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High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

High Throughput Screening von Fungal Endoglucanaseaktivität in Escherichia coli

Full Text

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06:16 min

August 13, 2011

DOI: 10.3791/2942-v

Mary F. Farrow¹, Frances H. Arnold²

¹Department Of Chemistry and Chemical Engineering,California Institute of Technology, ²Chemistry and Chemical Engineering,California Institute of Technology

Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.

Summary

Wir beschreiben eine niedrige Kosten, hohe Durchsatz-Verfahren zum Screening von Pilzen Endoglucanaseaktivität in

Transcript

In diesem Hochdurchsatz-Screening für die Aktivität von Pilz-Endogluconaten in E-coli wird der gängige mikrobielle Farbstoff Congo Red verwendet, um den enzymatischen Abbau von Carboxymethylcellulose durch Zellen zu visualisieren, die auf festem Medium wachsen. Die ersten Zellen werden mit einer Endogluconat-Bibliothek transformiert und selektiv für einzelne Kolonien plattiert. Dann werden einzelne Klone gepflückt und über Nacht in 96-Well-Platten gezüchtet. Als nächstes wird ein enzymatisches Screening durch Replikatplattierung auf IPTG-haltigen CMC-Platten durchgeführt, um die Endogluconat-Expression zu induzieren.

Schließlich wird der Akt der Klone von der bei minus 80 Grad Celsius gelagerten Masterplatte entnommen. Dieser Assay liefert eindeutige Ergebnisse als Abbauzonen an der Koloniestelle, wo die Halo-Größe mit der enzymatischen Aktivität korreliert und eine qualitative Bewertung der relativen Proteinfitness ermöglicht. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Overlay-Methode besteht darin, dass sie eine Hochdurchsatzanalyse mit einer sehr niedrigen Falsch-Positiv-Rate ermöglicht.

Geben Sie 25 Gramm LB-Wachstumsmedium, 15 Gramm Agar und 1,5 Gramm Carboxymethylcellulosesubstrat in einen Liter destilliertes Wasser, einen Autoklaven zum Sterilisieren. Nach dem Abkühlen des Mediums werden geeignete Antibiotika und IPTG bis zu einer Endkonzentration von 100 Mikromolaren zugegeben. Gießen Sie nun jeweils 200 Milliliter Medium in fünf große quadratische Petrischalen oder Bio-Essay-Tabletts und lassen Sie die Teller vollständig trocknen.

Generieren Sie zunächst eine Bibliothek von katalytischen Endogluconatdomänen in einen geeigneten Vektor wie PET 22 B plus von novagen. Generieren Sie zunächst eine Bibliothek von katalytischen Endogluconatdomänen in einen geeigneten Vektor wie PET 22 B plus von Novogen, der den T-Sieben-Promotor mit einem Lackoperator und eine PAL-LV-Signalsequenz für das Targeting auf das Periplasma enthält. Transformieren Sie die Endogluconat-Bibliothek in einen E-Coli-Stamm BL 21 DE mit drei Platten für einzelne Kolonien unter Verwendung von Glasperlen und inkubieren Sie die Transformation über Nacht bei 37 Grad Celsius mit sterilen Zahnstochern, inokulieren Sie Klone in 96.

Well-Deep-Well-Platten mit 400 Mikrolitern LB-Medien, die mit geeigneten Antibiotika ergänzt werden. Inkubieren Sie über Nacht bei 37 Grad Celsius und schütteln Sie bei 250 U/min. Geben Sie nun steriles Glycerin in 96 Well-Overnight-Kulturen für die Langzeitlagerung bei minus 80 Grad Celsius.

Dies ist die Master-Platte, die mit einem 96-Pin-Stempel verwendet wird und die Platten-Übernachtkulturen auf die Screening-Platten repliziert, die IPTG und CMC für jede Screening-Platte enthalten. Fünf Sätze Übernachtkulturen mit einem Stempel versehen und bei Raumtemperatur inkubieren, bis sich sichtbare Kolonien gebildet haben. Spülen Sie die Platte weiter mit destilliertem Wasser aus, bis alle Spuren der Bienenvölker entfernt sind.

Gießen Sie gerade genug ein, 0,5 % Kongorot, um die gewaschene Platte zu bedecken, und inkubieren Sie sie maximal 15 Minuten bei Raumtemperatur. Gießen Sie den Farbstoff in einer großzügigen Menge von einem molaren Natriumchlorid ab und inkubieren Sie ihn 15 Minuten bei Raumtemperatur. Verwerfen Sie dann das Natriumchlorid, um CMC-Abbauhöfe freizulegen.

Wählen Sie mit einem sterilen Zahnstocher aktive Enzyme aus der Master-Platte für die weitere Charakterisierung aus. In diesem Beispiel wurden Endogluconat-Expressionsvektoren in PET 22 B plus unter der Kontrolle des T-7-Promotors mit einem Lack-Operator generiert. Die resultierende T-Leistung von Endogluconat-exprimierenden BL 21-Kolonien wurde dann gescreent, um CMC-Abbauhalos zu erzeugen. Nach dem Waschen und der Entwicklung mit Congo Red können Klone auf diesen Screening-Platten typischerweise als inaktiv, wöchentlich aktiv und hochaktiv identifiziert werden, basierend auf der Größe der Abbauzonen.

Hier ist die Identifizierung aktiver Enzyme robust und reproduzierbar. Es ist wichtig, daran zu denken, die Screening-Platten richtig zu beschriften, um positive Klone in der Master-Platte korrekt zu identifizieren.

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