Grundlegende

In diesem Video zeigen wir Ihnen, wie man C. elegans im ersten Larvenstadium synchronisiert. Diese Methode ist einfach, aber sehr gebräuchlich und daher äußerst nützlich, besonders wenn Sie noch Anfänger sind.

Wenn Sie ein C-Experte sind, finden Sie hier möglicherweise einige Hinweise zur Optimierung dieses Protokolls. Die Grundlage der Synchronisation von Würmern beruht auf der relativen Resistenz von L1-Larven und Embryonen gegenüber alkalischer Hypochloritlösung im Vergleich zu erwachsenen Tieren. Diese erwachsenen Würmer mit zahlreichen enthaltenen Embryonen werden mit einer Hypochloritlösung inkubiert, sodass sie abgetötet werden und nur die Embryonen übrig bleiben.

Der zweite Teil der Synchronisierung wird durch Nahrungsmangel erreicht, sodass die Embryonen, obwohl sie zu unterschiedlichen Zeitpunkten eintreffen, nicht weiter als bis zum L1-Stadium entwickeln. Der erste Schritt, um ein Blitzing-Protokoll zu beginnen, besteht darin, Würmer im Eiablagestadium zu haben, wobei mehrere Eier auf der Platte verteilt sind. Verwenden Sie M9, um die erwachsenen Tiere zu gewinnen, um die Ernte durchzuführen.

Außerdem können die Embryonen, die bereits an die Oberfläche der Platte migriert sind, mit einem weichen Material wie einem Stück Röntgenfilm abgeschabt und die Bakterien durch mehrere M-9-Waschungen entfernt werden. Gewöhnlich reichen ein paar Waschungen aus. Sobald die Würmer gewaschen wurden, ist es an der Zeit, gemäß unseren Präferenzen die frisch zubereitete Bleichlösung hinzuzufügen.

Steuern Sie die Inkubationszeit, während Sie das Reagenzglas schütteln. Sie können die Entwicklung der erwachsenen Tiere unter dem Stereomikroskop überwachen. Sobald nahezu keine Kadaver mehr sichtbar sind, beenden Sie die Reaktion, indem Sie M9 hinzufügen, bis das Reagenzglas vollständig gefüllt ist.

Um das Protokoll abzuschließen, führen Sie mindestens drei Waschschritte durch. Mit M-neun-Eiern werden die Eier über Nacht unter kontinuierlicher Schüttelung in M-neun-Puffer inkubiert, wodurch das Ausschlüpfen ermöglicht, die weitere Entwicklung der Würmer jedoch verhindert wird. Obwohl die Synchronisierung bei jeder Temperatur zwischen 15 und 25 Grad durchgeführt werden kann, wird 15 empfohlen.

Da die Entwicklung langsamer verläuft, durchläuft, wie bereits erwähnt, elegans während seiner Entwicklung vier Larvenstadien vor der Erwachsenenphase, wobei die Dauer abhängig von der Temperatur ist, bei der es gezüchtet wird. Während der Typ C elegans Wachstumstemperaturen im Bereich von 15 bis 25 Grad verträgt, ist die Wachstumsrate jedoch höher.

Die obere Temperatur hier zeigt, wie sich nach 24 Stunden die Entwicklungsstadien, in denen sich die Würmer befinden, unterscheiden. Bei 15 und 25 Grad Celsius beobachten wir nach 48 Stunden bei 25 Grad bereits Embryonen. Allerdings müssen wir mehr als 80 Stunden warten, um Embryonen auf der Oberfläche der Platten zu sehen.

Bei Würmern, die bei 15 Grad gezüchtet wurden, um optimale Ergebnisse zu erzielen, müssen mehrere Aspekte berücksichtigt werden, wenn ein Blitz-Experiment durchgeführt wird. Ebenso wichtig ist es, Würmer im gewünschten Entwicklungsstadium für das Experiment zu erkennen. Daher zeigen wir Ihnen, wie man die Stadien entweder anhand der Größe, der differentiellen Interferenzkontrastmikroskopie oder der Färbung unterscheidet.

