Name: High-Efficiency Transduktion von Liver Cancer Cells von rekombinanten Adeno-assoziierten Virus Serotyp 3 Vektoren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 19 min 2 s
Description: Erfahren Sie die hocheffiziente Transduktion von Leberkrebszellen mit rekombinanten AAV3-Vektoren. Diese Methode ermöglicht gezielte Gentherapie und hohe Transfereffizienz in menschlichen Hepatoblastomzellen.

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Wir danken Drs. R. Jude Samulski und Xiao Xiao für ihre Sachspenden von rekombinanten AAV3 und AAV-EGFP-Plasmiden, bzw., und Dr. Gail Tomlinson für die großzügige Bereitstellung von Hep293TT Zellen. Diese Arbeit wurde teilweise durch Public Health Service gewähren Zuschüsse R01 HL-076901, R01 HL-097088 und P01 DK-058327 (Projekt 1) von den National Institutes of Health (AS) unterstützt.

1. Verpackung von rekombinanten Adeno-assoziierten Virus Serotyp 3 (rAAV3) Vektoren <ol><li> Besuchen Sie die Website: " <a href="http://www.geguchadze.com/calc">http://www.geguchadze.com/calc</a> "und berechnen Sie die DNA-Menge. </li><li> Pre-Mix Plasmide pHelper (Adenovirus Helfer), pACG2c3 (AAV-Helfer) und pdsAAV-CB-EGFP (rAAV-Vektor) in Medium ohne FBS und Antibiotika. Das Gesamtvolumen sollte 8.750 ul für zehn 15 cm 2 Platten sein. </li><li> Fügen Sie direkt 1.250 ul des PEI (0,1% m / v, Polysciences, Kat. Nr. 23966, pH 4,5) in die DNA-Lösung in Schritt 1.2. Vortex die DNA-PEI-Lösung für ein paar Sekunden. </li><li> Inkubieren DNA-PEI Lösung für ein komplexes für 5 min bei Raumtemperatur (RT) zu bilden. </li><li> 1 ml der DNA-PEI-Lösung pro 15 cm 2 Platten. </li><li> Entfernen Medium nach 4 Stunden und ersetzt mit frischen 25 ml Vollmedium +10% FBS (C-DMEM). </li><li> Zweiundsiebzig Stunden nach der Transfektion, kratzen Zellen und gießen in einen konischen 250 ml-Zentrifugenröhrchen. </li><li> Spin bei 3000 Umdrehungen pro Minute, bei 4 ° C für 10 min. Überstand abgießen. </li><li> Re-suspend das Zellpellet in 5 ml RB TMS-Puffer (50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 8,0). Transfer zu einem neuen 15 ml konischen Rohr. </li><li> Einfrieren in Trockeneis-Ethanol-Bad für 10 min und Auftauen bei 37 ° C für 10 min. Dreimal wiederholen. </li><li> Add 1 ul von 4,8 M MgCl 2 und 2 ul Benzonase (25 U / ul, Novagen, Kat. Nr. 70664-3). Vortex und inkubieren bei 37 ° C für 40 min. </li><li> Spin down bei 4.000 rpm, bei 4 ° C für 40 min und den Überstand (geklärte Lysat). </li><li> In einem 13 mL Quick-Seal-Zentrifugenröhrchen (Beckman, Kat. Nr. 342413), Last Iodixanol Gradienten (OptiPrep, Kat. Nr. 1114542) von oben nach unten: 2 ml 15%, 2 ml 25%, 1,5 ml 40% und 1,5 ml 60% Iodixanol. Legen Sie den Überstand (Schritt 1,12) auf der Oberseite des Iodixanol Gradienten. Füllen Sie das Röhrchen mit RB TMS Buffer. </li><li> Zentrifuge mit 75.000 UpM für 1 Stunde bei 16 ° C mit Beckman 90TI Rotor. </li><li> Sammeln Sie die 40% Iodixanol Fraktion durch Einlegen einer Spritze bei 40-60%-Grenze. </li><li> Übertragen Sie die 40% Iodixanol Bruchteil in einem 50 ml konischen Rohr und machen bis zu 40 ml mit Puffer A (20 mM Tris, 15 mM NaCl, pH 8,5). </li><li> Montieren Sie die Filtrationsvorrichtung mit HiTrap Q HP-Säule (GE Healthcare, Kat. Nr. 17-1154-01). Die Säule wird mit den folgenden Puffer: 25 ml Puffer A (20 mM Tris, 15 mM NaCl, pH 8,5), 25 ml Puffer B (10 mM Tris, 