Name: Verwenden Sie für Menschenrechte Perivaskuläre Stammzellen für die Knochenregeneration (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-25T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 5 s
Description: Erfahren Sie die Isolation perivaskulärer Stammzellen aus Fettgewebe mittels FACS für die Knochenregeneration. Diese Methode zeigt vollständige Ossifikation innerhalb von acht Wochen in vivo.

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Diese Arbeit wurde von der CIRM Frühe II Translational Research Award TR2-01821, NIH / NIDCR (Zuschüsse R21 DE0177711 und RO1 DE01607), UC Discovery Grant 07-10677, AWJ und RKS unterstützt haben T32 Ausbildungsstipendien Awards (5T32DE007296-14), JNZ hat eine Ausbildung CIRM Gemeinschaft (TG2-01169).

1. Perivaskuläre Stammzellisolation Dies wird in Einzelheiten in der nebenstehenden Artikel "Die Reinigung von Perivaskuläre Stammzellen aus menschlichen weißen Fettgewebe" beschrieben, vertreten durch M. CORSELLI et al. 2. Scaffold Creation <ol><li> Gerüste sind an zuvor veröffentlichten Protokolls aus Poly (milchsäure-co-Glykolsäure) (PLGA, Burmingham Polymer) mit Hydroxyapatit-Beschichtung 4-6 Maß. Apatit-beschichteten PLGA Gerüste werden von 85/15 PLGA im Gießverfahren und einem teilchenförmigen Laugung hergestellt. Gerüste sind in einer sphärischen Form (2 mm Durchmesser) für Muskel Beutel Implantation, eine Scheibenform (4 mm Durchmesser) für Calvaria Implantation oder zylindrische (4 mm Durchmesser, 6 mm Länge) für femorale Segmentdefekten erstellt. </li><li> Kurz gesagt, PLGA / Chloroform-Lösungen mit Saccharose (Polymer / Saccharose-Verhältnis 5/95, w / w) gemischt werden, in einen 200-300-Mikrometer Durchmesser Teflonform, um die maßgeschneiderte Nachteile schaffen gegossentruct. Nach dem Gefriertrocknen über Nacht werden die Gerüste aus Teflon-Form entfernt und in ddH 2 O, um die Saccharose zu lösen. Gerüste werden durch Eintauchen in 70% Ethanol für 30 min desinfiziert, gefolgt von drei Spülungen ddH 2 O. </li><li> Für Apatit-Beschichtung wird ein simulierter Körperflüssigkeit (SBF) Lösung durch sequentielles Lösen von CaCl 2, MgCl 2 • 6H 2 O, NaHCO 3 und K 2 HPO 4 • 3 H 2 O in ddH 2 O. vorbereitet Lösung auf pH 6 mit indem 1 M Salzsäure zur Erhöhung der Löslichkeit verringert. Na 2 SO 4, KCl und NaCl zugegeben und der End-pH auf 6,5 (SBF 1) eingestellt. </li><li> Mg2 + und HCO 3 - frei SBF (SBF 2) wird durch Zugabe von CaCl 2 und K 2 HPO 4 • 3 H 2 O in ddH 2 O und pH-Wert auf 6 gesenkt vorbereitet. KCl und NaCl zugegeben und der End-pH auf 6,8 eingestellt. Alle Lösungen sind steril durch eine 0,22 um PES Membr gefiltertane (Nalgene). Unmittelbar vor dem Beschichten werden die getrockneten PLGA Gerüsten Glimmentladung Argon-Plasma-Ätzen (Harrick Scientific) unterzogen, um die Benetzung und Beschichtungsgleichmäßigkeit zu verbessern. </li><li> Geätzte Gerüste werden dann in SBF 1 für 12 h inkubiert und geändert werden, um Mg 2 + und HCO 3 - freien SBF 2 für weitere 12 h bei 37 ° C unter leichtem Rühren. Beschichtete Gerüste werden mit ddH 2 O gewaschen, um überschüssige Ionen zu entfernen und lyophilisiert vor der weiteren Untersuchungen. </li></ol> 3. Das Muscle Pouch Modell Implantation <ol><li> 100 ul einer PSC-Suspension in PBS (Phosphate Buffered Saline) werden vorsichtig auf die sphärische PLGA-basierte Implantat unmittelbar vor der Implantation gesunken. Die Zellen wurden durch lentiviralen Einsetzen der Firefly-Luciferase voretikettiert, um in vivo nach der Implantation Tracking zu ermöglichen. Die Zelldichte von 2,5 x 10 5 pro Implantat. </li><li> SCID (severe combined immundefizienten) Mäuse werden am Alter von 6 Wochen eingesetzt. Die Tiere sind Anesthetized