Morphologische Analyse Drosophila Larven peripheren sensorischen Neuron Dendriten und Axone mit Genetic Mosaike

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die detaillierte Morphologie von Drosophila-, Larven-, Dendriten- und Arborisationsneuronen zu visualisieren. Dies wird erreicht, indem zunächst Embryonen entnommen, gealtert und GFP-markierte genetische Klone durch Hitzeschock-induzierte Lipase-Expression erzeugt werden. Der zweite Schritt besteht darin, Larven mit fluoreszierenden Neuronenklonen auszuwählen und ein Bild ihrer dendritischen ABAs zu machen.

Nach der Bildgebung der Lava werden sie präpariert, fixiert und immungefärbt, damit sie montiert werden können und ihre dendritischen Häfen und axonalen terminalen Morphologien durch konfokale Immunfluoreszenzmikroskopie sichtbar gemacht werden können. Heute werde ich ein Protokoll zur morphologischen Analyse von unteren peripheren Sensor-OIDs und Exons mit Hilfe genetischer Mos demonstrieren. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Bereich der neurologischen Entwicklung zu beantworten, wie z. B. welche genetischen Programme die neuronale Identität, die dendritische Mundform und die externe Verdrahtung steuern.

Beginnen Sie dieses Protokoll, indem Sie Embryonen auf Apfelsaftplatten sammeln. Der Hitzeschock wird in einem 38 Grad Celsius warmen Wasserbad verabreicht, und die Dauer variiert je nach Embryogenetik und gewünschter Klongröße. Generieren Sie für dieses Protokoll Markum-Klone aus Embryonen mit einem dendritischen Arborisierungs-Neuronentreiber. Halten Sie die Marker-Embryonen vor dem Hitzeschock zwei Stunden lang bei 25 Grad Celsius, umgeben von Feuchtigkeit und Gewebe.

Bereiten Sie die Auffangplatten auf den Hitzeschock vor, indem Sie sie mit leeren Platten und Para-Fill tauchfähig machen. Dann schocken Sie die Marker-Embryonen eine Stunde lang, um kleine Klone oder die Markierung einzelner Neuronen zu erzeugen. Um die Anzahl der Klone zu erhöhen, verwenden Sie einen längeren Hitzeschock, indem Sie 45 Minuten im Bad, gefolgt von 30 Minuten bei Raumtemperatur und dann weitere 30 Minuten im Bad inkubieren.

Um Flipout-Klone zu erzeugen, sammeln Sie Embryonen für 24 Stunden ununterbrochen. Dieses Protokoll verwendet einen spezifischen Treiber der Klasse vier. Schocken Sie die ausflippenden Embryonen eine Stunde lang nach dem Hitzeschock.

Legen Sie die Sammelplatten in eine 10 Zentimeter große Petrischale, umgeben von Feuchtigkeit und Geweben und Kultur. Die Embryonen werden während der Embryonenkultivierung auf 25 Grad Celsius überwacht und füllen die Hefepaste bei Bedarf wieder auf. Denn die Ernährung beeinflusst die neuronale Entwicklung entscheidend.

Bewahren Sie die Kultur auf, bis die wandernde dritte im Stern liegende Lava kurz eingesammelt werden kann, und spülen Sie die Larven des dritten Stadiums vorsichtig in Leitungswasser ab und geben Sie sie auf eine Agarplatte. Untersuchen Sie nun die Larven mit einem leistungsstarken Fluoreszenzmikroskop und einer Insektenzange. Identifizieren Sie Larven mit GFP-positiven Neuronen in der Körperwand und übertragen Sie sie mit einem Tropfen 80% Glycerin auf einen Depressionsträger.

Lege einen Deckzettel auf die Rutsche, um die Lava ruhig zu stellen. Stellen Sie sicher, dass keine Luft zwischen der Lava und dem Deckglas zurückbleibt. Verwenden Sie die konfokale Standardmikroskopie, um die interessierenden Neuronen durch die Lavakutikula sichtbar zu machen.

Um die Position der Lava für einen besseren Betrachtungswinkel zu ändern, drücken Sie vorsichtig auf den Deckglas, um die Lava herumzurollen. Beginnen Sie dieses Protokoll, indem Sie eine Lava mit einer Insektenzange auf die SIL-Schutzplatte übertragen. Stecken Sie es dann am vorderen und hinteren Ende fest.

Fügen Sie dann calciumfreien HL 3.1 Puffer hinzu. Schneiden Sie nun die Hälfte durch beide Enden der Lava senkrecht zur vorderen hinteren Achse. Schneiden Sie dann entlang der Mittellinie zwischen den beiden Luftröhren.

Schneiden Sie vorsichtig jede einzelne Trachealverbindung zur Körperwand ab, bevor Sie den Darm vorsichtig entfernen. Dadurch bleiben die segmentalen Nerven, die zwischen dem PNS und dem ZNS verlaufen, intakt. Während die Larve noch an der Zellschutzplatte befestigt ist, fixieren Sie sie 20 Minuten lang in 4%Para-Formaldehyd in PBS auf einem sanft rotierenden Schüttler und führen Sie jede Dissektion in weniger als fünf Minuten durch.

