Name: Single Read und Paired End mRNA-Seq Illumina Bibliotheken von 10 Nanogramm Gesamt-RNA (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 49 s
Description: Erfahren Sie die Herstellung von Illumina mRNA-Seq-Bibliotheken aus nur 10 Nanogramm Gesamt-RNA mittels T7-linearer Amplifikation. Diese Methode ermöglicht Genexpressionsanalysen aus begrenzten Zellpopulationen.

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Diese Arbeit wurde durch Mittel aus dem Morgridge Institut für Forschung und der University of Wisconsin-Stiftung unterstützt. Wir danken Krista Eastman für redaktionelle Unterstützung.

<ol><li>Tang, F., Barbacioru, C., Wang, Y., Nordman, E., Lee, C., Xu, N., Wang, X., Bodeau, J., Tuch, B. B., Siddiqui, A., Lao, K., Surani, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mRNA-Seq+whole-transcriptome+analysis+of+a+single+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">mRNA-Seq whole-transcriptome analysis of a single cell.</a> Nature Methods. 6, 377-382 (2009).</li>
<li>Armour, C. D., Castle, J. C., Chen, R., Babak, T., Loerch, P., Jackson, S., Shah, J. K., Dey, J., Rohl, C. A., Johnson, J. M., Raymond, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+transcriptome+profiling+using+selective+hexamer+priming+for+cDNA+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Digital transcriptome profiling using selective hexamer priming for cDNA synthesis.</a> Nature Methods. 6, 647-649 (2009).</li>
<li>Mortazavi, A., Williams, B. A., McCue, K., Schaeffer, L., Wold, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+and+quantifying+mammalian+transcriptomes+by+RNA-Seq%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq.</a> Nature Methods. 5, 621-628 (2008).</li>
<li>Mamanova, L., Andrews, R. M., James, K. D., Sheridan, E. M., Ellis, P. D., Langford, C. F., Ost, T. W., Collins, J. E., Turner, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FRT-seq+amplification-free%2C+strand-specific+transcriptome+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">FRT-seq amplification-free, strand-specific transcriptome sequencing.</a> Nature Methods. 5, 130-132 (2010).</li>
<li>Sengupta, S., Ruotti, V., Bolin, J., Elwell, A., Hernandez, A., Thomson, J., Stewart, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+consistent%2C+fully+representative+mRNA-Seq+libraries+from+ten+nanograms+of+total+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Highly consistent, fully representative mRNA-Seq libraries from ten nanograms of total RNA.</a> Biotechniques. 49, 898-904 (2010).</li>
<li>Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrafast+and+memory-efficient+alignment+of+short+DNA+sequences+to+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Genome.+Biology%22%5BJournal%5D)">Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome.</a> Genome. Biology. 10, R25-R25 (2009).</li>
<li>Li, B., Ruotti, V., Stewart, R. M., Thomson, J. A., Dewey, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-Seq+gene+expression+estimation+with+read+mapping+uncertainty%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">RNA-Seq gene expression estimation with read mapping uncertainty.</a> Biotechniques. 26, 493-500 (2010).</li>
<li>Thomson, J. A., Itskovitz-Eldor, J., Shapiro, S. S., Waknitz, M. A., Swiergiel, J. J., Marshall, V. S., Jones, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282, 1145-1147 (1998).</li>
<li>mRNA-Seq-8 Sample Prep Kit [Internet]. , Illumina. Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.illumina.com/products/mrna_seq_8_sample_prep_kit.ilmn">http://www.illumina.com/products/mrna_seq_8_sample_prep_kit.ilmn</a> Forthcoming.</li>
<li>ScriptSeq mRNA-Seq Library Preparation Kit (Illumina -compatible) Epicentre [Internet]. , Epicenter. Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.epibio.com/item.asp?id=578">http://www.epibio.com/item.asp?id=578</a> Forthcoming.</li>
</ol>

Die Autoren offenbaren, dass JAT einer der Gründer, Aktionärskapitalismus abgelöst, Berater und Vorstandsmitglied von Cellular Dynamics International (CDI) ist. Er dient auch als wissenschaftlicher Berater und finanziellen Interessen in Tactics II Stem Cell Ventures.

