Name: Morphologische Analyse Drosophila Larven peripheren sensorischen Neuron Dendriten und Axone mit Genetic Mosaike (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-07T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 42 s
Description: Lernen Sie die morphologische Analyse von Drosophila-Larven-Neuronen mit genetischen Mosaiken. Diese Methode ermöglicht die Visualisierung dendritischer Strukturen und axonaler Terminals durch konfokale Immunfluoreszenzmikroskopie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Die Autoren danken RIKEN für die Finanzierung. Wir danken auch Cagri Yalgin, Caroline Delandre und Jay Parrish für Diskussionen über genetische und Immunhistochemie-Protokollen.

1.Vorbereitung von Reagenzien <ol><li> Bereiten Ca + +-freien HL3.1 Kochsalzlösung 28. <ol><li> In mM: 70 NaCl, 5 KCl, 20 MgCl 2, 10 NaHCO 3, 5 HEPES, 115 Saccharose und 5 Trehalose; pH 7,2. Filter sterilisieren und lagern bei 4 ° C. Hinweis: Ca + +-freier Lösung verhindert Muskelkontraktion beim Präparieren. </li></ol></li><li> Machen Poly-L-Lysin (PLL) Deckgläser. <ol><li> Lösen 100mg PLL in 4.2ml Wasser und machen 300μl Aliquots in Eppendorf-Röhrchen und bei -20 ° C. </li><li> Vor der Beschichtung Deckgläser zunächst Tauwetter ein Aliquot, bringen Sie es bis zu 10ml in ddH 2 O, und fügen Sie 20 &amp;mgr; l von Kodak Photo-Flo; die endgültige PLL-Konzentration liegt bei 0,7 mg / ml. </li><li> Tauchen Deckgläser für 30 Minuten in PLL-Lösung, zu entfernen und trocken, dann kurz mit Wasser abspülen und trocknen. Zweimal wiederholen. Behandelte Deckgläser dauern ca. 1 Monat. </li></ol></li></ol> 2. Genetische Kreuzungen <ol><li> To generieren MARCM Klone. Hier ist ein Beispiel Kreuz mit einem pan-DA Fahrer 11,27: FRT2A x hsFLP; Gal4 109 (2) 80, UAS-mCD8:: GFP; Wanne-GAL80 FRT2A/SM5-TM6B </li><li> Zur Erzeugung von Flp-out-Klone. Hier ist ein Beispiel Kreuz mit einem Klasse IV-spezifische Treiber 8: ppk-Gal4 x yw, hsFLP; UAS-FRT-CD2, y +-stop-FRT-mCD8:: GFP </li></ol> 3. Sammlung von Embryonen <ol><li> Keep Drosophila Kreuze in einer Sammlung Flasche bei 25 ° C und sammeln Embryonen auf einem Apfelsaft-Agar Platte 29 verteilt mit einer dünnen Schicht von Hefepaste 30,31. </li></ol> 4. Hitze-Schock-Behandlung von Embryonen <ol><li> Stellen Sie eine leere Platte im Gegensatz zum Apfelsaft-Agar-Platte, auf der die Embryonen gelegt worden. Seal um diese beiden Platten mit Parafilm (Abb. 2). </li><li> Während Hitzeschockprotein, tauchen the Platte in das Wasserbad und halten Sie ihn mit dem Metall Gewicht. </li><li> Für MARCM Embryonen <ol><li> Sammeln Embryonen für 2h und inkubieren in einer 10cm Petrischale umgeben von feuchten Gewebe bei 25 ° C für eine zusätzliche 2h. Hinweis: Einstellung des Hitzeschock-Protokoll verändert die Frequenz, bei der Klone generiert werden. </li><li> Für eine kleinere Anzahl von Klonen, mit dem Ziel für einzelne isolierte Nervenzellen, tauchen und Hitzeschock im Wasserbad für 1 Stunde bei 38 ° C. </li><li> Für eine größere Anzahl von Klonen Hitzeschock für 45 Minuten bei 38 ° C, bei RT 30 Minuten, dann Hitzeschock wieder erholen für einen zusätzlichen 30 Minuten. </li></ol></li><li> Sammeln Flp-out Embryonen für 24 Stunden und Hitzeschock für 1h bei 38 ° C. </li></ol> 5. Screening nach Klonen <ol><li> Nach Hitzeschock, entfernen Sie den Deckel des Wasser-dichte Anordnung und Ort der Apfelsaft-Agar-Platte in eine 10 cm Petrischale mit angefeuchteten Gewebe umgeben. Kultur der Embryonen und Larven anschließende bei 25 ° C bis zu wandernIng. 3 rd instar. Hinweis: Kulturbedingungen, insbesondere Ernährung, haben gezeigt, dass DA dendritischen Dorn Morphologie 32,33 zu ändern. Stellen Sie sicher, dass wachsenden Larven Zugang zu Hefepaste zu allen Zeiten; überwachen und füllt die Hefepaste wie erforderlich. </li><li> Von diesem Zeitpunkt an das Protokoll ab, manipulieren Larven vorsichtig mit einer Pinzette Insekten. </li><li> Kurz und sanft spülen die Larven in Leitungswasser, und platzieren Sie dann auf eine Agarplatte. Hinweis: Dieser Schritt reduziert Hintergrundgeräusche Autofluoreszenz aus der Nahrung oder Schmutz auf der Oberfläche Larven. </li><li> Untersuchen Sie die Larven unter einem starken Fluoreszenz Präpariermikroskop. Identifizieren Larven mit GFP-positive Neurone / Zellen im Körper Wand. </li></ol> 6. In-vivo-Bildgebung von Dendriten <ol><li> Legen Sie die Larve in eine Depression Objektträger mit einem kleinen Tropfen von 80% Glycerin. Legen Sie ein Deckglas auf dem Objektträger um die Larve zu immobilisieren. Stellen Sie sicher, dass keine Luft zwischen der Larve und die coversli bleibtSeite </li><li> Schieben Sie das Deckglas auf die Larve Rolle der Visualisierung des Neurons von Interesse erlauben. Bild der mCD8:: GFP-markierten dendritischen Dorn über die konfokale Mikroskopie. </li></ol> 7. Larven Dissektion Beachten Sie vor Beginn: DA Neuron Dendriten verschlechtern sich rasch nach Beginn der Dissektion. Dissect jede einzelne Larve in weniger als 5min zum guten Dendriten Morphologie gewährleisten. <ol><li> Dissect wandernde 3 rd Larvenstadium auf einem Sylgard Platte wie zuvor 34 mit den folgenden Modifikationen: <ol><li> Für die Darstellung von DA Neuron Axon-Termini, sicherzustellen, dass das ZNS intakt ist und der segmentalen Nerven sind nicht kaputt. Nach dem Öffnen der Larven, zunächst vorsichtig schneiden die Tracheal-Verbindungen, um den Körper Wand und dann vorsichtig die gesamte Darm. </li><li> Wenn die Abbildung der Dendriten allein, entfernen Sie das ZNS zu erlauben eine flachere Montage. </li></ol></li></ol> 8. Fixation und Sperrung von Larven Filets <ol><li> Mit der Larve noch auf