Hydrophobe Salz-modifizierte Nafion zur Enzymimmobilisierung und Stabilisierung

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, ein mykellares Polymer zur Immobilisierung und Stabilisierung von Enzymen herzustellen. Um dies zu erreichen, mischen Sie zunächst die Neon-Suspension mit dem Cheal-Ammoniumbromid-Salz und wirbeln die Mischung, um die protonierte Form von Nafion durch Ammoniumsalze auszutauschen. Im zweiten Schritt wird das resultierende Polymer getrocknet, indem die Mischung in ein Wannenboot gegossen und die Lösungsmittel verdunsten lassen.

Als Nächstes den Polymeren in entionisiertes Wasser für 12 bis 24 Stunden einweichen, um überschüssiges Salz zu entfernen. Nach der Salzextraktion den Polymeren mit Wasser abspülen und anschließend vollständig durch Verdunstung trocknen lassen. Der letzte Schritt besteht darin, den Polymeren in ein sauberes Gefäß zu überführen und ihn zur Verwendung bei der Enzym-Immobilisierung in Lösungsmittel erneut aufzuschwemmen. Letztendlich wird dieser mykellare Polymerträger für die Immobilisierung von Enzymen eingesetzt, um die Stabilität von Enzymen in Aktivitätsassays zu verbessern.

Im Allgemeinen werden Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten haben, da der Vorgang zwar äußerst einfach erscheint, die Trocknungsprozedur jedoch entscheidend für die Herstellung eines funktionsfähigen Polymers ist. Die Durchführung der Prozedur wird von Shu, einem Doktoranden in meinem Labor, demonstriert, um mit der Modifizierung von Nafion mit Nerium-Ammoniumsalzen zu beginnen. Geben Sie ein dreifaches molares Überschussvolumen bezogen auf die Säuregruppen des Nafion-Polymers an Alkylammoniumbromid-Salz ein.

Überführen Sie das Alk-Ammoniumbromid-Salz kräftig in ein Glasfläschchen. Schütteln Sie eine Flasche mit einer 5 %igen (Gewicht pro Volumen) Nafion-Suspension etwa 30 Sekunden lang, um sicherzustellen, dass das Nafion gleichmäßig in Lösung suspendiert ist. Pipettieren Sie zwei Milliliter des nun erneut suspendierten Nafions ab und geben Sie es zu dem Glasfläschchen mit dem AGU-Ammoniumbromid-Salz hinzu.

Versetzen Sie das Gefäß bei 900 U/min für 10 bis 15 Minuten im Vortex. Gießen Sie anschließend die viskose Lösung in eine Kunststoff-Wägepfanne und übertragen Sie mithilfe einer Pipette jegliche Restlösung aus dem Gefäß in die Wägepfanne. In diesem Beispiel ist das Boot teilweise abgedeckt und wird zur vollständigen Verdunstung der Lösungsmittel aus der Wägepfanne mit einer Verdunstungsrate, die mehr als sechs Stunden dauert, auf der Laborbank belassen.

Die vollständige Verdampfung des gesamten Lösungsmittels mit der geeigneten Verdampfungsrate sollte einen gelben oder braunen transparenten Film auf dem Boden der Wägepfanne hinterlassen, wie hier gezeigt. Wenn das Lösungsmittel zu schnell verdampft, bildet sich anstelle eines transparenten Films ein krustiges oder kristallines Material, was darauf hinweist, dass die mikrozellulare Struktur des Polymers zerstört wurde. Wenn die Lösungsmittelverdampfung zu langsam erfolgt oder das Ammoniumsalz zu lange reagieren darf und dabei zu viel Wasserdampf aufnimmt, bildet sich entweder ein klebriges oranges Gel oder ein weißes kristallines Material.

In beiden Fällen muss das Verfahren erneut gestartet werden. Nachdem das gesamte Lösungsmittel mit der geeigneten Verdampfungsrate verdunstet ist, füllen Sie die Wägeschale mit 10 bis 20 Milliliter 18 Megaohm-Zentimeter entionisiertem Wasser, decken Sie sie ab und lassen Sie sie 12 bis 24 Stunden lang einweichen, um überschüssige Alkylammoniumbromid-Salze und HBr zu entfernen. 12 bis 24 Stunden später pipettieren Sie das Wasser ab und geben so viel entionisiertes Wasser hinzu, dass die Schale vollständig gefüllt ist. Achten Sie darauf, stets vom Polymerfilm weg zu pipettieren, um Verluste zu vermeiden.

