Name: Hochdurchsatz-Screening Quantitative Expression und Aufreinigung rekombinanter zu Disulfid-reichen Proteine Venom Produziert in Applied E. coli (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 16 s
Description: Erfahren Sie ein Hochdurchsatz-Screening zur quantitativen Expression und Aufreinigung löslicher Proteine aus E. coli mittels automatisierter Flüssigkeits-handhabung. Diese Methode optimiert die Produktion disulfidreicher Fusionsproteine für die biotechnologische Forschung.

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Diese Arbeit wurde von der VENOMICS Projekt, Europäische Projektzuschuss N ° 278346 über das Siebte Rahmenprogramm (RP7 GESUNDHEIT 2011-2015) unterstützt. Die VENOMICS Projekt ist eine Zusammenarbeit zwischen verschiedenen Forschungseinrichtungen und Unternehmen in Europa: AFMB, Aix-Marseille Université (Frankreich), CEA Saclay (Frankreich), NZYTech (Portugal), SistemasGenomicos (Spanien), Universität Lüttich (Belgien), VenomeTech (Frankreich), Vitamib (Frankreich), Zealand Pharma (Dänemark) Diese Arbeit wurde von der Französisch-Infrastruktur für integrierte Strukturbiologie (FRISBI) ANR-10-InSb-05 bis 01 unterstützt. Die Autoren möchte auch Herrn Jeremy Turchetto für die Unterstützung bei den Vorbereitungen für die Dreharbeiten des Videos bedanken.

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Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Es gibt kein einziges universelles Protokoll für die Expression von löslichen, gefalteten, funktionellen Proteinen. Um kosten-und zeiteffizient sein, die meisten Labors oder Proteinkern Einrichtungen die Arbeit mit mehreren Zielen verwenden daher einen hohen Durchsatz-Screening-Protein-Expression, um die besten &quot;Generika&quot; Kombination von Variablen, um ein lösliches aktives Protein für die Mehrheit der Ziele zu erhalten finden. Wir haben DsbC als ein allgemein anwendbares Fusionspartner für die lösliche Expression von Disulfid-reichen Peptide und Proteine ​​11 identifiziert. Verwendung DsbC Fusionen und Hochdurchsatzverfahren, innerhalb einer Woche die lösliche Expression mehrerer Ziele beobachtet werden, und dann 11 zusätzliche Variablen, wie sie in der Einleitung erwähnt, kann in nachfolgenden Runden auf die Ziele, die eine weitere Optimierung erforderlich gescreent werden. Die hier beschriebenen Protokolle werden bei der Expression von Disulfid-reiche Proteine ​​und Peptide gerichtet. Für Anwender, die expresse nicht-netzartige Proteine ​​in einem Hochdurchsatz-Art und Weise haben sich die entsprechenden Protokolle zuvor veröffentlicht worden und kann an anderer Stelle 22,24 gefunden werden. Der hohe Durchsatz Aufbau ist ideal für eine Vielzahl von Anwendungen, einschließlich der Screening einer großen Anzahl von verschiedenen löslichen Proteine ​​zur Expression und Screening einer großen Anzahl von Expressionskonstrukten (einschließlich verschiedener Fusions Tags) für mehrere Zielgene gleichzeitig ( oder mehrere Expressionskonstrukte für ein einzelnes Ziel), um die Erfolgsquote zu verbessern. Die Plattform kann auch für den Leistungsvergleich und Validierung neuer Protokolle auf einer großen Anzahl von Zielen verwendet werden. Andere Anwendungen umfassen das Screening von Varianten für eine schwieriges Ziel, z. B. Orthologen oder alle Mitglieder der gleichen Familie oder den Erfolg der Herstellung einer Gruppe von Mutanten von einem einzelnen Ziel in einem Experiment getestet. Dieses Protokoll wurde auch in Kombination mit Co-Expressionsvektoren (wit verwendeth eine einzige markierte Protein), um die Pull-down-und vorläufige Charakterisierung von Protein-Protein-Komplexe, gefolgt von gründlicher biophysikalische Analyse, um die korrekte Stöchiometrie der Komplexbildung und 33 bestätigen lassen. Die Menge an Protein gereinigt ist manchmal für Mikrotests (Funktionstests, Protein-DNA-34 oder Protein-Protein-Interaktionsassays). Es gibt mehrere Vorteile bei der Hochdurchsatz-Screening Strategie Ausdruck: (i) die Fähigkeit, eine Vielzahl von Zielen zu testen, oder eine große Anzahl von Variablen in einem einzigen Experiment, (ii) begrenzt Batch-zu-Batch-Variante (iii) Einfachheit und Benutzerfreundlichkeit, die an einem kleineren mit Tiefbrunnen, (iv) die Skalierbarkeit und Reproduzierbarkeit bei größeren Maßstab, (v) das Potenzial für die Automatisierung, und (vi) Einfachheit der Verfolgung und Handhabung (keine Kennzeichnung von einzelnen Röhren, weniger Fehler bei der Verwendung der Platten-Format als mit der Handhabung von Einzelrohren in der Misch-oder Austausch von Klonen) eingeführt. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; Obwohl in dem Protokollabschnitt erörtert, gibt es mehrere wichtige Überlegungen für die Vorbereitung des Versuchs, die kurz unten beschrieben wird. Für eine ausführliche Diskussion siehe auf der vorherigen Veröffentlichung 24. Für maximale Effizienz, ist es vorteilhaft, ein geeignetes System zur Hochdurchsatz-Klonen haben, um die Unter Klonen einer großen Anzahl von Zielen zu vereinfachen. Für die Anfangsphase des VENOMICS Projekt nutzen wir die vielseitige Gateway-Rekombination System 25, die Subklonierung in einem Tempo, von Hunderten von Klonen pro Woche können in einem beliebigen Ziel-Vektor. Protokolle für die Gateway-Rekombination Klonen auf der Invitrogen Website. Weitere Alternativen für die Hochdurchsatz-Klonen sind Ligation-unabhängigen Klonen (LIC) 35,36 und restriktionsfreie (RF) 37 Klonen. Es gibt mehrere Möglichkeiten, die Zielgene zur Expression von Entry-Klon Sammlungen zu erhalten, auch durch PCR aus DNA-Matrize, oder alssynthetische Gene, die die für das Projekt ausgewählt VENOMICS Strategie ist. Synthetische Gene können mit Rekombinationsstellen an jedem Ende des Gens und Gensynthese bestellen können leicht Codon-Optimierung des Zielgens Sequenz (E. coli seltene Codons auszuschließen). Dies ist empfehlenswert, aber nicht notwendig. Für Ziele ohne Codon-Optimierung, die eine hohe Anzahl von seltenen Codons, Rosetta 2 (DE3) pLysS (die tRNAs für seltene Codons, die nicht hoch in E. coli exprimiert werden, trägt) enthalten kann besser geeignet als BL21 (DE3) pLysS ist. Zwar gibt es Stämme zur Verfügung, die die Reduktion von Disulfidbindungen in der Regel reduzierenden Umgebung des Cytoplasmas zu begrenzen, in der Hand haben sie nicht so erfolgreich gewesen wie normale E. coli-Stämme 11. Analytische Skala Affinitätsreinigung von den Testausdruck Kulturen, um die löslichen Fusionsproteine ​​zu erholen und zu quantifizieren, die