Screening Multi-Enzym ein High-throughput Genetic Enzymscreening-System verwenden

Das übergeordnete Ziel dieser Methodik ist es, mehrere Enzyme mit einem einzigen Hochdurchsatz-Screening-System zu bewerten. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der Mikroorganismen und des Bioengineerings zu metagenomischem Screening und Enzym-Engineering zu beantworten. Wir haben ein genetisches Enzym-Screening-System entwickelt, das aus der MPL-Mutante, die auf Phenylen reagiert, und ihrem nachgeschalteten GFP-Reporter besteht.

Sobald ein metagenomisches Gen durch Reaktion mit dem bereitgestellten Substrat die von uns gewünschte Enzymaktivität zeigt, aktiviert eine Phenylenverbindung des Reaktionsprodukts die Dmp-Mutante und löst die GFP-Reporterexpression aus, die leicht mit einem Fluoreszenzmessgerät erfasst werden kann. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass diese einzelne Methode im Gegensatz zu herkömmlichen Screening-Techniken für das Screening mehrerer Arten unterschiedlicher Enzyme unter Verwendung des entsprechenden Substrats anwendbar ist. Dieses Verfahren wird von Kil Koang Kwon, einem Doktoranden in unserem Labor, demonstriert.

Nach dem Aufbau einer metagenomischen Bibliothek in E.Coli mit einem Fosmidvektor unter Verwendung eines Produktionskits für die Fosmidbibliothek wird die pGESS(E135K)DNA in die Zellen der Metagenombibliothek transportiert. Lagern Sie dann die transformierten Bibliothekszellen bei minus 70 Grad Celsius und 20 Mikroliter Aliquoten. Um die falsch positiven Ergebnisse zu entfernen, tauen Sie zunächst ein Aliquot einer metagenomischen Bibliothek auf Eis auf.

Dann inokulieren Sie zehn Mikroliter der aufgetauten Zellen in zwei Millilitern Lysogenatbrühe, die Ampicillin und Chloramphenicol enthält, in einem 14-Milliliter-Rundbodenröhrchen bei 37 Grad Celsius und 200 U/min für vier Stunden. Stellen Sie in der Zwischenzeit die entsprechenden Parameter auf dem FACS-Gerät für das Lesen der metagenomischen Bibliothekszellen in der Standard-FACS-Software ein. Am Ende der Inkubation werden fünf Mikroliter Zellen in einem Fünf-Milliliter-Röhrchen mit rundem Boden in einen Milliliter PBS überführt.

Laden Sie dann das verdünnte Bibliotheks-Sample und passen Sie die Ereignisrate auf 1000 bis 1500 Ereignisse pro Sekunde an. Um auf einem globalen Arbeitsblatt ein logarithmisch skaliertes Streuflächen-Streudiagramm mit Vorwärtsskalierung im Vergleich zu einem logarithmisch skalierten Seitenstreuflächen-Streuflächendiagramm zu erstellen, erstellen Sie ein Punktdiagramm, und zeichnen Sie ein Polygon-Gate um die Singulett-Ereignisse, die die Bakterienpopulation enthalten. Um eine Zellzahl im Vergleich zu einem logarithmisch skalierten FITC-Flächenhistogramm darzustellen, öffnen Sie ein Histogramm und passen Sie die FITC-Spannung so an, dass der Spitzenwert der glockenförmigen Verteilung kleiner als zehn hoch zwei der FITC-Fläche ist.

Öffnen Sie als Nächstes ein weiteres Punktdiagramm, um ein logarithmisch skaliertes Vorwärts-Streuflächendiagramm im Vergleich zu einem logarithmischen FITC-Flächendiagramm zu erstellen, und legen Sie ein R2-Sortiergatter zwischen plus fünf und minus fünf Prozent der Zellen von der Mitte der Verteilung fest. Wenn alle Tore gesetzt sind, stellen Sie ein Sammelröhrchen mit 1,2 Millilitern antibiotisch zugesetzter Lysogenat-Bouillon an den FACS-Instrumentenauslass und sortieren Sie eine mal zehn bis sechs der angehaltenen Zellen in die Brühe. Am Ende der Sortierung das Sammelröhrchen verschließen und die Zellen vorsichtig vortexen.