500 mM NaCl, pH 8,5); 50 ml Puffer A; 40 ml Virus-Probe in Puffer A, 50 ml Puffer A (20 mM Tris, 15 mM NaCl, pH 8,5); 20 ml Puffer C (20 mM Tris, 175 mM NaCl, pH 8,5); </li><li> Sammeln Buffer C in einem 20 ml Apollo-Konzentratoren (Orbital Biosciences). Zentrifuge bei 3.000 rpm bei 4 ° C für 10 min. </li><li> Verwerfen Sie den Durchfluss durch und fügen 20 mL gekühlter PBS und Zentrifuge bei 3.000 rpm bei 4 ° C für 10 min. </li><li> Verwerfen Sie den Durchfluss durch und stell 500 ul von gekühlten PBS. Waschen Sie die Vektoren aus der Membran und Transfer zum Silicon behandelten Eppendorf-Röhrchen und lagern in kleinen Aliquots bei -80 ° C eingefroren </li></ol> 2. Bestimmung der rAAV3 Vektortiter <ol><li> Tauwetter 10 ul des gereinigten Virus in ein Eppendorf-Röhrchen auf Eis. Add 40 ul ddH 2 O. </li><li> Add 0,2 ul der Benzonase (25 U / ul, Novagen, Kat. Nr. 70664) und bei 37 ° C für 1 Stunde. </li><li> Nehmen Sie 50 ul von Plasmid-Standard (0,2 ng / mL) in einem anderen Eppendorf-Röhrchen. </li><li> Add 50 ul 100 mM NaOH in jedes Röhrchen und inkubieren bei 65 ° C für 30 min. </li><li> Gefühlt auf Eis sofort für mindestens 5 min. </li><li> Cut Transfer-Membran (Millipore, Cat # INYC00010) nach Bio-Dot-Filterpapier (Bio-Rad, Kat. Nr. 1620161). Spülen Sie Membran in 10x SSC mit drei Filterpapiere für 20 min. </li><li> Set Slot-Blot-SF Apparatus (Bio-Dot, Kat. Nr. 170-6542). Schließen Sie eine Thermoskanne und 100 ul von 10x SSC auf die Slot-Blot-Apparatur. </li><li> Add 100 ul 20x SSC und 1 ul 6x Loading Dye zu jeder der Proben in Schritt 2.5. </li><li> Legen Sie 100 ul der einzelnen Proben auf die Membran in die Slot-Blot-Apparatur. </li><li> Add another 100 ul 10x SSC in jeder der Proben. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 2.9 und 2.10, bis alle die Probe geht durch die Membran. </li><li> Zerlegen Sie den Slot-Blot-Apparatur und entfernen Sie die Membran. Legen Sie es in Inspector Linker SL-1000 UV Crosslinker. Schalten Sie "Energy", "Optimal Crosslink" (show 1200) und drücken Sie "Start". </li><li> Boil 1 ml Lachssperma (SS) DNA (Fisher, Kat. Nr. NC9753983) für 5 min. Gefühlt auf Eis für mindestens 5 min. </li><li> Bereiten Sie die Pre-Hybridisierungslösung durch Mischen 27.5 mL ddH 2 O, 15 ml 20x SSC, 5 ml 50x Denhardt-Lösung, 1,25 ml 20% SDS, 0,25 ml PolyA und 1 ml SS DNA aus Schritt 2.13. </li><li> Suspend die Membran in 25 ml pre-Hybridisierungslösung in einem verschlossenen Glaszylinder und Inkubieren bei 65 ° C in einer Hybridisierung Kammer über Nacht. </li><li> Verdünnen Sie 50 ng DNA-Vorlagen in 10 ul ddH 2 O. Kochen bei 100 ° C für 5 min und Chill auf Eis sofort für mindestens 5 min. </li><li> Zentrifuge bei 3.000 rpm bei RT für 1 min. Add 2 &amp;mgr; l 10 mM 3 dNTPs (fehlt dCTP), 2 ul der Hexanukleotid Mix (Roche, Kat. Nr. 11277081001), 1 ul Klenow (Roche, Kat. Nr. 11008404001) und 5 ul α -32 P-dCTP. Bei 37 ° C für 10 min. </li><li> Zentrifuge G-50 Säulen (GE Healthcare, Kat. Nr. 27-5330-01) bei 3.000 rpm für 2 min. Laden Sie die Sonde in Step 2,17 in der Spalte. Zentrifuge bei 3.000 rpm für 2 min und sammeln Sie die Flow-Through. </li><li> Messen der Radioaktivität. Kochen Sie die Sonde bei 100 ° C für 5 min und Chill auf Eis sofort für mindestens 5 min. </li><li> Fügen Sie die Sonde (6x10 5 cpm / ml) in die Pre-Hybridisierungslösung mit Membran. </li><li> Inkubieren über