die Platte Sylgard merken, fix it in 4% PFA in PBS für 20 Minuten bei RT auf einem sanft rotierenden Schüttler. </li><li> Entfernen Spuren von Larven Gewebe (fat Körper, Luftröhre, etc.) nach der Fixierung. </li><li> Wash in PBST (PBS mit 0,1% Triton X-100) 3x 10 Minuten auf dem Sylgard Platte und Shaker. Wenn die Prüfung Axon-Termini, halten Sie das Filet auf dem Teller Sylgard. (Wenn Färbung Dendriten ist es möglich, die Larven Filets auf einem 0,5 ml Röhrchen füllen bei diesem Schritt 34) </li><li> Blockieren Sie die Larven für 20 Minuten bei RT in 5% normalem Esel-Serum (NDS) in PBST auf einem Schüttler. </li></ol> 9. Die Färbung der Larven Filets <ol><li> Blocking-Lösung und Inkubation in Primärantikörper (in 5% NDS / PBST) über Nacht bei 4 ° C in einer kleinen Tupperdose, umgeben von feuchten Gewebe. </li><li> Entfernen Sie die Rohre von 4 ° C inkubieren eine weitere Stunde bei RT. </li><li> Wash 6x 10 Minuten in PBST. Fügen Sie den sekundären antibOdy (in 5% NDS / PBST) und Abdeckung, um zu verhindern Fluorophor Photobleaching 34. </li><li> Inkubieren entweder bei RT für 2 Stunden oder über Nacht bei 4 ° C eine Stunde bei RT folgten. </li><li> Waschen Sie die Larven 6x 10 Minuten in PBST und fahren Sie mit Montage. </li></ol> 10. Montage der Larven Filets für die Prüfung der Dendriten Laube <ol><li> Montieren Sie je Larven Filet so flach wie möglich mit Sezieren einer Schere oder einem Skalpell den Kopf abzuschlagen (einschließlich der Mund Haken) und der hintere (einschließlich der Luftlöcher) 34. </li><li> Setzen Sie den Larven Filet auf der Folie Nagelhaut-Seite nach unten, in 80% Glycerin montieren und Dichtung den Seiten des Deckglases mit Nagellack für einen "schnellen" Halterung 34. </li><li> Für eine dauerhafte Befestigung und ein klareres Bild <ol><li> Setzen Sie den sezierten Larven Filet Muskel-Seite nach unten auf einen Tropfen PBS auf eine PLL Deckglas, wird es schnell zu dem Deckglas haften. </li><li> Entfernen Sie so viel Flüssigkeit wie möglich nach der Montage, however nicht lassen Sie es vollständig trocknen. </li><li> Nehmen Sie das Deckglas (mit angeschlossenem Larven Filet) durch eine Ethanol-Serie: 35% Ethanol, 50%, 70%, 95%, und schließlich 2x 100% Ethanol für jeweils 10 Minuten (2. 100% EtOH Lösung häufig geändert werden soll, gefolgt ), und schließlich, waschen 2-3x 10 Minuten in Xylol. </li><li> Gib einen Tropfen des DPX Deckfluessigkeit (Distyrene Weichmacher Xylol) auf einen sauberen Objektträger und legen Sie es vorsichtig Deckglas Filet-side-down an der Spitze. Halten Sie in der Dunkelheit, und warten Sie einen Tag für die DPX vor Bildgebung gesetzt. </li></ol></li></ol> 11. Montage der Larven Filets für die Prüfung der Axon-Termini <ol><li> Halten Sie die segmentalen Nerven, die zwischen den PNS und ZNS intakt während der Präparation, Fixierung und Färbung, damit die Verfolgung der Axone von peripheren sensorischen Neuronen Zellkörper zu den VNC. </li><li> Montieren Sie je Larven Filet Nagelhaut-Seite nach unten in 80% Glycerin in eine Depression gleiten. Verfolgen Sie die Axone aus der DA Zellkörper zu denVNC unter dem konfokalen Mikroskop. Hinweis: PNS Neuronen in jeder Körperzelle Wandsegment Projekt auf die verwandten Segment des VNC. </li></ol> 12. Repräsentative Ergebnisse: Repräsentative Ergebnisse sind in den Abbildungen 3-5 dargestellt. Abb.. 3 zeigt die ganze Laube einer Klasse IV da Neuron, in vivo unter dem konfokalen Mikroskop aufgenommen. Abb.. 4 zeigt eine Nahaufnahme eines Teils des Dendriten Laube eines immunhistochemisch markierten Klasse III Neuron, das richtig ist fest mit der Morphologie erhalten. Die zugehörigen Einschub zeigt die Erniedrigung, die nach einem erfolglosen Dissektion und Fixierung (beide gefärbt mit anti-GFP-Antikörper) auftreten können. Abb.. 5 zeigt eine einzelne Klasse IV Axon-Terminus in das ZNS (anti-GFP, grün), alle Klasse IV Termini sind mit anti-CD2 (magenta) co-gefärbt. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/3111/3111fig1.jpg"> Abbildung 1 Protocol Überblick. a) Sammeln und dann Hitzeschock-Embryonen. b) Wählen Sie eine Larve mit einem GFP-positive DA Neuron zu klonen, und dann Bild der GFP-markierten Dendriten Laube in der Live-Larve. c) Präparieren Sie die Larve, und dann immunhistochemisch färben das Filet. d) Montieren Sie die Kirchenfenster Filet, und dann Bild der dendritischen Dorn und axonalen Projektionen der DA Neuron Klone. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/3111/3111fig2.jpg"> Abbildung 2: Herstellung von Apfelsaft-Agar-Platte für Hitzeschock. Nehmen Sie die Platte (weißer Pfeil, ab), fügen Sie eine zweite Petrischale auf (roter Pfeil b) und Dichtung um mit Parafilm (blauer Pfeil, b). <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/3111/3111fig3.jpg"> Abbildung 3 in vivo Bild des Dendriten Laube eines mCD8:: GFP-markierten MARCM clone (Genotyp in 2,1), die eine Klasse IV (v'ada) Neuron einer 3 rd instar Larve. Scale-Bar ist 50 um. d/3111/3111fig4.jpg "/&gt; Abbildung 4 mCD8:: GFP-markierten MARCM Klon eines Klasse-III-Neuron (ddaa) mit anti-GFP Antikörper gefärbt und zeigt gute Morphologie nach einer erfolgreichen Präparation und Befestigung (grün). Der Einschub zeigt Dendriten Abbau (weiße Pfeile), die nach erfolglosen Dissektion und Fixierung (magenta). Scale-Bar ist 25 um. <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/3111/3111fig5.jpg"> Abbildung 5 Die 3. Larvenstadium Larven VNC. Eine Flp-out-Klon aus einer einzigen Klasse VI (VDAB) Axon-Terminus (Genotyp in 2,2) wird unter Verwendung anti-GFP-Antikörper (grün). Anti-CD2 Etiketten aller Klasse IV Termini (magenta). Scale-Bar ist 25 um.

