Name: Screening Multi-Enzym ein High-throughput Genetic Enzymscreening-System verwenden (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 10 s
Description: Erfahren Sie ein Hochdurchsatz-Screening für mehrere Enzyme mit einem universellen genetischen Enzymscreening-System. Diese Methode identifiziert Lipase, Cellulase und alkalische Phosphatase durch Substratwechsel.

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Diese Forschung wurde durch Zuschüsse des Intelligent Synthetic Biology Center des Global Frontier Project (2011-0031944), des Next-Generation Biogreen 21 Program (PJ009524), NRF-2015M3D3A1A01064875 und des KRIBB Research Initiative Program unterstützt.

1. Vorbereiten der Metagenom-Bibliothek mit pNP-GESS <ol><li> Konstruieren Sie eine Metagenom - Bibliothek in E. coli mit einem Vektor , der eine Fosmid Fosmid Bibliothek Produktions Kit gemäß dem Protokoll des Herstellers 5. </li><li> 100 ul Aliquots der Bibliothek zur Lagerung bei -70 ° C, die eine Quelle der metagenomic Bibliothekszellen ist. Anmerkung: Die optische Dichte eines bei einer Wellenlänge von 600 nm (OD 600) dieser Bibliothek stock gemessenen Probe ist etwa 100. </li><li> Auftauen 100 ul der Vorrats metagenomic Bibliothek auf Eis und Beimpfen für 2 h mit 37 ° C inkubiert in einem 500 ml-Kolben, enthaltend 50 ml Luria-Bertani (LB) und 12,5 &amp; mgr; g / ml Chloramphenicol. </li><li> Ernte der Zellen in einem 50 ml konischen Röhrchen durch Zentrifugation bei 1.000 xg für 20 min bei 4 ° C. </li><li> Das Pellet schnell in 50 ml eiskaltem destilliertem Wasser (DW) und Zentrifuge bei 1000 × g für 20 min bei 4 ° C wieder. </li><li> Resuspend das Pellet in 50 ul eiskaltem DW mit 10% (v / v) Glycerin. Verwenden Sie 50 ul dieser Zelle aliquoten für die Elektroporation. </li><li> Legen Sie die Mischung aus elektro Zellen 50 &amp; mgr; l und pGESS (E135K) 5 DNA (100 ng) in einer eiskalten Elektroporationsküvette und elektroporieren (1,8 kV / cm, 25 &amp; mgr; F) die Mischung. </li><li> Schnell 1 ml SOB-Medium mit Katabolitenrepression (SOC) Medium und die Zellen vorsichtig resuspendieren. </li><li> Übertragen Sie die Zellen in 14 ml Rundbodenrohr mit einer Pipette und Inkubation bei 37 ° C für 1 Stunde. </li><li> Verbreiten 500 ul der gewonnenen Zellen auf LB 20 x 20 cm quadratische Platte, die 12,5 &amp; mgr; g / ml Chloramphenicol und 50 ug / ml Ampicillin. Inkubieren Platte bei 30 ° C für 12 Stunden. </li><li> Schaben die Kolonien eine Zellschaber und sammeln Zellen in einem 50 ml konischen Röhrchen mit eiskalten Zelle Speichermedien. </li><li> Zentrifuge bei 1.000 xg für 20 min bei 4 ° C. Das Pellet in 10 ml eiskaltem Zelle Speichermedieneiner OD 600 von 100 zu erreichen. </li><li> 20 ul Aliquot der Zellen für die Lagerung bei -70 ° C. </li></ol> 2. Entfernen Fehlalarme aus der Metagenom-Bibliothek <ol><li> Auftauen Lager metagenomic Bibliothekszellen (aus Schritt 1.13), die Metagenom-DNA Fosmid und pGESS (E135K) auf Eis. </li><li> Beimpfen von 10 &amp; mgr; l der Zellen in 2 ml LB, enthaltend 50 ug / ml Ampicillin und 12,5 ug / ml Chloramphenicol in einem 14-ml-Rundbodenröhrchen. bei 37 ° C inkubieren, bei 200 rpm für 4 Stunden unter Schütteln. </li><li> Inzwischen schalten Sie die FACS-Maschine und öffnen Sie die Standard-FACS-Software. Verwenden Sie die folgenden Einstellungen: Düsenspitze Durchmesser, 70 &amp; mgr; m; Forward Scatter Area (FSC-A) Empfindlichkeit, 300 V-logarithmische Verstärkung; Side Scatter Area (SSC-A) Empfindlichkeit, 350 V-logarithmische Verstärkung; Fluoresceinisothiocyanat Area (FITC-A) Empfindlichkeit, 450 V-logarithmische Verstärkung; Schwellenparameter, FSC-A-Wert 5. Hinweis: Typische Einstellungen gegeben sindfür die FACS - Gerät in der Tabelle der Materialien erwähnt. Passen Sie die Einstellungen für andere FACS-Geräte. </li><li> Verdünne die metagenomic Bibliothekszellen aus Schritt 2.2 durch Zugabe von 5 ul der Probe auf eine 5-ml-Rundbodenröhrchen mit 1 ml