Renditen durchgeführt. Quantitative Daten können auf th erhaltene löslich Ausbeuten der Fusionsproteine ​​in einem Bereich von 0,1 ausgedrückt - 100 mg / l Kultur. Wenn ein Ziel nicht löslich ist, können alternative Expression und Induktionstemperaturen, Belastungen oder Medien getestet, bevor verschiedenen Fusionspartnern verfolgt werden. Für lösliche Expression von Disulfid-reiche Proteine, die zuvor den Effekt der Fusionspartner auf Platz wir als DsbC&gt; DsbA&gt; GST&gt; MBP&gt; TRX&gt; HIS-Tag für Cytoplasmaexpression 11. Periplasmatische Ausdruck ist eine weitere Möglichkeit, die die erfolgreiche Faltung von Disulfid-reich Ziele helfen können. Das Periplasma ist eine weniger reduzierenden Umgebung als Zytoplasma und enthält nützliche Redox-Chaperone zu Disulfidbrücken zu unterstützen. DsbC, DsbA und MBP-Proteine ​​werden normalerweise in das Periplasma durch die periplasmatische Signalsequenzen lokalisiert. Dies bietet die Möglichkeit, diese Tags nutzen, um die Disulfid-reich Ziele in den periplasmatischen Raum, um Falten zu unterstützen lenken. Für unlösbare Ziele wäre der nächste Schritt purify des unlöslichen His-markierten Ziel aus Einschlusskörpern, Solubilisierung und Rückfaltung (dies ist aus dem Geltungsbereich dieses Protokoll und wird hier nicht diskutiert werden 3 9). Dies kann ziemlich einfach für Ziele mit nur ein oder zwei Disulfid-Bindungen, aber wird immer schwieriger, da die Anzahl der Disulfidbindungen erhöht. Alternativ und insbesondere für Proteine ​​und Peptide, die mit vier oder mehr Disulfidbindungen, kann es vorteilhaft sein, um komplexere Herstellungssystemen, wie Hefe-, Insekten-oder Säuger-Expressions versuchen. Mit den Fortschritten in der Miniaturisierung und Automatisierung, wird HTP Elektrophysiologie Lab-on-a-Chip-Technologien 28 zweifellos der Weg der Zukunft für funktionelle Analysen sein. Wir sehen, dass für die meisten Zwecke (vielleicht mit Ausnahme der Strukturuntersuchungen), wird dies die Notwendigkeit für große Kulturen zu negieren. Kleinkulturen nicht nur nützlich für das Screening von Expressionsbedingungen, sondern auch in der Lage, suf bereitzustellenchend Probenmengen für diese miniaturisierten Funktionstests. Die Möglichkeit, mehrere Ziele parallel in ausreichenden Mengen für die funktionelle Charakterisierung produzieren wird die Kosten für die Kultivierung und Verwendung dieser Art von Plattformen zu senken, wird die Expression und Charakterisierung von rekombinanten Proteinen mehr kosten-und zeit wirksam. Die Protokolle haben hier auf den Ausdruck von Disulfid-reichen Peptide und Proteine ​​in der Anfangsphase des RP7 Europäischen VENOMICS Projekt angewendet. Gifte sind eine ausgezeichnete Quelle von bioaktiven Peptiden, die oft interessante pharmakologische Potential. Allerdings ist ihre Produktion anspruchs aufgrund ihrer komplexen Disulfid-Bindungsmuster und klein. Mit Hochdurchsatz-Plattformen wie das hier beschrieben wird, zielt das Projekt VENOMICS, um eine Bibliothek von 10.000 neuartige Peptide Gift erzeugen, um die Vielfalt in der Natur beobachtet reproduzieren. Diese Bibliothek wird für die Charakterisierung von Disulfid-R ausgenutzt werden,ICH Peptide mit potentiellen pharmakologischen oder therapeutischen Anwendungen mit dem Ziel der Entwicklung neuer Medikamente. Die Plattform wird derzeit für das Benchmarking und Validierung neuer Protokolle für die Verwendung in der VENOMICS Projekt verwendet.

Durch die Weiterentwicklung der Genomik und Beschleunigung des Entdeckung neuer Proteine ​​motiviert, haben eine hohe Durchsatzrohrleitungen entwickelt, um traditionelle Ansätze für das Screening und die Identifizierung der optimalen Proteinproduktionsstrategien parallelisieren. Potential Variablen optimiert werden können, umfassen, sind aber nicht beschränkt auf unterschiedlichen Expressionsstämme 1,2, Temperatur 3,4, 2,3 Medien, Ziel Varianten 5, 6-13 Fusionspartner, die Co-Expression mit Chaperonen 14,15 cytoplasmatische oder periplasmatischen Expression 16-18, und Reinigungspuffer 3 Komponenten. Durch die Implementierung von Hochdurchsatz-Methoden, viele Variablen oder viele Ziele können parallel mit einem hohen Maß an Effizienz getestet werden, bei gleichzeitiger Begrenzung von Charge zu Charge Variation. Nach unserer Erfahrung gibt die Strategie auch eine gute Reproduzierbarkeit auf Scale-up mit der gleichen Kultur (Temperatur, Medien, Belüftung, etc.) und Reinigungsbedingungen (gleiche Resin, Puffer, etc.). Mehrere Hochdurch Plattformen in den letzten zehn Jahren verwendet worden, um Bedingungen für lösliche Proteinexpression zu identifizieren, und zwar durch Variieren von Parametern wie Fusionspartner Expressionsstämmen oder Temperatur 19-23. Wir haben vor kurzem nutzten unsere Hochdurchsatz-Screening-Ansatz für die Expression von löslichen Disulfid-reiche Proteine ​​11. Die ausgewählten Proteine ​​waren nicht nur aus giftigen Quellen, aber auch eingeschlossen Disulfid-reichen Enzyminhibitoren aus einer Vielzahl von Arten, einschließlich Pflanzen, Schweine, Kühe und Menschen. Das Experiment wurde die Wirkung von 12 verschiedenen Fusionspartnern und drei verschiedenen Expressionsstämme auf die Löslichkeit und Faltung von Disulfid-28 retikuliert Proteinen. Wir haben gezeigt, dass die Verwendung DsbC als Fusionspartner für die Produktion in den Stamm BL21 (DE3) pLysS erheblich outproduced (sowohl in der Ausbeute und der Anzahl der erhaltenen löslichen Proteine) jede andere Kombination von Stamm und Fusion 11 getestet. DieErgebnisse dieses Experiments war die Basis für die Anpassung unserer ursprünglichen allgemeinen Hochdurchsatz-Pipeline (die für die Expression Screening einer Vielzahl von Proteinen verwendet wurde) 22,24 in eine besser geeignet für die Expression von Disulfid-reichen Zielen. Disulfid-reiche Proteine ​​aus Tiergiften sind von besonderem Interesse. Gifte sind eine komplexe Mischung von bioaktiven Peptiden und Proteinen, mit potentiellen Wert pharmakologisch und therapeutisch. Allerdings ist die Expression der Disulfidbindung-enthaltenden Proteinen, die nicht trivial. Diese Proteine ​​enthalten im allgemeinen zwischen 6.59 Disulfidbindungen und muss mit den korrekten Disulfid-Bindungsmuster, um aktiv zu sein, oxidiert werden. Derzeit ist die Plattform für das Screening der Expression einer großen Anzahl von Disulfid-reiche Tiergift-Proteine, die als Teil der Europäischen VENOMICS FP7-Projekt (www.venomics.eu) und Benchmarking-Roman Protokolle für die Hochdurchsatz-Expression von Tausenden von Zielen