<ol><li>Grueber, W. B., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tiling+of+the+Drosophila+epidermis+by+multidendritic+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Tiling of the Drosophila epidermis by multidendritic sensory neurons.</a> Development. 129, 2867-2878 (2002).</li>
<li>Crozatier, M., Vincent, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+multidendritic+neuron+differentiation+in+Drosophila%3A+the+role+of+Collier%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Control of multidendritic neuron differentiation in Drosophila: the role of Collier.</a> Dev Biol. 315, 232-242 (2008).</li>
<li>Hattori, Y., Sugimura, K., Uemura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+expression+of+Knot%2FCollier%2C+a+transcriptional+regulator+of+the+EBF%2FOlf-1+family%2C+endows+the+Drosophila+sensory+system+with+neuronal+class-specific+elaborated+dendritic+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Cells%22%5BJournal%5D)">Selective expression of Knot/Collier, a transcriptional regulator of the EBF/Olf-1 family, endows the Drosophila sensory system with neuronal class-specific elaborated dendritic patterns.</a> Genes Cells. 12, 1011-1022 (2007).</li>
<li>Jinushi-Nakao, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Knot%2FCollier+and+cut+control+different+aspects+of+dendrite+cytoskeleton+and+synergize+to+define+final+arbor+shape%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Knot/Collier and cut control different aspects of dendrite cytoskeleton and synergize to define final arbor shape.</a> Neuron. 56, 963-978 (2007).</li>
<li>Sugimura, K., Satoh, D., Estes, P., Crews, S., Uemura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+morphological+diversity+of+dendrites+in+Drosophila+by+the+BTB-zinc+finger+protein+abrupt%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Development of morphological diversity of dendrites in Drosophila by the BTB-zinc finger protein abrupt.</a> Neuron. 43, 809-822 (2004).</li>
<li>Li, W., Wang, F., Menut, L., Gao, F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BTB%2FPOZ-zinc+finger+protein+abrupt+suppresses+dendritic+branching+in+a+neuronal+subtype-specific+and+dosage-dependent%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">BTB/POZ-zinc finger protein abrupt suppresses dendritic branching in a neuronal subtype-specific and dosage-dependent.</a> 43, 823-834 (2004).</li>
<li>Zlatic, M., Landgraf, M., Bate, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+specification+of+axonal+arbors%3A+atonal+regulates+robo3+to+position+terminal+branches+in+the+Drosophila+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Genetic specification of axonal arbors: atonal regulates robo3 to position terminal branches in the Drosophila nervous system.</a> Neuron. 37, 41-51 (2003).</li>
<li>Grueber, W. B., Ye, B., Moore, A. W., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendrites+of+distinct+classes+of+Drosophila+sensory+neurons+show+different+capacities+for+homotypic+repulsion%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Dendrites of distinct classes of Drosophila sensory neurons show different capacities for homotypic repulsion.</a> Curr Biol. 13, 618-626 (2003).</li>
<li>Grueber, W. B., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+levels+of+the+homeodomain+protein+cut+regulate+distinct+dendrite+branching+patterns+of+Drosophila+multidendritic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Different levels of the homeodomain protein cut regulate distinct dendrite branching patterns of Drosophila multidendritic neurons.</a> Cell. 112, 805-818 (2003).</li>
<li>Moore, A. W., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((hamlet%2C+a+binary+genetic+switch+between+single-+and+multiple-+dendrite+neuron+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">hamlet, a binary genetic switch between single- and multiple- dendrite neuron morphology.</a> Science. 297, 1355-1358 (2002).</li>
<li>Gao, F. B., Brenman, J. E., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+regulating+dendritic+outgrowth%2C+branching%2C+and+routing+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Genes regulating dendritic outgrowth, branching, and routing in Drosophila.</a> Genes Dev. 13, 2549-2561 (1999).</li>
<li>Corty, M. M., Matthews, B. J., Grueber, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecules+and+mechanisms+of+dendrite+development+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Molecules and mechanisms of dendrite development in Drosophila.</a> Development. 136, 1049-1061 (2009).</li>
<li>Moore, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+mechanisms+to+define+neuron+class-specific+dendrite+arbor+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Adh.+Migr%22%5BJournal%5D)">Intrinsic mechanisms to define neuron class-specific dendrite arbor morphology.</a> Cell Adh. Migr. 2, 81-82 (2008).</li>
<li>Hughes, C. L., Thomas, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensory+feedback+circuit+coordinates+muscle+activity+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A sensory feedback circuit coordinates muscle activity in Drosophila.</a> Mol. Cell. Neurosci. 35, 383-396 (2007).</li>
<li>Nishimura, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+of+Behaviors+and+Segmental+Coordination+During+Larval+Locomotion+Is+Disrupted+by+Nuclear+Polyglutamine+Inclusions+in+a+New+Drosophila+Huntington%27s+Disease-Like+Model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurogenet%22%5BJournal%5D)">Selection of Behaviors and Segmental Coordination During Larval Locomotion Is Disrupted by Nuclear Polyglutamine Inclusions in a New Drosophila Huntington's Disease-Like Model.</a> J Neurogenet. 24, 194-206 (2010).</li>
<li>Song, W., Onishi, M., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+multidendritic+sensory+neurons+are+necessary+for+rhythmic+locomotion+behavior+in+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Peripheral multidendritic sensory neurons are necessary for rhythmic locomotion behavior in Drosophila larvae.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104, 5199-5204 (2007).</li>
<li>Hwang, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nociceptive+neurons+protect+Drosophila+larvae+from+parasitoid+wasps%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Nociceptive neurons protect Drosophila larvae from parasitoid wasps.</a> Curr Biol. 17, 2105-2116 (2007).</li>
<li>Xiang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-avoidance-mediating+photoreceptors+tile+the+Drosophila+larval+body+wall%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Light-avoidance-mediating photoreceptors tile the Drosophila larval body wall.</a> Nature. 468, 921-926 (2010).</li>
<li>Cheng, L. E., Song, W., Looger, L. L., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+TRP+channel+NompC+in+Drosophila+larval+and+adult+locomotion%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The role of the TRP channel NompC in Drosophila larval and adult locomotion.</a> Neuron. 67, 373-380 (2010).</li>