PBS. </li><li> Legen Sie die verdünnte Bibliothek Probe auf die Ladeöffnung des FACS Gerät und klicken Sie auf die Schaltfläche Laden auf dem Acquisition Armaturenbrett des FACS-Software. </li><li> Stellen Sie die Ereignisrate auf 1.000 - 1.500 Veranstaltungen / sec durch Klicken und die Durchflussrate auf dem Armaturenbrett zu steuern. </li><li> Erstellen Sie log skaliert FSC-A vs. Protokoll auf einem globalen Arbeitsblatt SSC-Streudiagramm skaliert durch Klicken auf die Dot Plot - Schaltfläche in der Werkzeugleiste. Stellen Sie die Streu Gate R1 die Singulett-Ereignisse (Bakterienpopulation) mit dem Polygon-Tor-Taste in der Werkzeugleiste zu umfassen. </li><li> Plot ein Histogramm mit Zellzahl gegen log auf dem Arbeitsblatt FITC-A skaliert durch einen Klick auf Histogramm - Taste. Dann stellen Sie die FITC Spannung von der Cytometer Register Einstellungen auf Inspektorfenster steuern, dass die Spitze der glockenförmigen Verteilung von weniger als 10 2 von FITC-A ist. </li><li> Erstellen Sie ein Protokoll skaliert FSC-A vs. das Protokoll FITC-A Plot, indem Sie auf dem globalen Arbeitsblatt auf dem Dot Plot-Schaltfläche klicken. Stellen Sie eine Sortier Tor R2 auf dem Grundstück das Polygon-Gate-Button in der Werkzeugleiste, so dass das Tor zwischen + 5% und -5% Zellen, die aus der Mitte der Verteilung (insgesamt 10% der Zellen rund um den Gipfel des glocken befindet förmige Kurve). </li><li> Legen Sie eine Sammelröhrchen , das 1,2 ml LB sowohl die R1 und R2 Tore befriedigend 50 ug / ml Ampicillin und 12,5 ug / ml Chloramphenicol am Ausgang des FACS Instrument und sortieren 10 6 Zellen enthält. </li><li> Entfernen Sie die Sammelröhrchen, Kappe und sanft Wirbel. </li></ol> 3. metagenomische Enzymscreening <ol><li> Inkubieren der sortierten Zellen (aus Schritt 2.11) bei 37 ° C mit 200 Umdrehungen pro Minute , bis die OD 600 0,5 Schütteln erreicht. </li><li> 1 &amp; mgr; l Induktions Lösung Kopieren Sie die intrazelluläre Fosmid Kopienzahl zu verstärken. Inkubieren der Zellen für weitere 3 h bei 37 ° C mit Schütteln bei 250 Upm. </li><li> Zur Herstellung von Zellen für die Sortierung, 0,5 ml der kultivierten Zellen hinzuzufügen und ein geeignetes Substrat (p - Nitrophenyl Acetat, p - Nitrophenyl-β-D-cellobiosid oder Phenylphosphat) in einen 14-ml - Rundbodenrohr in einer Endkonzentration von 100 uM. <ol><li> Für eine Kontrollprobe mit 0,5 ml der kultivierten Zellen aus Schritt 3.2 in einen 14-ml-Rundbodenrohr. Füge das gleiche Volumen an PBS als das Substratvolumen in Schritt 3.3. </li></ol></li><li> Inkubieren der zwei Proben bei 37 ° C mit bei 200 Upm für 3 h schütteln. </li><li> Inzwischen bereiten die FACS-Maschine mit den gleichen Konfigurationen wie Schritt 2.3. </li><li> Zugabe von 5 &amp; mgr; l der Zellen (für die Sortierung) und Kontrollzellen zu zwei 5 ml-Rundbodenröhrchen mit 1 ml PBS, respectively. </li><li> Das Röhrchen enthält Kontrollzellen auf ter Verladehafen der FACS, und klicken Sie auf die Schaltfläche Laden auf Acquisition Armaturenbrett des FACS-Software. Stellen Sie die Ereignisrate auf 1.000 - 3.000 Veranstaltungen / sec durch auf dem Armaturenbrett Flow Rate Tasten steuern. </li><li> Erstellen Sie log skaliert FSC-A gegen log SSC-A skaliert Streudiagramm mit einem Klick auf Dot Plot - Taste auf dem globalen Arbeitsblatt der Software und stellen Sie die Streu Gate R1 die Singulett - Ereignisse (Bakterienpopulation) mit dem Polygon - Tor - Taste auf das zu umfassen Werkzeugleiste. </li><li> Erstellen Sie log skaliert FSC-A gegen log FITC-A skaliert Streudiagramm , indem Sie auf dem Arbeitsblatt auf dem Dot Plot Schaltfläche klicken und stellen Sie eine Sortier Gate R2 auf dem Grundstück mit dem Polygon - Tor - Taste auf der Werkzeugleiste , so dass weniger als 0,1% negative Zellen sind innerhalb des R2-Gatter erkannt. </li><li> Bringen Sie die Steuerprobenröhrchen mit dem Sortierprobenröhrchen und stellen Sie die Ereignisrate auf 1.000 - 3.000 Veranstaltungen / s durch die Strömungsgeschwindigkeit Tasten am Armaturenbrett steuern. </li><li> Legen Sie eine Sammelröhrchen, das 0,5ml LB am Auslass des FACS - Instrument und aussortieren 10 4 Zellen erfüllt sowohl die R1 und R2 Gattern. Hinweis: Das Sortierkriterium von oben 0,1% bis 5% des FITC-A in der R2 Gate reichen kann. In diesem Protokoll wurden obersten 1% Zellen als positive gesammelt. </li><li> Entfernen Sie die Sammelröhrchen, Kappe und sanft Wirbel. </li><li> Verbreiten Sie die 0,5 ml gesammelten Proben auf zwei Agarplatten (90 mm Petrischalen) mit LB, 50 ug / ml Ampicillin, 12,5 ug / ml Chloramphenicol und Inkubation über Nacht die Platte bei 37 ° C. </li><li> Falls erforderlich, zusätzliche Runden der Sortierung für FITC-A-Anreicherung durch Wiederholen der Schritte 3,1-3,14. </li></ol> 4. Hit Auswahl und Enzymaktivität Bestätigung <ol><li> Durchflusszytometrie-Analyse <ol><li> Von der Platte inkubiert bei Schritt 3.14, wählen Sie eine Kolonie zeigen keine Fluoreszenz eine Kolonie-Picker unter der Beobachtung von 488 nm Wellenlänge einer LED-Beleuchtung verwendet wird. </li><li> Impfen der ausgewählten Kolonie in einem 14-ml-round Boden - Röhrchen mit 2 ml LB unter Schütteln bei 200 rpm 50 &amp; mgr; g / ml Ampicillin und 12,5 ug / ml Chloramphenicol bei 37 ° C , enthaltend bis zu dessen OD 600 0,5 erreicht. </li><li> In 2 ul Induktions Lösung Kopieren Sie die intrazelluläre Fosmid Kopienzahl zu verstärken. Inkubieren der Zellen für weitere 3 h bei 37 ° C mit Schütteln bei 250 Upm. </li><li> Bereiten Sie eine 14 ml-Rundbodenrohr und 1 ml der kultivierten Zellen (Schritt 4.1.3). Hinzufügen eines geeigneten Substrats (p - Nitrophenyl Acetat, p -nitrophenyl- β -D-cellobiosid, oder Phenyl phosphat) in einer Endkonzentration von 100 uM. <ol><li> Zur Kontrolle, fügen Sie die 1 ml kultivierten Zellen aus Schritt 4.1.3 in einem 14 ml-Rundbodenrohr und das gleiche Volumen an PBS als Substrat Volumen in Schritt 4.1.4 hinzuzufügen. </li></ol></li><li> Inkubieren der zwei Proben bei 37 ° C mit bei 200 Upm für 3 h schütteln. </li><li> Inzwischen bereiten die FACS-Maschine mit den gleichen Konfigurationen wie Schritt 2.3. </li><li> Werden 5 ul der Kontrolle und Substrat behandelten Zellen zu 5 ml Rundbodenröhrchen mit 1 ml PBS, respectively. </li><li> Legen Sie die Röhrchen mit Kontrollzellen auf dem Ladeanschluss des FACS-Gerät und klicken Sie auf die Schaltfläche Laden auf Acquisition Armaturenbrett des FACS-Software. Stellen Sie die Ereignisrate auf 1.000 - 3.000 Veranstaltungen / s unter Verwendung von Flow Rate Tasten auf dem Armaturenbrett. </li><li> Klicken Sie auf Acquisition Taste FITC-A zu messen. </li><li> Bringen Sie die Steuerprobenröhrchen mit dem Substrat behandelt Probenröhrchen. Stellen Sie die Ereignisrate auf 1.000 - 3.000 Veranstaltungen / s unter Verwendung von Flow Rate Tasten auf dem Armaturenbrett. </li><li> Klicken Sie auf Acquisition Taste FITC-A zu messen. </li><li> Vergleichen der Fluoreszenz der beiden Gruppen von Zellen durch ein Histogramm der Zellzahl aufgetragen gegen den log FITC-A skaliert. </li></ol></li><li> Andere Tests Enzymaktivität zu bestätigen <ol><li> Zur weiteren Identifizierung der Enzymkandidaten ausgewählt, extrahieren Fosmid DNA-Standard Extraktion Pro mitverfahren aus den handelsüblichen Extraktions Kits und die Nukleotidsequenz zu analysieren, oder das Enzym in vitro Aktivität getestet 6,7. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Eine Erhöhung der Produktionseffizienz von Biokatalysatoren ist ein Schlüssel für den Erfolg von bio-chemischen Industrie Basis 9 und Metagenom gilt als einer der besten natürlichen Enzymquelle. In diesem Sinne ist es wichtig , neue Enzyme aus der Metagenoms Screening wo die Mehrheit der genetischen Ressourcen 10 nicht erforscht. Mehrere Screening - Verfahren entwickelt worden , die Enzymprodukte unter Verwendung von Transkriptionsaktivatoren 11, 12 , aber diese Techniken erfordern spezi...