verwendet . Hier ein automatisiertes Verfahrenist für die Hochdurchsatz-Klein Expressions-Screening und Reinigung (siehe Abbildung 1) vorgesehen angewendet zu Disulfid-reiche Tiergift-Proteine. Die Strategie für die Disulfid-reiche Peptide und Proteine ​​verwendet eine HIS-Tag zur Aufreinigung und der redoxaktiven Fusionspartner, DsbC, die Schaffung spaltbare HIS-DsbC Fusionen an die Zielproteine ​​(siehe Abbildung 2). Während der Schwerpunkt der Protokolle hier ist die Automatisierung mit Hilfe eines Liquid-Handling-Roboter und HTP-Elektrophorese sind diese Methoden auch für einen hohen Durchsatz manuelle Ansatz, was bedeutet, dass auch Laboratorien mit einer Grundeinstellung können die Vorteile der Protokolle ohne Voraussetzung für die teure Ausrüstung zu nehmen . Hand Protokolle für die Transformation, um die Reinigung und Analyse (nicht spezifisch für Disulfid-reiche Proteine) an anderer Stelle 24 veröffentlicht worden und werden hier nicht wiederholt werden. Der Durchsatz der manuellen Verfahren (von Expressionsklon durch Rekombination erzeugtnationalen Klonen 25, um die Analyse der löslichen Protein-Ebene) ist 96 (unter Verwendung von SDS-PAGE-Detektion) oder 384 (4 x 96, mit Dot-Blot und SDS-PAGE 26) Kulturen pro Woche (siehe Abbildung 1). Dies kann erhöht werden, wenn in einer halbautomatischen Weise (unter Verwendung eines Flüssigkeitshandhabungsroboter und Dot-Blot-26 oder HTP-Elektrophorese, wie mit einem Caliper GXII LabChip System 22 durchgeführt werden, für die Analyse der Ergebnisse) auf bis zu 1.152 (12 x 96)-Kulturen, die parallel über eine Woche, wie hierin beschrieben. Die Kultur wird in 24 Tiefbrunnen (DW24)-Format durchgeführt, so dass die regelmäßige Schüttelinkubatoren kann im Gegensatz zu Kulturen in tiefe gut gewachsen 96 (DW96)-Format, das die Verwendung von kurzen Orbital High-Speed-Schüttelinkubatoren für ausreichende Belüftung notwendig (Schütteln verwendet werden bei 800 rpm). Der Einsatz von Auto-Induktion Medien 27 vereinfacht auch Ausdruck, wodurch die manuelle Induktionsschritt. Selbst dort, wo Labors vordefinierten Ausdruck und puri nutzen bereitsfizierung Bedingungen, können diese direkt in diese HTP-System übertragen werden einfach um die Effizienz zu verbessern. Eine detaillierte schematische Darstellung des Hochdurchsatz-Screening-Pipeline für Disulfid-reiche Proteine ​​ist in Fig. 3 vorgesehen. Die Parameter in der Pipeline wurden basierend auf umfangreichen Screening-Experimenten 11, 22, die uns erlaubte, die nützlichsten Bedingungen für die Proteinproduktion zu wählen ausgewählt. Charakterisierung kann auf markierten Proteine ​​direkt aus Klein Ausdrücke in Pilotstudien wo Zehn Mikrogramm Probe genügt, oder für empfindliche funktionelle Assays und Bindungsstudien (zum Beispiel Low-Volume-Patch-Clamp-Systemen HTP 28) gereinigt, durchgeführt werden. Das gleiche kann auch auf den unbezeichnet Ziele nach der Spaltung durchgeführt werden, wenn das Etikett und Protease entfernt werden (z. B. durch Umkehrphasen-HPLC). Die Qualitätskontrolle kann auch durch Massenspektrometrie (um die erwartete Größe und Oxidation st bestätigenate) oder chromatographische Methoden (Reinheit oder Heterogenität bestätigen) 29. Manchmal markieren Spaltung ist unnötig oder sogar unerwünscht ist (besonders für schlecht lösliche Proteine ​​30,31), so dass in diesem Protokoll Spaltung ist optional. Unabhängig davon, in allen Konstrukten gibt es eine TEV Protease-Schnittstelle (ENLYFQ / [G] 32) unmittelbar vor dem Zielgens auf native Protein nach Abspaltung erzeugen (siehe Abbildung 2 und Diskussion). Wenn die Spaltung der Fusions Tag gewünscht wird, kann die Spaltung (in der Elutionsfraktion oder &quot;on column&quot;) im kleinen Maßstab zu analysieren Effizienz getestet werden, Bedingungen zu optimieren, falls erforderlich und erhalten zuverlässige Schätzungen der Erträge für nachfolgende Anlagen Experimenten. Es gibt zwei Optionen für das Volumen der Perlen während der Affinitätsreinigung verwendet werden, abhängig von den Zielen und den Erwartungen des Experiments. Um so viel Protein wie möglich zu erfassen (für Pilottests oder MS zu reinigen, oder Extrapol seinaß für Scale-up-Ausbeuten) ein Endvolumen von 200 &amp;mgr; l des Harzes verwendet werden, die den Nachweis des löslichen Proteins in dem Bereich von 1-100 mg / l Kultur vor der Sättigung des Systems (siehe Protokoll (A) in Abschnitt 8.1) . Wenn das Ziel des Experiments ist die Detektion von geringen Mengen an löslichen Proteinen, dann ist jedoch ein Endvolumen von 50 ul Harz geeignet, die den Nachweis des löslichen Proteins im Bereich von 0,1-25 mg / L Kultur (siehe Protokoll (B ) in Abschnitt 8.2). Die Produktion kann hochskaliert werden, falls erforderlich, auf Milligramm-Mengen gereinigt Ziele für weitere strukturelle und funktionelle Studien mit, die für lösliche Expression identifiziert Bedingungen zu erhalten. Die Details der Scale-up-Protokolle auf AFMB verwendet haben, an anderer Stelle 22,24 diskutiert. Weitere Einzelheiten mit Bezug auf die Versuchsaufbau kritischen Schritte in dem Protokoll sind Modifikationen und Fehlersuche und Grenzen der Technik in der Scheibe vorgesehen istussion. Bitte lesen Sie die Diskussion vor Beginn der Experimente. In den Protokollen erwarten wir eine Erfolgsrate von 90% in jedem Schritt (zum Beispiel mindestens 90% der Kulturen müssen zu einem bestimmten Schritt zu wachsen). Wenn die Erfolgsrate einer Stufe in dem Experiment unter 90% werden die Proben verworfen und das Experiment wird für die vollständige Sammlung von Konstrukten wiederholt. Jedoch ist dieses Erfolgsrate nicht auf die Anzahl der Konstrukte, die als lösliche Proteine ​​oder der Anteil von Konstrukten, die mit 100% Effizienz spalten, zu exprimieren, wie dies in hohem Maße von den getesteten Proteine ​​sein. Die konkreten Details für das Set-up des Roboterarbeitstisch sind für jedes Protokoll vorgesehen ist (Abbildung 4 siehe auch), aber sie können als geeignet für alternative Arbeitstisch-Set-ups erforderlich. Der Roboter-Hardware (Tecan) besteht aus einer 96-Multichannel-Arm (MCA96), Roboter-Manipulator (Roma) und der 8-Kanal-Liquid-Handling-Kopf (LiHa). Alle Schritte Verwendung der MCA96 kann auch über die LiHa wenn ein MCA96 nicht verfügbar ist, aber sie wird länger dauern, weil die LiHa müssen zwischen den Schritten gewaschen werden. Während der Roboter technisch nicht sterilen Umgebung, die Aufnahme von Antibiotika im allgemeinen gewährleistet, dass es keine Probleme mit der Verschmutzung oder Sterilität.