<li>Babcock, D. T., Landry, C., Galko, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokine+signaling+mediates+UV-induced+nociceptive+sensitization+in+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Cytokine signaling mediates UV-induced nociceptive sensitization in Drosophila larvae.</a> Curr Biol. 19, 799-806 (2009).</li>
<li>Hafer, N., Schedl, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+Larval+CNS+in+Drosophila+Melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Dissection of Larval CNS in Drosophila Melanogaster.</a> J. Vis. Exp. (1), e85-e85 (2006).</li>
<li>Grueber, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Projections+of+Drosophila+multidendritic+neurons+in+the+central+nervous+system%3A+links+with+peripheral+dendrite+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Projections of Drosophila multidendritic neurons in the central nervous system: links with peripheral dendrite morphology.</a> Development. 134, 55-64 (2007).</li>
<li>Merritt, D. J., Whitington, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+projections+of+sensory+neurons+in+the+Drosophila+embryo+correlate+with+sensory+modality%2C+soma+position%2C+and+proneural+gene+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Central projections of sensory neurons in the Drosophila embryo correlate with sensory modality, soma position, and proneural gene function.</a> J Neurosci. 15, 1755-1767 (1995).</li>
<li>Blair, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+mosaic+techniques+for+studying+Drosophila+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Genetic mosaic techniques for studying Drosophila development.</a> Development. 130, 5065-5072 (2003).</li>
<li>Lee, T., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+for+studies+of+gene+function+in+neuronal+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis.</a> Neuron. 22, 451-461 (1999).</li>
<li>Wong, A. M., Wang, J. W., Axel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+representation+of+the+glomerular+map+in+the+Drosophila+protocerebrum%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Spatial representation of the glomerular map in the Drosophila protocerebrum.</a> Cell. 109, 229-241 (2002).</li>
<li>Shimono, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multidendritic+sensory+neurons+in+the+adult+Drosophila+abdomen%3A+origins%2C+dendritic+morphology%2C+and+segment-+and+age-dependent+programmed+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Dev%22%5BJournal%5D)">Multidendritic sensory neurons in the adult Drosophila abdomen: origins, dendritic morphology, and segment- and age-dependent programmed cell death.</a> Neural Dev. 4, 37-37 (2009).</li>
<li>Feng, Y., Ueda, A., Wu, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+minimal+hemolymph-like+solution%2C+HL3.1%2C+for+physiological+recordings+at+the+neuromuscular+junctions+of+normal+and+mutant+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurogenet%22%5BJournal%5D)">A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae.</a> J Neurogenet. 18, 377-402 (2004).</li>
<li>Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSullivan%2C+W+%22Drosophila+Protocols%22">Drosophila Protocols</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2000).</li>
<li>Kaczynski, T. J., Gunawardena, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+the+Embryonic+Nervous+System+in+Whole-mount+Drosophila+Embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Visualization of the Embryonic Nervous System in Whole-mount Drosophila Embryos.</a> J. Vis. Exp. (46), e2150-e2150 (2010).</li>
<li>Featherstone, D. E., Chen, K., Broadie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harvesting+and+preparing+Drosophila+embryos+for+electrophysiological+recording+and+other+procedures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Harvesting and preparing Drosophila embryos for electrophysiological recording and other procedures.</a> J Vis Exp. , (2009).</li>
<li>Medina, P. M., Swick, L. L., Andersen, R., Blalock, Z., Brenman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+forward+genetic+screen+for+identifying+mutations+affecting+larval+neuronal+dendrite+development+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A novel forward genetic screen for identifying mutations affecting larval neuronal dendrite development in Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 172, 2325-2335 (2006).</li>
<li>Mirouse, V., Swick, L. L., Kazgan, N., St Johnston, D., Brenman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LKB1+and+AMPK+maintain+epithelial+cell+polarity+under+energetic+stress%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">LKB1 and AMPK maintain epithelial cell polarity under energetic stress.</a> J Cell Biol. 177, 387-392 (2007).</li>
<li>Brent, J., Werner, K., McCabe, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+Larval+NMJ+Immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Drosophila Larval NMJ Immunohistochemistry.</a> J. Vis. Exp. 25, e1108-e1108 (2009).</li>
<li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118, 401-415 (1993).</li>
<li>Sugimura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+developmental+modes+and+lesion-induced+reactions+of+dendrites+of+two+classes+of+Drosophila+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Distinct developmental modes and lesion-induced reactions of dendrites of two classes of Drosophila sensory neurons.</a> J Neurosci. 23, 3752-3760 (2003).</li>
<li>Zito, K., Parnas, D., Fetter, R. D., Isacoff, E. Y., Goodman, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Watching+a+synapse+grow%3A+noninvasive+confocal+imaging+of+synaptic+growth+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Watching a synapse grow: noninvasive confocal imaging of synaptic growth in Drosophila.</a> Neuron. 22, 719-729 (1999).</li>
<li>Landgraf, M., Sanchez-Soriano, N., Technau, G. M., Urban, J., Prokop, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Charting+the+Drosophila+neuropile%3A+a+strategy+for+the+standardised+characterisation+of+genetically+amenable+neurites%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Charting the Drosophila neuropile: a strategy for the standardised characterisation of genetically amenable neurites.</a> Dev Biol. 260, 207-225 (2003).</li>
</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Die Drosophila Larve DA Neuronenmodell liefert eine hervorragende genetische System von Mechanismen zu untersuchen, dass die Kontrolle Neuron Morphologie und Schaltung Bildung. MARCM ist in der Regel für die Kennzeichnung und zur Erzeugung von Mutanten DA Neuron Klone verwendet. Für MARCM wir verwenden entweder eine pan-neuronalen (zB Gal4 C155) oder DA Neuronen-spezifische Treiber. Mit einem pan-neuronaler Fahrer ist es möglich, direkt zu verwenden mehrere Bestände weit aus öffentli...