Nacht bei 65 ° C in einer Hybridisierung Kammer. </li><li> Verwerfen der Hybridisierungslösung und spülen Sie die Membran in 2x SSC +0,1% SDS bei RT für 15 min. </li><li> Entsorgen Sie die Lösung und spülen Sie die Membran in 0,1 x SSC +0,1% SDS bei 65 ° C für 30 min. </li><li> Entsorgen Sie die Lösung und spülen Sie die Membran in 0,1 x SSC bei RT kurz. </li><li> Setzen Sie den Film bei -80 ° C für 6 Stunden und Entwicklung des Films. Ein typisches Ergebnis ist in Abbildung 1 dargestellt. </li></ol> 3. rAAV3 Vektor-vermittelte Transduktion und Transgenexpression in Human Liver Cancer Cells <ol><li> Seed 1x10 4 Zellen (entweder Huh7 oder Hep293TT) in jede Vertiefung der 96-Well-Platte. Inkubieren in einem befeuchteten CO 2-Inkubator für mindestens 18 Stunden. </li><li> Entfernen Sie Medium aus dem 96-Well-Platte. </li><li> Wash Zellen zweimal mit 50 ul Medium ohne FBS und Antibiotika und zu entfernen. </li><li> Add 50 ul Medium ohne FBS und Antibiotika und rAAV-Vektoren bei 5.000 vgs / Zelle. </li><li> Die Platten in der CO 2-Inkubator für 4 Stunden. </li><li> Entsorgen Sie das Medium. Wash Zellen zweimal mit 50 ul Vollmedium und zu entfernen. </li><li> Add 150 ul C-DMEM in jede Vertiefung und inkubieren Sie die Platte in CO 2-Inkubator für 72 Stunden, und visualisieren die EGFP-Expression mit einem Fluoreszenzmikroskop (DMI 4000B; Leica Microsystems). </li><li> Bilder aus drei Brunnen von Virus-infizierten Zellen quantitativ durch ImageJ-Analyse-Software (NIH, Bethesda, MD, USA) analysiert. </li><li> Transgenexpression als Gesamtfläche von grüner Fluoreszenz (Pixel 2) pro Gesichtsfeld beurteilt. Ein typisches Ergebnis ist in Abbildung 2 dargestellt. </li><li> Transgenexpression kann auch durch Durchflusszytometrie bestimmt werden. </li></ol> 4. Repräsentative Ergebnisse: Nach dem Protokoll oben genannten, kann man AAV-Serotyp Vektoren effizient zu generieren. Die typische Ausbeute ist ~ 500 ul mit ~ 10 11 vgs / ul des gereinigten Vektor Lager. Die Reinheit des Vektors Lager wird durch den Vergleich Hybridisierungssignale auf quantitative DNA-Slot-Blots, mit und ohne Benzonase Verdauung bestimmt. Gereinigtes rAAV3 Vektoren transduzieren menschlichen Leberkrebs - hepatoblastoma (HB) und des hepatozellulären Karzinoms (HCC) - Zelllinien effizient. <img src="/files/ftp_upload/2538/2538fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Quantitative DNA-Slot-Blot-Analyse zur Bestimmung der Titer von rAAV3 Vektoren. Zweifache Verdünnungen des gereinigten viralen Aktien, mit Benzonase (obere Reihe) verdaut wurden quantitative DNA-Slot Blots mit 32 P-markierten EGFP-spezifischen DNA-Sonde analysiert. Der Titer AAV3 Vektor wurde durch Vergleich mit 1 ng (mittlere Reihe) oder 10 ng (untere Reihe) von AAV-EGFP-Plasmid-Standards auf der Membran geladen bestimmt. Die Zahlen zum DNA-Kopien entsprechen. <img src="/files/ftp_upload/2538/2538fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. Rekombinante AAV-Vektor-vermittelte Transgenexpression in der menschlichen Leber Krebszellen. Hep293TT Zellen, einer kürzlich etablierten humanen Zelllinie hepatoblastoma 4, wurden entweder mock-infiziert (linkes Bild), oder transduziert mit 5.000 vgs / Zelle entweder scAAV2-EGFP oder scAAV3-EGFP-Vektoren bei 37 ° C für 2 Stunden. Transgenexpression visualisiert wurde 72 Stunden nach der Transduktion mit einem Fluoreszenzmikroskop.

