Single Read und Paired End mRNA-Seq Illumina Bibliotheken von 10 Nanogramm Gesamt-RNA

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Illumina-mRNA-Sequenzbibliotheken aus geringen Mengen Ausgangsmaterial herzustellen. Der erste Schritt des Verfahrens ist die Reverse Transkription von Gesamt-RNA mit DTT-sieben Primern zur Erzeugung von CD-NA. Die CD-NA wird anschließend für die RNA-Amplifikation durch In-vitro-Transkription verwendet. Danach wird die amplifizierte RNA einer zufälligen Fragmentierung unterzogen.

Die Reverse Transkription der fragmentierten RNA erzeugt CDNA, die einer Adapterligation, Größenselektion und PCR-Amplifikation unterzogen wird. Letztendlich zeigt dieses Protokoll das Genexpressionsprofil der Probe durch die Messung der Genkopienzahlen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass lediglich 10 Nanogramm Gesamt-RNA als Ausgangsmaterial benötigt werden.

Das ist um Größenordnungen geringer als das, was von anderen bestehenden Protokollen verlangt wird. Darüber hinaus kann es gepaarte Bibliotheken aus solch geringen Ausgangsmengen an RNA erzeugen. Diese Methode wird es Wissenschaftlern ermöglichen, neue Fragestellungen in der Biologie zu untersuchen, indem sie die Bestimmung von Genexpressionsprofilen aus schwer zugänglichen Zellpopulationen erlaubt, wie sie beispielsweise aus Laser-Kapture-Mikrodissektion oder aus Durchflusszytometrie stammen.

Die Idee zur Entwicklung dieser Methode entstand zunächst, als wir die Genexpression einer sehr begrenzten Anzahl von Zellen analysieren mussten, die aus humanen amnionischen Stammzellen differenziert wurden. Eine visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend, da die Handhabung von RNA aufgrund der sehr geringen Menge an RNA, die leicht degradiert werden kann, schwer zu erlernen ist. Die Durchführung der Methode demonstrieren Angela Elwell, Jennifer Bolen und Baal Kimm Wynn aus meinem Labor.

Die Methode zur parallelen Herstellung von Einzel- und Paired-End-Sequenzierbibliotheken ist ein mehrstufiges Verfahren, wie in diesem Flussdiagramm dargestellt. Zunächst wird Gesamt-RNA aus den Zellen oder Geweben der Untersuchung isoliert und zur Herstellung doppelsträngiger CD NA verwendet. Anschließend werden polyadenylierte Boten-RNAs selektiv aus der CD NA mittels der auf T sieben basierenden ewin linearen Amplifikationsmethode amplifiziert. Danach wird die amplifizierte poly a A zufällig fragmentiert.

Nach der Aufreinigung des fragmentierten RNA-Materials wird dieses revers transkribiert zu cDNA. Die cDNA wird an den Enden repariert, und es werden Basen an das 3'-Ende der DNA-Fragmente angehängt. Anschließend erfolgt die Ligation von Adaptern an die DNA, gefolgt von keiner Einzelschnitt-Digestion. Im Fall der Einzel-Read-Bibliothek wird die DNA-Bibliothek dann durch Gelelektrophorese gereinigt und mittels PCR amplifiziert, um die Illumina-Adapter zu ligieren.

Schließlich ist die DNA-Bibliothek nach der Quantifizierung bereit für die Sequenzierung. Für dieses Video werden nur ausgewählte Verfahren innerhalb dieses Protokolls demonstriert. Die Reverse Transkription der fragmentierten polyA-mRNAs in cDNA umfasst die Synthese des ersten und zweiten Strangs.

Fügen Sie für die Synthese des ersten Strangs für die Single-Read-Bibliothek die folgenden Reagenzien in ein PCR-Gefäß hinzu: 10 Mikroliter fragmentierte poly-mRNA und ein Mikroliter des nicht-einen zufälligen Nonamer-Primers. Die Sequenz des nicht-einen Nonamer-Primers ist hier dargestellt. Die fünfendnahe Sequenz, die grün dargestellt ist, stellt die nicht-eine Restriktionsstelle dar.

Während die in Blau dargestellte Sequenz das reverse Komplement der Adapter-B-Sequenz von Illumina aus dem Chip-Sequenzier-Kit ist, inkubieren Sie das Gemisch fünf Minuten lang bei 70 Grad Celsius im Thermocycler und kühlen es anschließend rasch auf Eis ab. Unter Beibehaltung des Gemischs auf Eis fügen Sie folgende Reagenzien aus dem Superscript-III-Kit hinzu: vier Mikroliter 5x First-Strand-Puffer, zwei Mikroliter DTT und 1,5 Mikroliter DNTP-Gemisch. Verwenden Sie im DNTP-Gemisch anstelle von DCTP fünf Methyl-DCTP. Stellen Sie das Röhrchen im Thermocycler bei 42 Grad Celsius für zwei Minuten und geben Sie danach ein Mikroliter Superscript-III-Reversetranskriptase hinzu. Inkubieren Sie eine Stunde lang bei 42 Grad Celsius.