durch Einatmen und Isofluran Prämedikation mit Buprenorphin (Bedford Labs). Nach dem Standard-Betadin Herstellung werden die bilateralen Einschnitte in den hinteren Gliedmaßen aus (Längs-und 2 mm in der Länge). </li><li> Taschen sind in den Bizeps femoris durch stumpfe Präparation parallel zur Muskelfaser langen Achse geschnitten. Für jede Maus, wird das PLGA-basierte Implantat mit PSCs eingeführt und der Faszie des Muskels mit 5-0 Vicryl (Ethicon) vernäht. </li><li> Die Haut wird mit 5-0 Vicryl nächste in einer subkutanen Muster geschlossen. Für 10 Tage; Tiere sind postoperativ mit Buprenorphin für 48 Stunden und TMP / SMX (Qualitest Trimethoprim / Sulfamethoxazol) behandelt. </li></ol> 4. Die Schädeldecken Defektmodell Implantation <ol><li> Nach Isofluran-Narkose von SCID-Mäusen (12-14 Wochen alt), wird das Haar geschoren und die Haut mit Betadine pro Protokoll desinfiziert. </li><li> Ein 8-mm Hautschnitt entlang der Mitte Pfeilnaht der Maus Kalotte hat. Als nächstes wird die calvArial Periost wird sanft von Q-Tip-Anwendung entfernt. </li><li> Dann wurde unter Verwendung diamantbeschichteten Trephine Bits in einem Breitband-Dentalbohrers wird ein 4-mm-parietalen Knochendefekt erstellt. Der Defekt ist voller Stärke - aber nicht darauf geachtet wird, um die darunterliegende Dura mater zu verletzen. </li><li> Der maßgefertigte PLGA-basierte Implantat mit eingepflanzten PSCs wird dann vorsichtig in der defekten Stelle platziert. Die Zelldichte von 2,5 x 10 5 pro Implantat. Schließlich wird die Haut mit 6-0 Vicryl vernäht. Die Tiere werden nach der Operation mit Buprenorphin für 48 Stunden und TMP / SMX für 10 Tage behandelt. </li></ol> 5. Der Femur segmentalen Defekt Modell Implantation <ol><li> Athymischen Ratten (12-14 Wochen alt) sind unter Isofluran-Inhalation betäubt. Der Oberschenkel ist geschrubbt und zubereitete pro Standard-Protokoll mit Betadine (Abbildung 1). </li><li> Ein 27-30-mm Längsinzision über die anterolaterale Seite des Oberschenkels gemacht. Der Femurschaft wird dann durch die Trennung der vastus lat. ausgesetzteralis und M. biceps femoris (Abbildung 2). </li><li> Um die Konsistenz der Knochenregeneration zu maximieren, wird das Periost über der femoralen Defekt vollständig mit der resezierten femoralen Segment entfernt. </li><li> Ein Polyethylen-Platte (Länge, 23 mm, Breite 4 mm, Höhe, 4 mm) an der antero-Oberfläche des Femur. Die Platte enthält sechs vorgebohrten Löcher bis 0,9 mm Durchmesser Gewinde-Kirschner-Drähte (Zimmer) unterzubringen. Unter die Platte als Schablone werden sechs Gewinde Kirschner-Drähte durch die Platte und beide Kortikales (Abbildung 3) niedergebracht. </li><li> Als nächstes wird mit einer kleinen oszillierenden Sägeblatt (Stryker, MI) wird eine 6-mm-Mitte-diaphysären Defekt erzeugt. Segment Defekte werden dann durch die Insertion von PLGA Implantaten auf die beladen worden mit Zellen gemäß Protokoll (4) behandelt wurden. </li><li> Die darüber liegende Muskeln und Faszien sind mit 4-0 Vicryl resorbierbaren Fäden verschlossen, um das Implantat zu fixieren, und die Haut vernäht. </li> 6. In-vivo-Beurteilungen <ol><li> Radiographische Bewertungen sind in einer Längsrichtung Weise sowohl Hochauflösung XR und Hochauflösung μCT (Mikro-Computertomographie)-Analyse durchgeführt. Für μCT-Analyse (Skyscan 1172F), werden die Bilder bei einer Auflösung von 19,73 um (100 kV und 100 mA Strahlungsquelle mit Hilfe eines 0,5 mm Aluminium-Filter) gescannt. Bilder werden mit Hilfe DataViewer, Recon, CTAN, und CTVol Software. </li><li> Biolumineszenz-Bildgebung wird auch in serieller Weise zu Zelle Transplantation, Lebensfähigkeit, der Vermehrung zu beurteilen und schließt Migration aus der Implantationsstelle