<table border="1"><tr><th> Name des Reagenzes </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th><th> Kommentare (optional) </th></tr><tr><td> SZX16 Fluoreszenz Dissektionsmikroskop (mit GFPHQ Filter) </td><td> Olymp </td><td> SZX16 </td><td></td></tr><tr><td> Live-Insect Zange </td><td> FST </td><td> 26030-10 </td><td></td></tr><tr><td> 26mm x 76mm Depression Objektträger </td><td> Toshinriko Co. </td><td> T8-R004 </td><td></td></tr><tr><td> Sylgard 184 (oder Silpot 184) </td><td> Dow Corning </td><td> 3097358-1004 </td><td></td></tr><tr><td> Poly-L-Lysin </td><td> Sigma </td><td> P-1524 </td><td> Dieses Produkt hat sich als am effektivsten </td></tr><tr><td> DPX Eindeckmedium </td><td> Sigma </td><td> 44581 </td><td></td></tr><tr><td> Rabbit anti-GFP </td><td> Invitrogen </td><td> A-11122 </td><td> Verdünnung 1:500 </td></tr><tr><td> Rat anti-CD8 </td><td> Caltag </td><td> 5h10 </td><td> Verdünnung 1:200 </td></tr><tr><td> Maus anti-CD2 </td><td> AbD serotec </td><td> MCA443R </td><td> Verdünnung 1:700 </td></tr><tr><td> Maus anti-Fasciclin2 </td><td> DSHB </td><td> 1D4 </td><td> Verdünnung 1:10 </td></tr></table>