Als Nächstes richten Sie die Reaktion zur Synthese des ersten Strangs für die para-end-Bibliothek ein. Geben Sie die folgenden Reagenzien in ein PCR-Gefäß: 10 Mikroliter fragmentiertes poly NNA und ein Mikroliter zufälliger Hexamer-Primer. Inkubieren Sie fünf Minuten bei 65 Grad Celsius im Thermocycler und kühlen Sie anschließend schnell auf Eis ab.

Unter Beibehaltung des Röhrchens auf Eis folgende Reagenzien aus dem Superscript-Three-First-Strand-Kit hinzufügen: vier Mikroliter 5x First-Strand-Puffer, zwei Mikroliter DTT und 1,5 µL dNTPs. Im Thermocycler bei 45 °C eine Minute lang inkubieren. Anschließend ein Mikroliter Superscript Three Reverse Transkriptase hinzufügen und bei 45 °C eine Stunde lang inkubieren.

Beide Reaktionen sind bereit für die Synthese des zweiten Strangs. Geben Sie jeder der Mischungen auf Eis die folgenden Reagenzien aus dem Superscript Two-Kit hinzu: 91 µL freies Wasser, 30 µL 5x Second-Strand-Puffer, 3 µL dNTPs, 1 µL E. coli-DNA-Ligase, 4 µL E. coli-DNA-Polymerase und 1 µL E. coli-RNase H. Mischen Sie jede Probe durch vorsichtiges Umstülpen, zentrifugieren Sie kurz und inkubieren Sie bei 16 °C für zwei Stunden.

Fügen Sie für die Endreparatur der cDNA für die Single-Read-Bibliothek zu 40 Mikrolitern gereinigter cDNA die folgenden Reagenzien hinzu: fünf Mikroliter T4-DNA-Ligasepuffer mit 10 Millimolar ATP, zwei Mikroliter dNTP-Mix, ein Mikroliter T4-DNA-Polymerase, ein Mikroliter Klenow-Enzym und ein Mikroliter T4-PNK zur Endreparatur der cDNA. Für die Paired-End-Bibliothek fügen Sie zu 30 Mikrolitern gereinigter cDNA diese Reagenzien hinzu: 45 Mikroliter RNase-freies Wasser.

10 µL T4-DNA-Ligase-Puffer mit 10 mmol ATP, 4 µL 10 mmol DNTP-Mix, 5 µL T4-DNA-Polymerase, 1 µL Klenow-Enzym und 5 µL T4-PNK; inkubieren Sie beide Röhrchen im Thermocycler nach der Endreparatur bei 20 °C für 30 Minuten.

Der nächste Schritt in diesem Protokoll besteht darin, Adeninbasen an das 3'-Ende der DNA-Fragmente für die Single-Read-Bibliothek anzuhängen. Bereiten Sie die folgende Reaktionsmischung vor: 34 Mikroliter DNA-Probe, 5 Mikroliter Klino-Puffer, 10 Mikroliter DATP und 1 Mikroliter Klino exo. Für die Paired-End-Bibliothek bereiten Sie die folgende Reaktionsmischung vor: 32 Mikroliter DNA-Probe, 5 Mikroliter Clin-Out-Puffer.

10 µL dATP und 3 µL Clin-Out-Exo: Inkubieren Sie beide Reaktionsgemische 30 Minuten bei 37 °C, bevor Sie die Reaktionen für die Adapterligation vorbereiten. Tauen Sie die Adapter auf Eis auf und verdünnen Sie sie im Verhältnis 1:20 für die Einzellesebibliothek. Verwenden Sie das Illumina-Chip-Sequenz-Sample-Prep-Kit, um das folgende Reaktionsgemisch herzustellen: 10 µL DNA-Probe, 1 µL Adapter-Oligo-Mix, 15 µL 2X DNA-Ligase-Puffer und 4 µL DNA-Ligase; inkubieren Sie 15 Minuten lang.

Bei Raumtemperatur für die Paired-End-Bibliothek verwenden Sie das Illumina Paired-End-Sample-Prep-Kit, um die folgende Reaktion vorzubereiten. Mischen Sie 10 Mikroliter DNA-Probe, 10 Mikroliter PE-Adapter-Oligo-Mix, 25 Mikroliter zweifach konzentrierter DNA-Ligase-Puffer und 5 Mikroliter DNA-Ligase; inkubieren Sie 15 Minuten bei 20 Grad Celsius. Reinigen Sie anschließend beide Ligationsreaktionen mit XMO-Säulen.

Eluieren Sie die Single-Read-Bibliothek und 44 Mikroliter Wasser, um die Paired-End-Bibliothek mit sechs Mikrolitern Elutionspuffer zu eluieren, gefolgt von einer weiteren Elution in fünf Mikrolitern EB. Führen Sie eine Not-One-Digestion ausschließlich für die Single-Read-Bibliothek durch. Inkubieren Sie für zwei Stunden bis über Nacht bei 37 Grad Celsius, nachdem Sie die Reaktion mithilfe einer ZY IMO-Säule gereinigt haben.