Aktuelle Protokolle für die Herstellung gepaart Ende Bibliotheken benötigen zwischen 1 pg 9 bis 2,5 pg 10 ab Höhe der Gesamt-RNA. Hier präsentieren wir unsere lineare T7 Amplifikation (T7LA)-Methode, um sowohl ein Lese-und gepaart Ende Illumina Sequenzierung Bibliotheken und Show vorzubereiten, dass diese Methode ermöglicht die Erstellung von Bibliotheken aus so niedrig wie 10 ng Gesamt-RNA, Herstellung Daten, die vergleichbar mit der ist minimal verstärkt (MinAmp) Bibliotheken von 1000 fold Ausgangsmaterial mehr (10 ug Gesamt-RNA) hergestellt. Die 10 ng Bibliotheken nicht nur identifizieren, ähnlich Gesamtzahl der Gene, sondern auch zu produzieren Genexpressionssignaturen, die ähnlich sind (Abb. 3a und b). Darüber hinaus sind sowohl die einzelnen Lese-und gepaart Ende Bibliotheken durch die T7LA Verfahren hergestellte sehr ähnlich zueinander (Abbildung 3c), denen die Forscher die Daten von Bibliotheken aus beiden Protokolle erwirtschaftet vergleichen können. Da diese Bibliotheken aus humanen embryonalen Stammzellen RNA bereit waren, suchten wirfür 30 Stammzell-spezifische Gene unter den Bibliotheken und feststellen, dass fast alle diese Gene (93-100%) durch die Bibliotheken von mindestens 10 ng Gesamt-RNA ab (Abbildung 4) gemacht werden identifiziert, damit die Validierung unseres Protokolls. Wir glauben, dass unser Protokoll wäre sehr nützlich für die Forscher, besonders in Fällen wie flow sortierten Zellen oder Laser-Mikro-seziert Gewebe, in dem Ausgangsmaterial ist begrenzt. In einem solchen Fall würde unser Protokoll erlauben Generation von Genexpressionsdaten vergleichbar mit Bibliotheken aus viel größeren Mengen ab gemacht, da unser Protokoll produziert Expressionsprofile vergleichbar mindestens 3 Größenordnungen der Ausgangs-RNA.

<table border="1"><tbody><tr><td> Firma </td><td> Kit / Reagent </td><td> Catalog # </td><td> Besondere </td></tr><tr><td> Ambion </td><td> Fragmentation Reagenz </td><td> AM8740 </td><td></td></tr><tr><td> Ambion </td><td> Liner Acrylamid </td><td> AM9520 </td><td></td></tr><tr><td> Ambion </td><td> MEGAscript T7 Kit </td><td> AM1334 </td><td></td></tr><tr><td> Ambion </td><td> Nicht DEPC behandelt Nuclease freies Wasser </td><td> AM9932 </td><td></td></tr><tr><td> Fermentas </td><td> dNTP Set </td><td> R0181 </td><td></td></tr><tr><td> Fermentas </td><td> methylierte dNTPs </td><td> R0431 </td><td> Für Single Read Probenvorbereitung nur </td></tr><tr><td> Illumina </td><td> TruSeq SR Cluster-Generation kit v5 </td><td> GD-203-5001 </td><td> Für Single Read Probenvorbereitung nur </td></tr><tr><td> Illumina </td><td> TruSeq Seq Kit v5 36 Zyklen </td><td> FC-104-5001 </td><td></td></tr><tr><td> Illumina </td><td> Chip Seq Sample Prep Kit </td><td> IP-102-1001 </td&gt; <td> Für Single Read Probenvorbereitung nur. Kann mit NEB DNA Probenvorbereitung Master Mix ersetzt Set 1 Cat # E6040S </td></tr><tr><td> Illumina </td><td> TruSeq PE Cluster-Generation kit v5 </td><td> PE-203-5001 </td><td> Für gepaart Ende Probenvorbereitung nur </td></tr><tr><td> Illumina </td><td> Gepaart End Sample Prep Kit </td><td> PE-102-1001 </td><td> Für gepaart Ende Probenvorbereitung nur </td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> 1kb Plus Leiter </td><td> 10787-018 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> E. coli RNase H </td><td> 18021-014 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> RNase Out </td><td> 10777-019 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> 2. Strang-Puffer 5x </td><td> 10812-014 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> E. coli-DNA-Polymerase </td><td> 18010-017 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> E-Gel SYBR Safe 2% </td><td> G521802 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> Superscript III (mit 5-fach FS-Puffer und 0,1 M DTT) </td><td> 18080-085 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> Trizol </td><td> 12183555 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> RNA quibit Assay-Kit </td><td> Q32852 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> dsDNA HS Qubit-Assay-Kit </td><td> Q32851 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> E. coli-DNA-Ligase </td><td> 18052-019 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> T4 DNA Polymerase </td><td> 18005-025 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> Ultra Pure Dnase Rnase Wasser </td><td> 10977-015 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> Superscript II doppelsträngigen cDNA-Synthese-Kit </td><td> 11917-020 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> Random Primer (Invitrogen) </td><td> 48190-011 </td><td> Für gepaart Ende Probenvorbereitung nur </td></tr><tr><td> IDT </td><td> Not1Nonamer B Primer </td><td> N / A </td><td> Für Single Read samPLE prep nur </td></tr><tr><td> IDT </td><td> Oligo dT T7 </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> NEB </td><td> Not1 Verdauung kit </td><td> R0189S </td><td> Für Single Read Probenvorbereitung nur </td></tr><tr><td> Qiagen </td><td> Rneasy MinElute kit </td><td> 74204 </td><td></td></tr><tr><td> Qiagen </td><td> RNeasy Mini Kit (50) </td><td> 74104 </td><td></td></tr><tr><td> Qiagen </td><td> Gel Purification Kit </td><td> 28604 </td><td></td></tr><tr><td> Qiagen </td><td> DNase Set </td><td> 79254 </td><td></td></tr><tr><td> Qiagen </td><td> Rneasy MinElute kit </td><td> 74204 </td><td></td></tr><tr><td> Zymo Forschung </td><td> DNA sauber und Konzentrator (250X) </td><td> D4014 </td><td></td></tr></tbody></table>