In diesem Diagramm können Sie die Wachstumsrate von GaN-Würmern in Abhängigkeit von der Temperatur erkennen, wie wir sagen, wachsen sie bei 25 Grad deutlich schneller. Es besteht eine Korrelation zwischen der Körpergröße von Tieren und ihrer Entwicklung in marinen Elementen. Mithilfe geeigneter Software können Tiere vermessen und anschließend in den entsprechenden Entwicklungsstand klassifiziert werden.

Laut diesem Diagramm ist die Fundstelle jedoch ein grober Marker für Entwicklungsstadien. Eine genauere Stadieneinteilung kann durch die Beobachtung von Teilen der Meere erreicht werden, anatomische Merkmale, die entweder mittels differentieller Interferenz, Kontrastmikroskopie oder DPI-Färbung genutzt und erkannt werden können. In unserem Labor haben wir dieses Protokoll verwendet, um Würmer für verschiedene Experimente zu synchronisieren, wie beispielsweise Mikroeier in Mono-Färbung, in situ-Visualisierung und Up-is-Färbung.

Außerdem hilft Ihnen dieses Protokoll, Verunreinigungen zu vermeiden. Zur Kontrastverstärkung wird die differentielle Interferenzkontrast- oder Nomarski-Mikroskopie angewendet. Bei ungefärbten, transparenten Proben werden die Tiere lebend auf einer Basis aus 2 % Agros Agar aufgebracht, der im Voraus hergestellt und bei vier Grad gelagert werden kann, wenn er benötigt wird.

Es kann geschmolzen und bei 65 Grad gehalten werden. Sobald das Agarose geschmolzen ist, bringen Sie etwas Klebeband auf einem Objektträger an und platzieren Sie diese an beiden Seiten eines dritten Objektträgers. Nehmen Sie vorsichtig etwas Agarose und geben Sie einen Tropfen auf den Objektträger ohne Klebeband.

Bedecken Sie die Agaros mit einer weiteren, quer platzierten Objektträgerplatte. Sobald der Pfad fest ist, trennen Sie die beiden Objektträger vorsichtig, indem Sie einen auf dem anderen entlangschieben. Das Polster bleibt an einem davon haften.

Geben Sie etwas Amazon auf das Polster, um die Würmer immobilisiert zu halten. Sammeln Sie einige Würmer unter dem Stereomikroskop und überführen Sie sie in den Tropfen lele. Vermeiden Sie es, den Pfad zu beschädigen.

Nehmen Sie einen Deckelträger und geben Sie etwas Nagellack an die Ränder. Platzieren Sie vorsichtig den Deckelträger auf diesem Objektträger, um die Bildung von Blasen zu vermeiden. Die Präparation kann sofort unter dem Mikroskop betrachtet werden. Eines der einfachsten Merkmale der C. elegans-Anatomie ist die Alva.

Beispielsweise ist ein aava mit einer dreifachen Weihnachtsform charakteristisch für das L-vier-Stadium. Detaillierte Informationen zur c-elgan-Anatomie während der Entwicklung sind auf www.orla.org erhältlich. Die Tapis-Färbung ist ein gängiges Verfahren, um einzelne Zellen zu identifizieren.

Die Fixierung mit dem Tunnel ist eine schnelle Methode, um Würmer zu fixieren. Für die DAPPY-Färbung geben Sie zuerst einen Tropfen M-neun-Puffer auf die Oberfläche eines Objektträgers. Nehmen Sie einige Würmer direkt von der Platte und überführen Sie sie in den Tropfen M-neun.

Entfernen Sie überschüssiges M9 entweder mit einer Pipette oder mit einem weichen Tuch. Fügen Sie einen Tunnel zu den Würmern hinzu. Wiederholen Sie dies.

Wenn der erste Tropfen trocken ist, geben Sie etwas Einbettmedium mit API hinzu und lassen Sie es über Nacht lagern, bevor Sie die Präparation zum Mikroskop bringen. Die Entwicklung des Präparats kann leicht in einer warmen Umgebung mit API beobachtet werden.