Spülen Sie insgesamt dreimal nach den Spülvorgängen. Lassen Sie das Wiegetablett unbedeckt stehen, bis das Polymer vollständig trocken ist. Wenn es vollständig trocken ist, sollte das Polymer ein durchsichtiger und leicht spröder Kunststofffilm sein.

Im Gegensatz dazu weisen Polymere, die nicht ordnungsgemäß getrocknet wurden, nach der Salzauszugung ein ganz anderes Erscheinungsbild auf, wie hier gezeigt. Entfernen Sie vorsichtig mit einem Spatel den getrockneten Film aus der Wägepfanne und überführen Sie ihn in ein sauberes Glasfläschchen. Geben Sie zwei Milliliter Ethanol und drei keramische Mischkugeln hinzu und wirbeln Sie vier Stunden lang oder bis der Polymerfilm vollständig resuspendiert ist.

Die alkyammoniummodifizierte Nathe-On-Lösung ist nun bereit zur Verwendung für die Enzymimmobilisierung. Falls das zu immobilisierende Enzym ein trockenes Enzym ist, wiegen Sie ein Milligramm des Enzyms in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen ab und geben ein Milliliter eines 100 Millimolar pH-7-Phosphatpuffers hinzu, um eine Enzymlösung mit einer Konzentration von einem Milligramm pro Milliliter herzustellen. Überführen Sie 120 Mikroliter der Enzymlösung mit einer Konzentration von einem Milligramm pro Milliliter in ein neues Röhrchen.

Geben Sie 60 Mikroliter der ALK-ammoniummodifizierten Nafion-Lösung hinzu und wirbeln Sie 10 Sekunden lang im Vortex. Das Verhältnis von Enzym zu Polymerlösung muss bei einer Vergrößerung der Menge für eine große Anzahl von Replikaten zwei zu eins betragen. Geben Sie abschließend jeweils 60 Mikroliter der Enzym-Polymer-Lösung in den Boden der drei separaten Küvetten mit einer Fläche von je einem Quadratzentimeter und lassen Sie sie über Nacht trocknen.

Die Stabilität des Enzyms im Polymerfilm kann anschließend anhand von enzymatischen Aktivitätsanalysen wie gezeigt bewertet werden. Um diese Analyse zu beginnen, geben Sie die folgenden Reagenzien in das Vial, in dem die modifizierte Nafion-Polymermatrix mit dem NAD-abhängigen Dehydrogenase-Enzym abgeschieden wurde: 1,3 Milliliter 50 Millimolarer Natriumpyrophosphat, 1,5 Milliliter frisch hergestelltes 15 Millimolares Nicotinamidadenindinukleotid oder NAD und 0,1 Milliliter Wasser.

Platzieren Sie die Küvette in einem UV-sichtbaren Spektrophotometer, das auf eine Wellenlänge von 340 Nanometern eingestellt ist. Geben Sie 0,1 Milliliter Ethanol in die Küvette und mischen Sie die Reagenzien, indem Sie die Lösung fünfmal vorsichtig auf- und abpipettieren. Verwenden Sie für die Blindprobe anstelle der 0,1 Milliliter Ethanol 0,1 Milliliter zusätzliches Wasser. Notieren Sie fünf Minuten nach Zugabe der Reagenzien zur Küvette die Extinktion bei 340 Nanometern.

Messen Sie die Extinktion erneut 20 Minuten nach Zugabe der Reagenzien zur qve; diese beiden Datenpunkte werden aufgetragen, um eine Steigung zu erhalten, die zur Berechnung der enzymatischen spezifischen Aktivität immobilisierter pq verwendet werden kann. Pipettieren Sie diese Reagenzien in die mit dem modifizierten Nafion-Polymer und PQQ-abhängiger Dehydrogenase co-kastete qve. 1,5 Milliliter Natriumphosphat und 200 Mikroliter 600 Mikromolar pH-Methylsulfat oder PMS.