<table><tbody><tr><td>Tecan Freedom EVO 200 Liquid-Handling-Roboter</td><td>Tecan Group Ltd.</td><td></td><td>Die Protokolle können an jeden Liquid-Handling-Roboter mit einem Vakuumverteiler für Platten angepasst werden. http://www.tecan.com/platform/apps/product/index.asp?MenuID=2694&ID=5270&Menu=1&Item=21.1.8</td></tr><tr><td>96-Well-PCR (PCR96) Platten</td><td>Greiner Bio-One</td><td>652270</td><td>http://us.gbo.com/bioscience/detail/2504/</td></tr> <tr><td>LB medium</td><td></td><td></td><td>Autoklavierend für Sterilität.</td></tr><tr><td>Antibiotika-Aktien</td><td></td><td></td><td>Kanamycin (50 mg/ml), Ampicillin (100 mg/ml), Chloramphenicol (34 mg/ml in Ethanol), Lagerbestände bei &minus; 20 °C. Verwenden Sie eine Verdünnung von 1:1.000.</td></tr><tr><td>Deep-Well-Platte 96 (DW96) mit 2,42 ml Volumenkapazität</td><td>Greiner Bio-One</td><td>780270</td><td>Autoklavierend für Sterilität. http://us.gbo.com/bioscience/detail/2462/</td></tr> <tr><td>Expressionsvektoren</td><td></td><td></td><td>Für die Expression von Zielkonstrukten. Lagern bei &minus; 20 °C.</td></tr><tr><td>BL21 (DE3) pLysS-kompetente Zellen</td><td></td><td></td><td>Oder alternativ E. coli Expressionsstamm nach Wahl des Benutzers. Lagern bei &minus; 80 °C.</td></tr><tr><td>Breathseal atmungsaktive Klebefolie</td><td>Greiner Bio-One</td><td>676050</td><td></td></tr><tr><td>PCR-Maschine mit 96-Well-Plattenblock</td><td></td><td></td><td>Für die Transformation, den Hitzeschock und das Sieden von SDS-PAGE/Caliper-Proben.</td></tr><tr><td>24-Well-sterile Gewebekulturplatten</td><td>Greiner Bio-One</td><td>662165</td><td>http://us.gbo.com/bioscience/detail/2220/</td></tr> <tr><td>LB-Agar</td><td></td><td></td><td>für Sterilität autoklaviert.</td></tr><tr><td>200 &mu; l sterile Einweg-Spitzen</td><td>Tecan Group Ltd.</td><td>30 038 617</td><td>http://www.tecan.com/platform/apps/product/index.asp?MenuID=2283&ID=4118&Menu=1&Item=21.4.1.2</td></tr><tr><td>Multitron Schüttelinklinkubator, mit 3 mm Hub</td><td>Infos</td><td>AJ103</td><td>Nicht erforderlich, es kann auch ein regulärer Schüttelinkubator verwendet werden. http://www.infors-ht.com/index.php/en/</td></tr> <tr><td>Platten-Inkubator</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikrotiterplatte</td><td></td><td></td><td>Für Glycerinbestände und Elution unter Verwendung des Aufreinigungsprotokolls B.</td></tr><tr><td>Glycerin</td><td>Zur Herstellung von Glycerin-Aktien</td><td></td><td></td>.</tr><tr><td>200 &mu; l Einweg-Trinkgelder</td><td>Tecan Group AG</td><td>30 038 616</td><td>http://www.tecan.com/platform/apps/product/index.asp?MenuID=2283&ID=4118&Menu=1&Item=21.4.1.2</td></tr><tr><td>Klebeband-Pads&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>19570</td><td>http://www.qiagen.com/Products/Catalog/Lab-Essentials-and-Accessories/Tape-Pads</td></tr><tr><td>Bactinyl</td><td>Orapi Gruppe</td><td></td><td>Oder gleichwertiges mikrobielles Desinfektionsmittel.</td></tr><tr><td>ZYP-5052 mittel</td><td></td><td></td><td>Siehe Tabelle 1 für Rezepturen der Komponenten.</td></tr><tr><td>Deep Well 24 (DW24) Platten, 10 ml Fassungsvermögen</td><td>Whatman</td><td>7701-5102</td><td>Autoklavierend für Sterilität. http://www.whatman.com/UNIPLATECollectionandAnalysisMicroplates.aspx#7701-5102</td></tr><tr><td>Klare Mikrotiterplatte mit flachem Boden</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655101</td><td>Für Absorptionsmessungen. http://us.gbo.com/bioscience/detail/2029/</td></tr> <tr><td>Spektralphotometer</td><td></td><td></td> <td>mit PlattenablesungWahlfrei. Zur Messung von OD600 von Kulturen.</td></tr><tr><td>Zentrifuge mit Rotor für Deep-Well-Platten&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Geeignet für 3.800 x g.</td></tr><tr><td>Lysozym</td><td></td><td></td><td>50 mg/ml in Wasser. Lagern bei &minus; 20 °C.</td></tr><tr><td>Imidazol ACS-Qualität</td><td>Merck</td><td>IX0005-1</td> Es <td>muss eine hochwertige Imidazol-Qualität verwendet werden, damit sie die A280-Messwerte für die Berechnung der Proteinausbeute nicht beeinträchtigt.</td></tr><tr><td>Lysepuffer</td><td></td><td></td><td>50 mM Tris, 300 mM NaCl, 10 mM Imidazol pH 8 mit 0,25 mg/ml Lysozym (oder Ihrem bevorzugten Puffer). Fügen Sie jedes Mal Lyzozym aus dem Vorrat hinzu und lagern Sie es nicht über einen längeren Zeitraum.</td></tr><tr><td>Wasserbad</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Platten-Ultraschallgerät (Ultraschallprozessor XL, angepasst für Deep-Well-Platten)</td><td>Misonix Inc.</td><td></td><td>Nicht unbedingt erforderlich. Lysozym allein reicht in der Regel für eine nahezu vollständige Lyse aus.</td></tr><tr><td>DNase&nbsp;</td><td></td><td></td><td>2 mg/ml Vorrat in Wasser, Filter sterilisiert. Speichern Sie Aliquots bei &minus; 20 °C.</td></tr><tr><td>Magnesiumsulfat (MgSO4)2</td><td></td><td></td> <td>M Vorrat in Wasser, autoklaviert.</td></tr><tr><td>SDS-PAGE oder Caliper Probenpuffer&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bindungspuffer</td><td></td><td></td><td>50 mM Tris, 300 mM NaCl, 10 mM Imidazol pH 8 (oder Ihr bevorzugter Puffer). Bei 4 °C lagern.</td></tr><tr><td>Waschpuffer</td><td></td><td></td><td>50 mM Tris, 300 mM NaCl, 50 mM Imidazol pH 8 (oder Ihr bevorzugter Puffer). Bei 4 °C lagern.</td></tr><tr><td>Elutionspuffer</td><td></td><td></td><td>50 mM Tris, 300 mM NaCl, 250 mM Imidazol pH 8 (oder Ihr bevorzugter Puffer). Bei 4 °C lagern.</td></tr><tr><td>96-Well-Empfänger/Filterplatte 20 & Mikro; m, 1,8 ml Fassungsvermögen</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740686.4</td><td>http://www.mn-net.com/ProductsBioanalysis/Accessories/tabid/10909/language/en-US/Default.aspx</td></tr><tr><td>200 &mu; l Einweg-Spitzen mit breiter Bohrung</td><td>Tecan Group Ltd.</td><td>30 050 348</td><td>http://www.tecan.com/platform/apps/product/index.asp?MenuID=2283&ID=4118&Menu=1&Item=21.4.1.2</td></tr><tr><td>Ni Sepharose 6 Fast Flow Harz</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5318-02</td><td>Zur Aufreinigung von Zielfusionsproteinen. Bei 4 °C lagern. Vor Gebrauch waschen und äquilibrieren. http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences/17531802</td></tr><tr><td>Tabakätzvirus (TEV)-Protease</td><td></td><td></td><td>Optional, für die Spaltung. 2 mg/ml, ohne Reduktionsmittel im Lagerpuffer. Lagern bei &minus; 80 °C.