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Rekombinante Vektoren auf einer nicht-pathogenen menschlichen Parvovirus, das Adeno-assoziierte Virus (AAV) wurden entwickelt und werden derzeit in einer Reihe von Gentherapie klinische Studien 5. Zuvor, von den 10 am häufigsten verwendete AAV-Serotypen, die Transduktionseffizienz von AAV3 Vektoren im Allgemeinen berichtet worden, um besonders niedrig sein, sowohl in vitro und in vivo 1. Aber unsere jüngsten Beobachtung, dass AAV3 Vektoren transduzieren menschlichen Leber Krebszelllinien außerordentlich gut, wie quantitativ mittels Durchflusszytometrie 2 bestimmt, und dass AAV3 nutzt die menschlichen Hepatozyten-Wachstumsfaktor-Rezeptor (hHGFR) als zelluläre Co-Rezeptor für die Bindung und die Eintragung in diese Zellen 3, empfehlen dringend eine selektive Gewebe-Tropismus AAV3 für den menschlichen Leberzellen im allgemeinen und der menschlichen Leber Krebszellen im Besonderen. Da jedoch AAV3 Vektoren auch transduzieren normalen menschlichen Hepatozyten effizient 2, würden ihre mögliche Verwendung in der Krebstherapie Anwendung in vivo werden negativ beeinflusst. Eine mögliche Strategie, um dieses mögliche Problem zu umgehen, besteht Transkriptions-Targeting von Krebszellen durch die Identifizierung eines Gens Produkt, das selektiv durch den Tumor produziert wird, aber nicht durch normale Hepatozyten. Zum Beispiel haben frühere Studien gezeigt, dass der Serumspiegel von α-Fetoprotein (AFP) als ein spezifischer Marker für die Verfolgung der Gegenwart, Progression und / oder Wiederauftreten bestimmter Arten von Leberkrebs eingesetzt werden, da normale Hepatozyten in der Regel sehr geringe Mengen produzieren dieses Proteins. In der Tat haben wir AAV3 Vektoren, die die AFP-Promotor Transgenexpression in Leberkrebszellen Ziel verwendet, aber nicht in normalen Hepatozyten 2 und Studien werden derzeit durchgeführt, um die Wirksamkeit dieses Ansatzes in einem murinen Xenograft-Modell von Leberkrebs zu testen. In unseren zusätzlichen Untersuchungen haben wir festgestellt, dass die Transduktion Effizienz verschiedener AAV-Serotyp Vektoren deutlich durch ortsspezifische Mutagenese von Oberflächen-exponierten Tyrosinreste in der viralen Kapside 6-14 erweitert werden. Seit 6 von 7 Oberflächen-exponierten Tyrosine auch in AAV3 konserviert sind, haben wir Mutagenese dieser Reste durchgeführt und festgestellt, dass die Transduktion von Tyrosin-Mutante AAV3 Vektoren deutlich wird in der menschlichen Leber Krebszellen (unveröffentlichte Daten) erweitert. Die Studien werden derzeit auch im Gange, um die Sicherheit und Wirksamkeit des Tyrosin-Mutante AAV3 Vektoren in Maus-Xenograft-Modellen für den menschlichen hepatoblastoma und des hepatozellulären Karzinoms zu bewerten und, sofern erfolgreich, die optimale Tyrosin-Mutante AAV3 Serotyp Vektoren können sich als nützlich erweisen für die Ausrichtung der menschlichen Leber Krebserkrankungen für die potenzielle Gentherapie.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Cellgro</td><td>10-0170CM</td><td></td></tr><tr><td>PEI</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>23966</td><td></td></tr><tr><td>Benzonase</td><td>Novagen, EMD Millipore</td><td>70664-3</td><td></td></tr><tr><td>HiTrap Q HP-Säule</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1154-01</td><td></td></tr><tr><td>Lachssperma-DNA</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9753983</td><td></td></tr><tr><td>Iodixanol-Gradiente</td><td>OptiPrep</td><td>1114542</td><td></td></tr><tr><td>G-50-Säulen</td><td>GE Healthcare</td><td>27-5330-01</td><td></td></tr></tbody></table>

high-efficiency transduktion von liver cancer cells von rekombinanten adeno-assoziierten virus serotyp 3 vektoren

High-Efficiency Transduction of Liver Cancer Cells by Recombinant Adeno-Associated Virus Serotype 3 Vectors 

Rekombinante Vektoren auf einer nicht-pathogenen menschlichen Parvovirus basieren, haben die Adeno-assoziierten Virus 2 (AAV2) entwickelt worden und sind derzeit im Einsatz in einer Reihe von Gentherapie klinische Studien. In jüngerer Zeit haben eine Reihe von zusätzlichen AAV-Serotypen auch isoliert worden, von denen gezeigt wurde, um eine selektive Gewebe-Tropismus in verschiedenen kleinen und großen Tiermodellen 1 aufweisen. Von den 10 am häufigsten verwendete AAV-Serotypen ist AAV3 mit Abstand die am wenigsten effiziente Transduktion in Zellen und Geweben in vitro als auch in vivo. Doch in unserem kürzlich veröffentlichten Studien, haben wir dokumentiert, dass AAV3 Vektoren menschlichen Leberkrebs transduzieren - hepatoblastoma (HB) und des hepatozellulären Karzinoms (HCC) - Zelllinien äußerst effizient, weil AAV3 nutzt menschlichen Hepatozyten-Wachstumsfaktor-Rezeptor als zellulären Co-Rezeptor für die Bindung und die Eintragung in diese Zellen 2,3. In diesem Artikel beschreiben wir die notwendigen Schritte zur hocheffizienten Transduktion von humanen Leber-Krebszellen durch rekombinante AAV3 Vektoren, die ein Reporter-Gen zu erreichen. Die Verwendung von rekombinanten AAV3 Vektoren, die ein therapeutisches Gen kann schließlich das Potenzial der Gentherapie von Lebertumoren beim Menschen führen.

In diesem Artikel beschreiben wir die Identifikation des Adeno-assoziierten Virus Serotyp 3 (AAV3) als die effizienteste Vektor für die Ausrichtung der menschlichen Leber Krebszellen.