Eluieren Sie die Single-Read-Bibliothek mit sechs Mikrolitern Puffer EB, gefolgt von einer zweiten Verdünnung mit fünf Mikrolitern EB. Die an Adapter ligierte DNA für beide Bibliotheken ist nun bereit für die Größenselektion. Das Größenselektionsverfahren für die an Adapter ligierte DNA wird unter Verwendung eines 2 %igen Cyber Safe EE von In Vitrogen durchgeführt; starten Sie dazu das Programm „Null“ für eine Vorlaufzeit von zwei Minuten.

Nach dem Vorelektrophoretischen Lauf 10 µL der One KB Plus-Ladder und der 2D-NA-Proben laden. Die leeren Gelen mit je 10 µL Wasser auffüllen und das Laufprogramm starten. Ein Egel 2 % für 28 Minuten laufen lassen.

Wenn der Lauf abgeschlossen ist, selektieren Sie mithilfe einer frischen Rasierklinge die Gelelektrophorese-Fraktionen im Größenbereich von 200 bis 300 Basenpaaren. Die Anzahl der durch die verschiedenen Bibliotheken identifizierten Gene wurde bewertet, und diese Tabelle zeigt Informationen zu den Clusteranzahlen. Gene, die Fehlerquote und der Prozentsatz der Alignierung der Einzel- und Paarendbibliotheken sowohl für Einzel- als auch für Paarendbibliotheken.

Die 10 Nanogramm T7 LA-Bibliotheken identifizierten nahezu die gleiche Anzahl an Genen wie die 10 Mikrogramm UN-verstärkten Bibliotheken mit einem TPM von 10 oder mehr. Bei den Einzel-Read-Bibliotheken identifizierte die 10 Nanogramm T7 LA-Bibliothek 100 % der 8.500 Gene, die von der 10 Mikrogramm UN-verstärkten Bibliothek bei Paradigma-Bibliotheken erfasst wurden. Die 10 Nanogramm T7 LA-Bibliothek identifizierte 86 % der Gene, die von der 10 Mikrogramm unverstärkten Bibliothek erfasst wurden.

Bibliotheken, die aus weniger als 10 Nanogramm hergestellt wurden, konnten nicht so viele Gene identifizieren. Beispielsweise identifizierte die Einzellese-Protokoll-Bibliothek mit einem Nanogramm T-sieben-LA nur etwa 50 % der Gene, die von der 10-Mikrogramm-MinAmp-Bibliothek identifiziert wurden. Daher sollte die geringste Menge an Gesamt-RNA für die Verwendung mit dem T-sieben-LA-Protokoll auf 10 Nanogramm begrenzt werden, die einem housekeeping-Gen zugeordnet werden.

GA DH zeigt, dass alle T-sieben-LA-Bibliotheken, die mit mindestens 10 Nanogramm startender RNA hergestellt wurden, alle Exons identifizierten, einschließlich des extremen 5'-Exons. Die Maßstabsleiste links für die Einzel-Read-Bibliotheken entspricht 350 Gesamtreads. Die Maßstabsleiste in der Mitte für die DEN-Bibliotheken entspricht 5.000 Gesamtreads.

Ein Vergleich der 10 Nanogramm T-sieben-LA-Einzel- und Paar-End-Bibliotheken mit den Min-Amp-Bibliotheken zeigt einen hohen Grad an Ähnlichkeit. Zwischen der Einzel-Read-10-Nanogramm-T-sieben-LA-Bibliothek und der 10-Mikrogramm-Min-Amp-Bibliothek wurde eine Spearman-Korrelation von 0,90 erzielt, und zwischen der Paar-End-10-Nanogramm-T-sieben-LA-Bibliothek und der 10-Mikrogramm-Min-Amp-Bibliothek eine Korrelation von 0,95. Zusätzlich wurde ein Vergleich zwischen den beiden Einzel-Read- und Paar-End-Bibliotheken, die aus 10 Nanogramm Gesamt-RNA hergestellt wurden, durchgeführt, und der sehr hohe Korrelationskoeffizient zeigt, dass beide Typen von Bibliotheken, die mit dem T-sieben-LA-Protokoll erstellt wurden, eine sehr ähnliche Genexpressions-Signatur erzeugen.

Schließlich wurden, da diese Bibliotheken aus humaner embryonaler Stammzell-RNA 30 Stammzellen hergestellt wurden, gezielt bestimmte Gene in den Bibliotheken gesucht. Fast alle dieser Gene wurden durch die Bibliotheken identifiziert, die aus mindestens 10 Nanogramm Gesamt-RNA hergestellt wurden, wodurch dieses Protokoll validiert wird. Bei der Durchführung dieses Protokolls ist es wichtig, daran zu denken, die kleinen RNA-Proben äußerst sorgfältig zu handhaben, um eine Degradation zu verhindern.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein sehr gutes Verständnis dafür haben, wie man Illumina-, Mr.Aeq-Einzelstrang- und Paradigm-Bibliotheken aus sehr geringen Mengen an Ausgangsmaterial herstellt.