single read und paired end mrna-seq illumina bibliotheken von 10 nanogramm gesamt-rna

Single Read and Paired End mRNA-Seq Illumina Libraries from 10 Nanograms Total RNA

Whole Transkriptom-Sequenzierung von mRNA-Seq ist nun weitgehend auf globale Genexpression, Mutation, Allel-spezifische Expression und anderen genomweiten Analysen durchzuführen verwendet. mRNA-Seq selbst öffnet das Tor zur Genexpressionsanalyse der nicht-sequenzierten Genomen. mRNA-Seq bietet eine hohe Empfindlichkeit, einen großen Dynamikbereich und erlaubt die Messung der Niederschrift Kopienzahl in einer Probe. Illumina Genome Analyzer führt die Sequenzierung einer großen Anzahl (&gt; 10 7) von relativ kurzer Sequenzabschnitte (&lt;150 bp). Der &quot;paired end&quot;-Ansatz, wobei eine einzelne lange lesen an seinen beiden Enden ist sequenziert, erlaubt für die Verfolgung von alternativen Spleißstellen , Insertionen und Deletionen, und ist für de novo Transkriptom Montage nützlich. Eine der wichtigsten Herausforderungen, denen Forscher gegenüberstehen wird eine begrenzte Menge des Ausgangsmaterials. Zum Beispiel in Experimenten, bei denen Zellen durch Laser-Mikrodissektion, zur Verfügung geerntet werden ab Gesamt-RNA may Maßnahme Nanogramm. Vorbereitung der mRNA-Seq-Bibliotheken aus solchen Proben wurden 1, 2 beschrieben, aber mit erheblichen PCR-Amplifikation, dass Bias einführen kann. Andere RNA-Seq Bibliothek Bauverfahren mit minimalen PCR-Amplifikation wurden 3, 4 veröffentlicht, aber benötigen Mikrogramm-Mengen von Gesamt-RNA ab. Hier beschreiben wir ein Protokoll für den Illumina Genome Analyzer II Plattform für mRNA-Seq-Sequenzierung für die Bibliothek Vorbereitung, die erhebliche PCR-Amplifikation vermeidet und benötigt nur 10 Nanogramm Gesamt-RNA. Während dieses Protokoll wurde zuvor auch für Single-End-Sequenzierung 5, wo sie gezeigt, dass direktionale Bibliotheken, ohne dabei signifikante Verstärkung Bias produzieren beschrieben wurde validiert, hier sind wir zu validieren es weiter für die Verwendung als ein gekoppeltes Ende-Protokoll. Wir selektiv zu verstärken polyadenyliert Boten-RNAs aus beginnend Gesamt-RNA mit der T7 basiert Eberwine lineare Verstärkung Methode geprägt &quot;T7LA &quot;(T7 lineare Verstärkung). Die verstärkten Poly-A-mRNAs fragmentiert sind, revers transkribiert und Adapter ligiert, um die endgültige Sequenzierung Bibliothek zu erzeugen. Für beide gelesen und gepaart Ende läuft, Sequenzen des menschlichen Transkriptom 6 sind abgebildet und so normiert, dass Daten aus mehreren Läufen kann verglichen werden. Wir berichten über die Messung der Genexpression in Einheiten von Transkripten pro Million (TPM), die eine überlegene Maßnahme RPKM beim Vergleich Proben 7 ist.

Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Herstellung der beiden einzigen gelesen und gepaart Ende Illumina mRNA-Seq-Sequenzierung Bibliotheken zur Genexpressionsanalyse auf T7 lineare RNA-Amplifikation basieren. Dieses Protokoll erfordert nur 10 Nanogramm ab Gesamt-RNA und erzeugt sehr konsistent Bibliotheken für ganze Transkripte.

Single Read und Paired End mRNA-Seq Illumina Bibliotheken von 10 Nanogramm Gesamt-RNA

Die Sequenzierung des gesamten Transkriptoms mittels mRNA-Seq wird mittlerweile in großem Umfang eingesetzt, um globale Genexpression, Mutationen, allelspezifische Expression und andere ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Illumina-mRNA-Sequenzbibliotheken aus geringen Mengen Ausgangsmaterial herzustellen. Der erste Schritt des Verfahrens ist die Reverse Transkription von Gesamt-RNA mit DTT-sieben Primern zur Erzeugung von CD-NA. Die CD-NA wird anschließend für die RNA-Amplifikation durch In-vitro-Transkription verwendet. Danach wird die amplifizierte RNA einer zufälligen Fragmentierung unterzogen.Die Reverse Transkription der fragmentierten RNA erzeugt CDNA, die einer Adapterligation, Größenselektion und PCR-Amplifikation unterzogen wird. Letztendlich zeigt dieses Protokoll das Genexpressionsprofil der Probe durch die Messung der Genkopienzahlen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass lediglich 10 Nanogramm Gesamt-RNA als Ausgangsmaterial benötigt werden.Das ist um Größenordnungen geringer als das, was von anderen bestehenden Protokollen verlangt wird. Darüber hinaus kann es gepaarte Bibliotheken aus solch geringen Ausgangsmengen an RNA erzeugen. Diese Methode wird es Wissenschaftlern ermöglichen, neue Fragestellungen in der Biologie zu untersuchen, indem sie die Bestimmung von Genexpressionsprofilen aus schwer zugänglichen Zellpopulationen erlaubt, wie sie beispielsweise aus Laser-Kapture-Mikrodissektion oder aus Durchflusszytometrie stammen.Die Idee zur Entwicklung dieser Methode entstand zunächst, als wir die Genexpression einer sehr begrenzten Anzahl von Zellen analysieren mussten, die aus humanen amnionischen Stammzellen differenziert wurden. Eine visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend, da die Handhabung von RNA aufgrund der sehr geringen Menge an RNA, die leicht degradiert werden kann, schwer zu erlernen ist. Die Durchführung der Methode demonstrieren Angela Elwell, Jennifer Bolen und Baal Kimm Wynn aus meinem Labor.Die Methode zur parallelen Herstellung von Einzel- und Paired-End-Sequenzierbibliotheken ist ein mehrstufiges Verfahren, wie in diesem Flussdiagramm dargestellt. Zunächst wird Gesamt-RNA aus den Zellen oder Geweben der Untersuchung isoliert und zur Herstellung doppelsträngiger CD NA verwendet. Anschließend werden polyadenylierte Boten-RNAs selektiv aus der CD NA mittels der auf T sieben basierenden ewin linearen Amplifikationsmethode amplifiziert. Danach wird die amplifizierte poly a A zufällig fragmentiert.Nach der Aufreinigung des fragmentierten RNA-Materials wird dieses revers transkribiert zu cDNA. Die cDNA wird an den Enden repariert, und