</td></tr><tr><td>96 Bohrlöcher 0,22 & Mikro; m Filterplatte</td><td>Millipore</td><td>MSGV N22 10</td><td>Optional. Zur Filterung der löslichen Fraktion nach der Spaltung. http://www.millipore.com/catalogue/item/msgvn2210</td></tr><tr><td>SDS-PAGE/Dot-Blot-Gerät oder Caliper Labchip GXII-Gerät</td><td></td><td></td><td>Elektrophoresegerät und Wahl des Geltyps liegt beim Benutzer. s Ermessen.</td></tr><tr><td>Spektralphotometer und Küvetten</td><td></td><td></td><td>Zur Messung der Absorption bei 280 nm (A280) zur Berechnung der Ausbeute an löslichen Proteinen. Nicht erforderlich, wenn die Analyse am Messschieber durchgeführt wird.</td></tr><tr><td>ZipTip Pipettenspitzen</td><td>Millipore</td><td></td><td>Optional. Die Art des ZipTip liegt im Ermessen des Benutzers. Für größere Proteine sollte C4-Harz verwendet werden, während für Peptide C18 besser geeignet sein kann. Alternative Methoden zur Entsalzung von Proben können auch verwendet werden, um Proben vor einer weiteren Qualitätskontrolle zu reinigen. http://www.millipore.com/catalogue/module/c5737#0<</td></tr><tr>td colspan="4">Materialien werden in der Reihenfolge aufgelistet, in der sie im Protokollabschnitt benötigt werden. Reagenzien können, sofern nicht anders angegeben, bei Raumtemperatur gelagert werden. Referenznummern des Verfassers" Es wird eine bevorzugte Materialauswahl angeboten, es können jedoch auch gleichwertige Produkte geeignet sein. Bei Reagenzien, bei denen die Marke keinen Einfluss auf das Ergebnis des Experiments hat, wurden die Angaben zum Unternehmen weggelassen.</td></tr></tbody></table>

hochdurchsatz-screening quantitative expression und aufreinigung rekombinanter zu disulfid-reichen proteine ​​venom produziert in applied<em&gt; e. coli</em

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

Escherichia coli (E. coli) ist das am weitesten verbreitete Expressionssystem für die Produktion von rekombinanten Proteinen für die strukturelle und funktionelle Untersuchungen. , Reinigung von Proteinen ist jedoch manchmal eine Herausforderung, da viele Proteine ​​in einer unlöslichen Form exprimiert wird. Bei der Arbeit mit schwer oder mehrere Ziele empfiehlt es sich daher um einen hohen Durchsatz (HTP)-Protein-Expression Screening auf einem kleinen Maßstab (1-4 ml-Kulturen) verwenden, um schnell Bedingungen für lösliche Expression zu identifizieren. Um mit den verschiedenen Programmen strukturelle Genomik des Labors, einer quantitativen (in einem Bereich von 0,1 bis 100 mg / L Kultur von rekombinanten Protein) und HTP-Protein-Expression Screening-Protokoll wurde auf Tausenden von Proteinen umgesetzt und validiert bewältigen. Die Protokolle wurden unter Verwendung eines automatisierten Flüssigkeitshandhabungsroboter kann aber auch manuell ohne spezielle Ausrüstung durchgeführt werden. Disulfid-reichen Gift Proteine ​​gewinnenzunehmende Anerkennung für ihr Potenzial als therapeutische Leitstrukturen. Sie können sehr potenter und selektiver sein, aber ihre komplexen Disulfidbrücke Netzwerke machen sie schwierig zu produzieren. Als Mitglied des Europäischen Venomics FP7-Projekt ( <a href="http://www.venomics.eu">www.venomics.eu</a> ), ist unsere Herausforderung, erfolgreiche Produktionsstrategien mit dem Ziel, Tausende von neuen Giftproteine ​​für funktionelle Charakterisierung zu entwickeln. Durch die Redox-Eigenschaften der Disulfidbindungsisomerase DsbC unterstützt, passten wir unsere HTP Produktionsrohrleitung für die Expression von oxidierten funktionellen Gift-Peptiden in E. coli Zytoplasma. Die Protokolle sind auch für die Herstellung von verschiedenen Disulfid-reiche Proteine. Hier zeigen wir unsere Pipeline für die Produktion von Tiergift-Proteine ​​angewendet. Mit den hierin beschriebenen Protokollen ist es wahrscheinlich, dass lösliche Disulfid-reichen Proteinen in weniger als einer Woche erhalten werden. Selbst aus einem kleinen Maßstab, gibt es das Potenzial, um th verwendenE gereinigte Proteine ​​für die Validierung der Oxidationszustand durch Massenspektrometrie, zur Charakterisierung in Pilotstudien oder für empfindliche Mikro-Assays.

Repräsentative Ergebnisse sind in Fig. 6 für das Screening von Expressions 96 Disulfid-reiche Proteine ​​vom VENOMICS Pipeline gezeigt. Die Proteine ​​werden durch zunehmende Anzahl von Disulfidbindungen dann zunehmende Anzahl an Resten angeordnet sind. Die Peptide wurden in das Zytoplasma mit einer HIS-tag und DsbC Fusionspartner ausgedrückt. Bei Verwendung der empfohlenen Kulturbedingungen wird eine OD 600 von 12 normalerweise erreicht. Die Peptide wurden unter Verwendung von 8,2-Protokoll-B mit einem Endvolumen von 50 &amp;mgr; l Nickelaffinitätsharz gereinigt, so dass ein Maximum von ~ 25 mg / l Fusionsprotein konnte in diesem Versuch festgestellt werden. Figur 6A zeigt das Ergebnis der Elektrophorese aus dem Bremssattel LabChip System (welches die Fusion vor der Spaltung) und dem Bewertungssystem basierend auf einer Extrapolation in mg / l Kultur des Fusionsproteins zu erhalten (in Anteilen von 0,1 bis 2 mg / l Kultur, 2 10 mg / l Kultur, 10 bis 25 mg / l Kultur und kein<html> t festgestellt.) Beachten Sie, dass die gespaltene DsbC Tag läuft normalerweise bei etwa 32 kDa, 27 kDa anstatt wie erwartet. Ebenso sind die DsbC Fusionen führen auch rund 5 kDa höher als erwartet. Für viele der Ziele, die wir sehen, nicht nur die intakte Fusions (Oberband), sondern auch der Fusionspartner allein (Unterband). Für einige dieser Ziele die Optimierung der Kulturbedingungen kann das Verhältnis des intakten Fusions (Oberband) im Vergleich zu DsbC allein ermöglicht eine Erhöhung der endgültige Ertrag zu verbessern. Das Scoring nur auf der Ebene der intakten Fusions basiert. Nur 16 der 96 Proteine ​​konnten nicht an der Fusionsebene nachgewiesen werden. Dies entspricht einer Gesamterfolg Niveau von 83%. Von den 80 Proteinen, die nachgewiesen werden konnte, 45 von diesen wurden in Konzentrationen von mehr als 2 mg / L Kultur (56%) festgestellt. Je nach Ziel und Fusion werden Proteinausbeuten in der Regel im Bereich von 2-100 mg / L Kultur (obwohl in diesem Beispiel unter Verwendung des Protokolls 8.2 B ein Maximum von ~ 25 mg / l Fusionsprotein detektiert werden kann). t &quot;&gt; Eine Analyse des Erfolgs von Anzahl der vorhandenen Disulfidbrücken (in 6B gezeigt) zeigt angemessenen Erfolg für alle Zahlen der getesteten Disulfidbrücken (zwischen 1 und 7), wobei die niedrigste Erfolgsniveau auf 66% für die Ziele, die 6 Disulfid Bindungen. Eine Analyse der Verteilung der Expressions Erfolg durch isoelektrische Punkt und der Anzahl der Reste (in Fig. 6C gezeigt) zeigt keine besondere Vorliebe für die Technik, mit beiden erfolgreich exprimiert Ziele und Ziele, die nicht erkannt