Eine kürzlich entwickelte Hochdurchsatz - Einzelzellen - Assay - Technik ermöglicht neue Enzyme aus einer großen Genbank auf ihre funktionellen Aktivitäten 1 basierend gescreent werden. Auf Einzelzellebene, Transkriptionsproteinen regulieren eingesetzt Expression auszulösen Reportergens durch Abfühlen kleine Moleküle, die als Ergebnis eines Zielenzymaktivität erzeugt werden. Ein früher Ansatz involviert die Isolierung eines Phenol abbau Operon aus Ralstonia eutropha E2 unter Verwendung des substratinduzierte Genexpression Screening (SIGEX) Verfahren, bei dem das Substrat , die Expression eines Reporterproteins 2 induziert. NHAr von Pseudomonas putida wurde verwendet , um Benzaldehyd - Dehydrogenase 3 und lysG aus Corynebacterium glutamicum ausgewählt wurde für die Hochdurchsatz - Screening eines neuen L-Lysin-produzierender Stamm von unterschiedlichen Mutantenbibliotheken 4 verwendet. Zuvor eine genetische Enzym screening - System (GESS) wurde als allgemein anwendbare Screening - Plattform 5 vorgeschlagen. Dieses System verwendet das Phenol-Erkennung Dimethylphenol Regler, DmpR, von P. putida. DmpR (E135K) und eine Mutante von DmpR, können auch in GESS (pNP-GESS) zum Nachweis von p - Nitrophenol (pNP) eingesetzt werden. In Gegenwart von Zielenzymen Herstellung phenolische Verbindungen, GESS in E. coli - Zellen emittiert ein Fluoreszenzsignal, das eine schnelle Trennung von Einzelzellen ermöglicht , eine Fluoreszenz-aktivierten Zellsortierer verwenden (FACS). Aber die Expression des Enzyms metagenomic erscheint als schwächer zu sein, daß der herkömmliche rekombinante Enzyme; Daher wurde GESS ausgelegt phenolische Verbindungen mit maximaler Empfindlichkeit zu erfassen , indem die Kombination der ribosomalen Bindungsstelle (RBS) und Terminatorsequenzen zusammen mit optimalen Betriebszustand 5 untersuchen. Einer der wesentlichen Vorteile von GESS ist, dass diese einzelne Methode ermöglicht es theoretisch das Screening von over als 200 verschiedene Arten von Enzymen in der BRENDA - Datenbank (Tabelle 1, http: // www.brenda-enzymes.info, 2013,7) , indem einfach verschiedene Substrate verwendet. Es zeigte sich, dass Cellulase, Lipase gezeigt, und Methyl - Parathion Hydrolase (MPH) kann mit geeigneten Substraten von p - Nitrophenyl- Butyrat, p - Nitrophenyl-cellotrioside und Methyl - Parathion jeweils 5 unter Verwendung von pNP-GESS nachgewiesen werden. Vor kurzem wurde nachgewiesen , daß eine alkalische Phosphatase (AP), die eine der neuen Enzyme ist pNP-GESS identifiziert verwendet wird , ist das erste thermolabilen AP in kälteangepassten marine Metagenomen gefunden 6. Hier Details des Screening - Prozesses präsentiert mit pNP-GESS die Aktivitäten von drei verschiedenen Arten von enzymes- Lipase Nachweis, Cellulase und alkalische Phosphatase -und schnell neue Kandidaten Enzyme aus einer metagenomic Bibliothek 5,6 identifizieren. Die Verfahren umfassen die Vorverarbeitung Metagenom mit pNP-GESS und Betrieb eines flow-Zytometrie Sortierer. Während die erhaltenen Treffer müssen zur weiteren Identifizierung sequenziert werden, erstreckt sich dieses Protokoll, das Verfahren auf eine Bestätigung zu den Schritten der Enzymaktivität unter Verwendung von Durchflusszytometrie.

