Hochdurchsatz-Screening Quantitative Expression und Aufreinigung rekombinanter zu Disulfid-reichen Proteine ​​Venom Produziert in Applied E. coli

Das übergeordnete Ziel des folgenden Verfahrens ist es, ein Hochdurchsatz-Expressionsscreening-Protokoll zu verwenden, um den Gehalt an löslichen Proteinen in E-coli mit Hilfe eines automatisierten Liquid-Handling-Roboters zu quantifizieren. Dies wird durch erstes Impfen erreicht.96. Nach Well-Vorkulturen mit Zellen, die mit Plasmiden transformiert wurden, die für die Zielfusionsproteine kodieren, werden am nächsten Tag 24-Well-Platten, die mit Autoinduktionsmedien gefüllt sind, mit den Nacht-Vorkulturen inokuliert, um eine Expression zu erzeugen.

Die Kulturen nach der Ernte und dem Einfrieren löslicher Proteine aus den Expressionskulturen werden dann durch immobilisierte Metallaffinitätschromatographie aufgereinigt. Letztendlich können die Löslichkeitsgrade für jede intakte Zielfusion gemessen werden, um die optimalen Expressionsbedingungen für die Proteinproduktion und die Generierung erfolgreicher Ziele zu bestimmen. Aufgrund der Vorteile dieser Technik traditioneller Methoden zur Effizienzsteigerung, der begrenzten Chargenbestrahlung und der Einfachheit der Datenverarbeitung und -verfolgung ist die visuelle Demonstration dieser Methode von entscheidender Bedeutung.

Die automatisierten Schritte können entmutigend und im Textformat allein schwer zu verstehen sein, da der Text nicht die Schnelligkeit oder Einfachheit des Verfahrens vermittelt. Nach der Transformation der Bakterien wird zunächst mit dem Robotergreifer der Deckel der ersten 24-Well-LB-Agarplatte beiseite gelegt. Verwenden Sie anschließend den Achtkanal-Liquid-Handling-Arm, um 50 Mikroliter Transformationsgemisch aus einer 96-Well-Transformationsplatte zu mischen und dann anzusaugen.

Geben Sie die Transformationsmischung in den ersten vier Kanälen des Liquid-Handling-Arms in die erste Säule der LB-Agarplatte und die Umwandlungen in den letzten vier Kanälen in die zweite Säule der LB-Agarplatte. Waschen Sie alle Spitzen nach der Abgabe gründlich und übertragen Sie dann die Transformationsmischung von der 96-Well-Platte in alle Vertiefungen in den nächsten vier Säulen der LB-Agarplatte, bis Die Platte ist fertig. Sobald die Übertragung auf die erste Platte abgeschlossen ist, setzen Sie den Deckel wieder auf und beginnen Sie mit der Übertragung für die nächste Platte. Sobald alle Transformationen plattiert sind, schütteln Sie alle Platten eine Minute lang bei 1200 U/min, um eine homogene Verteilung der Transformationsmischung zu erzeugen.

Verwenden Sie dann nach dem Mischen den 96-Mehrkanalarm, um 60 Mikroliter der verbleibenden Transformationsmischung aus der 96-Well-Platte abzusaugen und die Mischung in eine Tiefbrunnen-96-Platte mit LB-Brühe zu geben. Versiegeln Sie die Vorkulturen 96 mit atmungsaktiver Klebefolie, um die Belüftung der Kultur zu ermöglichen, und stellen Sie die Platte dann über Nacht bei maximaler Geschwindigkeit in einen 37 Grad Celsius heißen Schüttelinkubator. Sobald sich die Vorkulturen im Inkubator befinden, fahren Sie die LB-Agarplatten in einer Haube mit abgenommenen Deckeln für etwa 10 Minuten.