High-Efficiency Transduktion von Liver Cancer Cells von rekombinanten Adeno-assoziierten Virus Serotyp 3 Vektoren

Es wurden rekombinante Vektoren auf der Basis eines nicht-pathogenen humanen Parvovirus, dem adeno-assoziierten Virus 2 (AAV2), entwickelt, die derzeit in einem ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, aktive Vektoren des adeno-assoziierten Virus-Serotyps drei herzustellen, die menschliche Leberkrebszellen effizient transduzieren können. Dies wird erreicht, indem zunächst drei verschiedene Plasmide gleichzeitig in 293-Zellen transfiziert werden. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht in der Reinigung der in 293-Zellen zusammengesetzten AAV-Typ-3-Variante.Der dritte Schritt des Verfahrens besteht darin, die Titer des gereinigten AAV-Drei-Vektor-Präparats zu bestimmen. Der letzte Schritt des Verfahrens ist die Transduktion menschlicher Leberkrebszellen mittels der gereinigten AAV-Drei-Vektoren. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die mittels Fluoreszenzmikroskopie ein stark exprimiertes EGFP-Protein in menschlichen Leberkrebszellen zeigen.Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden liegt in der Erzielung einer hohen Effizienz der Genübertragung und -expression in menschlichen Leberkrebszellen. Obwohl diese Methode Einblicke in die Herstellung von AAV-Drei-Vektoren ermöglicht, kann sie auch auf andere Systeme angewandt werden, beispielsweise auf die weitaus häufiger verwendeten AAV-Zwei-Vektoren. Personen, die neu in dieser Methode sind, werden im Allgemeinen Schwierigkeiten haben, da mehrere Arbeitsschritte erforderlich sind, die mühsam sein können. Die Durchführung des Verfahrens wird ein Biologe aus unserem Labor demonstrieren.Die experimentellen Manipulationen in diesem Abschnitt des Protokolls werden 48 Stunden vor Beginn dieses Verfahrens in einer Zellkulturhaube durchgeführt. Säen Sie 10 Zellkulturschalen mit einem Durchmesser von 15 Zentimetern mit der menschlichen embryonalen Nierenzelllinie 2, 9 3 aus, sodass die Zellen am Tag der Transfektion 70 bis 80 % konfluent sind. Verwenden Sie die Website www.ge shae. com/calc, um die Menge an Plasmid-DNA zu berechnen, die für die Transfektion verwendet werden soll. Sobald die korrekten Volumina an Plasmid-DNA berechnet wurden, fahren Sie mit der Transfektion fort, indem Sie ein geeignetes Volumen an Zellkulturmedium ohne FBS und Antibiotika in ein steriles 15-Milliliter-Röhrchen pipettieren.Pipettieren Sie anschließend die erforderlichen Volumina von P-Hilfsvektor, PACG zwei, C3 und PDSA AAV C-B-E-G-F-P in das Medium. Das Gesamtvolumen sollte für 10 15-Zentimeter-Platten 8.750 Mikroliter betragen; pipettieren Sie 1.250 Mikroliter PEI in das Medium, das die Plasmid-DNA enthält. Wirbeln Sie die DNA-PEI-Lösung einige Sekunden lang, und inkubieren Sie sie danach fünf Minuten bei Raumtemperatur, um die Bildung von DNA-PEI-Komplexen zu ermöglichen. Entnehmen Sie die 10 15-Zentimeter-Platten mit HEC 2 9 3-Zellen aus dem Zellkultur-Inkubator.Dann pipettieren Sie einen Mikroliter der DNA-PEI-Lösung in jede der Platten. Inkubieren Sie die Platten vier bis sechs Stunden lang in einem Zellkultur-Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid. Nach vier bis sechs Stunden entfernen Sie vorsichtig das Medium von den Platten.Anschießend pipettieren Sie 25 Milliliter komplettes Medium mit 10 % FBS in jede Platte. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid für etwa 72 Stunden. Sobald die 72 Stunden verstrichen sind, nehmen Sie die Platten aus dem Inkubator und kehren Sie zur Gewebekulturhaube zurück.Danach die Medien nicht absaugen, sondern mit einem Zellkratzer die Zellschicht vom Boden der Platte in das Zellkulturmedium abkratzen. Das Zell enthaltende Medium in ein kegelförmiges Zentrifugenröhrchen mit 250 Milliliter Fassungsvermögen gießen. Dieses Verfahren für jede transfizierte Platte wiederholen und den Inhalt jeder Platte in dasselbe kegelförmige Zentrifugenröhrchen mit 250 Milliliter Fassungsvermögen geben.Zentrifugieren Sie das Röhrchen mit den Zellen und dem Medium in einer gekühlten Zentrifuge bei vier Grad Celsius für 10 Minuten bei 3000 Umdrehungen pro Minute. Nach der Zentrifugation das Überstand entfernen, dann fünf