<table><tbody><tr><td>CopyControl</td><td>Epicentre</td><td>CCFOS110</td><td>Produktionskit für Fosmid-Bibliotheken&nbsp;</td></tr><tr><td>CopyControl Induktionslösung</td><td>Epizentrum</td><td>CCIS125</td><td>Fosmid Kopierinduktionslösung</td></tr><tr><td>EPI300</td><td>Epizentrum</td><td>EC300110</td><td>Elektrokompetente Zelle</td></tr><tr><td>pCC1FOS</td><td>Epizentrum</td><td>CCFOS110</td><td>Fosmid-Vektor</td></tr><tr><td>Gene Pulser Mxcell</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>Elektroporationsküvette und Elektroporatsystem</td></tr><tr><td>FACSAria III</td><td>Becton Dickinson</td><td></td><td>Durchflusszytometrie (FACS-Gerät)</td></tr><tr><td>AZ100M</td><td>Nikon</td><td></td><td>Mikroskop&nbsp;</td></tr><tr><td>UltraSlim&nbsp;</td><td>Maöstrogen</td><td></td><td>LED-Strahler</td></tr><tr><td>50 ml konisches Röhrchen</td><td>BD Falcon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>14 ml Röhrchen mit rundem Boden&nbsp;</td><td>BD Falcon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>5-ml-Tube mit rundem Boden</td><td>BD Falcon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>p-Nitrophenylphosphat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N7653</td><td>Substrat</td></tr><tr><td>p-nitrophenyl &beta;-D-Cellobiosid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N5759</td><td>Substrat</td></tr><tr><td>p-nitrophenylbutylat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N9876& nbsp;</td><td>Substrat</td></tr><tr><td>Luria-Bertani (LB)</td><td>BD Difco</td><td>244620</td><td>Trypton 10 g/L, Hefeextrakt 5 g/L, Natriumchlorid 10 g/L</td></tr><tr><td>Super Optimal Brühe (SOB)</td><td>BD Difco</td><td>244310</td><td>Trypton 20 g/L, Hefeextrakt 5 g/L, Natriumchlorid 0,5 g/L, Magnesiumsulfat 2,4 g/L, Kaliumchlorid 186 mg/L</td></tr><tr><td>Super Optimale Brühe mit Katabolit-Repression (SOC)</td><td></td><td>SOB, 0,4 % Glukose</td><td></td></tr><tr><td>2x Hefeextrakt Trypton (2xYT)</td><td>BD Difco</td><td>244020</td><td>Pankreasverdau von Casein 16 g/L, Hefeextrakt 10 g/L, Hefeextrakt 5 g/L</td></tr><tr><td>Zellspeichermedien</td><td></td><td></td><td>2x YT Brühe, 15% Glycerin, 2% Glucose</td></tr><tr><td>pGESS(E135K)</td><td></td><td></td><td>Ein DNA-Vektor, der dmpR, egfp-Gene mit ihren entsprechenden Promotoren, RBS und Terminator enthält. Siehe die Referenz 5 im Manuskript für mehr Details.</td></tr><tr><td>Chloramphenicol</td><td>Sigma</td><td>C0378</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Sigma</td><td>A9518</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSDiva</td><td>Becton Dickinson</td><td></td><td>Durchflusszytometrie Softwareversion 7.0</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>70011-044</td><td>0,8 % NaCl, 0,02 % KCl, 0,0144 % Na2HPO4, 0,024 % KH2OP4, pH 7,4</td></tr></tbody></table>