Anschließend werden die Platten in einem 37 Grad Celsius heißen Platteninkubator über Nacht invertiert. Am nächsten Tag werden mit dem Liquid-Handling-Arm 100 Mikroliter der Nacht-Vorkultur in eine Tiefbrunnen-96-Platte aspiriert, um die Expressionskulturen in einer 40. Verdünnung zu inokulieren, wobei das gleiche Schema wie zuvor verwendet wird, wobei der Liquid-Handling-Arm an der Waschstation zwischen den einzelnen Säulen der Vorkulturen gründlich gewaschen wird. Wenn die Inokulation abgeschlossen ist, legen Sie die Expressionskulturen in einen 37 Grad Celsius heißen Schüttelinkubator, der vier Stunden lang mit atmungsaktivem Klebstoff verschlossen ist.

Reduzieren Sie dann die Temperatur auf 17 Grad Celsius für eine Inkubation über Nacht. Am nächsten Morgen zentrifugieren Sie die 24 Platten für 10 Minuten bei 3000 Gs. Entsorgen Sie den Überstand in einen Abfallbehälter mit einem antimikrobiellen Wirkstoff und klopfen Sie die Platten dann kopfüber auf saugfähiges Papier, um eventuelles Restmedium zu entfernen und zu überprüfen, ob die Kulturen korrekt gewachsen sind. Überprüfen Sie, ob sich Pellets im tiefen Schacht befinden.

Als nächstes aspirieren Sie 125 Mikroliter Lysepuffer und geben den Puffer zweimal in jede Vertiefung der 24 Platten mit vier Spitzen in jede Vertiefung ab. Um das endgültige Volumen von einem Milliliter Lysepuffer zu erreichen, um die Pellets zu resuspendieren, schütteln Sie die Platten fünf Minuten lang bei 1200 U/min. Übertragen Sie die Zellsuspensionen auf dem Roboter zurück in die entsprechenden Vertiefungen einer Tiefbrunnenplatte 96 und lagern Sie die Platten mindestens eine Stunde lang bei minus 80 Grad Celsius.

Für diese Demonstration werden wir das Protokoll mit 50 Mikrolitern Nickelkügelchen zur Aufreinigung der Zielfusionsproteine verwenden. Tauen Sie die Tiefbrunnenplatte 96 zunächst ca. 15 Minuten lang in einem Wasserbad auf. Anschließend werden die Zelllysate im Schüttelinkubator bei maximaler Geschwindigkeit für weitere 10 Minuten reanimiert, die Kulturen sollten zähflüssig werden.

Verwenden Sie anschließend eine manuelle Achtkanalpipette, um DNAs und Magnesiumsulfat zu dispensieren. Mischen Sie es in jede Vertiefung der Deep Well 96-Platte auf eine Endkonzentration von 10 Mikrogramm pro Milliliter bzw. 20 Millimolar. Schütteln Sie die verschlossene Platte weitere 15 Minuten, dann sollte die Kultur nicht mehr zähflüssig werden. Um ein Verstopfen der Filterplatte während der Reinigung zu vermeiden, ist es wichtig, sorgfältig visuell zu überprüfen, dass keines der Lysate mehr viskos ist.

Verwenden Sie auf dem Liquid-Handling-Roboter 200-Mikroliter-Spitzen mit breiter Bohrung, um die Harzaufschlämmung gründlich zu mischen, bevor Sie 200 Mikroliter der Aufschlämmung in die Tiefbrunnenplatte 96 mit dem Lysat überführen. Schütteln Sie die Tiefbrunnenplatte 96 bei 1400 U/min und Raumtemperatur 10 Minuten lang, um eine Bindung zu ermöglichen, und verwenden Sie dann die Spitzen mit breiter Bohrung, um die vollen 1200 Mikroliter Harzlysataufschlämmung in 200 Mikrolitern Aliquots auf die Filterplatte zu übertragen. Schalten Sie nun das Vakuum für ca. 30 Sekunden ein, um das Lysat durch die Platte zu filtern und den Durchfluss in einer tiefen Vertiefung zu sammeln.

96 unterhalb des Tiefbrunnens 96, der den Durchfluss enthält, wird unterhalb der Filterplatte entnommen und bis zum Ende des Versuchs auf einem Gestell gelagert. Waschen Sie dann das Harz jedes Mal zweimal mit 800 Mikrolitern Bindepuffer nach dem zweiten Waschen und legen Sie mit dem Robotergreifer eine frische, tiefe, gut 96er Platte unter die Filterplatte, um die 50 Millimolar I Midaz-Wäsche aufzufangen. Es werden 150 Mikroliter Waschpuffer auf die Filterplatte gegeben und das Vakuum erneut angelegt, bis der Puffer durch die Vertiefung 96 gelaufen ist.