morphologische analyse drosophila larven peripheren sensorischen neuron dendriten und axone mit genetic mosaike

Morphological Analysis of Drosophila Larval Peripheral Sensory Neuron Dendrites and Axons Using Genetic Mosaics

Entwicklung des Nervensystems erfordert die korrekte Spezifikation der Neuron Position und Identität, durch genaue Neuron-Klasse-spezifische dendritische Entwicklung und axonalen Verdrahtung gefolgt. Vor kurzem hat die dendritische Verzweigung (DA) sensorischen Neuronen der Drosophila Larve peripheren Nervensystem (PNS) haben sich leistungsfähige genetische Modelle, in denen sowohl allgemeine und Klassen-spezifische Mechanismen der neuronalen Differenzierung aufzuklären. Es gibt vier Haupt-DA Neuron Klassen (I-IV) 1. Sie sind in der Reihenfolge zunehmender Dendriten Laube Komplexität, benannt und haben klassenspezifische Unterschiede in der genetischen Kontrolle ihrer Differenzierung 2-10. Die DA sensorischen Systems ist ein praktisches Modell, um die molekularen Mechanismen hinter der Kontrolle von dendritischen Morphologie 11-13 zu untersuchen, weil: 1) es Vorteile der leistungsstarken genetischen Werkzeuge in der Fruchtfliege, 2) nehmen die DA Neuron Dendriten Laube breitet sich aus in nur 2 Dimensionen unter einem optisch clear Larvencuticula macht es einfach, mit hoher Auflösung in vivo, 3 Visualisierung) der Klasse-spezifische Vielfalt in dendritische Morphologie erleichtert eine vergleichende Analyse zu den wichtigsten Elementen der Kontrolle der Bildung von einfachen vs stark verzweigte dendritische Bäume zu finden, und 4) dendritischen Dorn stereotypen Formen der verschiedenen DA Neuronen zu erleichtern morphometrische statistischen Analysen. DA Neuronen-Aktivität modifiziert die Ausgabe eines larvalen Fortbewegung central pattern generator 14-16. Die verschiedenen DA Neuron Klassen haben verschiedene sensorische Modalitäten und deren Aktivierung auslöst verschiedenen Verhaltensreaktionen 14,16-20. Außerdem verschiedene Klassen schicken axonalen Projektionen stereotyp in die Drosophila Larve des zentralen Nervensystems in der Bauchmark (VNC) 21. Diese Projektionen enden mit topographischen Darstellungen beider DA Neuron Sinnesmodalität und die Position in der Körperwand der dendritischen Bereich 7,22, 23. Daher Untersuchung von DA axonalen Projektionen können verwendet werden, um Mechanismen, die topographische Kartierung 7,22,23, sowie die Verkabelung einer einfachen Schaltung modulierenden Larven Fortbewegung 14-17 aufzuklären. Wir stellen Ihnen hier eine praktische Anleitung zur Generierung und Analyse genetischer Mosaike 24 Kennzeichnung DA Neuronen über MARCM (Mosaic Analyse mit einem reprimierbaren Zell Marker) 1,10,25 und Flp-out 22,26,27 Techniken (zusammengefasst in Abb. 1)..

Die dendritischen Verzweigung sensorischen Neuronen des<em&gt; Drosophila</em&gt; Larven des peripheren Nervensystems sind nützliche Modelle, um sowohl allgemeine als auch Neuron-Klasse-spezifische Mechanismen der neuronalen Differenzierung aufzuklären. Wir präsentieren eine praktische Anleitung zur Generierung und Analyse dendritischer Verzweigung Neuron genetischen Mosaiken.

Morphologische Analyse Drosophila Larven peripheren sensorischen Neuron Dendriten und Axone mit Genetic Mosaike