Platzieren Sie die Probe in einem UV-sichtbaren Spektrophotometer, das auf eine Wellenlänge von 600 Nanometern eingestellt ist, und tariert das Gerät. Fügen Sie 100 Mikroliter einer Mischung aus 700 Mikrolitern Chlorogenol oder DCIP und 200 Mikrolitern des gewünschten Substrats hinzu. Mischen Sie die Reagenzien, indem Sie die Lösung fünfmal vorsichtig auf- und abpipettieren, um eine Blindprobe herzustellen.

Verwenden Sie 200 Mikroliter Wasser anstelle des Substrats der Wahl. Fünf Minuten nach Zugabe der Reagenzien. Messen Sie die Extinktion bei 600 Nanometern.

Messen Sie die Extinktion erneut 20 Minuten nach Zugabe der Reagenzien, um diesen Assay zu starten. Geben Sie hinzu zur Q VET co-gewalzten mit dem modifizierten Nafion-Polymer und Glucose-Oxidase. Zwei Milliliter einer Lösung, die Folgendes enthält: 0,2 molares p-Hydroxybenzoesäure, 0,02 % Natriumazid, 128 Einheiten Peroxidase, 0,3 Millimolares 4-Aminoantipyrin, einmolarer Kaliumphosphat und 50 Millimolares Glucose.

Gibt die Lösung durch fünfmaliges Auf- und Abpipettieren an. Stellen Sie den Q vet in ein UV-sichtbares Spektrophotometer, das auf eine Wellenlänge von 510 Nanometern eingestellt ist. Fünf Minuten nachdem die Reagenzien dem qve zugesetzt wurden.

Messen Sie die Absorption bei 510 Nanometern. Nehmen Sie danach die Absorption erneut 20 Minuten nach Zugabe der Reagenzien auf. Diese Tabelle zeigt die Ergebnisse des Assays zur NAD-abhängigen Glucose-Dehydrogenase-Aktivität, die an immobilisierte und ausgewählte modifizierte Nafion-Polymere gebunden ist.

Es wurde beobachtet, dass die immobilisierte, NAD-abhängige Glucosedehydrogenase eine geringere spezifische Aktivität aufwies als das Enzym in Pufferlösung. Dies liegt daran, dass Polymermembranen den Transport großer Moleküle vermindern; obwohl Glucose, das Substrat des Assays, klein ist, muss das Cofaktor NAD in die Membran hinein- und wieder herausdiffundieren. Bei NAD-abhängigen Dehydrogenasen verringert die durch die Immobilisierung im Polymer bedingte Transportbegrenzung die beobachtete enzymatische Aktivität.

In der folgenden Tabelle sind die Ergebnisse von Assays zur Aktivität der PQQ-abhängigen Glucosedehydrogenase dargestellt, die auf immobilisierten und ausgewählten modifizierten Nafion-Polymeren getestet wurde. Es ist wichtig anzumerken, dass die auf den meisten Nafion-Filmen immobilisierten Enzyme eine höhere Aktivität aufweisen als die Enzyme in Pufferlösung. Da die PQQ-abhängige Glucosedehydrogenase ein membranassoziiertes Protein ist, bietet das hydrophobe, modifizierte My-Zellulär-Nafion eine membranähnlichere Umgebung als der Puffer, um die aktive PQQ-abhängige Glucosedehydrogenase zu stabilisieren, wodurch die Enzymaktivität gesteigert wird.

Letztlich die repräsentativen Assayergebnisse der spezifischen Aktivität von Glucose-Oxidase. Immobilisierte und ausgewählte modifizierte Nafion-Polymere sind in dieser Tabelle dargestellt. Die enzymatischen Assays für jedes der Polymere mit jeweils einem der drei Enzyme zeigen, dass die Trends der relativen spezifischen Aktivität im Vergleich zum Enzym in Lösung von dem jeweiligen Enzymsystem abhängen.

Daher muss das genaue für jedes Enzym benötigte Polymer optimiert werden. Bei dem Versuch, dieses Verfahren durchzuführen, ist es wichtig, daran zu denken, dass der Trocknungsschritt für dieses spezielle Verfahren entscheidend ist.