es werden Basen an das 3'-Ende der DNA-Fragmente angehängt. Anschließend erfolgt die Ligation von Adaptern an die DNA, gefolgt von keiner Einzelschnitt-Digestion. Im Fall der Einzel-Read-Bibliothek wird die DNA-Bibliothek dann durch Gelelektrophorese gereinigt und mittels PCR amplifiziert, um die Illumina-Adapter zu ligieren.Schließlich ist die DNA-Bibliothek nach der Quantifizierung bereit für die Sequenzierung. Für dieses Video werden nur ausgewählte Verfahren innerhalb dieses Protokolls demonstriert. Die Reverse Transkription der fragmentierten polyA-mRNAs in cDNA umfasst die Synthese des ersten und zweiten Strangs.Fügen Sie für die Synthese des ersten Strangs für die Single-Read-Bibliothek die folgenden Reagenzien in ein PCR-Gefäß hinzu: 10 Mikroliter fragmentierte poly-mRNA und ein Mikroliter des nicht-einen zufälligen Nonamer-Primers. Die Sequenz des nicht-einen Nonamer-Primers ist hier dargestellt. Die fünfendnahe Sequenz, die grün dargestellt ist, stellt die nicht-eine Restriktionsstelle dar.Während die in Blau dargestellte Sequenz das reverse Komplement der Adapter-B-Sequenz von Illumina aus dem Chip-Sequenzier-Kit ist, inkubieren Sie das Gemisch fünf Minuten lang bei 70 Grad Celsius im Thermocycler und kühlen es anschließend rasch auf Eis ab. Unter Beibehaltung des Gemischs auf Eis fügen Sie folgende Reagenzien aus dem Superscript-III-Kit hinzu: vier Mikroliter 5x First-Strand-Puffer, zwei Mikroliter DTT und 1,5 Mikroliter DNTP-Gemisch. Verwenden Sie im DNTP-Gemisch anstelle von DCTP fünf Methyl-DCTP. Stellen Sie das Röhrchen im Thermocycler bei 42 Grad Celsius für zwei Minuten und geben Sie danach ein Mikroliter Superscript-III-Reversetranskriptase hinzu. Inkubieren Sie eine Stunde lang bei 42 Grad Celsius.Als Nächstes richten Sie die Reaktion zur Synthese des ersten Strangs für die para-end-Bibliothek ein. Geben Sie die folgenden Reagenzien in ein PCR-Gefäß: 10 Mikroliter fragmentiertes poly NNA und ein Mikroliter zufälliger Hexamer-Primer. Inkubieren Sie fünf Minuten bei 65 Grad Celsius im Thermocycler und kühlen Sie anschließend schnell auf Eis ab.Unter Beibehaltung des Röhrchens auf Eis folgende Reagenzien aus dem Superscript-Three-First-Strand-Kit hinzufügen: vier Mikroliter 5x First-Strand-Puffer, zwei Mikroliter DTT und 1,5 µL dNTPs. Im Thermocycler bei 45 °C eine Minute lang inkubieren. Anschließend ein Mikroliter Superscript Three Reverse Transkriptase hinzufügen und bei 45 °C eine Stunde lang inkubieren.Beide Reaktionen sind bereit für die Synthese des zweiten Strangs. Geben Sie jeder der Mischungen auf Eis die folgenden Reagenzien aus dem Superscript Two-Kit hinzu: 91 µL freies Wasser, 30 µL 5x Second-Strand-Puffer, 3 µL dNTPs, 1 µL E. coli-DNA-Ligase, 4 µL E. coli-DNA-Polymerase und 1 µL E. coli-RNase H. Mischen Sie jede Probe durch vorsichtiges Umstülpen, zentrifugieren Sie kurz und inkubieren Sie bei 16 °C für zwei Stunden.Fügen Sie für die Endreparatur der cDNA für die Single-Read-Bibliothek zu 40 Mikrolitern gereinigter cDNA die folgenden Reagenzien hinzu: fünf Mikroliter T4-DNA-Ligasepuffer mit 10 Millimolar