Milliliter RB-TMS-Puffer auf das Pellet pipettieren und resuspendieren. Überführen Sie die Zellsuspension in ein sauberes kegelförmiges 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen.Stellen Sie das 15-Milliliter-Röhrchen in ein Trockeneis-Ethanol-Bad, um es 10 Minuten lang einzufrieren. Nach Ablauf der Inkubationszeit nehmen Sie das Röhrchen heraus und stellen es 10 Minuten lang auf 37 Grad Celsius. Zum Auftauen wiederholen Sie diesen Einfrier-Auftau-Zyklus weitere zwei Mal.Schwenken Sie das Röhrchen einige Sekunden lang im Vortex. Nach jedem Auftauen, nach der endgültigen Auftauperiode, pipettieren Sie ein Mikroliter 4,8-molares Magnesiumchlorid und zwei Mikroliter mit 25 Einheiten pro Mikroliter Benon-Nase in die Zelllösung und schwenken Sie im Vortex, um es zu mischen.Anschließend 40 Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren. Nach der Inkubation das Röhrchen in eine gekühlte Zentrifuge bei vier Grad Celsius geben und 40 Minuten lang mit 4.000 Umdrehungen pro Minute zentrifugieren. Gegen Ende der Zentrifugationsdauer das IAL-Gradientenmedium vorbereiten, das zur Reinigung des Virus verwendet wird. Dazu zwei Milliliter 15 %, zwei Milliliter 25 %, 1,5 Milliliter 40 % und 1,5 Milliliter 60 % IAL in ein 13-Milliliter-Verschlusszentrifugenröhrchen pipettieren.Nach der Zentrifugation pipettieren Sie das S-Supernatant aus dem Zentrifugenröhrchen, wobei darauf zu achten ist, den Zellpellet nicht aufzuwirbeln. Geben Sie das Supernatant auf den IAL-Gradienten und pipettieren Sie anschließend so viel RB-TMS-Puffer in das Röhrchen, dass es vollständig gefüllt ist. Stellen Sie das Röhrchen in einen Beckman-90-TI-Rotor, wobei darauf zu achten ist, dass der Rotor ordnungsgemäß ausbalanciert ist. Zentrifugieren Sie eine Stunde lang bei 75.000 Umdrehungen pro Minute und 16 Grad Celsius.Nach der Zentrifugation sammeln Sie die 40 % IAL-Fraktion, indem Sie eine 5-mL-Spritze mit einer 18-Gauge-Nadel an der Grenze zwischen 40 % und 60 % in das IAL-Gradientenmedium einführen. Saugen Sie vorsichtig die Flüssigkeit in die Spritze und sammeln Sie die 40 % IAL-Fraktion.Drücken Sie die 40 % IAL-Fraktion aus der Spritze in ein 50-Milliliter-Konischgefäß. Füllen Sie dann das Gefäß unter Zugabe von Puffer A auf ein Endvolumen von 40 Milliliter auf. Bauen Sie die Filtrationsapparatur unter Verwendung einer High Trap Q HP-Säule gemäß den Herstelleranweisungen zusammen.Anschließend die Säule mit den folgenden Lösungen waschen: 25 Milliliter Puffer A, 25 Milliliter Puffer B, 50 Milliliter Puffer A, 40 Milliliter der vorbereiteten idalen Virusprobe in Puffer A, 50 Milliliter Puffer A und abschließend 20 Milliliter Puffer C. Sammeln Sie Puffer C in einem 20-Milliliter-Apollo-Konzentrator. Zentrifugieren Sie die Probe anschließend 10 Minuten lang bei 3000 Umdrehungen pro Minute in einer gekühlten Zentrifuge, die auf vier Grad Celsius eingestellt ist. Nach der Zentrifugation das Durchflussvolumen verwerfen.Anschließend 20 Milliliter kalte PBS zum Apollo-Konzentrator hinzufügen und erneut in einer gekühlten Zentrifuge bei vier Grad Celsius für 10 Minuten bei 3000 Umdrehungen pro Minute zentrifugieren. Danach erneut den Durchlauf entsorgen und 500 Mikroliter kalte PBS auf die Membran pipettieren, um das Virus von der Membran erneut in Lösung zu bringen. Danach 10-Mikroliter-Aliquote des viralen Vektors in silikonbehandelte Sammelröhrchen pipettieren und bei minus 80 Grad Celsius bis zur Verwendung lagern; einen der 10-Mikroliter-Aliquote des gereinigten Virus auf Eis auftauen.Pipettieren Sie 40 Mikroliter doppelt destilliertes Wasser in das Röhrchen, um das Virus zu verdünnen. Geben Sie anschließend 0,2 Mikroliter einer 25 Einheiten pro Mikroliter-Ben-Nase-Lösung hinzu und inkubieren Sie die Mischung eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius. In der Zwischenzeit pipettieren Sie 50 Mikroliter eines 0,2 Nanogramm pro Mikroliter-Plasmidstandards in ein sauberes Eppendorf-Röhrchen.Nach der Inkubation 50 Mikroliter 100 Millimolar Natriumhydroxid zu dem Röhrchen mit dem Virus hinzufügen. Bens aase mix zu dem Röhrchen mit dem Plasmidstandard hinzufügen. Beide Röhrchen 30 Minuten bei 65 Grad Celsius inkubieren.Nach Ablauf der 30 Minuten beide Röhrchen unverzüglich