Um die interessierenden metagenomischen Enzyme zu screenen, inkubieren Sie die sortierten Zellen bei 37 Grad Celsius und 200 U/min, bis der OD600 0,5 erreicht, und fügen Sie dann einen Mikroliter Kopienunktionslösung hinzu, um die intrazelluläre Fosmid-Kopienzahl zu amplifizieren. Nach drei Stunden bei 37 Grad Celsius und 250 U/min verbinden sich 0,5 Milliliter der Zellen mit dem entsprechenden Substrat in einem 14 Milliliter Rundbodenröhrchen zu einer Endkonzentration von 100 Mikromolaren. Anschließend werden die Kontroll- und Versuchsproben bei 37 Grad Celsius und 200 U/min für weitere drei Stunden inkubiert.

Während die Proben wackeln, stellen Sie die FACS-Maschinenparameter wie gerade gezeigt ein. Geben Sie dann fünf Mikroliter Zellen aus jeder Probe in einzelne Fünf-Milliliter-Röhrchen mit rundem Boden, die einen Milliliter PBS enthalten. Laden Sie als Nächstes die Beispielzellen, und legen Sie die Ereignisrate auf 1000 bis 3000 Ereignisse pro Sekunde fest.

Erstellen Sie ein logarithmisch skaliertes Vorwärts-Streuflächen-Streudiagramm im Vergleich zu einem logarithmisch skalierten Seitenstreuflächen-Streudiagramm, und passen Sie das R1-Streugatter so an, dass es die Bakterienzellen des Singulett-Ereignisses umfasst. Erstellen Sie dann ein logarithmisch skaliertes Vorwärtsstreudiagramm im Vergleich zu einem logarithmisch skalierten FITC-Flächenstreudiagramm, und legen Sie ein R2-Sortiergatter so fest, dass weniger als 0,1 % der negativen Zellen erkannt werden. Laden Sie nun das Probenröhrchen und stellen Sie die Ereignisrate bei Bedarf auf 1000 bis 3000 Ereignisse pro Sekunde ein.

Stellen Sie dann ein Sammelröhrchen mit 0,5 Millilitern Lysogenatbrühe an den FACS-Instrumentenausgang und sammeln Sie eine mal zehn bis ein Viertel der Zellen innerhalb der R1- und R2-Gates. Wenn alle Zellen isoliert wurden, verschließen Sie das Entnahmeröhrchen und wirbeln Sie die Zellen vorsichtig ein. Dann verteilen Sie 0,5 Milliliter der gesammelten Proben auf zwei 90-Millimeter-Agarplatten mit Lysogenatbrühe, die mit Antibiotika ergänzt ist, und inkubieren die Platten über Nacht bei 37 Grad Celsius.

In dieser Abbildung ist das demonstrierte Screening-Protokoll dargestellt, einschließlich der Entfernung der falsch positiven Ergebnisse durch negative Sortierung und der Auswahl positiver Treffer unter Verwendung der Sortiergatter R1 und R2. Die Treffer können dann ausgewertet werden, indem die Blütenpracht der Probe mit und ohne Substrat verglichen wird. In diesem repräsentativen p-Nitroph-Acetat-vermittelten Screening war die Fluoreszenz der substratbehandelten Zellen höher als die der Kontrollzellen, was fünf Lipase-Kandidaten in diesem Experiment bestätigte.

Trotz der breiten Verbreitungen dieser drei Cellulosekandidaten sind deutliche Unterschiede in der durchschnittlichen FITC-Intensität der Populationen zu beobachten. Diese vier Phosphatase-Kandidaten weisen im Vergleich zu den Kontrollzellen ebenfalls hohe Fluoreszenzwerte auf. Darüber hinaus kann die alkalische Phosphataseaktivität von ORF-eingefügten Vektoren durch Durchflusszytometrie bestätigt werden, wobei für das getroffene Enzym ein stärkeres Fluoreszenzsignal beobachtet wurde als für die Zellen, die das leere Plasmid tragen.

Es ist wichtig, sich daran zu erinnern, dass diese Technik auf das Screening einer breiten Palette von Enzymen angewendet werden kann, indem ein geeignetes Substrat und die richtige Rationskonzentration ausgewählt werden. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie das Next Generation Sequencing durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zur Identifizierung und Charakterisierung des Enzymkandidaten im Hochdurchsatz zu beantworten. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Hochdurchsatz-Enzym-Screening-Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet des Enzym-Engineerings, verschiedene metagenomische Enzyme zu erforschen, ohne dass eine Enzymspezifität erforderlich war.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie das metogene Schaltkreis-basierte Hochdurchsatz-Screening-System mit einer breiten Palette von Enzymzielen verwenden können.