ATP, zwei Mikroliter dNTP-Mix, ein Mikroliter T4-DNA-Polymerase, ein Mikroliter Klenow-Enzym und ein Mikroliter T4-PNK zur Endreparatur der cDNA. Für die Paired-End-Bibliothek fügen Sie zu 30 Mikrolitern gereinigter cDNA diese Reagenzien hinzu: 45 Mikroliter RNase-freies Wasser.10 µL T4-DNA-Ligase-Puffer mit 10 mmol ATP, 4 µL 10 mmol DNTP-Mix, 5 µL T4-DNA-Polymerase, 1 µL Klenow-Enzym und 5 µL T4-PNK; inkubieren Sie beide Röhrchen im Thermocycler nach der Endreparatur bei 20 °C für 30 Minuten.Der nächste Schritt in diesem Protokoll besteht darin, Adeninbasen an das 3'-Ende der DNA-Fragmente für die Single-Read-Bibliothek anzuhängen. Bereiten Sie die folgende Reaktionsmischung vor: 34 Mikroliter DNA-Probe, 5 Mikroliter Klino-Puffer, 10 Mikroliter DATP und 1 Mikroliter Klino exo. Für die Paired-End-Bibliothek bereiten Sie die folgende Reaktionsmischung vor: 32 Mikroliter DNA-Probe, 5 Mikroliter Clin-Out-Puffer.10 µL dATP und 3 µL Clin-Out-Exo: Inkubieren Sie beide Reaktionsgemische 30 Minuten bei 37 °C, bevor Sie die Reaktionen für die Adapterligation vorbereiten. Tauen Sie die Adapter auf Eis auf und verdünnen Sie sie im Verhältnis 1:20 für die Einzellesebibliothek. Verwenden Sie das Illumina-Chip-Sequenz-Sample-Prep-Kit, um das folgende Reaktionsgemisch herzustellen: 10 µL DNA-Probe, 1 µL Adapter-Oligo-Mix, 15 µL 2X DNA-Ligase-Puffer und 4 µL DNA-Ligase; inkubieren Sie 15 Minuten lang.Bei Raumtemperatur für die Paired-End-Bibliothek verwenden Sie das Illumina Paired-End-Sample-Prep-Kit, um die folgende Reaktion vorzubereiten. Mischen Sie 10 Mikroliter DNA-Probe, 10 Mikroliter PE-Adapter-Oligo-Mix, 25 Mikroliter zweifach konzentrierter DNA-Ligase-Puffer und 5 Mikroliter DNA-Ligase; inkubieren Sie 15 Minuten bei 20 Grad Celsius. Reinigen Sie anschließend beide Ligationsreaktionen mit XMO-Säulen.Eluieren Sie die Single-Read-Bibliothek und 44 Mikroliter Wasser, um die Paired-End-Bibliothek mit sechs Mikrolitern Elutionspuffer zu eluieren, gefolgt von einer weiteren Elution in fünf Mikrolitern EB. Führen Sie eine Not-One-Digestion ausschließlich für die Single-Read-Bibliothek durch. Inkubieren Sie für zwei Stunden bis über Nacht bei 37 Grad Celsius, nachdem Sie die Reaktion mithilfe einer ZY IMO-Säule gereinigt haben.Eluieren Sie die Single-Read-Bibliothek mit sechs Mikrolitern Puffer EB, gefolgt von einer zweiten Verdünnung mit fünf Mikrolitern EB. Die an Adapter ligierte DNA für beide Bibliotheken ist nun bereit für die Größenselektion. Das Größenselektionsverfahren für die an Adapter ligierte DNA wird unter Verwendung eines 2 %igen Cyber Safe EE von In Vitrogen durchgeführt; starten Sie dazu das Programm „Null“ für eine Vorlaufzeit von zwei Minuten.Nach dem Vorelektrophoretischen Lauf 10 µL der One KB Plus-Ladder und der 2D-NA-Proben laden. Die leeren Gelen mit je 10 µL Wasser auffüllen und das Laufprogramm starten. Ein Egel 2 % für 28 Minuten laufen lassen.Wenn der Lauf abgeschlossen ist, selektieren Sie mithilfe einer frischen Rasierklinge die Gelelektrophorese-Fraktionen im Größenbereich von 200 bis 300 Basenpaaren. Die Anzahl der