screening multi-enzym ein high-throughput genetic enzymscreening-system verwenden

Multi-enzyme Screening Using a High-throughput Genetic Enzyme Screening System

Die jüngste Entwicklung einer Hochdurchsatz-Einzelzell-Assay-Technik ermöglicht das Screening neuartiger Enzyme basierend auf funktionellen Aktivitäten aus einer groß angelegten metagenomischen Bibliothek1. Wir haben bereits ein genetisches Enzym-Screening-System (GESS) vorgeschlagen, das einen Dimethylphenol-Regulator verwendet, der durch Phenol oder p-Nitrophenol aktiviert wird. Da eine große Menge natürlicher enzymatischer Reaktionen diese phenolischen Verbindungen aus Phenolsubstraten produziert, kann dieses einzelne genetische Screening-System theoretisch auf das Screening von über 200 verschiedenen Enzymen in der BRENDA-Datenbank angewendet werden. Trotz der allgemeinen Anwendbarkeit von GESS erfordert die Anwendung des Screening-Verfahrens ein spezifisches Verfahren, um die maximalen Durchflusszytometriesignale zu erreichen. Im Folgenden beschreiben wir den entwickelten Screening-Prozess, der die Metagenom-Vorverarbeitung mit GESS und den Betrieb eines Durchflusszytometrie-Sortierers umfasst. Drei verschiedene phenolische Substrate (p-Nitrophenylacetat, p-Nitrophenyl-β-D-Cellobiosid und Phenylphosphat) mit GESS wurden zum Screening und zur Identifizierung von drei verschiedenen Enzymen (Lipase, Cellulase und alkalische Phosphatase) verwendet. Die ausgewählten metagenomischen Enzymaktivitäten konnten nur mit der Durchflusszytometrie bestätigt werden, aber DNA-Sequenzierung und diverse in vitro Analysen können für die weitere Genidentifikation verwendet werden.

Die drei phenolischen Substrate wurden untersucht, um neue metagenomic Enzyme aus einer Metagenom Bibliothek von Ozean-Wattsedimente in Taean, Südkorea identifizieren durch das vorgeschlagene Protokoll folgen. Für die Bibliothekskonstruktion, durchschnittlich 30 bis 40 kb Metagenoms Sequenzen wurden in Fosmide eingeführt, die auf dem E. beruhen coli F - Faktor Replikon und als eine einzige Kopie in einer Zelle dargestellt. Beachten Sie, dass Fosmide haben zur Konstrukti...

Diese Arbeit stellt eine Methode des Hochdurchsatz-Screenings unter Verwendung eines universellen genetischen Enzym-Screening-Systems vor, das theoretisch auf über 200 Enzyme angewendet werden kann. Dabei identifiziert das Single-Screening-System drei verschiedene Enzyme (Lipase, Cellulase und alkalische Phosphatase) durch einfaches Wechseln des verwendeten Substrats (p-Nitrophenylacetat, p-Nitrophenyl-β-D-Cellobiosid und Phenylphosphat).

Screening Multi-Enzym ein High-throughput Genetic Enzymscreening-System verwenden

The recent development of a high-throughput single-cell assay technique enables the screening of novel enzymes based on functional activities from a ...

