Stereotaktischen Chirurgie für Exzitotoxische Läsion Spezifische Hirnareale in der erwachsenen Ratte

Gezielte Abtragung von spezifischen Hirnregionen (en) durch Infusion unter Verwendung eines stereotaktischen Koordinaten Excitotoxin beschrieben. Diese Technik könnte auch für die Infusion von anderen Chemikalien in dem Gehirn der Ratte angepasst werden.

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist die Läsion eines bestimmten Bereichs des Rattengehirns durch stereotaktische Infusion eines Erregertoxins. Dies wird erreicht, indem zunächst eine Ratte ordnungsgemäß in das stereotaktische Gerät eingebaut wird. Der zweite Schritt besteht darin, die Infusionsposition anhand von stereotaktischen Koordinaten zu lokalisieren.

Als nächstes wird das Excitotoxin infundiert und von der Nadelspitze weg diffundiert. Der letzte Schritt besteht darin, die Nadel zu entfernen und den Schnitt zu schließen. Letztendlich werden immunhistochemische Gegenfärbungen von fixierten Gewebeschnitten verwendet, um eine effektive und korrekt lokalisierte Läsion zu zeigen.

Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Bereich der Neurowissenschaften zu beantworten, wie z. B. die Funktionen diskreter Hirnareale. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da Sie für die richtige Montage des Kopfes, so dass er waagerecht und sicher ist, wissen müssen, wie die richtige Position aussieht. Um das Experiment vorzubereiten, füllen Sie zunächst eine 10-Mikroliter-Hamilton-Spritze mit sterilem Wasser.

Montieren Sie dann die gefüllte Spritze in den Behälter einer programmierbaren Pumpe mit sechs Spritzen und befestigen Sie das Ende des Spritzenkolbens in der geklemmten Halterung an der Pumpe. Führen Sie eine zuvor vorbereitete 30-Gauge-Flachschnitt-Infusionsnadel von einem Zoll in einen etwa zwei Fuß langen, gassterilisierten PE 20-Schlauch ein. Verwenden Sie anschließend eine 25-Gauge-Nadel und eine Milliliterspritze, um den Schlauch mit sterilem Wasser vorzufüllen.

Schieben Sie das offene Ende des Schlauchs auf die Hamilton-Spritze. Achten Sie darauf, dass keine Luftblasen im Rohr entstehen. Klemmen Sie nun das Ende der Infusionsnadel des Schlauchs mit einem Zylinder-Elektrodenmanipulator auf den Arm eines stereotaktischen Geräts.

Führen Sie dann die Infusionsnadel zwischen die Klemme und den gerillten Zylinder ein und stellen Sie sicher, dass die Klemme über einem Schlauchstück befestigt ist, in dem sich die Nadel befindet, um ein Abflachen des Schlauchs zu vermeiden. Stellen Sie anschließend die Pumpe auf eine Geschwindigkeit von mehr als fünf Mikrolitern pro Minute ein und schalten Sie die Pumpe ein. Sobald die Pumpe läuft, sollte an der Spitze der Infusionsnadel eine Wasserperle erscheinen.

Nutzen Sie diese Gelegenheit, um die Verbindungen und Schläuche zu überprüfen, um sicherzustellen, dass keine Lecks vorhanden sind. Wische die Wasserperle mit einem sterilen Tupfer ab. Stellen Sie dann die Pumpe so ein, dass sie sich zurückzieht und eine zwei Mikroliter große Luftblase aufsaugt.

Die Oberseite der Blase sollte im Schlauch sichtbar sein. Tauchen Sie nun die Spitze der Infusionsnadel in eine 20 Milligramm pro Milliliter Lösung NMDA in steriles 0,1 molares PBS und entnehmen Sie vier bis fünf Mikroliter der Flüssigkeit. Stellen Sie sicher, dass die Luftblase das sterile Wasser und die NMDA-Lösung trennt.

Sobald ein geeignetes Volumen der NMDA-Lösung hergestellt wurde, kann das Gefäß mit der Stammlösung entfernt werden, und dann ist das Setup bereit für die Operation. Nach der Montage der Ratte in den stereotaktischen Rahmen sollte sich jeder Ohrbügel so anfühlen, als würde er auf einem festen Platz ruhen und nicht so weit in den Kopf einsinken. Der Penny sollte symmetrisch aussehen und flach auf den Ohrbügeln zu liegen scheinen.

Das Aufweiten des Pennys nach oben deutet auf eine falsche Platzierung der Ohrbügel hin. Der Kopf sollte nicht als Reaktion auf den Druck am Hals wackeln. Verwenden Sie einen sterilen Tupfer, um Augensalbe auf die Augen aufzutragen.