wurden während der Auftragung verstreut. Fig. 6D zeigt ein Beispiel der Ergebnisse der Massenspektrometrie Elektrospray-Ionisation-Massenspektrometrie (ESI-MS) für ein einzelnes Ziel erhalten wird, vor und nach Reduktion der Probe mit DTT. Normalerweise würde eine solche erschöpfende Massenspektrometrieanalyse nicht durchgeführt werden müssen (eine reduzierte Probe nicht analysiert werden müssen), aber für die Zwecke der gründlichen demonstration wir beide Ergebnisse gezeigt. Die dargestellte Ziel ist ein 5,7 kDa Disulfid-reichen Giftprotein mit 4 Disulfidbrücken. Das Spektrum auf der linken Seite zeigt die Ergebnisse für das Protein vor der Reduktion mit DTT, wie es nach der Spaltung und Entsalzung ohne weitere Eingriffe. Das Spektrum auf der rechten Seite zeigt die Protein nach Reduktion mit DTT, gefolgt von Entsalzen, um überschüssiges DTT zu entfernen. Die, die den experimentellen Massen-Ionen sind mit Pfeilen auf das Spektrum und die Bezeichnung für jedes Ion markiert ist grün dargestellt. Die für diese Ionen berechnet Versuchs den Massen (für das Protein vor der Reduktion (-DTT) und nach Reduktion (+ DTT)) sind in der Tabelle gezeigt. Die Massen (5709,6 Da für die Probe vor der Reduktion und 5717,6 Da für die reduzierte Probe) zeigen eine Massendifferenz von 8 Da. Eine Massendifferenz von 2 Da entspricht der Gegenwart von 1 Disulfidbrücke oxidiert, damit eine Massendifferenz von 8 Da die Anwesenheit von 4 Disulfid-Bindungen (wie erwartet) inder nicht-reduzierten Probe. <img alt="Figur 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51464/51464fig1highres.jpg" width="500" /> 1. Schematische Darstellung des Expressions-Screening mit hohem Durchsatz Protokoll. Unter Verwendung dieses Protokolls 96-384 Bedingungen können von einer einzigen Person in einer Woche mit manuellen Verfahren getestet werden, oder bis zu 1.152 Bedingungen mit der beschriebenen halbautomatischen Ausrüstung. Expressionsplasmide werden mit einer Rekombination Klonen Technologie, so dass zahlreiche Ziele können auf einmal subkloniert errichtet. Sobald löslichen Expressionsbedingungen wurden identifiziert und Spaltung durchgeführt wird, wenn gewünscht, kann das Protein auf die Qualitätskontrolle gehen, um die Oxidation und Reinheit im Mikro und / oder Großproduktion zu überprüfen. <img alt="Figur 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51464/51464fig2highres.jpg" width = &quot;500&quot; /&gt; Abbildung 2. Schematische für den universellen rekombinatorische Klonen und konstruieren Design. Aus den Zieleintrag Klone können mehrere Expressionsvektoren werden in einem einzigen Experiment in einem Hochdurchsatzverfahren (bis zu 6 x 96 Klone Eintrag in einer Woche) subkloniert. Das exprimierte Protein kodiert für ein HIS-Tag für Nickel-Affinitätsreinigung. Die DsbC (fehlt seiner periplasmatische Signalsequenz für Cytoplasmaexpression) Fusionspartner wird verwendet, um die Löslichkeit und / oder Hilfe Faltung und korrekte Oxidation des Zielproteins zu erhöhen. Beachten Sie, dass die Zielkodierungssequenz sollte ein N-terminales TEV-Protease-Erkennungsstelle (ENLYFQ) enthalten, wenn tag Spaltung gewünscht wird. Der Einschub links oben zeigt die Herstellung der Eintrag Klone unter Verwendung einer Donor-Vektor und die Zielsequenzen, die durch PCR oder Gen-Synthese erhalten werden können. Eintrag Klone können auch von kommerziellen Entry-Klon Sammlungen erhalten werden. Mehrere rekombinatorische Klonen Systeme verfügbar sind, aber wir nutzen die Gateway-system, wie in dem Schema gezeigt. <img alt="Fig. 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51464/51464fig3highres.jpg" width="500" /> 3. Hochdurchsatz-Screening-Pipeline für mehrere Disulfid-reiche Ziele. Ziele werden zunächst als HIS-DsbC-Fusionen in das Zytoplasma der BL21 (DE3) pLysS E. ausgedrückt coli bei 37/17 ° C unter Verwendung von Auto-Induktionsmedium (ZYP-5052). Reinigung von Nickel Harz, gefolgt vom Nachweis von löslichen Konstrukte HTP-Elektrophorese (oder Dot-Blot / SDS-PAGE) durchgeführt. Wenn die erste Runde der Expressions-Screening nicht erfolgreich ist, werden alternative Kulturbedingungen versucht. Wenn Konstrukte erzeugen lösliche Proteine ​​in hohen Ausbeuten im Mikro und Qualitätskontrolle durchgeführt werden kann und, falls erforderlich, können die Großproduktion verfolgt werden. Für Ziele, wo die Renditen löslich sind nicht hoch genug ist, können Expressions-Screening mit alternativen stra weiterIns und Temperaturen dann andere Fusionspartner und periplasmatischen Ausdruck. Optionale Schritte sind durch gestrichelte Kästen dargestellt. <img alt="Fig. 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51464/51464fig4highres.jpg" width="500" /> Abbildung 4. Robot Arbeitstisch Setup für die HTP-Plattform. Das Layout der Liquid-Handling-Roboter-Arbeitstisch angezeigt wird, obwohl alternative Arbeitstische können auch verwendet werden, wenn es gleichwertige Sites. Das Setup besteht aus einer Waschstation (WS) für die (8-Kanal-Liquid-Handling-Kopf (LiHa)), zwei Mikroträgern mit jeweils 4 Positionen (MP4, Positionen 1-4 und 5-8), eine Vakuumstation mit 2 Positionen (Te-Sauger, Positionen 9 und 10), ein Mikroträger mit 3 Positionen (MP3, Positionen 11-13), zwei Plattenschüttler mit 2 Positionen jeweils (Te-Shakers, Positionen 14-15 und 16-17) und ein Träger für Einwegspitzen mit 3 Positionen (DiTi, Positionen 18-20). Neben derre sind zwei Hotel-Träger für Deep Well Platten und eine für Mikroplatten (nicht gezeigt). Die auf der Liquid-Handling-Roboter installierte Hardware ist ein 96-Mehrkanal-Arm (MCA96) zur Verwendung mit Einwegspitzen, einem 8-Kanal-Liquid-Handling-Kopf (LiHa) mit festen Spitzen und einem Roboter-Manipulator (Roma), die Platten / Geräte herum bewegt der Arbeitstisch. Die Nummerierung der Positionen ist in der gesamten Protokoll bezeichnet. <img alt="Figur 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51464/51464fig5highres.jpg" width="500" /> Abbildung 5. Schema für die Übertragung von einer einzigen 96-Well-Platte in vier 24-Well-Platten. <img alt="Fig. 6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51464/51464fig6highres.jpg" width="500" /> Abbildung 6. Repräsentative Ergebnisse sind für den Ausdruck Bildschirm von 96 Disulfid-reich pro Gift gezeigtProteine. Die Proteine ​​wurden als HIS-DsbC Fusionen im Zytoplasma exprimiert und mit 50 ul Nickel Harz (Protokoll 8.2-B) gereinigt. A) Expression Screening-Ergebnisse und zeigt virtuelle Gel und erzielte für die Expressionsausbeute. Der Kontrast in der