Das übergeordnete Ziel dieser Methodik besteht darin, mehrere Enzyme mithilfe eines einzigen Hochdurchsatz-Screening-Systems zu bewerten. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich Mikroorganismen und Bioingenieurwesen bezüglich des Metagenom-Screenings und der Enzymtechnik zu beantworten. Wir haben ein genetisches Enzym-Screening-System entwickelt, das aus dem MPL-Mutanten besteht, der auf Phenylenderivate reagiert, sowie einem darunterliegenden GFP-Reporter. Sobald ein metagenomisches Gen durch Reaktion mit dem bereitgestellten Substrat die gewünschte Enzymaktivität zeigt, aktiviert eine Phenylenderivat-Verbindung des Reaktionsprodukts den Dmp-Mutanten und löst die Expression des GFP-Reportergens aus, die leicht mit einem Fluoreszenzmessgerät erfasst werden kann. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass im Gegensatz zu herkömmlichen Screening-Methoden diese einzige Methode zur Untersuchung mehrerer verschiedener Enzymtypen durch Verwendung des jeweils geeigneten Substrats eingesetzt werden kann. Diese Prozedur wird Kil Koang Kwon, ein Doktorand in unserem Labor, demonstrieren.Nachdem eine metagenomische Bibliothek in E. coli mit einem Fosmid-Vektor unter Verwendung eines Fosmid-Bibliothek-Herstellungskits konstruiert wurde, das pGESS(E135K)-DNA in die Zellen der metagenomischen Bibliothek überführen. Anschließend die transformierten Bibliothekszellen bei minus 70 Grad Celsius in 20-Mikroliter-Aliquots lagern. Um falsch-positive Ergebnisse zu entfernen, zunächst ein Aliquot der metagenomischen Bibliothekszellen auf Eis auftauen.Anschließend zehn Mikroliter der aufgetauten Zellen in zwei Milliliter Lysogenatbrühe, die Ampicillin und Chloramphenicol enthält, in einem 14-Milliliter-Rundbodentestgefäß bei 37 Grad Celsius und 200 U/min vier Stunden lang inkubieren. In der Zwischenzeit die geeigneten Parameter am FACS-Gerät für die Analyse der metagenomischen Bibliothekszellen in der Standard-FACS-Software einstellen. Am Ende der Inkubation fünf Mikroliter Zellen in ein Milliliter PBS in einem 5-Milliliter-Rundbodentestgefäß überführen.Danach die verdünnte Bibliotheksprobe laden und die Ereignisrate auf 1000 bis 1500 Ereignisse pro Sekunde einstellen. Um ein logarithmisch skaliertes Streudiagramm der Vorwärtsstreufläche gegen die logarithmisch skalierte Seitenstreufläche auf einem globalen Arbeitsblatt zu erstellen, erzeugen Sie ein Punktediagramm und zeichnen Sie ein Polygon-Tor um die Einzelereignisse, die die bakterielle Population enthalten. Um ein Histogramm der Zellanzahl gegen die logarithmisch skalierte FITC-Fläche darzustellen, öffnen Sie ein Histogramm und stellen Sie die FITC-Spannung so ein, dass das Maximum der glockenförmigen Verteilung unter zehn hoch zwei der FITC-Fläche liegt.Öffnen Sie als Nächstes ein weiteres Punktdiagramm, um ein logarithmisch skaliertes Streulicht-Areal (forward scatter area) gegen log FITC-Areal aufzutragen, und setzen Sie ein R2-Sortiergatter zwischen plus fünf und minus fünf Prozent der Zellen vom Zentrum der Verteilung. Sobald alle Gatter gesetzt sind, stellen Sie ein Sammelröhrchen mit 1,2 Milliliter antibiotisch ergänztem Lysogenbrühe am Auslass des FACS-Geräts auf und sortieren eine Million der gatterierten Zellen in die Brühe. Verschließen Sie am Ende der Sortierung das Sammelröhrchen und wirbeln Sie die Zellen vorsichtig an.Um die metagenomischen Enzyme von Interesse zu screenen, inkubieren Sie die sortierten Zellen bei 37 Grad Celsius und 200 U/min, bis die OD600 den Wert 0,5 erreicht, und geben Sie dann ein Mikroliter Induktionslösung hinzu, um die intrazelluläre Fosmidkopienzahl zu amplifizieren. Nach drei Stunden bei 37 Grad Celsius und 250 U/min mischen Sie 0,5 Milliliter der Zellen mit dem geeigneten Substrat in einem 