Tragen Sie nun 2%ige Chlorhexidinlösung auf die Kopfhaut auf, während Sie einziehen. Konzentrische Kreise von der geplanten Schnittstelle zum Rand des rasierten Bereichs. Tragen Sie 70%iges Ethanol auf die gleiche Weise auf.

Wiederholen Sie diesen Vorgang dreimal, gefolgt von einer Anwendung von 10%iger Povidon-Jodlösung, da die Kopfhaut jetzt steril ist und nur mit sterilen Materialien berührt werden sollte. Ziehen Sie zu diesem Zeitpunkt sterile OP-Handschuhe an und legen Sie ein steriles Tuch über das Tier, so dass die Fensteröffnung die Operationsstelle freilegt. Das Tier ist nun bereit für die Operation, nachdem es mit einem Skalpell mit einer Klinge mit der Nummer 10 einen zwei Zentimeter langen Längsschnitt entlang der Mittellinie der Kopfhaut gemacht hat, beginnend hinter der Augenlinie.

Ziehen Sie mit sterilen Wattestäbchen die Faszie über der Schädeloberfläche bis zu den Rändern der Operationsstelle. Verwenden Sie vier gebogene sterile Hämostaten, um die Faszie auf jeder Seite des vorderen und hinteren Aspekts des Schnitts zu klemmen. Um ein chirurgisches Fenster zu schaffen, legen Sie das andere Ende der Hämostaten neben das Tier.

Um den Schnitt zu öffnen und den Schädel vollständig freizulegen. Suchen Sie zunächst bgma und lambda, wie in diesem Diagramm dargestellt. Bewege dann die Nadel so, dass die Spitze gerade das scharlachrote bgma berührt.

Notieren Sie die dorsale ventrale Koordinate gemäß der Venia-Skala. Es ist eine gute Idee, sich vor Beginn des Eingriffs mit dem Ablesen der Venienschuppe vertraut zu machen. Eine Anleitung finden Sie am Ende dieses Videos.

Nach dem Berühren des unsterilen stereotaktischen Geräts ist der Chirurg nicht mehr steril und sollte darauf achten, die sterile Operationsstelle oder die Teile von Werkzeugen, die die Operationsstelle berühren, nicht zu berühren. Hebe dann die Nadel leicht an und bewege die Nadelspitze gerade wieder zurück auf Lambda. Senken Sie die Nadelspitze ab und notieren Sie die dorsale Bauchkoordinate.

Wenn diese Koordinate innerhalb von 0,1 Millimetern von der für Broma aufgezeichneten Koordinate liegt, gilt der Schädel als eben. Wenn nicht, muss die Bissstange angepasst und die Messungen wiederholt werden. Sobald sich der Kopf in der dorsalen ventralen Ebene waagerecht befindet, führen Sie das Nadeltorema zurück und notieren Sie die vorderen, hinteren und medialen lateralen Koordinaten.

Berechnen Sie die Zielpositionierung der Nadel basierend auf den Atlas-Koordinaten des Gehirns der interessierenden Struktur und bewegen Sie die Nadel an die berechnete Position. Markieren Sie die Position der Nadel und schwenken Sie die Nadel dann aus dem Weg. Bohren Sie mit einem Dremel-Motorradwerkzeug und einem sterilen Dentalbohrer vorsichtig ein etwa zwei Millimeter großes Loch an der Stelle der Nadelposition, ohne die Dura oder das darunter liegende Gewebe zu beschädigen.

Reiben Sie das Loch auf, um es zu vergrößern, und wenn Sie fertig sind, saugen Sie das Blut mit einem Wattestäbchen auf. Nachdem Sie das Loch gebohrt haben, schwingen Sie die Nadel wieder in Position. Senke die Nadel in das Loch, bis die Spitze die Dura berührt.

Notieren Sie diese dorsale ventrale Koordinate und subtrahieren Sie das entsprechende Tal, das erforderlich ist, um die interessierende Gehirnregion zu erreichen. Senken Sie die Nadel langsam auf das berechnete Niveau ab. Hebe dann die Nadel wieder auf eine Höhe über dem Schädel.

Verwenden Sie einen Reinigungsdraht für eine Hamilton-Spritze, um die Spitze der Infusionsnadel von Verstopfungen zu befreien. Lassen Sie nun die Pumpe mit der gleichen Geschwindigkeit wie zuvor laufen. Am Ende der Infusionsnadel sollte sich eine Flüssigkeitsperle bilden.

Wenn nicht, wiederholen Sie den Vorgang zum Beseitigen der Verstopfung und versuchen Sie es erneut. Nachdem Sie sich vergewissert haben, dass die Nadel frei von Verstopfungen ist, senken Sie die Nadel langsam wieder auf die gewünschte dorsale ventrale Höhe. Markieren Sie die beiden Enden der Luftblase mit schwarzem Marker.