virtuellen Gel Spur-zu-Spur angepasst, um für sehr schwache oder starke Bänder zu kompensieren. Beachten Sie, dass für einige Ziele zwei Bänder zu sehen ist, die obere Bande, die dem intakten Fusionsprotein und der unteren Bande, die dem Fusions Tag allein. B) der Anteil der Proteine ​​in jedem Expressionsniveau exprimiert, verglichen mit der Anzahl der Disulfidbindungen in das Protein. Die tatsächliche Anzahl von Proteinen in jeder Gruppe auf dem Graphen. C) überschichtet Die Verteilung der Expressionslevel basierend auf isoelektrischen Punkt (pI) und die Anzahl von Resten. D) ein Beispiel für die Massenspektrometrie-Ergebnisse für ein 5,7 kDa Disulfid-reichen Gift Protein mit 4 Disulfidbrücken. Das Spektrum aufdie linke Seite zeigt das Protein vor der Reduktion mit DTT und das Spektrum auf der rechten Seite zeigt das Protein mit DTT reduziert und dann entsalzt. Die, die den experimentellen Massen-Ionen sind mit Pfeilen markiert und deren Zuordnungen sind in grün dargestellt. Die experimentellen Massen für das Protein vor der Reduktion und nach der Reduktion sind in der Tabelle dargestellt und zeigen eine Massendifferenz von 8 Da, entsprechend der Anwesenheit von oxidierten Protein vor Zugabe des Reduktionsmittels. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51464/51464fig6highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur sehen .</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> Komponente </td><td> Rezept </td><td> Kommentar </td></tr><tr><td> ZY </td><td> ~ 928 ml 10 g Trypton 5 g Hefeextrakt 925 ml Wasser </td><td> Mischen und dann im Autoklaven zu sterilisieren. </td></tr&gt; <tr><td> 2 M MgSO 4 </td><td> 100 ml 49,3 g MgSO 4 · 7H 2 O ~ 60 ml Wasser </td><td> Rühren, bis gelöst, dann im Autoklaven zu sterilisieren. </td></tr><tr><td> 50x 5052 </td><td> 1 L 250 g Glycerin 730 ml Wasser 25 g Glukose 100 g α-Lactose </td><td> In der Reihe über Hitze rühren, bis alle gelöst und dann im Autoklaven zu sterilisieren. </td></tr><tr><td> 20x NPS </td><td> 1 L 900 ml Wasser 66 g (NH 4) 2 SO 4 136 g KH 2 PO 4 142 g Na 2 HPO 4 </td><td> In der Reihe und rühren, bis alles gelöst und dann im Autoklaven zu sterilisieren. </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Rezept für Komponenten ZYP-5052 Medium.

Ein Protokoll für die quantitative, Expressionsscreening mit hohem Durchsatz und analytischen Reinigung von Fusionsproteinen aus kleinen Escherichia coli-Kulturen beschrieben und auf die Expression von Disulfid-reichen Tiergift-Protein-Targets aufgebracht.

Hochdurchsatz-Screening Quantitative Expression und Aufreinigung rekombinanter zu Disulfid-reichen Proteine ​​Venom Produziert in Applied<em&gt; E. coli</em

Escherichia coli (E. coli) is the most widely used expression system for the production of recombinant proteins for structural and functional studies. ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Verfahrens ist es, ein Hochdurchsatz-Expressionsscreening-Protokoll zu verwenden, um den Gehalt an löslichen Proteinen in E-coli mit Hilfe eines automatisierten Liquid-Handling-Roboters zu quantifizieren. Dies wird durch erstes Impfen erreicht.96. Nach Well-Vorkulturen mit Zellen, die mit Plasmiden transformiert wurden, die für die Zielfusionsproteine kodieren, werden am nächsten Tag 24-Well-Platten, die mit Autoinduktionsmedien gefüllt sind, mit den Nacht-Vorkulturen inokuliert, um eine Expression zu erzeugen.Die Kulturen nach der Ernte und dem Einfrieren löslicher Proteine aus den Expressionskulturen werden dann durch immobilisierte Metallaffinitätschromatographie aufgereinigt. Letztendlich können die Löslichkeitsgrade für jede intakte Zielfusion gemessen werden, um die optimalen Expressionsbedingungen für die Proteinproduktion und die Generierung erfolgreicher Ziele zu bestimmen. Aufgrund der Vorteile dieser Technik traditioneller Methoden zur Effizienzsteigerung, der begrenzten Chargenbestrahlung und der Einfachheit der Datenverarbeitung und -verfolgung ist die visuelle Demonstration dieser Methode von entscheidender Bedeutung.Die automatisierten Schritte können entmutigend und im Textformat allein schwer zu verstehen sein, da der Text nicht die Schnelligkeit oder Einfachheit des Verfahrens vermittelt. Nach der Transformation der Bakterien wird zunächst mit dem Robotergreifer der Deckel der ersten 24-Well-LB-Agarplatte beiseite gelegt. Verwenden Sie anschließend den Achtkanal-Liquid-Handling-Arm, um 50 Mikroliter Transformationsgemisch aus einer 96-Well-Transformationsplatte zu mischen und dann anzusaugen.Geben Sie die Transformationsmischung in den ersten vier Kanälen des Liquid-Handling-Arms in die erste Säule der LB-Agarplatte und die Umwandlungen in den letzten vier Kanälen in die zweite Säule der LB-Agarplatte. Waschen Sie alle Spitzen nach der Abgabe gründlich und übertragen Sie dann die Transformationsmischung von der 96-Well-Platte in alle Vertiefungen in den nächsten vier Säulen der LB-Agarplatte, bis Die Platte ist fertig. Sobald die Übertragung auf die erste Platte abgeschlossen ist, setzen Sie den Deckel wieder auf und beginnen Sie mit der Übertragung für die nächste Platte. Sobald alle Transformationen plattiert sind, schütteln Sie alle Platten eine Minute lang bei 1200 U/min, um eine homogene Verteilung der Transformationsmischung zu erzeugen.Verwenden Sie dann nach dem Mischen den 96-Mehrkanalarm, um 60 Mikroliter der verbleibenden Transformationsmischung aus der 96-Well-Platte abzusaugen und die Mischung in eine Tiefbrunnen-96-Platte mit LB-Brühe zu geben. Versiegeln Sie die Vorkulturen 96 mit atmungsaktiver Klebefolie, um die Belüftung der Kultur zu ermöglichen, und stellen Sie die Platte dann über Nacht bei maximaler Geschwindigkeit in einen 37 Grad Celsius heißen Schüttelinkubator. Sobald sich die Vorkulturen im Inkubator befinden, fahren Sie die LB-Agarplatten in einer Haube mit abgenommenen Deckeln für etwa 10 Minuten.Anschließend werden die Platten in einem 37 Grad Celsius heißen Platteninkubator über Nacht invertiert. Am nächsten Tag werden mit dem Liquid-Handling-Arm 100 Mikroliter der Nacht-Vorkultur in eine Tiefbrunnen-96-Platte aspiriert, um die Expressionskulturen in einer 40. Verdünnung zu inokulieren, wobei das gleiche Schema wie zuvor verwendet wird, wobei der Liquid-Handling-Arm an der Waschstation zwischen den einzelnen Säulen der Vorkulturen gründlich gewaschen wird. Wenn die Inokulation abgeschlossen ist, legen Sie die Expressionskulturen in einen 37 Grad Celsius heißen Schüttelinkubator, der vier Stunden lang mit atmungsaktivem