Die Wäsche wird unter der Filterplatte entnommen und bis zum Ende des Versuchs auf einem Gestell gelagert. Nach zwei weiteren Waschvorgängen mit 800 Mikrolitern Waschpuffer, wie für den Bindungspuffer demonstriert, wurde die Mikroplatte mit dem Robotergreifer auf den Arbeitstisch übertragen und der SPE-Block und die Filterplatte wieder auf die Mikroplatte gelegt, um den Elucian aufzufangen. Geben Sie dann 190 Mikroliter Elucian-Puffer zum Harz in der Filterplatte.

Wenden Sie das Vakuum nach drei Minuten eine Minute lang an, um den gesamten Puffer passieren zu lassen. Überprüfen Sie schnell und visuell, ob die Ellucian-Volumina korrekt sind. Zum Schluss werden Blockproben des Ellucian Wash and Flow durch Platten zur Quantifizierung des Niveaus der löslichen Expression genommen.

Analysieren Sie zuerst die Ellucian-Platte und überprüfen Sie erst bei Bedarf die entsprechenden Wasch- und Durchflussfraktionen. Diese Daten veranschaulichen ein Elektrophorese-Ergebnis des Messschieber-Laborchip-Systems. Die intakten gespaltenen Fusionsproteine werden durch die oberen Banden dargestellt, während die gespaltenen Proteinfragmente als untere Banden dargestellt werden.

Es wurde bestimmt, dass die Fusionsausbeuten für jedes Zielprotein in den Bereichen von 0,1 bis zwei, zwei bis 10 und 10 bis 25 Mikrogramm pro Liter Kulturniveaus lagen oder in einigen Fällen nicht nachgewiesen wurden. Die Bewertung des Erfolgs der Proteinexpression anhand der Anzahl der Diss-Sulfidbindungen, die in jedem Fusionsproteinfragment vorhanden sind, zeigt einen angemessenen Erfolg für alle getesteten Disulfidbindungen, wobei das niedrigste Erfolgsniveau 66 % für Ziele mit sechs Disulfidbindungen beträgt. Die Analyse der Verteilung des Expressionserfolgs basierend auf dem isoelektrischen Punkt und der Anzahl der Reste zeigt keine besondere Verzerrung für die Technik, wobei sowohl erfolgreich exprimierte Ziele als auch Ziele, die nicht nachgewiesen wurden, über das gesamte Diagramm verstreut sind.

Sobald die Fusionen detektiert und gespalten wurden, werden die gereinigten Targets einer Qualitätskontrolle durch Elektrospray-Ionisation und Massenspektrometrie unterzogen. Hier ist das repräsentative Ziel ein 5,7 Kilodalton dissulfidreiches Giftprotein mit vier Disulfidbindungen. Dieses Spektrum zeigt die Ergebnisse für das Protein vor der Reduktion mit DTT wie nach der Spaltung und Entsalzung ohne weitere Eingriffe.

Dieses Spektrum zeigt das Protein nach der Reduktion mit DTT, gefolgt von der Entsalzung, um überschüssiges DTT zu entfernen. Die Pfeile zeigen die Ionen an, die den experimentellen Massen entsprechen, und die Bezeichnung für jedes Ion ist grün dargestellt. Die für diese Ionen berechneten experimentellen Muttermassen sind in der Tabelle dargestellt und entsprechen einer Massendifferenz von acht Dalton, was vier oxidierten Die-Sulfid-Bindungen entspricht.

Nach der Einrichtung kann das vollständige Protokoll an mehr als tausend Kulturen innerhalb einer Woche durchgeführt werden. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie kleine E-Coli-Kulturen verwenden können, um die erfolgreichen Bedingungen zu identifizieren, die für die Produktion löslicher Proteine mit Hochdurchsatzmethoden erforderlich sind.