Stellen Sie die Infusionspumpe auf 0,1 Mikroliter pro Minute ein und starten Sie die Infusion. Die Bewegung der Blase zeigt an, dass die Nadel nicht verstopft ist und dass die Infusion wirkt. Lassen Sie das Neurotoxin zwei Minuten lang in das Gehirn eindringen.

Sobald die Infusion abgeschlossen ist, stoppen Sie die Pumpe und warten Sie fünf Minuten. Für das NMDH von der Nadelspitze weg diffundieren. Abhängig von der Gehirnregion kann es notwendig sein, die Nadel ein wenig anzuheben und erneut für einen kürzeren Zeitraum zu infundieren.

Dies geschieht, um sicherzustellen, dass die Zielstruktur von der Infusion abgedeckt wird. Sobald die Infusion des Neurotoxins abgeschlossen ist, heben Sie die Nadel langsam aus dem Gehirn und schwingen Sie den stereotaktischen Arm aus dem Weg. Nachdem du ein frisches Paar sterile Handschuhe angezogen hast, verwende sterile Wattespitzen, um überschüssiges Blut auf dem Schädel abzuwischen.

Entfernen Sie dann die Klammern von der Armaturentafel. Verwenden Sie dann eine Londoner Pinzette, um die beiden Seiten des Schnitts zusammenzuschieben und sicherzustellen, dass sich die inneren Ränder der Haut treffen. Lassen Sie die Haut sich nicht zum Schnitt hin einrollen.

Halten Sie den Schnitt fest und bringen Sie Wundklammern entlang der Länge des Schnitts an. Dazu werden in der Regel drei bis fünf gewickelte Clips benötigt. Nachdem Sie die Wundklammern platziert haben, verwenden Sie eine Pinzette, um die Klammern einzuklemmen und weiter zu sichern.

Tauschen Sie zum Schluss den gehefteten Schnitt gegen 10%ige Povidon-Jodlösung aus. Bringen Sie die Ratte in den Heimkäfig zurück. Überwachen Sie die Genesung des Tieres und verabreichen Sie Analgetika gemäß den institutionellen Richtlinien.

Diese Grafik zeigt das Durchschnittsgewicht von 17 Ratten, die sich Stereotypen und Operationen unterzogen haben, und sechs Ratten, die nicht operiert wurden. Der Tag Null ist der Tag des chirurgischen Eingriffs. Nach der Operation nahm das Gewicht der Ratten zwei bis drei Tage lang ab und nahm dann um den fünften bis sechsten Tag zu.

Dieses Bild zeigt einen krestalen violetten Gegenfleck auf einem 30 Mikrometer großen koronalen Schnitt mit der kahlen Stelle einer MDA-Läsion der basalen lateralen Amygdala. Die weißen Pfeile umreißen die Läsion. Es kann mit der kontralateralen Seite des Hirnschnitts verglichen werden, die keine Läsion aufweist.

Dieses Bild zeigt eine ähnliche Läsion des zentralen Kerns Amygdala. Diese Zeichnung zeigt einen stereotaktischen Standardwert, um die Ziffern links von der Dezimalstelle zu erhalten. Verwenden Sie die Markierungen auf der rechten Seite.

Die beschriftete Ziffer entspricht der Zehnerstelle, d.h. eins ist 10 und zwei gleich 20. Die Rauten zwischen den beschrifteten Ziffern entsprechen den einzelnen Einheiten eins bis neun. Die Nulllinie gibt an, auf welche ganze Zahl das Stereotyp gesetzt ist.

Hier befindet sich die Nulllinie zwischen den Markierungen 10 und 11, was anzeigt, dass der Messwert zwischen 10 und 11 liegt. Um die Zahlen rechts von der Nachkommastelle zu bestimmen, verwenden Sie die Markierungen auf der linken Seite. Die Rauten auf der linken Seite sind von null bis 10 nummeriert, wobei jede unbeschriftete Raute eine Einheit Differenz zu den daneben darstellt. Die Raute auf der linken Seite, die am besten mit den Rauten auf der rechten Seite übereinstimmt, zeigt die erste Dezimalstelle der Koordinatenlesung hier an.

Die Raute auf der linken Seite, die der Zahl neun entspricht, stimmt am besten mit den Rauten auf der rechten Seite überein, so dass die Nachkommastelle neun ist. Der Endwert liegt bei 10,9 Millimetern. Sobald diese Technik gemeistert ist, sollte sie 30 Minuten dauern, wenn sie richtig ausgeführt wird.

Befolgen Sie dieses Verfahren. Virale Vektoren oder sir a könnten spezifisch in das Gehirn infundiert werden, um Fragen zu beantworten, wie z. B. wie die Veränderung der Genexpression in bestimmten Gehirnregionen die Gehirnfunktion verändert.