14-Milliliter-Rundbodenglas zu einer Endkonzentration von 100 Mikromolar. Anschließend inkubieren Sie die Kontroll- und Versuchsproben weitere drei Stunden bei 37 Grad Celsius und 200 U/min.Während die Proben geschüttelt werden, stellen Sie die FACS-Geräteparameter wie gerade gezeigt ein. Geben Sie anschließend fünf Mikroliter Zellen aus jeder Probe in einzelne fünf Milliliter fassende Rundbodentuben, die jeweils ein Milliliter PBS enthalten. Laden Sie danach die Zellenprobe auf und stellen Sie die Ereignisrate auf 1000 bis 3000 Ereignisse pro Sekunde ein.Erstellen Sie ein gestreutes Diagramm mit logarithmisch skaliertem Forward-Scatter-Bereich gegen logarithmisch skalierten Side-Scatter-Bereich und passen Sie das Streutor R1 so an, dass es die einzelnen bakteriellen Zellen umfasst. Erstellen Sie anschließend ein gestreutes Diagramm mit logarithmisch skaliertem Forward-Scatter gegen logarithmisch skalierten FITC-Bereich und setzen Sie ein Sortiertor R2, sodass weniger als 0,1 % der negativen Zellen detektiert werden. Laden Sie nun die Probenprobe und stellen Sie die Ereignisrate gegebenenfalls auf 1000 bis 3000 Ereignisse pro Sekunde neu ein.Danach eine Sammelröhre mit 0,5 Millilitern Lysogenatbrühe an den Auslass des FACS-Geräts stellen und zehntausend der Zellen innerhalb der Tore R1 und R2 sammeln. Sobald alle Zellen isoliert wurden, die Sammelröhre verschließen und die Zellen vorsichtig wirbeln. Anschließend 0,5 Milliliter der gesammelten Probe auf zwei 90-Millimeter-Agarplatten mit Lysogenatbrühe, die mit Antibiotika ergänzt ist, verteilen und die Platten über Nacht bei 37 Grad Celsius inkubieren.In dieser Abbildung ist das dargestellte Screening-Protokoll veranschaulicht, einschließlich der Entfernung von Falsch-positiven Ergebnissen durch negatives Sortieren und der Auswahl der positiven Hits mithilfe der Sortiertore R1 und R2. Die Hits können anschließend bewertet werden, indem die Fluoreszenz der Probe mit und ohne Substrat verglichen wird. Bei diesem repräsentativen, durch p-Nitrophenylacetat vermittelten Screening war die Fluoreszenz der mit Substrat behandelten Zellen höher als die der Kontrollzellen, wodurch in diesem Experiment fünf Lipase-Kandidaten bestätigt wurden.Trotz der weiten Verbreitung dieser drei Cellulose-Kandidaten sind deutliche Unterschiede in der durchschnittlichen FITC-Intensität der Populationen zu beobachten. Diese vier Phosphatase-Kandidaten weisen außerdem im Vergleich zu den Kontrollzellen hohe Fluoreszenzniveaus auf. Darüber hinaus kann die alkalische Phosphatase-Aktivität von Vektoren mit eingefügtem orf mittels Durchflusszytometrie bestätigt werden, wobei ein stärkeres Fluoreszenzsignal für den Enzymtreffer im Vergleich zu den Zellen mit dem leeren Plasmid beobachtet wird.Es ist wichtig zu beachten, dass diese Technik durch Wahl eines geeigneten Substrats und Verhältnisses der Konzentrationen zur Untersuchung einer breiten Palette von Enzymen eingesetzt werden kann. Nach diesem Verfahren können weitere Methoden wie die Next-Generation-Sequenzierung durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zur Identifizierung und Charakterisierung von Enzymkandidaten auf Hochdurchsatzweise zu beantworten. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Hochdurchsatz-Technik zur Enzymscreening-Forschung im Bereich der Enzymtechnik den Weg, um verschiedene metagenomische Enzyme zu erforschen, ohne dass eine Enzymspezifität erforderlich ist.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie das auf metogenetischen Schaltkreisen basierende Hochdurchsatz-Screening-System mit einer breiten Palette von Enzymzielen verwendet wird.

multi-enzyme-screening-using-high-throughput-genetic-enzyme-screening

Research

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