getan. Biolumineszenz-Bildgebung erfolgt mit Hilfe eines IVIS Lumina II Gerät (Caliper Life Sciences). Licht-Ausgänge werden quantifiziert durch lebende Image Software (Xenogen). Insgesamt Lichtleistung wird in Photonen / Sekunde / cm ² / Steradiant aufgezeichnet. </li><li> Histologische und histomorphometrische Analyse wird post mortem durchgeführt. Routinefärbungen eingesetzt werden, umfassen Masson, Anilinblau, S.entachrome und Picrosirius rot. Histomorphometrische Analyse lässt sich leicht entweder mit Anilinblau oder pentachrome Flecken durchgeführt, bei dem Osteoid dunkelblau und gelb, bzw. erscheint. Pixel pro starkem Gesichtsfeld berechnet mit dem Zauberstab-Werkzeug in Adobe Photoshop. </li></ol> 7. Repräsentative Ergebnisse Da sowohl die Schädeldecken und femoralen Defekte kritischen Größe sind, sollten keine signifikante Heilung ohne Behandlung mit Wachstumsfaktoren oder exogene Stammzellen zu erwarten. In Bezug auf die chirurgische Manöver sollte der Muskel Beutel Dissektion entlang Faszien sein und damit minimale Blutung sollte begegnet werden. Auch wenn der Muskel Beutel Modell bilateraler Ebene durchgeführt wird, sollte die Maus mit Leichtigkeit am Tag nach der Operation ein zu Fuß. Für die Kalvariamodell Defekt wird Blutungen auftreten, kann aber mit einem Wattestäbchen getränkt werden. Äußerste Sorgfalt sollte nicht auf die zugrunde liegende Dura mater verletzt werden - wie dies störenmit normaler Heilung. Für die FSD-Modell wird darauf geachtet, nicht um die großen Blutgefäße zu verletzen, so wie nicht übermäßige Blutungen oder den N. femoralis zu veranlassen, um neurologische Schäden zu verhindern. Kirschner-Drähte mit leichtem Druck gebohrt, um nicht den kortikalen Knochen in dem Verfahren beschädigt werden. <img alt="Abbildung 1." src="/files/ftp_upload/2952/2952fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1."> Abbildung 1. Präoperative Vorbereitung für Femur segmentalen Defekt (FSD) in athymischen Ratten. Männliche Ratten (12-14 Wochen alt) sind unter Isofluran-Inhalation betäubt. Der Oberschenkel ist geschrubbt und desinfiziert pro Standard-Protokoll mit Betadine. <img alt="Abbildung 2." src="/files/ftp_upload/2952/2952fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2."> Abbildung 2. Operative Freilegung für Femur segmentalen Defekt (FSD) Schöpfung. Ein 27-30 mm Längsinzision über die anterolaterale Seite des Oberschenkels gemacht. Die lateralen Seite des Femurs wird dann durch Trennen des Musculus vastus lateralis ausgesetztund M. biceps femoris. <img alt="Abbildung 3." src="/files/ftp_upload/2952/2952fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 3."> Abbildung 3. Fixierung für Femoral segmentalen Defekt (FSD) Schöpfung. Ein Polyethylen-Platte (Länge, 23 mm, Breite 4 mm, Höhe, 4 mm) an der antero-Oberfläche des Femur. Die Platte enthält sechs vorgebohrten Löcher bis 0,9 mm Durchmesser Gewinde-Kirschner-Drähte unterzubringen. Unter die Platte als Schablone werden sechs Gewinde Kirschner-Drähte durch die Platte und beide Kortikales gebohrt. Als nächstes wird eine 6 mm Mitte-diaphysären Defekt erzeugt. Sobald dies durchgeführt wird, wird eine maßgeschneiderte Gerüst direkt eingefügt, die genau den Defekt vor Ort (nicht dargestellt). <img alt="Abbildung 4." src="/files/ftp_upload/2952/2952fig4.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 4."> Abbildung 4. Beispiel für Kalvariamodell Defect Postoperative. Ein 4 mm, kreisförmigen Calvaria Defekt in der rechten Scheitelbein in athymischen Mäusen erzeugt. Abgebildeten hier ist ein Defekt implantiert mitPSCs nach 8 Wochen postoperativ. Notieren Sie sich die Anwesenheit des neuen Knochens innerhalb der defekten Stelle. </ol>

