Morphologische Analyse Drosophila Larven peripheren sensorischen Neuron Dendriten und Axone mit Genetic Mosaike

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die detaillierte Morphologie von Drosophila-Larven-Dendritischen-Arborisierungs-Neuronen sichtbar zu machen. Dies wird erreicht, indem zunächst Embryonen gesammelt, gealtert und durch Hitzeschock-induzierte Lipase-Expression genetische Klone mit GFP-Markierung erzeugt werden. Der zweite Schritt besteht darin, Larven mit fluoreszierenden Neuronklonen auszuwählen und Bilder ihrer dendritischen ABAs aufzunehmen.

Nach der Bildgebung der Larven werden diese disseziert, fixiert und immungefärbt, um sie anschließend zu präparieren und ihre dendritischen Verästelungen sowie die Morphologie der axonalen Endigungen mittels konfokaler Immunfluoreszenzmikroskopie sichtbar zu machen. Heute werde ich eine Anleitung zur morphologischen Analyse der peripheren sensorischen Organe und Axone von Sula im unteren Bereich mithilfe genetischer Mosaike demonstrieren. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der neurodevelopmentalen Forschung zu beantworten, beispielsweise welche genetischen Programme die neuronale Identität, die Form der dendritischen Äste und die äußere Verschaltung steuern.

Beginnen Sie dieses Protokoll mit der Sammlung von Embryonen auf Apfelsaftplatten. Die Hitzeschockbehandlung erfolgt in einem Wasserbad bei 38 Grad Celsius, wobei die Dauer je nach der Genetik der Embryonen und der gewünschten Größe der Klone variiert. Erzeugen Sie für dieses Protokoll Markum-Klone aus Embryonen mit einem pand-Dendritischen-Arborisation-Neuronen-Treiber. Vor dem Hitzeschock lagern Sie die Marker-Embryonen zwei Stunden lang bei 25 Grad Celsius, umgeben von feuchten Tüchern.

Bereiten Sie die Sammelplatten für den Hitzeschock vor, indem Sie sie mithilfe leerer Platten und Parafilm wasserdicht machen. Führen Sie dann einen Hitzeschock an den Markerembryonen für eine Stunde durch, um kleine Klone oder die Markierung einzelner Neuronen zu erzeugen. Um die Anzahl der Klone zu erhöhen, wenden Sie einen verlängerten Hitzeschock an, indem Sie 45 Minuten im Wasserbad inkubieren, gefolgt von 30 Minuten bei Raumtemperatur und anschließend weiteren 30 Minuten im Wasserbad.

Um Flipout-Klone zu erzeugen, sammeln Sie Embryonen 24 kontinuierliche Stunden lang. Dieses Protokoll verwendet einen klasse-vier-spezifischen Treiber. Führen Sie eine Hitzeschockbehandlung der Flipout-Embryonen eine Stunde nach dem Hitzeschock durch.

Stellen Sie die Sammelteller in eine 10 cm große Petrischale, die von feuchten Tüchern und Kultur umgeben ist. Die Embryonen werden während der Embryokultivierung bei 25 Grad Celsius überwacht, und die Hefepaste wird nach Bedarf ergänzt. Da die Ernährung die neuronale Entwicklung entscheidend beeinflusst.

Kultivieren Sie die Larven, bis wandernde Larven im dritten Stadium erhältlich sind. Sammeln Sie diese kurzzeitig ein und spülen Sie die Larven im dritten Stadium vorsichtig mit Leitungswasser ab. Überführen Sie sie anschließend auf eine Agarplatte. Untersuchen Sie nun die Larven mithilfe eines leistungsstarken fluoreszenzmikroskopischen Stereomikroskops und Insektenpinzetten. Identifizieren Sie Larven mit GFP-positiven Neuronen in der Körperwand und übertragen Sie sie auf eine Objektträgermulde mit einem Tropfen 80%igem Glycerin.

Platzieren Sie ein Deckglas auf dem Objektträger, um die Larve zu fixieren. Stellen Sie sicher, dass sich keine Luft zwischen der Larve und dem Deckglas befindet. Verwenden Sie eine Standard-Konfokalmikroskopie, um die Neuronen von Interesse durch die Larvenhaut sichtbar zu machen.

Um die Position der Lava für einen verbesserten Betrachtungswinkel zu verändern, schieben Sie vorsichtig am Deckglas, um die Lava zu rollen. Beginnen Sie dieses Protokoll, indem Sie mithilfe von Insektenpinzetten eine Lava auf die SIL-Schutzplatte übertragen. Danach fixieren Sie sie an den vorderen und hinteren Enden mit Nadeln.

Dann kalziumfreie HL-3.1-Pufferlösung hinzufügen. Schneiden Sie nun an beiden Enden der Larve entlang der anterior-posterioren Achse zur Hälfte durch. Anschließend entlang der Mittellinie zwischen den beiden Tracheen schneiden.

Schneiden Sie vorsichtig jede einzelne tracheale Verbindung zur Körperwand durch, bevor Sie den Darm behutsam entfernen. Dadurch bleiben die segmentalen Nerven, die zwischen dem peripheren und dem zentralen Nervensystem verlaufen, intakt. Befestigen Sie das Larvenexemplar weiterhin an der Zellenschutzplatte und fixieren Sie es 20 Minuten lang bei Raumtemperatur in 4% Para-Formaldehyd in PBS auf einem sanft rotierenden Schüttler. Führen Sie jede Dissektion innerhalb von weniger als fünf Minuten durch.