Die Entwicklung des Nervensystems erfordert die korrekte Spezifikation der Position und Identität von Neuronen, gefolgt von einer präzisen, neuronenklassenspezifischen dendritischen...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die detaillierte Morphologie von Drosophila-Larven-Dendritischen-Arborisierungs-Neuronen sichtbar zu machen. Dies wird erreicht, indem zunächst Embryonen gesammelt, gealtert und durch Hitzeschock-induzierte Lipase-Expression genetische Klone mit GFP-Markierung erzeugt werden. Der zweite Schritt besteht darin, Larven mit fluoreszierenden Neuronklonen auszuwählen und Bilder ihrer dendritischen ABAs aufzunehmen.Nach der Bildgebung der Larven werden diese disseziert, fixiert und immungefärbt, um sie anschließend zu präparieren und ihre dendritischen Verästelungen sowie die Morphologie der axonalen Endigungen mittels konfokaler Immunfluoreszenzmikroskopie sichtbar zu machen. Heute werde ich eine Anleitung zur morphologischen Analyse der peripheren sensorischen Organe und Axone von Sula im unteren Bereich mithilfe genetischer Mosaike demonstrieren. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der neurodevelopmentalen Forschung zu beantworten, beispielsweise welche genetischen Programme die neuronale Identität, die Form der dendritischen Äste und die äußere Verschaltung steuern.Beginnen Sie dieses Protokoll mit der Sammlung von Embryonen auf Apfelsaftplatten. Die Hitzeschockbehandlung erfolgt in einem Wasserbad bei 38 Grad Celsius, wobei die Dauer je nach der Genetik der Embryonen und der gewünschten Größe der Klone variiert. Erzeugen Sie für dieses Protokoll Markum-Klone aus Embryonen mit einem pand-Dendritischen-Arborisation-Neuronen-Treiber. Vor dem Hitzeschock lagern Sie die Marker-Embryonen zwei Stunden lang bei 25 Grad Celsius, umgeben von feuchten Tüchern.Bereiten Sie die Sammelplatten für den Hitzeschock vor, indem Sie sie mithilfe leerer Platten und Parafilm wasserdicht machen. Führen Sie dann einen Hitzeschock an den Markerembryonen für eine Stunde durch, um kleine Klone oder die Markierung einzelner Neuronen zu erzeugen. Um die Anzahl der Klone zu erhöhen, wenden Sie einen verlängerten Hitzeschock an, indem Sie 45 Minuten im Wasserbad inkubieren, gefolgt von 30 Minuten bei Raumtemperatur und anschließend weiteren 30 Minuten im Wasserbad.Um Flipout-Klone zu erzeugen, sammeln Sie Embryonen 24 kontinuierliche Stunden lang. Dieses Protokoll verwendet einen klasse-vier-spezifischen Treiber. Führen Sie eine Hitzeschockbehandlung der Flipout-Embryonen eine Stunde nach dem Hitzeschock durch.Stellen Sie die Sammelteller in eine 10 cm große Petrischale, die von feuchten Tüchern und Kultur umgeben ist. Die Embryonen werden während der Embryokultivierung bei 25 Grad Celsius überwacht, und die Hefepaste wird nach Bedarf ergänzt. Da die Ernährung die neuronale Entwicklung entscheidend beeinflusst.Kultivieren Sie die Larven, bis wandernde Larven im dritten Stadium erhältlich sind. Sammeln Sie diese kurzzeitig ein und spülen Sie die Larven im dritten Stadium vorsichtig mit Leitungswasser ab. Überführen Sie sie anschließend auf eine Agarplatte. Untersuchen Sie nun die Larven mithilfe eines leistungsstarken fluoreszenzmikroskopischen Stereomikroskops und Insektenpinzetten. Identifizieren Sie Larven mit GFP-positiven Neuronen in der Körperwand und übertragen Sie sie auf eine Objektträgermulde mit einem Tropfen 80%igem Glycerin.Platzieren Sie ein Deckglas auf dem Objektträger, um die Larve zu fixieren. Stellen Sie sicher, dass sich keine Luft zwischen der Larve und dem Deckglas befindet. Verwenden Sie eine Standard-Konfokalmikroskopie, um die Neuronen von Interesse durch die Larvenhaut sichtbar zu machen.Um die Position der Lava für einen verbesserten Betrachtungswinkel zu verändern, schieben Sie vorsichtig am Deckglas, um die Lava zu rollen. Beginnen Sie dieses Protokoll, indem Sie mithilfe von Insektenpinzetten eine Lava auf die SIL-Schutzplatte übertragen. Danach fixieren Sie sie an den vorderen und hinteren Enden mit Nadeln.Dann kalziumfreie HL-3.1-Pufferlösung hinzufügen. Schneiden Sie nun an beiden Enden der Larve entlang der anterior-posterioren Achse zur Hälfte durch. Anschließend entlang der Mittellinie zwischen den beiden Tracheen schneiden.Schneiden Sie vorsichtig jede einzelne tracheale Verbindung zur Körperwand durch, bevor Sie den Darm behutsam entfernen. Dadurch bleiben die segmentalen Nerven, die zwischen dem peripheren und dem zentralen Nervensystem verlaufen, intakt. Befestigen Sie das Larvenexemplar weiterhin an der Zellenschutzplatte und fixieren Sie es 20 Minuten lang bei Raumtemperatur in 4% Para-Formaldehyd in PBS auf einem sanft rotierenden Schüttler. Führen Sie jede Dissektion innerhalb von weniger als fünf Minuten durch.Andernfalls beginnen die Neuriten der dendritischen Autorisationsneuronen zu zerfallen. Nach der Fixierung entfernen Sie überschüssiges larvales Gewebe. Anschließend waschen Sie die Filets dreimal mit PBST, wobei jede Waschung 10 Minuten dauert.Nach den Waschschritten inkubieren Sie die Larven 20 Minuten bei Raumtemperatur in der Blockierungslösung unter leichtem Schütteln. Nach Abschluss der Blockierung ersetzen Sie die Blockierungslösung durch die Primärantikörperlösung. Geben Sie die Probe in einen kleinen Kunststoffbehälter, der mit feuchten Tüchern umgeben ist, und inkubieren Sie sie über Nacht bei vier Grad Celsius. Am nächsten Tag setzen Sie die Inkubation für eine zusätzliche Stunde bei Raumtemperatur fort.Waschen Sie den Lava-Fillet anschließend sechsmal mit PBST, jeweils 10 Minuten pro Waschgang. Geben Sie nun den sekundären Antikörper hinzu und legen Sie die Fillets in einen lichtdichten Behälter, um eine Photobleiche des Fluorophors zu verhindern. Inkubieren Sie die Fillets entweder mehrere Stunden bei Raumtemperatur oder über Nacht bei vier Grad Celsius, gefolgt von einer Stunde bei Raumtemperatur.Spülen Sie die Filets abschließend sechsmal in PBST, wobei jede Spülung 10 Minuten dauert. Die Gewebe sind dann bereit zur Einbettung. Um die Axonendigungen sichtbar zu machen, montieren Sie die larvalen Filets einfach mit der Cuticula-Seite nach unten in 80 % Glycerin auf einer Vertiefungsrutsche.Um klarere Bilder von Dendriten zu erhalten, stellen Sie eine Dauermontierung mit mit PLL beschichteten Deckgläsern her. Um die Deckgläser zu beschriften, verwenden Sie einen Aliquot von PLL. Füllen Sie es mit zweifach destilliertem Wasser auf 10 Milliliter auf und geben Sie 20 Mikroliter Kodak Photo Flow hinzu.Die Deckgläser 30 Minuten lang in der PLL-Lösung untertauchen und nach dem Herausnehmen lufttrocknen lassen. Anschließend kurz mit Wasser spülen und erneut lufttrocknen.Wiederholen Sie diesen Vorgang zweimal. Beginnend mit dem PLL-Bad halten die behandelten Deckgläser etwa einen Monat lang. Befestigen Sie nun ein präpariertes larvales Muskelpräparat mit der Muskelseite nach unten in einen Tropfen PBS auf einem PLL-Deckglas.Das Filet haftet mithilfe eines Papiertuchs schnell am Deckglas an. Entfernen Sie so viel Flüssigkeit wie möglich, lassen Sie es jedoch nicht vollständig austrocknen. Anschließend dehydrieren Sie die larvalen Filets durch eine Reihe von 10-minütigen Ethanolbädern, beginnend mit 35 % Ethanol, gefolgt von 50 %, dann 70 %, dann 95 %, dann 100 % und schließlich einem zweiten Bad mit 100 % Ethanol.Führen Sie nach den Ethanolbädern zwei oder drei Bäder mit je 10 Minuten in Xylol durch. Geben Sie dann einen Tropfen DPX auf einen sauberen Objektträger und setzen Sie vorsichtig das Deckglas in das DPX, wobei es mit der Seite nach unten platziert wird. Bewahren Sie den Objektträger im Dunkeln auf und warten Sie einen Tag, bis das DPX ausgehärtet ist.Bevor das Gewebe mittels In-vivo- und Fokalmikroskopie abgebildet wird, können Bilder wie dieses aufgenommen werden. Der gesamte Baum eines dendritischen Baums eines Neurons der Klasse vier. Dies ist eine Vergrößerung eines dendritischen Baums eines immunhistochemisch markierten Neurons der Klasse drei, das korrekt fixiert wurde, um die Morphologie zu erhalten.Die Einlage zeigt die Degradation, die nach einer erfolglosen Dissektion und Fixierung auftreten kann. Diese Überlagerung zeigt ein einzelnes Axonende der Klasse vier im ZNS. Das Axon ist mit anti-GFP in Grün markiert und alle Termiten der Klasse vier wurden zusätzlich mit anti-CD2 in Magenta gefärbt. Während des Durchführens dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, die Proben schnell zu dissezieren und zu fixieren, indem man die Axone vom Peripheren zum ZNS verfolgt. Es ist hilfreich, im Hinterkopf zu behalten, dass PNS-Neuronen in jedem Körpersegment zum entsprechenden Segment des ventralen Nervenstrangs projizieren. Außerdem, wenn Sie nur Dendriten visualisieren möchten, entfernen Sie die CNAs während der Dissektion, und die Färbung kann in anhängenden Röhrchen anstelle auf Platten durchgeführt werden.Beim Montieren dieser Filets für die Dendriten-Bildgebung zuerst den Kopf mit Mundhaken und das hintere Ende mit Glitzern abschneiden. Für eine optimale Präparation.