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</ol>

KT, BP und CS sind Erfinder von perivaskulären Stammzell-Patente von der UCLA eingereicht. Drs. KT und CS sind die Begründer der Scarless Laboratories Inc., die perivaskulären Stammzellen-Patente lizenziert diese von der UC Regents. Dr. Chia Soo ist auch ein Offizier der Scarless Laboratories, Inc.

Die Isolierung von PSCs ist gut an anderer Stelle beschrieben 1-3, einschließlich eines separat eingereicht JoVE Veröffentlichung speziell an PSC Isolation Protokolle und Methoden. Der spezifische Zweck dieses Artikels ist zu beschreiben und zu zeigen, 3-Protokolle für die PSC in vivo-Anwendung für die Knochenbildung / Regeneration. Die SCID-Maus-Muskel-Tasche ist eine häufig beschriebene Modell für menschliche ektopische Knochenbildung 7. Wichtige Unterschiede gibt es zwischen ektopen und orthotopen (Defekt) Modelle für die Knochen, darunter parakrine Interaktion mit dem Host Knochen bildenden Zellen 8 sowie einer Fülle von osteogenen Faktoren Signalisierung in der Skelett-Defekt Mikroumgebung. Zwei Mängel werden hier vorgestellt und eine Kalvariamodell defect8 femoralen segmentalen Defekts 4. Beide sind gut dokumentiert, kritisch zu sein Größe (dh nicht auf ihren eigenen heilen). Interessante Unterschiede gibt es zwischen Kalvariamodell und femoralen Defekte. Zuerst wird derZell: Zell-Interaktion zwischen Heterotransplantattumor PSCs und körpereigenen Zellen ist sehr unterschiedlich. Im Sinne einer Calvaria Defekt, interagieren PSCs mit dem darunter liegenden Dura mater (die äußerste Schicht der Hirnhaut), ebenso wie diejenigen Osteoblasten und Periostzellen aufweist, die die defekten Stelle. Wichtig ist, dass die Wechselwirkung zwischen der implantierten Zellen und umgebenden Osteoblasten 8 oder implantierten Zellen und die zugrunde liegenden Dura (Levi et al., Im Druck) für die normale Stamm-Zell-vermittelte Osteogenese, um fortzufahren. Im Hinblick auf die femorale segmentalen Defekt (FSD), werden Xenotransplantat PSCs zu einem ganz anderen Zelle und Cytokin Umgebung ausgesetzt. Zum Beispiel wird die FSD Seite der zugehörigen Knochenmark und mesenchymale Stammzellen, sowie die Endost, Periost und langer Röhrenknochen Osteoblasten besteht. Theoretisch weist jede Zelle einen eigenen Reaktion auf eine Verletzung, und jede Zelle haben kann: Zell-Interaktionen mit PSC-Xenotransplantaten. Weitere deutliche Unterschiede bestehen zwischen Kalvariamodellund femoralen Defekte. Die Schädeldecken Knochen bilden zunächst durch intramembranöse Ossifikation, während die langen Knochen durch einen Knorpel-Zwischenprodukt (enchondralen Ossifikation) zu bilden. Darüber hinaus ist die reparative Verfahren nach der Verletzung auch ahmt diese Entwicklungsstörungen Herkunft. Post-FSD, wird Knorpel Kallusbildung beobachtet, während keine Zwischen-Knorpel in einem Scheitelbein Defekt gebildet wird. Schließlich kann die embryonale Herkunft des Schädels aus, dass der langen Knochen unterscheiden. Die Mehrheit der Schädel (einschließlich perivaskuläre Zellen - Perizyten - in der ganzen Kopfbereich) von der Neuralleiste (mesectoderm) abgeleitet, während die appendicularis Skelett der paraxialen Mesoderm Ableitung 9. All diese Unterschiede können in signifikanten Unterschiede in Bezug auf die PSC-vermittelte Knochenreparatur führen. Der Einsatz von PSCs hat einige Vorteile gegenüber traditionellen Fettgewebe gewonnene Stromazellen (ASC). PSCs erfordern keine Kultur und eine gereinigte Zellpopulation which beinhaltet keine anderen Stromazellen, die nicht in nicht teilnehmen - und kann sogar negativ regulieren - osteogene Differenzierung, wie Endothelzellen 10. Im Gegensatz zum Beispiel für klonale Analysen ASC, dass nur eine Subpopulation der Lage einer osteogenen Differenzierung in vitro 11 sind. Letztendlich wird das Skelettgewebe Entwicklungsanstrengungen wahrscheinlich enthalten eine osteocompetent Stammzellen (zB PSC) mit exogenen Wachstumsfaktoren und eine osteokonduktive Matrix (wie HA-PLGA verwendet in den vorliegenden Verfahren), um die besten zu heilen Skelettdefekten.

