></tr></tbody></table>

vorbereitung der beschwerde matrizen zur quantifizierung von cellular kontraktion

Preparation of Complaint Matrices for Quantifying Cellular Contraction

Die Regulation der zellulären Adhäsion an die extrazelluläre Matrix (ECM) ist von wesentlicher Bedeutung für die Zell-Migration und ECM Umbau. Fokalen Adhäsionen sind makromolekulare Baugruppen, die Kopplung der kontraktilen F-Aktin-Zytoskelett der ECM. Diese Verbindung ermöglicht die Übertragung von intrazellulären mechanischen Kräfte durch die Zellmembran mit dem darunterliegenden Substrat. Neuere Arbeiten haben gezeigt, die mechanischen Eigenschaften der ECM regulieren fokale Adhäsion und F-Aktin-Morphologie sowie zahlreiche physiologische Prozesse, einschließlich der Zelldifferenzierung, Division, Proliferation und Migration. So hat der Einsatz von Zellkultursubstraten zu einem immer vorherrschende Methode zur präzisen Steuerung und modulieren ECM mechanischen Eigenschaften. Zur Quantifizierung Zugkräfte an fokalen Adhäsionen in einer adhärenten Zelle, entsprechen Substraten in Verbindung mit hochauflösenden Bildgebung und rechnergestützte Techniken in einem Verfahren genannt Traction Force Mikroskopie (TFM) verwendet. Diese Technik beruht auf Messungen der lokalen Größe und Richtung der Substrat Verformungen durch zelluläre Kontraktion induziert. In Kombination mit hochauflösenden Fluoreszenzmikroskopie von fluoreszenzmarkierten Proteinen ist es möglich, Zytoskelett-Organisation und Umbau mit Zugkräften zu korrelieren. Hier präsentieren wir Ihnen ein ausführliches Versuchsprotokoll für die Herstellung von zweidimensionalen, konforme Matrizen für die Zwecke der Schaffung einer Zellkultur Substrat mit einem gut charakterisierten, abstimmbaren mechanische Steifigkeit, die für die Messung zellulärer Kontraktion ist. Diese Protokolle umfassen die Herstellung von Polyacrylamid-Hydrogele, Beschichtung von ECM-Proteine ​​auf solche Gele, Plattieren Zellen auf Gele und hochauflösenden konfokalen Mikroskopie mit einem Perfusionskammer. Darüber hinaus bieten wir eine repräsentative Stichprobe von Daten, die zeigen Lage und das Ausmaß der zellulären Kräfte mit angeführt TFM-Protokolle.

In diesem Video zeigen wir die experimentelle Techniken verwendet, um konform, extrazellulären Matrix (ECM) beschichtete Substrate für Zellkulturen herzustellen, und die durchaus in Zugkraft Mikroskopie und Beobachten Auswirkungen der ECM Steifigkeit auf das Verhalten der Zelle.

Vorbereitung der Beschwerde Matrizen zur Quantifizierung von Cellular Kontraktion

Die Regulation der zellulären Adhäsion an die extrazelluläre Matrix (ECM) ist essenziell für die Zellmigration und den ECM-Umbau. Fokale Adhäsionen sind ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, kompatible Matrizen zur Modulation und Quantifizierung zellulärer Kontraktion herzustellen. Dies wird zunächst erreicht, indem ein Deckglas aktiviert wird, um die Verankerung der Matrix zu ermöglichen. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht in der Polymerisation eines Polyacrylamidgels auf dem aktivierten Deckglas.Der dritte Schritt des Verfahrens besteht darin, Zellen auf das Gel aufzuplatzieren und ihre Anheftung zu ermöglichen. Der letzte Schritt des Verfahrens ist die Bildgebung des Gels, um Daten zu generieren, die mithilfe von Protokollen der Traktionskraftmikroskopie analysiert werden können. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die zeigen, wie Zellen mithilfe der Traktionskraftmikroskopie Zugkräfte auf ihre Matrix ausüben.Hallo, ich bin Yvonne Eons aus dem Labor von Margaret ELL am Physik-Department und am Institut für Biophysikalische Dynamik an der University of Chicago. Ich bin Steven Winter, ebenfalls aus dem Guard-Labor. Heute möchten wir Ihnen ein Verfahren zur Herstellung nachgiebiger Matrizen zur Messung zellulärer Kontraktion vorstellen.Wir verwenden diese Verfahren in unserem Labor, um kontraktil

preparation-of-complaint-matrices-for-quantifying-cellular-contraction

Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

Wir beschreiben die prototypische Verfahren zur Herstellung Mikroskop Deckgläser mit fluoreszierenden Gelatine zur Visualisierung invadopodia-vermittelte Matrixabbau beschichtet. Rechenverfahren Verwendung verfügbarer Software für die Quantifizierung der resultierenden Ebenen der Matrix Proteolyse durch einzelne Zellen innerhalb einer Mischpopulation und für Gruppen, die vielzelligen gesamte mikroskopische Felder dargestellt.

Quantitative Messung der Invadopodia-vermittelte extrazellulären Matrix Proteolyse in Einzel-und Multizelluläre Contexts

Dieses Video beschreibt die Messung der Kontraktion der Aorten-Glattmuskelzellen (SMC) mit Hilfe der elektrischen Zell-Substrat-Impedanzmessung (ECIS). ECIS misst die Fortbewegung von Zellen und ist eine zuverlässige Methode zur Messung von Kontraktionen.