Andernfalls beginnen die Neuriten der dendritischen Autorisationsneuronen zu zerfallen. Nach der Fixierung entfernen Sie überschüssiges larvales Gewebe. Anschließend waschen Sie die Filets dreimal mit PBST, wobei jede Waschung 10 Minuten dauert.

Nach den Waschschritten inkubieren Sie die Larven 20 Minuten bei Raumtemperatur in der Blockierungslösung unter leichtem Schütteln. Nach Abschluss der Blockierung ersetzen Sie die Blockierungslösung durch die Primärantikörperlösung. Geben Sie die Probe in einen kleinen Kunststoffbehälter, der mit feuchten Tüchern umgeben ist, und inkubieren Sie sie über Nacht bei vier Grad Celsius. Am nächsten Tag setzen Sie die Inkubation für eine zusätzliche Stunde bei Raumtemperatur fort.

Waschen Sie den Lava-Fillet anschließend sechsmal mit PBST, jeweils 10 Minuten pro Waschgang. Geben Sie nun den sekundären Antikörper hinzu und legen Sie die Fillets in einen lichtdichten Behälter, um eine Photobleiche des Fluorophors zu verhindern. Inkubieren Sie die Fillets entweder mehrere Stunden bei Raumtemperatur oder über Nacht bei vier Grad Celsius, gefolgt von einer Stunde bei Raumtemperatur.

Spülen Sie die Filets abschließend sechsmal in PBST, wobei jede Spülung 10 Minuten dauert. Die Gewebe sind dann bereit zur Einbettung. Um die Axonendigungen sichtbar zu machen, montieren Sie die larvalen Filets einfach mit der Cuticula-Seite nach unten in 80 % Glycerin auf einer Vertiefungsrutsche.

Um klarere Bilder von Dendriten zu erhalten, stellen Sie eine Dauermontierung mit mit PLL beschichteten Deckgläsern her. Um die Deckgläser zu beschriften, verwenden Sie einen Aliquot von PLL. Füllen Sie es mit zweifach destilliertem Wasser auf 10 Milliliter auf und geben Sie 20 Mikroliter Kodak Photo Flow hinzu.

Die Deckgläser 30 Minuten lang in der PLL-Lösung untertauchen und nach dem Herausnehmen lufttrocknen lassen. Anschließend kurz mit Wasser spülen und erneut lufttrocknen.

Wiederholen Sie diesen Vorgang zweimal. Beginnend mit dem PLL-Bad halten die behandelten Deckgläser etwa einen Monat lang. Befestigen Sie nun ein präpariertes larvales Muskelpräparat mit der Muskelseite nach unten in einen Tropfen PBS auf einem PLL-Deckglas.

Das Filet haftet mithilfe eines Papiertuchs schnell am Deckglas an. Entfernen Sie so viel Flüssigkeit wie möglich, lassen Sie es jedoch nicht vollständig austrocknen. Anschließend dehydrieren Sie die larvalen Filets durch eine Reihe von 10-minütigen Ethanolbädern, beginnend mit 35 % Ethanol, gefolgt von 50 %, dann 70 %, dann 95 %, dann 100 % und schließlich einem zweiten Bad mit 100 % Ethanol.

Führen Sie nach den Ethanolbädern zwei oder drei Bäder mit je 10 Minuten in Xylol durch. Geben Sie dann einen Tropfen DPX auf einen sauberen Objektträger und setzen Sie vorsichtig das Deckglas in das DPX, wobei es mit der Seite nach unten platziert wird. Bewahren Sie den Objektträger im Dunkeln auf und warten Sie einen Tag, bis das DPX ausgehärtet ist.

Bevor das Gewebe mittels In-vivo- und Fokalmikroskopie abgebildet wird, können Bilder wie dieses aufgenommen werden. Der gesamte Baum eines dendritischen Baums eines Neurons der Klasse vier. Dies ist eine Vergrößerung eines dendritischen Baums eines immunhistochemisch markierten Neurons der Klasse drei, das korrekt fixiert wurde, um die Morphologie zu erhalten.

Die Einlage zeigt die Degradation, die nach einer erfolglosen Dissektion und Fixierung auftreten kann. Diese Überlagerung zeigt ein einzelnes Axonende der Klasse vier im ZNS. Das Axon ist mit anti-GFP in Grün markiert und alle Termiten der Klasse vier wurden zusätzlich mit anti-CD2 in Magenta gefärbt.

Während des Durchführens dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, die Proben schnell zu dissezieren und zu fixieren, indem man die Axone vom Peripheren zum ZNS verfolgt. Es ist hilfreich, im Hinterkopf zu behalten, dass PNS-Neuronen in jedem Körpersegment zum entsprechenden Segment des ventralen Nervenstrangs projizieren. Außerdem, wenn Sie nur Dendriten visualisieren möchten, entfernen Sie die CNAs während der Dissektion, und die Färbung kann in anhängenden Röhrchen anstelle auf Platten durchgeführt werden.

Beim Montieren dieser Filets für die Dendriten-Bildgebung zuerst den Kopf mit Mundhaken und das hintere Ende mit Glitzern abschneiden. Für eine optimale Präparation.