verwenden sie für menschenrechte perivaskuläre stammzellen für die knochenregeneration

Use of Human Perivascular Stem Cells for Bone Regeneration

Menschliche perivaskulären Stammzellen (PSCs) können in ausreichender Zahl aus verschiedenen Geweben zum Zwecke der Skelett-Tissue-Engineering 3.1 isoliert werden. PSCs sind FACS-sortierten Population von &quot;Perizyten&quot; (CD146 + CD34-CD45-) und &quot;Adventitia-Zellen&quot; (CD146-CD34 + CD45-), jeder von denen wir bereits berichtet haben, um die Eigenschaften von mesenchymalen Stammzellen. PSCs, wie MSCs können osteogene Differenzierung sowie sezernieren pro-osteogene Cytokine 1,2 unterzogen. Im vorliegenden Protokoll demonstrieren wir den osteogenicity von PSCs in mehreren Tiermodellen einschließlich eines Muskels Beutel Implantation in SCID (severe combined immundefizienten) Mäuse, eine SCID-Maus Kalvariamodell Defekt und einen femoralen segmentalen Defekt (FSD) in athymischen Ratten. Der Oberschenkelmuskel Beutel Modell wird verwendet, um ektopische Knochenbildung zu beurteilen. Kalvariamodell Defekte sind auf dem Scheitelbein zentriert und sind standardmäßig 4 mm im Durchmesser (kritisch Größe) 8. FSDs sind bikortikale stabilisiert und sind mitein Polyethylen-Bar und K-Drähte 4. Der FSD beschrieben ist auch eine kritische Größe Defekt, der nicht wesentlich auf seine eigenen vier heilen. Im Gegensatz dazu, wenn Stammzellen oder Wachstumsfaktoren der defekten Stelle hinzugefügt wurden, können signifikante Knochenregeneration geschätzt. Das übergeordnete Ziel der PSC Xenografting ist es, das osteogene Potenzial dieser Zellart in beide ektopen und orthotopen Knochenregeneration Modelle zu demonstrieren.

Menschliche perivaskulären Stammzellen (PSCs) sind eine neue Klasse für Stammzell-Skelett-Geweberegeneration ähnlich wie mesenchymale Stammzellen (MSCs). PSCs durch FACS (fluorescence activated cell sorting) kann aus dem Fettgewebe während der üblichen Fettabsaugung Verfahren beschafft isoliert werden, dann mit einem osteoinduktiven Gerüst kombiniert, um die Knochenbildung zu erreichen<em&gt; In-vivo-</em&gt;.

Verwenden Sie für Menschenrechte Perivaskuläre Stammzellen für die Knochenregeneration