morphological-analysis-drosophila-larval-peripheral-sensory-neuron

Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Wir beschreiben das Verfahren zur Vorbereitung...

Visualisierung des embryonalen Nervensystems in Whole-mount Drosophila Embryos

Quelle: Ting, C., et al., Analyzing Dendritic Morphology in Columns and Layers. J. Vis. Exp. (2017)Dieses Video zeigt das Verfahren der Präparation eines Drosophila-Gehirns, der Erfassung horizontaler und frontaler Bildstapel von GFP-markierten Medulla-Dendriten unter einem konfokalen Mikroskop und der Erstellung einer 3D-Rekonstruktion, um ihre Morphologie über Schichten und Säulen hinweg zu analysieren.

Analyse der dendritischen Morphologie in Drosophila medulla-Schichten und -Säulen

Wir stellen eine Technik zur Markierung von einzelnen Neuronen im Zentralnervensystem (ZNS)...

Beschriften einzelner Zellen im zentralen Nervensystem<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Studien der neuronalen Morphogenese unter Verwendung von Drosophila Larven dendritischen arborization (da) Neuronen profitieren von in - situ - Visualisierung von neuronalen und epidermalen Proteine durch Immun. Wir beschreiben ein Verfahren, das durch Entfernen von Muskelgewebe aus der Larvenkörperwand Immunfluoreszenzanalyse von da Neuronen und die umliegenden Hautzellen verbessert.

Entfernung von<em&gt; Drosophila</em&gt; Muskelgewebe aus Larval Filets für Immunfluoreszenzanalyse von sensorischen Neuronen und epidermalen Zellen

Zwei Bildanalysealgorithmen, „Drosophila NMJ Morphometrie“ und „Drosophila NMJ Bouton Morphometrie“ wurden geschaffen, um automatisch neun morphologischen Merkmale der neuromuskulären Synapse Drosophila zu quantifizieren (NMJ).

Zwei Algorithmen für den Hochdurchsatz und Multi-parametrischer Quantifizierung<em&gt; Drosophila</em&gt; Neuromuskuläre Junction Morphology

Diese Arbeit beschreibt eine Standard-Immunhistochemie-Methode zur Visualisierung von Motor-Neuronen-Projektionen von späten Stadium-16 Drosophila Melanogaster Embryonen . Die gefilterte Präparation von festen Embryonen, die mit FasII-Antikörper gefärbt wurden, bietet ein leistungsfähiges Werkzeug, um die Gene zu charakterisieren, die für die motorische Axon-Pathfindung und die Zielerkennung während der neuronalen Entwicklung erforderlich sind.

Visualisierung des axonalen Projektionsmusters der embryonalen motorischen Neuronen in<em&gt; Drosophila</em

Dieses Protokoll beschreibt die Dissektion und Immunostaining von Erwachsenen Drosophila Melanogaster Gewebe des Gehirns. Insbesondere unterstreicht dieses Protokoll die Verwendung von Drosophila Pilz Körper und Photorezeptor Neuronen als Beispiel neuronale Teilmengen, die genau verwendet werden, um die allgemeinen Grundsätze für viele Aspekte der neuronalen Entwicklung aufzudecken.

Dissektion, Immunofluorescent Färbung der Pilz Körper und Photorezeptor Neuronen im Gehirn Erwachsener Taufliege melanogaster

Dieses Protokoll konzentriert sich auf Quantitative Analyse der neuronalen dendritischen Arborization Komplexität (NDAC) in Drosophila, die für Studien der dendritischen Morphogenese verwendet werden können.

Quantitative Analyse der neuronalen dendritischen Arborization Komplexität in Drosophila

Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Visualisierung der axonalen targeting mit ein fluoreszierendes Protein in Erwachsenen Beinen von Drosophila durch Fixierung, Montage, imaging und Post-Bildgebung Schritte.

Drosophila Bein Motoneuronen Axone durch die Erwachsenen Nagelhaut zu visualisieren

Wir beschreiben eine Methode zur retrograden Rückverfolgung der embryonalen motorischen Neuronen Von Drosophila mit lipophilen Fluoreszenzfarbstoffen.

Retrograde Tracing von Drosophila Embryonal Motor Neuronen mit lipophilen fluoreszierenden Farbstoffen

Hier stellen wir Protokolle zur Verfügung, um drei einfache verletzungsinduzierte Axondegeneration (Axontod) Assays in Drosophila melanogaster durchzuführen, um die morphologische und funktionelle Konservierung von abgetrennten Axonen und ihren Synapsen zu bewerten.

Morphologische und funktionelle Bewertung von Axonen und ihren Synapsen während des Axon-Todes bei Drosophila melanogaster

Lernen Sie die morphologische Analyse von Drosophila-Larven-Neuronen mit genetischen Mosaiken. Diese Methode ermöglicht die Visualisierung dendritischer Strukturen und axonaler Terminals durch konfokale Immunfluoreszenzmikroskopie.

Morphologische Analyse Drosophila Larven peripheren sensorischen Neuron Dendriten und Axone mit Genetic Mosaike

Weitere Videos entdecken