Klebstoff verschlossen ist.Reduzieren Sie dann die Temperatur auf 17 Grad Celsius für eine Inkubation über Nacht. Am nächsten Morgen zentrifugieren Sie die 24 Platten für 10 Minuten bei 3000 Gs. Entsorgen Sie den Überstand in einen Abfallbehälter mit einem antimikrobiellen Wirkstoff und klopfen Sie die Platten dann kopfüber auf saugfähiges Papier, um eventuelles Restmedium zu entfernen und zu überprüfen, ob die Kulturen korrekt gewachsen sind. Überprüfen Sie, ob sich Pellets im tiefen Schacht befinden.Als nächstes aspirieren Sie 125 Mikroliter Lysepuffer und geben den Puffer zweimal in jede Vertiefung der 24 Platten mit vier Spitzen in jede Vertiefung ab. Um das endgültige Volumen von einem Milliliter Lysepuffer zu erreichen, um die Pellets zu resuspendieren, schütteln Sie die Platten fünf Minuten lang bei 1200 U/min. Übertragen Sie die Zellsuspensionen auf dem Roboter zurück in die entsprechenden Vertiefungen einer Tiefbrunnenplatte 96 und lagern Sie die Platten mindestens eine Stunde lang bei minus 80 Grad Celsius.Für diese Demonstration werden wir das Protokoll mit 50 Mikrolitern Nickelkügelchen zur Aufreinigung der Zielfusionsproteine verwenden. Tauen Sie die Tiefbrunnenplatte 96 zunächst ca. 15 Minuten lang in einem Wasserbad auf. Anschließend werden die Zelllysate im Schüttelinkubator bei maximaler Geschwindigkeit für weitere 10 Minuten reanimiert, die Kulturen sollten zähflüssig werden.Verwenden Sie anschließend eine manuelle Achtkanalpipette, um DNAs und Magnesiumsulfat zu dispensieren. Mischen Sie es in jede Vertiefung der Deep Well 96-Platte auf eine Endkonzentration von 10 Mikrogramm pro Milliliter bzw. 20 Millimolar. Schütteln Sie die verschlossene Platte weitere 15 Minuten, dann sollte die Kultur nicht mehr zähflüssig werden. Um ein Verstopfen der Filterplatte während der Reinigung zu vermeiden, ist es wichtig, sorgfältig visuell zu überprüfen, dass keines der Lysate mehr viskos ist.Verwenden Sie auf dem Liquid-Handling-Roboter 200-Mikroliter-Spitzen mit breiter Bohrung, um die Harzaufschlämmung gründlich zu mischen, bevor Sie 200 Mikroliter der Aufschlämmung in die Tiefbrunnenplatte 96 mit dem Lysat überführen. Schütteln Sie die Tiefbrunnenplatte 96 bei 1400 U/min und Raumtemperatur 10 Minuten lang, um eine Bindung zu ermöglichen, und verwenden Sie dann die Spitzen mit breiter Bohrung, um die vollen 1200 Mikroliter Harzlysataufschlämmung in 200 Mikrolitern Aliquots auf die Filterplatte zu übertragen. Schalten Sie nun das Vakuum für ca. 30 Sekunden ein, um das Lysat durch die Platte zu filtern und den Durchfluss in einer tiefen Vertiefung zu sammeln.96 unterhalb des Tiefbrunnens 96, der den Durchfluss enthält, wird unterhalb der Filterplatte entnommen und bis zum Ende des Versuchs auf einem Gestell gelagert. Waschen Sie dann das Harz jedes Mal zweimal mit 800 Mikrolitern Bindepuffer nach dem zweiten Waschen und legen Sie mit dem Robotergreifer eine frische, tiefe, gut 96er Platte unter die Filterplatte, um die 50 Millimolar I Midaz-Wäsche aufzufangen. Es werden 150 Mikroliter Waschpuffer auf die Filterplatte gegeben und das Vakuum erneut angelegt, bis der Puffer durch die Vertiefung 96 gelaufen ist.Die Wäsche wird unter der Filterplatte entnommen und bis zum Ende des Versuchs auf einem Gestell gelagert. Nach zwei weiteren Waschvorgängen mit 800 Mikrolitern Waschpuffer, wie für den Bindungspuffer demonstriert, wurde die Mikroplatte mit dem Robotergreifer auf den Arbeitstisch übertragen und der SPE-Block und die Filterplatte wieder auf die Mikroplatte gelegt, um den Elucian aufzufangen. Geben Sie dann 190 Mikroliter Elucian-Puffer zum Harz in der Filterplatte.Wenden Sie das Vakuum nach drei Minuten eine Minute lang an, um den gesamten Puffer passieren zu lassen. Überprüfen Sie schnell und visuell, ob die Ellucian-Volumina korrekt sind. Zum Schluss werden Blockproben des Ellucian Wash and Flow durch Platten zur Quantifizierung des Niveaus der löslichen Expression genommen.Analysieren Sie zuerst die Ellucian-Platte und überprüfen Sie erst bei Bedarf die entsprechenden Wasch- und Durchflussfraktionen. Diese Daten veranschaulichen ein Elektrophorese-Ergebnis des Messschieber-Laborchip-Systems. Die intakten gespaltenen Fusionsproteine werden durch die oberen Banden dargestellt, während die gespaltenen Proteinfragmente als untere Banden dargestellt werden.Es wurde bestimmt, dass die Fusionsausbeuten für jedes Zielprotein in den Bereichen von 0,1 bis zwei, zwei bis 10 und 10 bis 25 Mikrogramm pro Liter Kulturniveaus lagen oder in einigen Fällen nicht nachgewiesen wurden. Die Bewertung des Erfolgs der Proteinexpression anhand der Anzahl der Diss-Sulfidbindungen, die in jedem Fusionsproteinfragment vorhanden sind, zeigt einen angemessenen Erfolg für alle getesteten Disulfidbindungen, wobei das niedrigste Erfolgsniveau 66 % für Ziele mit sechs Disulfidbindungen beträgt. Die Analyse der Verteilung des Expressionserfolgs basierend auf dem isoelektrischen Punkt und der Anzahl der Reste zeigt keine besondere Verzerrung für die Technik, wobei sowohl erfolgreich exprimierte Ziele als auch Ziele, die nicht nachgewiesen wurden, über das gesamte Diagramm verstreut sind.Sobald die Fusionen detektiert und gespalten wurden, werden die gereinigten Targets einer Qualitätskontrolle durch Elektrospray-Ionisation und Massenspektrometrie unterzogen. Hier ist das repräsentative Ziel ein 5,7 Kilodalton dissulfidreiches Giftprotein mit vier Disulfidbindungen. Dieses Spektrum zeigt die Ergebnisse für das Protein vor der Reduktion mit DTT wie nach der Spaltung und Entsalzung ohne weitere Eingriffe.Dieses Spektrum zeigt das Protein nach der Reduktion mit DTT, gefolgt von der Entsalzung, um überschüssiges DTT zu entfernen. Die Pfeile zeigen die Ionen an, die den experimentellen Massen entsprechen, und die Bezeichnung für jedes Ion ist grün dargestellt. Die für diese Ionen berechneten experimentellen Muttermassen sind in der Tabelle dargestellt und entsprechen einer Massendifferenz von acht Dalton, was vier oxidierten Die-Sulfid-Bindungen entspricht.Nach der Einrichtung kann das vollständige Protokoll an mehr als tausend Kulturen innerhalb einer Woche durchgeführt werden. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie kleine E-Coli-Kulturen verwenden können, um die erfolgreichen Bedingungen zu identifizieren, die für die Produktion löslicher Proteine mit Hochdurchsatzmethoden erforderlich sind.

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Biologie

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