durch die verschiedenen Bibliotheken identifizierten Gene wurde bewertet, und diese Tabelle zeigt Informationen zu den Clusteranzahlen. Gene, die Fehlerquote und der Prozentsatz der Alignierung der Einzel- und Paarendbibliotheken sowohl für Einzel- als auch für Paarendbibliotheken.Die 10 Nanogramm T7 LA-Bibliotheken identifizierten nahezu die gleiche Anzahl an Genen wie die 10 Mikrogramm UN-verstärkten Bibliotheken mit einem TPM von 10 oder mehr. Bei den Einzel-Read-Bibliotheken identifizierte die 10 Nanogramm T7 LA-Bibliothek 100 % der 8.500 Gene, die von der 10 Mikrogramm UN-verstärkten Bibliothek bei Paradigma-Bibliotheken erfasst wurden. Die 10 Nanogramm T7 LA-Bibliothek identifizierte 86 % der Gene, die von der 10 Mikrogramm unverstärkten Bibliothek erfasst wurden.Bibliotheken, die aus weniger als 10 Nanogramm hergestellt wurden, konnten nicht so viele Gene identifizieren. Beispielsweise identifizierte die Einzellese-Protokoll-Bibliothek mit einem Nanogramm T-sieben-LA nur etwa 50 % der Gene, die von der 10-Mikrogramm-MinAmp-Bibliothek identifiziert wurden. Daher sollte die geringste Menge an Gesamt-RNA für die Verwendung mit dem T-sieben-LA-Protokoll auf 10 Nanogramm begrenzt werden, die einem housekeeping-Gen zugeordnet werden.GA DH zeigt, dass alle T-sieben-LA-Bibliotheken, die mit mindestens 10 Nanogramm startender RNA hergestellt wurden, alle Exons identifizierten, einschließlich des extremen 5'-Exons. Die Maßstabsleiste links für die Einzel-Read-Bibliotheken entspricht 350 Gesamtreads. Die Maßstabsleiste in der Mitte für die DEN-Bibliotheken entspricht 5.000 Gesamtreads.Ein Vergleich der 10 Nanogramm T-sieben-LA-Einzel- und Paar-End-Bibliotheken mit den Min-Amp-Bibliotheken zeigt einen hohen Grad an Ähnlichkeit. Zwischen der Einzel-Read-10-Nanogramm-T-sieben-LA-Bibliothek und der 10-Mikrogramm-Min-Amp-Bibliothek wurde eine Spearman-Korrelation von 0,90 erzielt, und zwischen der Paar-End-10-Nanogramm-T-sieben-LA-Bibliothek und der 10-Mikrogramm-Min-Amp-Bibliothek eine Korrelation von 0,95. Zusätzlich wurde ein Vergleich zwischen den beiden Einzel-Read- und Paar-End-Bibliotheken, die aus 10 Nanogramm Gesamt-RNA hergestellt wurden, durchgeführt, und der sehr hohe Korrelationskoeffizient zeigt, dass beide Typen von Bibliotheken, die mit dem T-sieben-LA-Protokoll erstellt wurden, eine sehr ähnliche Genexpressions-Signatur erzeugen.Schließlich wurden, da diese Bibliotheken aus humaner embryonaler Stammzell-RNA 30 Stammzellen hergestellt wurden, gezielt bestimmte Gene in den Bibliotheken gesucht. Fast alle dieser Gene wurden durch die Bibliotheken identifiziert, die aus mindestens 10 Nanogramm Gesamt-RNA hergestellt wurden, wodurch dieses Protokoll validiert wird. Bei der Durchführung dieses Protokolls ist es wichtig, daran zu denken, die kleinen RNA-Proben äußerst sorgfältig zu handhaben, um eine Degradation zu verhindern.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein sehr gutes Verständnis dafür haben, wie man Illumina-, Mr.Aeq-Einzelstrang- und Paradigm-Bibliotheken aus sehr geringen Mengen an Ausgangsmaterial herstellt.