Andernfalls beginnen sich die Nieten der dendritischen Autorisierungsneuronen zu verschlechtern. Entfernen Sie nach der Fixierung überschüssiges Larvengewebe. Dann waschen Sie die Filets dreimal mit PBST für 10 Minuten pro Waschgang.

Nach dem Waschen inkubieren Sie die Larven 20 Minuten lang bei Raumtemperatur in Blocklösung unter leichtem Schütteln. Nachdem die Blockierung abgeschlossen ist, ersetzen Sie die Blockierungslösung durch die primäre Antikörperlösung. Legen Sie die Probe in den kleinen Plastikbehälter, der von Feuchtigkeit und Taschentüchern umgeben ist, und inkubieren Sie sie über Nacht bei vier Grad Celsius. Am nächsten Tag setzen Sie die Inkubation für eine weitere Stunde bei Raumtemperatur fort.

Anschließend das Lavafilet pro Waschgang sechsmal für 10 Minuten in PBST waschen. Geben Sie nun den Sekundärantikörper hinzu und geben Sie die Filets in einen dunklen Behälter, um ein Photobleichen des Fluors zu verhindern. Inkubieren Sie die Filets entweder stundenlang bei Raumtemperatur oder über Nacht bei vier Grad Celsius, gefolgt von einer Stunde bei Raumtemperatur.

Zum Schluss die Filets sechsmal pro Waschgang 10 Minuten lang in PBST waschen. Die Gewebe sind dann bereit für die Montage. Um die Axontermini sichtbar zu machen, montieren Sie einfach die Nagelhautseite der Larve mit der Nagelhautseite nach unten in 80%Glycerin in einem Vertiefungsobjektträger.

Um klarere Bilder von Dendriten zu erhalten, stellen Sie eine dauerhafte Halterung mit PLL-beschichteten Deckgläsern her. Um die Deckgläser zu kodieren und aliquot von PLL. Bringen Sie es auf bis zu 10 Milliliter doppelt destilliertes Wasser und fügen Sie 20 Mikroliter Kodak Photo Flow hinzu.

Tauchen Sie die Deckgläser 30 Minuten lang in die PLL-Lösung und trocknen Sie sie nach der Entnahme an der Luft. Spülen Sie sie dann kurz mit Wasser und Luft ab. Trocknen Sie sie erneut.

Wiederholen Sie diesen Vorgang zweimal. Beginnend mit dem PLL-Bad halten die behandelten Deckgläser ca. einen Monat. Montieren Sie nun ein präpariertes Larvenfilet mit der Muskelseite nach unten in einen Tropfen PBS auf einem PLL-Deckglas.

Das Filet haftet mit einem Stück Seidenpapier schnell auf dem Deckglas. Entfernen Sie so viel Flüssigkeit wie möglich, lassen Sie sie jedoch nicht vollständig austrocknen. Als nächstes dehydrieren Sie Larvenfilets und eine Reihe von 10-minütigen Ethanolbädern, beginnend mit 35 % Ethanol, gefolgt von 50 %, dann 70 %, dann 95 %, dann 100 % und schließlich ein zweites 100 % Ethanolbad.

Nach den Ethanolbädern folgen zwei oder drei 10-minütige Bäder in Xylol. Geben Sie dann einen Tropfen DPX auf einen sauberen Objektträger und setzen Sie den Deckglas vorsichtig mit der bedruckten Seite nach unten in den DPX ein. Lassen Sie die Folie im Dunkeln und warten Sie einen Tag, bis die DPX ausgehärtet ist.

Vor der Bildgebung des Gewebes mittels In-vivo- und Fokalmikroskopie ist es möglich, solche Bilder aufzunehmen. Der gesamte Dorn eines dendritischen Arborisationsneurons der Klasse vier. Dies ist eine Nahaufnahme eines dendritischen Dorns aus einem IHC-markierten Neuron der Klasse 3, das korrekt fixiert wurde, um die Morphologie zu erhalten.

Der Einschub zeigt die Degradation, die nach einer erfolglosen Dissektion und Fixierung auftreten kann. Diese Überlagerung zeigt einen Axonterminus der vierten Klasse im ZNS. Das Axon ist mit Anti-GFP in Grün markiert und alle Termiten der Klasse vier sind mit Anti-CD zwei in Magenta gefärbt.

Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, Proben schnell zu präparieren und zu fixieren, indem Axone von der Peripherie bis zum ZNS verfolgt werden. Es ist nützlich, sich vor Augen zu halten, dass PNS-Neuronen in jedem Körper segmentieren, projizieren sie zum kognitiven Segment des Nervencodes der Vents. Wenn Sie nur Dendriten sichtbar machen möchten, entfernen Sie die CNAs während der Dissektion, und die Färbung kann im Anhang von Röhrchen statt auf Platten durchgeführt werden.

Wenn Sie diese Filets für die Dendritenbildgebung montieren, schneiden Sie zuerst den Kopf mit Mundhaken und den Hinterkopf mit Glitzern ab. Für eine genussvolle Zubereitung.