mindestens fünf Minuten lang auf Eis abkühlen. Anschließend ein Stück Transfermembran in der gleichen Größe wie ein Stück Bio-Dot-Filterpapier zuschneiden. Die Transfermembran und drei Stücke Bio-Filterpapier in eine flache Schale legen.Füllen Sie die Wanne mit 10× SSC und lassen Sie sie 20 Minuten lang einweichen, während die Membran einweicht. Richten Sie die Slot-Block-SF-Vorrichtung gemäß den Herstelleranweisungen ein. Schließen Sie die Vorrichtung an einen Vakuumkolben an und pipettieren Sie dann 100 Mikroliter 10× SSC in jeden der Schlitzplätze, die mit der Verdünnung der Virusprobe und dem Plasmidstandard beladen werden sollen.Entfernen Sie die Röhrchen aus der auf vier Grad Celsius gekühlten Eisschleuderzentrifuge, die eine Minute lang bei 13.000 Umdrehungen pro Minute zentrifugiert wurden. Geben Sie dann 100 Mikroliter 20-fach SSC und ein Mikroliter 6-fach-Ladefarbstoff zu jedem Röhrchen hinzu. Pipettieren Sie anschließend weitere 100 Mikroliter 10-fach SSC in jedes Röhrchen und geben Sie jeweils 100 Mikroliter jeder Probe in benachbarte Schlitze. Wiederholen Sie den Verdünnungs- und Ladevorgang, bis das Gesamtvolumen jeder Probe in die Slot-Block-Vorrichtung geladen wurde, und fügen Sie anschließend 10-mal SSC in Ihrem Volumen von 100 Mikrolitern oder weniger hinzu. Sobald alle Proben durch die Membran gelaufen sind, demontieren Sie die Slot-Blot-Vorrichtung und entfernen Sie die Membran mit einer Pinzette. Achten Sie darauf, die Membran nur an den Rändern zu berühren, und legen Sie die Membran in die Kammer des Inspector Linker SL 1000 UV-Vernetzers.Dann wählen Sie die energieoptimale Vernetzung; die Vernetzung sollte ungefähr 30 Sekunden dauern. Bereiten Sie nun die Hybridisierung vor, indem Sie ein Milliliter Lachssperma-DNA fünf Minuten lang kochen. Nach dem Fünf-Minuten-Kochen sollte die Lachssperma-DNA sofort für mindestens fünf Minuten auf Eis abgekühlt werden.Dann bereiten Sie die Prähybridisierungslösung gemäß dem schriftlichen Protokoll vor. Pipettieren Sie 25 Milliliter der Prähybridisierungslösung, die Hähnchensperma-DNA enthält, in ein Hybridisierungsrohr. Überführen Sie die vernetzte Membran vorsichtig in das Hybridisierungsrohr und setzen Sie anschließend den Verschluss auf das Rohr, wobei sichergestellt werden muss, dass die Prähybridisierungslösung die Membran vollständig bedeckt.Im horizontalen Zustand über Nacht in einer Hybridisierungskammer bei 65 Grad Celsius inkubieren. Am nächsten Tag die Sondenpräparation beginnen, indem 50 Nanogramm DNA-Vorlage in ein Eppendorf-Röhrchen pipettiert und mit 10 Mikrolitern doppelt destilliertem Wasser verdünnt werden. Die verdünnte DNA fünf Minuten lang kochen und anschließend unverzüglich mindestens fünf Minuten auf Eis abkühlen. Die verdünnte DNA-Vorlage bei Raumtemperatur eine Minute lang bei 13.000 Umdrehungen pro Minute zentrifugieren.Dann gemäß den Strahlenschutzrichtlinien der Institution arbeiten. Bereiten Sie die radioaktive Sonde vor, indem Sie zwei Mikroliter 10-Millimolarer DNTS ohne DCTP und zwei Mikroliter Hexanukleotid mischen. Geben Sie ein Mikroliter AU und fünf Mikroliter 32P-D-C-T-P hinzu und inkubieren Sie eine Stunde bei 37 Grad Celsius. Nach der Inkubation fortfahren.Bereiten Sie G 50-Säulen durch Zentrifugation bei 3000 Umdrehungen pro Minute für zwei Minuten vor. Anschließend geben Sie die Probe auf die Säule und zentrifugieren Ihr Eluat bei 3000 Umdrehungen pro Minute für zwei Minuten, wobei Sie den Durchlauf sammeln. An diesem Punkt wird die Radioaktivität des Durchlaufs mit Standardverfahren gemessen, um die Zerfälle pro Minute pro Milliliter der Probe zu bestimmen.Als Nächstes den Probe fünf Minuten lang kochen. Danach den Probe unverzüglich fünf Minuten lang auf Eis abkühlen. Der Probe ist dann bereit, für die Hybridisierung verwendet zu werden, ohne dass die Membran entfernt werden muss.Pipettieren Sie die Sonde in einer Konzentration von sechs Mal zehn hoch fünf Zählungen pro Minute pro Milliliter direkt in die Prähybridisierungslösung im Hybridisierungsrohr. Inkubieren Sie die Hybridisierungskammer über Nacht bei 65 Grad Celsius am nächsten Tag. Entsorgen Sie die Hybridisierungslösung gemäß den institutionellen Vorschriften für Radioaktivität und pipettieren Sie 