single-read-paired-end-mrna-seq-illumina-libraries-from-10-nanograms

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Forschung

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Biology

Biologie

MicroRNAs (miRNAs) sind eine weit verbreitete Klasse von regulatorischen Molekülen. Hier beschreiben wir eine miRNA-Klonierungsmethode, die auf zwei potenten Ligationsschritten beruht, gefolgt von einer Hochdurchsatz-Sequenzierung. Unsere Methode ermöglicht eine genaue genomweite Quantifizierung von miRNAs.

Hoch effiziente Ligation kleine RNA-Moleküle für MicroRNA Quantifizierung von Hochdurchsatz-Sequenzierung

Dieses Protokoll beschreibt die kombinatorische Verwendung von ChIP-Seq, 4sU-Seq, total RNA-Seq und Ribosom profiling für Zelllinien und Primärzellen. Nachverfolgen von Änderungen im Transkriptionsfaktor verbindlich, de Novo Transkription, RNS-Verarbeitung, Umsatz und Übersetzung im Laufe der Zeit und zeigt den gesamten Verlauf der Ereignisse in aktivierten und/oder sich rasch verändernden Zellen ermöglicht.

Echtzeit-Analyse des Transkriptionsfaktors verbindlich, Transkription, Übersetzung und Umsatz, globale Ereignisse während der zellulären Aktivierung anzuzeigen

Dieses Protokoll wird veranschaulicht, wie extrazelluläre MicroRNAs von Zellkulturmedien für kleine RNA Bibliotheksbau und Sequenzierung der nächsten Generation zu reinigen. Verschiedenen Qualitätskontrolle Checkpoints werden beschrieben, Leser zu verstehen, was beim Arbeiten mit niedrigen Eingabesamples wie ExRNAs zu erwarten.

Isolieren, Sequenzierung und Analyse von extrazellulären MicroRNAs aus humanen mesenchymalen Stammzellen

Die Nanopore-Sequenzierung ist eine neuartige Technologie, die eine kostengünstige Sequenzierung an entfernten Orten und ressourcenarmen Umgebungen ermöglicht. Hier stellen wir ein Protokoll zur Sequenzierung von mRNAs aus Vollblut vor, das mit solchen Bedingungen kompatibel ist.

Sequenzierung von mRNA aus Vollblut mit Nanopore-Sequenzierung

Wir präsentieren ein detailliertes reparaturbasiertes Analyseprotokoll für kleine RNA-Bibliotheken mit weniger Voreingenommenheit als Standardmethoden und einer erhöhten Empfindlichkeit für 2'-O-Methyl-RNAs. Dieses Protokoll kann mit hausgemachten Reagenzien befolgt werden, um Kosten zu sparen oder Kits für die Bequemlichkeit zu verwenden.

Verbesserung der kleinen RNA-Seq: Weniger Voreingenommenheit und bessere Detektion von 2'-O-Methyl RNAs

Wir beschreiben eine Technik zur Profilierung von microRNAs in frühen Mausembryonen. Dieses Protokoll überwindet die Herausforderung des niedrigen Zelleingangs und der kleinen RNA-Anreicherung. Dieser Assay kann verwendet werden, um Veränderungen in der miRNA-Expression im Laufe der Zeit in verschiedenen Zelllinien des frühen Mausembryons zu analysieren.

Vorbereitung kleiner RNA-Bibliotheken für die Sequenzierung von frühen Mausembryonen

Hier beschreiben wir die Phasen der Probenentnahme und Vorbereitung für RIBO-seq in Bakterien. Die Sequenzierung der nach diesen Richtlinien erstellten Bibliotheken liefert ausreichende Daten für eine umfassende bioinformatische Analyse. Das Protokoll, das wir präsentieren, ist einfach, verwendet Standard-Laborgeräte und dauert sieben Tage von der Lyse bis zur Beschaffung von Bibliotheken.

RIBO-seq in Bakterien: ein Probensammlungs- und Bibliotheksvorbereitungsprotokoll für die NGS-Sequenzierung

Die absolute Quantifizierung der RNA-Sequenzierung (AQRNA-seq) ist eine Technologie, die entwickelt wurde, um die Landschaft aller kleinen RNAs in biologischen Gemischen zu quantifizieren. Hier werden sowohl die Bibliotheksvorbereitung als auch die Datenverarbeitungsschritte von AQRNA-seq demonstriert, wobei Veränderungen im Transfer-RNA (tRNA)-Pool in Mycobacterium bovis BCG während der hungerinduzierten Dormanzphase quantifiziert werden.

AQRNA-seq zur Quantifizierung kleiner RNAs

Large-Scale-Bildschirme von Metagenombanken

RNA Extraktion aus Neuroprecursor Zellen unter Verwendung des Bio-Rad Total RNA Kit

Erfahren Sie die Herstellung von Illumina mRNA-Seq-Bibliotheken aus nur 10 Nanogramm Gesamt-RNA mittels T7-linearer Amplifikation. Diese Methode ermöglicht Genexpressionsanalysen aus begrenzten Zellpopulationen.

Single Read und Paired End mRNA-Seq Illumina Bibliotheken von 10 Nanogramm Gesamt-RNA

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