Humane perivaskuläre Stammzellen (PSCs) können in ausreichender Anzahl aus verschiedenen Geweben für Zwecke des skeletalen Tissue Engineering isoliert werden1-3. PSCs sind ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, die Auswirkungen der Implantation perivaskulärer Stammzellen in ektopischen und orthotopen Knochen-Differenzierungsmodellen zu beobachten. Dies wird erreicht, indem zunächst Stammzellen aus Fettgewebe mithilfe der Fax-Technologie isoliert werden. Anschließend werden maßgeschneiderte Scaffolds hergestellt, um eine Oberfläche für die Zelldifferenzierung in entweder einem ektopischen oder orthotopen Milieu bereitzustellen.Um die knochenbildende Wirkung von PSCs zu testen, werden skelettale Defekte unter Verwendung eines Skid-Maus-Muskelgewebe-Beutel-Modells, eines Skid-Maus-Kalotten-Modells oder eines athymischen Ratten-Femur-Segmentdefekt-Modells erzeugt, und das transplantierte Gerüst wird in den Defekt eingebracht. Radiographische, histologische und biochemische Analysen zeigen, dass die Differenzierung perivaskulärer Stammzellen in vivo zu einer signifikanten Knochenbildung führt. Der Hauptvorteil der Verwendung paravaskulärer Stammzellen gegenüber anderen, traditionelleren Stammzellquellen liegt darin, dass PSCs oder paravaskuläre Stammzellen eine homogenere Population darstellen, was die Reinheit der Stammzellen erhöht, die Produktion von trophischen Faktoren verbessert und möglicherweise die Knochenbildung verstärkt.Beginnen Sie mit der Herstellung eines Scaffolds gemäß der begleitenden Publikation. Bereiten Sie den Scaffold für die Implantation vor, indem Sie eine Zellsuspension hinzufügen. Verwenden Sie für die Maus-Muskel-Pouch- oder Calvaria-Defekt-Modelle eine Dichte von 250.000 Zellen pro hundert Mikrolitern nach der Anästhesie.Sechs Wochen alte skid-Mäuse mit Isofluran und Buprenorphin anästhesieren. Im Hintergliedmaßenbereich eine Standard-Betadinvorbereitung durchführen. Anschließend einen zwei Millimeter langen longitudinalen, beidseitigen Schnitt anlegen und mittels stumpfer Dissektion vier Millimeter tiefe Taschen in den Musculus biceps femoris ausarbeiten.Parallel zu der Muskel­faser sollte nur eine minimale Blutung auftreten. Setzen Sie das Implantat, das mit PSCs besiedelt ist, ein. Nähen Sie nun die über dem Muskel liegende Faszie mit einem einfachen kontinuierlichen Nahtmuster mit fünf-oh-Vicryl.Anschließend die Haut mit fünf Null Vicryl in subkutikulärer Nahttechnik verschließen. Postoperativ die Tiere 48 Stunden lang mit Buprenorphin und 10 Tage lang mit T-M-P-S-M-X behandeln. Die Maus sollte am ersten postoperativen Tag mühelos laufen können.Nach Isofluran-Narkose eines 12 bis 14 Wochen alten Skid-Maus. Bereiten Sie den kranialen Bereich mit einer Standard-Betadine-Lösung vor. Beginnen Sie mit einem acht Millimeter langen Hautschnitt entlang der mittleren sagittalen Naht des Schädeldaches der Maus.Entfernen Sie anschließend vorsichtig das kalvarielle Periost mit einem Wattestäbchen und tupfen Sie die Blutung mit einem weiteren Wattestäbchen ab. Erzeugen Sie nun mithilfe eines diamantbeschichteten Trepanbohrers, der an einen Hochgeschwindigkeits-Zahnbürstgerät angeschlossen ist, einen vier Millimeter großen Defekt im Parietalknochen. Der Defekt sollte die volle Knochendicke umfassen, also vollständig durch den Knochen hindurchgehen, wobei jedoch äußerste Vorsicht geboten ist, um die darunterliegende Dura mater nicht zu verletzen, da dies die Heilung beeinträchtigen würde.Platzieren Sie nun vorsichtig das Implantat, das mit PSCs transplantiert wurde, an der Defektstelle. Schließen Sie die Haut abschließend mit sechs Vicryl-Nähten. Behandeln Sie die Tiere postoperativ 48 Stunden lang mit Buprenorphin und 10 Tage lang mit T-M-P-S-M-X.Beginnen Sie mit dem Abschaben und Präparieren des Femurs einer 