25 Milliliter zweifach konzentrierter SSC-Lösung plus 0,1 % SDS in das Rohr, um die Membran 15 Minuten bei Raumtemperatur zu waschen.Entsorgen Sie die Lösung und pipettieren Sie 25 Milliliter 0,1-fach SSC plus 0,1 % SDS in das Gefäß. Waschen Sie die Membran 30 Minuten lang bei 65 Grad Celsius. Danach entsorgen Sie die Lösung und spülen die Membran kurz mit 25 Milliliter 0,1-fach SSC bei Raumtemperatur ab.Wickeln Sie die Membran in Frischhaltefolie ein und legen Sie sie in eine Belichtungskassette, wobei im Dunkelraum gearbeitet werden muss. Legen Sie ein Stück Film auf die Membran und schließen Sie die Kassette, um sie vor Licht zu schützen. Stellen Sie die Belichtungskassette für sechs Stunden in den minus 80 Grad Celsius kalten Gefrierschrank.Nach sechs Stunden. Entwickeln Sie die Folie und bestimmen Sie die Titer der Virusstämme, indem Sie die Dichte der Virusbanden mit den Banden der Plasmidstandards vergleichen. Sobald der Titer bestimmt ist, kann das Virus verwendet werden, um Zellen zu transduzieren; impfen Sie zunächst 1 × 10⁴ Hep 2 93 TT-Zellen aus.In jedes Loch einer 96-Loch-Platte die Zellen mindestens 18 Stunden lang in einem Inkubator mit 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid inkubieren. Nach der Inkubation das Medium aus jedem Loch abziehen und vorsichtig 50 Mikroliter Medium ohne Antibiotika und FBS in jedes Loch pipettieren. Dieses Medium anschließend abziehen und den Vorgang wiederholen, um die Zellen zu waschen.Verdünnen Sie die rekombinanten a a v-Vektoren in Medium ohne FBS und Antibiotika auf eine Endkonzentration von 5.000 VGS pro Zelle. Geben Sie 50 Mikroliter dieser Lösung oder 50 Mikroliter Medium ohne FBS als negativen Kontrollansatz in die Vertiefungen der 96-Loch-Platte und inkubieren Sie zwei Stunden lang in einem 37 °C warmen Inkubator mit 5 % Kohlendioxid. Nach der Inkubation entfernen Sie das virushaltige Medium und waschen die Zellen zweimal wie zuvor mit jeweils 50 Mikrolitern vollständigem Medium pro Vertiefung. Nach dem Verwerfen der letzten Waschung 150 Mikroliter komplettes Medium in jede Vertiefung geben und die Platte 72 Stunden lang in einem Inkubator mit 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid inkubieren. Abschließend die EGFP-Expression mittels Fluoreszenzmikroskopie visualisieren. Die Fluoreszenzintensität kann mit der Image-J-Software quantifiziert werden, wobei die Transgenexpression als Gesamtfläche der grünen Fluoreszenz pro Sichtfeld bewertet wird.Ein Beispiel für einen quantitativen DNA-Slot-Blot zur Bestimmung der Titer von RAV-3-Vektoren ist hier dargestellt. Diese Membran wurde mit einem P-32-markierten EGFP-spezifischen DNA-Sonde hybridisiert. Die oberste Reihe des Blocks umfasst Verdünnungen im Verhältnis 1:2 von gereinigten viralen Stämmen, die mit Ben-Nase verdaut wurden.Die mittlere und untere Reihe bestehen aus A-A-V-E-G-F-P-Standards, die jeweils aus einem Nanogramm bzw. zehn Nanogramm Plasmid verdünnt wurden. Die Titer der Viruspräparationen werden durch Vergleich mit den Plasmidstandards bestimmt. Die auf dem Blot angezeigten Zahlen entsprechen der Anzahl an Plasmid-DNA-Kopien.Dies ist ein Beispiel für die durch einen rekombinanten AAV-Vektor vermittelte Transgenexpression. In einer humanen Hepatoblastomzelllinie wurden die Zellen 72 Stunden nach der Transduktion mittels Fluoreszenzmikroskopie visualisiert. Das erste Bild zeigt die Ergebnisse einer Scheininfektion.Das zweite Bild zeigt HEP 2 93 TT-Zellen, die mit 5.000 VGS pro Zelle aller AAV zwei EGFP-Vektoren bei 37 Grad Celsius für zwei Stunden transduziert wurden. Das letzte Bild zeigt die Transduktion mit 5.000 VGS pro Zelle von R AAV drei EEG FP unter denselben Bedingungen. Es ist ersichtlich, dass RAAV drei im Vergleich zu R AAV zwei deutlich effizienter bei der Transduktion dieses Zelltyps ist.Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Gentherapie zu beantworten, beispielsweise wie humane Leberkrebszellen gezielt behandelt werden können. Die Bedeutung dieser Technik erstreckt sich auf die Therapie von menschlichem Leberkrebs, da V drei in der Lage ist, ein therapeutisches Gen in menschlichem Leberkrebs auf hohem Niveau gezielt zu exprimieren.

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