Messung der SMC-Kontraktion in vitro: Eine nicht-invasive Methode zur Bewertung der Kontraktion von glatten Muskelzellen mit Hilfe der elektrischen Zell-Substrat-Impedanzmessung

Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung von Mikro Siliziumcantilevern biegsam Kulturoberflächen zur Messung der Kontraktionskraft der Muskelzellen in vitro. Zellkontraktion bewirkt Cantilever Biege, die gemessen werden können, aufgezeichnet und umgerechnet in die Messwerte von Kraft und bietet eine nicht-invasive und skalierbaren System zur Messung Kontraktionsfunktion in vitro.

Nutzung von Microscale Siliziumcantilevern to Cellular Kontraktionsfähigkeit beurteilen In-vitro-

Hier beschreiben wir die Entwicklung und Anwendung eines Gelkontraktionsassays zur Bewertung der kontraktilen Funktion in mesenchymalen Zellen, die einen epithelial-mesenchymalen Übergang durchlaufen haben.

Entwicklung eines<em&gt; In Vitro</em&gt; Assay Kontraktionsfunktion von mesenchymalen Zellen, die Unterzog Epithelial-mesenchymale Transition zur Bewertung

Die Zelldifferenzierung wird durch eine Vielzahl von Mikroumgebungsfaktoren reguliert, einschließlich der beiden Matrixzusammensetzung und Substratmaterialeigenschaften. Wir beschreiben hier eine Technik unter Verwendung von Zellmicroarrays in Verbindung mit Traktionskraftmikroskopie sowohl Zelldifferenzierung und biomechanischen Zell-Substrat-Wechselwirkungen als Funktion der Mikroumgebungskontext zu bewerten.

Ein Hochdurchsatz-Zellarray-Plattform für korrelative Analyse von Zelldifferenzierung und Zugkräften

Mechanische Kräfte sind wichtig für die Steuerung der Zellmigration. Dieses Protokoll demonstriert die Verwendung von elastischen Hydrogelen, die mit einer Glasmikropipette und einem Mikromanipulator verformt werden können, um Zellen mit einem lokalen Steifigkeitsgradienten zu stimulieren, um Veränderungen in der Zellstruktur und Migration hervorzurufen.

Einzelzelle Durotaxis Assay zur Beurteilung der mechanischen Steuerung der zellulären Bewegung und verwandter Signalereignisse

Wir präsentieren ein Protokoll zur Bewertung der elektromechanischen Wirkungen der GtACR1-Aktivierung in Kaninchen-Kardiomyozyten. Wir bieten detaillierte Informationen über Zellisolation, Kultivierung und adenovirale Transduktion sowie über funktionelle Experimente mit den Patch-Clamp- und Carbonfaser-Techniken.

Elektromechanische Bewertung der optogenetisch modulierten Kardiomyozytenaktivität

Dieser Beitrag beschreibt eine explantationskulturbasierte Methode zur Isolierung und Kultivierung primärer, patientenspezifischer humaner Aortenglattmuskelzellen und dermaler Fibroblasten. Weiterhin wird eine neuartige Methode zur Messung der Zellkontraktion und anschließenden Analyse vorgestellt, mit der patientenspezifische Unterschiede in diesen Zellen untersucht werden können.

Isolierung primärer patientenspezifischer glatter Aortenmuskelzellen und semiquantitative Echtzeit-Kontraktionsmessungen in vitro

Diese Arbeit präsentiert ein flexibles Protokoll für die Verwendung von FLECS-Technologie (fluoreszenzmarkierte elastomere kontrahierbare Oberflächen) im Mikrowellenformat zur vereinfachten, freihändigen Quantifizierung von einzelligen kontraktilen Kräften basierend auf visualisierten Verschiebungen fluoreszierender Proteinmikromuster.

Vereinfachte Hochdurchsatzanalyse der Einzelzellkontraktilität mit mikrostrukturierten Elastomeren

Die Analyse von Veränderungen der kontraktilen Funktion und der zellulären Integrität von humanen iPSC-abgeleiteten Kardiomyozyten ist von immenser Bedeutung für die nicht-klinische Arzneimittelentwicklung. Ein hybrides 96-Well-Zellanalysesystem adressiert beide Parameter in Echtzeit und physiologisch für zuverlässige, für den Menschen relevante Ergebnisse, die für einen sicheren Übergang in klinische Stadien erforderlich sind.

Hybridzell-Analysesystem zur Beurteilung struktureller und kontraktiler Veränderungen von humanen iPSC-abgeleiteten Kardiomyozyten für die präklinische kardiale Risikobewertung

Dieses Protokoll beschreibt, wie die Kontraktilität in adulten humanen primären Kardiomyozyten aus Spenderherzen mit dem MyoBLAZER-System gemessen werden kann, einer zuverlässigen Plattform zur Beurteilung arzneimittelinduzierter Veränderungen der Kontraktilität während der präklinischen Entwicklung.

Messung der Herzkontraktilität in isolierten adulten humanen primären Kardiomyozyten

Lernen Sie die Herstellung nachgiebiger Matrizen zur Quantifizierung zellulärer Kontraktion mittels Traction Force Microscopy. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Zell-Matrix-Interaktionen und deren Einfluss auf das Zellverhalten.

Vorbereitung der Beschwerde Matrizen zur Quantifizierung von Cellular Kontraktion

Weitere Videos entdecken