12 bis 14 Wochen alten amischen Ratte, die mit Isofluran anästhesiert wurde. Wenden Sie den Standard-Betadine-Protokoll an. Führen Sie einen 27 bis 30 Millimeter langen Längsschnitt an der anterolateralen Seite des Femurs durch.Als Nächstes wird der Femurschaft freigelegt, indem die Muskeln Musculus vastus lateralis und Musculus biceps femoris getrennt werden, um übermäßige Blutungen zu vermeiden. Achten Sie auf die großen Blutgefäße. Um die Konsistenz der Knochenregeneration zu maximieren, vollständig.Entfernen Sie das Periost, das den femoralen Defekt und das resezierte Femursegment überlagert. Vermeiden Sie eine Schädigung des Nervus femoralis, um neurologische Schäden zu verhindern. Legen Sie nun eine Polyethylenplatte auf die anterolaterale Oberfläche des Femurs.Sechs vorgebohrte Löcher in der Platte nehmen Kirschner-Drähte mit einem Durchmesser von 0,9 Millimeter auf. Unter Verwendung der Platte als Schablone wurden sechs Gewinde-Kirschner-Drähte durch die Platte und beide Kortikalis-Schichten gebohrt. Mit einer kleinen oszillierenden Sägeblattführung wird ein sechs Millimeter langer Defekt in der Mitte angelegt.Danach das PSC und den transplantierten Scaffhold in den Defekt einsetzen. Die überliegende Muskulatur und Faszie mit vier Vicryl-Resorptionsnähten verschließen. Um die Implantatfixierung sicherzustellen, dem Tier zwei Tage postoperativ Analgetika verabreichen und es über vier Wochen nach der Implantation in die Muskelhöhle hinweg auf eine Wunddehiszenz überwachen.Es zeigte sich ein allmählicher Anstieg des Knochenvolumens und der Knochendichte, wie mittels Mikro-CT- und Röntgenanalysen über einen Zeitraum von acht Wochen nach Erzeugung eines kalvarialen Defekts beobachtet wurde. Ohne Gerüst wurde aufgrund der kritischen Größe des Defekts keine Knochenheilung beobachtet, ebenso wenig mit Gerüst, aber ohne Zellen. Eine geringe Heilung von etwa 20 % wurde wie erwartet festgestellt. Mit einem besiedelten Gerüst zeigte sich eine allmähliche Zunahme der Defektausscheidung.Die Hauptossifikation erfolgte innerhalb von zwei Wochen. Acht Wochen nach Einbringen eines femoralen Defekts war die vollständige Ossifikation abgeschlossen. Bei Behandlung des Defekts mit BMP zwei zeigte sich bereits vier Wochen nach Behandlung ein allmählicher Anstieg der Ossifikation, wobei bei einigen Tieren die Konsolidierung beobachtet wurde; nach acht Wochen waren alle Tiere verheilt.Im Gegensatz dazu wurde weder ohne Gerüst noch mit einem Gerüst ohne Zellen oder rekombinantes Protein eine Knochenheilung beobachtet. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie eine gute Vorstellung davon haben, wie man paravaskuläre Stammzellen isoliert, wie man diese anschließend in Kombination mit osteoinduktiven PLGA-Gerüsten verwendet und schließlich, wie man diese kombinierten Gerüst- und Zellprodukte für drei verschiedene Methoden des Gewebeengineerings anwendet. Bei dem Versuch, jedes Verfahren wie hier dargestellt durchzuführen, gibt es einige Punkte, die es zu beachten gilt. Erstens ist bei dem Kalottendefektmodell die exakte Erhaltung der Dura mater entscheidend, um eine ordnungsgemäße Heilung sicherzustellen.Zweitens ist es beim Ratten-Femur-Segmentdefektmodell wichtig, das Trauma für die umliegenden Nerven und Blutgefäße zu minimieren. Sobald eine Person eine bestimmte chirurgische Technik wie hier dargestellt beherrscht, kann man erwarten, dass jede Implantation in die Muskelhülle etwa 20 Minuten in Anspruch nimmt und jedes kalvariale Defekt sowie jedes femorale Segmentdefekt bis zu 30 Minuten benötigt, um ordnungsgemäß durchgeführt zu werden.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung von Fettgewebe gewonnen Stromazellen aus lipoaspirate und die Schaffung einer 4 mm kritische Größe Calvaria Defekt Skelett Regeneration zu bewerten.

Reparatur eines Critical-sized Calvaria Defect Modells mit aus Fettgewebe gewonnenen Stromazellen aus Lipoaspirate Geerntet

Mesenchymale Stammzellen (MSCs) haben ein Differenzierungspotenzial in Richtung osteoblastischer Linie, wenn sie mit löslichen Faktoren oder spezifischen Biomaterialien stimuliert werden. Diese Arbeit stellt eine neuartige Option für die Verabreichung von MSCs aus der humanen Amnionmembran (AM-hMSCs) vor, die die bovine Knochenmatrix Nukbone (NKB) als Gerüst verwendet.

Isolierung von humanen mesenchymalen Stammzellen und deren Anbau an der porösen Knochenmatrix

Menschliche Herzgewebe birgt multi perivaskuläre Vorläuferzellpopulationen, die für myokardiale Regeneration geeignet sein können. Die hier beschriebene Technik ermöglicht die gleichzeitige Isolierung und Reinigung von zwei multi stromalen Zellpopulationen , die mit nativem Blutgefäße, dh CD146 + CD34 - Perizyten und CD34 + CD146 - Adventitia - Zellen aus dem menschlichen Herzmuskel.

Isolierung von Perivaskuläre multipotenten Vorläuferzellpopulationen aus menschlichem Herzgewebe

Die Kultivierung von humanen mesenchymalen Stromazellen (hMSCs) mit autologem Serum, reduziert das Risiko der Abstoßung durch xenogene Material und andere negative Auswirkungen. Es ermöglicht auch die Rückgewinnung von einer Untergruppe von mesodermalen Vorläufern, die frische hMSCs liefern kann. hMSCs in einem Eigen Fibringerinnsels Einbetten ermöglicht eine einfache Handhabung und effektive chirurgische Implantation.

Mesenchymale Stromazellen Zellkultur und Lieferung in Autologe Bedingungen: Ein intelligenter Ansatz für orthopädische Anwendungen

Aus Fett gewonnene Stromazellen können nützlich sein, um neues Gewebe aus den eigenen Zellen eines Patienten zu züchten. Wir präsentieren ein Protokoll für die Isolierung einer Subpopulation von humanen Fettgewebe-abgeleiteten Stromazellen (ASCs) mit erhöhtem osteogenem Potenzial, gefolgt von der Anwendung der Zellen in einem in vivo Kalvarienberg-Heilungsassay.

Schnelle Isolierung von BMPR-IB + Fettgewebe gewonnene Stromazellen für die Verwendung in einem Schädeldachdefektheilung Modell

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Blutgefäß Bildung in Vivo zu visualisieren und in Echtzeit in 3D Gerüste multiphoton Mikroskopie. Angiogenese in gentechnisch veränderten Gerüste wurde in einem murinen calvarial kritische Knochen-defekt-Modell untersucht. Mehr neue Blutgefäße waren in der Behandlungsgruppe als Kontrollen erkannt.

Visualisierung von Angiogenese durch Multiphoton Mikroskopie In Vivo in gentechnisch veränderten 3D-PLGA/nHAp Gerüst für Calvarial kritische Knochen defekt Reparatur

Eine Methode zum Erstellen und Lebendigen von verschiedenen humanisierten Knochenmarknischen in Mäusen wird vorgestellt. Basierend auf der unterstützenden Nische, die durch menschliche mesenchymale Zellen erzeugt wird, induziert die Zugabe von menschlichen Endothelzellen die Bildung von menschlichen Gefäßen, während die Zugabe von rhBMP-2 die Bildung von menschlichem Maus-chimären reifen Knochengewebe induziert.

Bioengineering von humanisierten Knochenmark-Mikroumgebungen in der Maus und ihre Visualisierung durch Live Imaging

Wir präsentieren Ihnen ein Protokoll, um die mRNA Ausdruck Biomarker der Knochenhaut-abgeleitete Zellen (PDCs) durch Vitamin C (Vitamin C) und 1,25-Dihydroxy Vitamin D [1,25-(OH)2D3] induzierte untersuchen. Darüber hinaus bewerten wir die Fähigkeit des PDCs, in Osteozyten, Chondrozyten und Adipozyten differenzieren.

Isolierung von mesenchymalen Stammzellen aus menschlichen alveoläre Periost und Effekte von Vitamin D auf knochenbildenden Aktivität Periost-abgeleitete Zellen

Die Knochentherapie über endochondrale Ossifikation durch Implantation von künstlichem Knorpelgewebe aus mesenchymalen Stammzellen hat das Potenzial, die Nachteile konventioneller Therapien zu umgehen. Hyaluronsäure-Hydrogele sind wirksam bei der Skalierung gleichmäßig differenzierter Knorpeltransplantate sowie bei der Schaffung von integriertem Knochen mit Vaskularisierung zwischen fusionierten Transplantaten in vivo.

Integrierte Knochenbildung durch in vivo ennochondrale Ossifikation mit mesenchymalen Stammzellen

In dieser Arbeit etablierten wir in vivo Osteo-Organoide, die durch knochenmorphogenetische Protein-2-beladene Gelatinegerüste ausgelöst wurden, um therapeutische hämatopoetische Stamm-/Vorläuferzellen für die Rekonstruktion eines geschädigten hämatopoetischen und Immunsystems zu gewinnen. Insgesamt kann dieser Ansatz eine vielversprechende Zellquelle für Zelltherapien darstellen.

In-vivo-Osteo-Organoid-Ansatz zur Gewinnung therapeutischer hämatopoetischer Stamm-/Vorläuferzellen

Erfahren Sie die Isolation perivaskulärer Stammzellen aus Fettgewebe mittels FACS für die Knochenregeneration. Diese Methode zeigt vollständige Ossifikation innerhalb von acht Wochen in vivo.

Verwenden Sie für Menschenrechte Perivaskuläre Stammzellen für die Knochenregeneration

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