Mit fluoreszenzaktivierter Zellsortierung die zelltypspezifische Genexpression im Hirngewebe von Ratten untersuchen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, einzelne neuronale Zelltypen aus dem Hirngewebe zu isolieren und anschließend zu analysieren. Dies wird erreicht, indem zunächst Nervengewebe in eine einzellige Suspension dissoziiert wird. Im zweiten Schritt wird das Myelin aus der Suspension entfernt und anschließend werden die Zellen mit zelltypspezifischen Antikörpern gefärbt.

Im letzten Schritt werden die einzelnen Zellpopulationen mittels Durchflusszytometrie sortiert. Letztendlich wird diese Methode der zelltypspezifischen Isolierung es den Anwendern ermöglichen, Veränderungen in der Gen- oder Proteinexpression oder epigenetische Modifikationen auf zelltypspezifische Weise zu testen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen der Neurowissenschaften zu beantworten, etwa welche Zelltypen bestimmte Rezeptoren exprimieren, welche bestimmte Proteine exprimieren und welche bestimmte epigenetische Modifikationen exprimieren, um zelltypspezifische Mechanismen im Gehirn besser zu verstehen.

Beginnen Sie die neuronale Dissoziation, indem Sie mit sterilen Rasierklingen jede Probe aus adultem Hirngewebe auf dem Deckel einer Sechs-Well-Kulturplatte in kleine 30 bis 400 Milligramm große Stücke würfeln. Tauchen Sie dann das Gewebe in einen Milliliter kalzium- und magnesiumfreies HBSS und überführen Sie die Proben mit einer Pipette in sterile Zwei-Milliliter-Zentrifugenröhrchen, wenn alle Gewebe entnommen wurden. Die Proben werden zentrifugiert und die Überstände aspiriert.

Fügen Sie 1.900 Mikroliter warmes Enzym hinzu. Mischen Sie eine und inkubieren Sie die Proben 15 Minuten lang. In einem 37 Grad Celsius heißen Wasserbad, wobei der Schlauch mehrmals alle fünf Minuten umgedreht wird, um die abgesetzten Gewebestücke wieder zu suspendieren.

Am Ende der Inkubation fügen Sie 30 Mikroliter frisch zubereitetes Enzym hinzu. Mischen Sie zwei zu jeder Probe und drehen Sie die Röhrchen vorsichtig um. Dissoziieren Sie dann mit einer Schädlingspipette, die mit eins beschriftet ist, jede Probe mit 30 Aufwärts- und Abwärts-Iterationen.

Achten Sie darauf, dass keine Blasen entstehen. Inkubieren Sie die Proben für weitere 15 Minuten bei 37 Grad Celsius mit Inversion alle fünf Minuten, gefolgt von einer Dissoziation der Proben mit einer Schädlingspipette. Nummer zwei, wie gerade gezeigt wurde.

Wechseln Sie dann zu Pipette Nummer drei, wiederholen Sie die Dissoziation und inkubieren Sie die Proben weitere 10 Minuten lang. Im Wasserbad mit Inversion alle fünf Minuten am Ende des Inkubationsfilters werden die Einzelzellsuspensionen durch 80-Mikron-Zellsiebe in 15-Milliliter-Falcon-Röhrchen gefüllt. Waschen Sie jedes Sieb mit 10 Millilitern kalzium- und magnesiumfreiem HBSS, um die enzymatischen Reaktionen zu stoppen, wenn die letzte Probe gefiltert wurde, drehen Sie die Röhrchen herunter und aspirieren Sie die Überstände, um das Myelin aus der Zelle zu entfernen.

Suspensionen resuspendieren die Pellets gründlich in 400 Mikrolitern Myelinentfernungspuffer und fügen Sie jedem Röhrchen die entsprechende Menge an Myelinentfernungsperlen hinzu. Pipettieren Sie die Lösungen auf und ab, bis die Zellen und Kügelchen gründlich vermischt sind. Anschließend wird die Probe 15 Minuten lang bei vier Grad Celsius inkubiert.

Nach der Inkubation waschen Sie jede Probe in fünf Millilitern Myelinentfernungspuffer, während sich die Zellen drehen, legen Sie eine Säule für jede Probe in das Magnetfeld eines Magnetsortierers und platzieren Sie einen sauberen 80-Mikron-Filter auf jeder Säule. Spülen Sie jeden Filter und jede Säule dreimal mit einem Milliliter Myelinentfernungspuffer und sammeln Sie den gesamten Durchfluss in einem Abfallbehälter. Legen Sie nach der letzten Spülung fünf Milliliter Polystyrol-Rundbodenröhrchen direkt unter jede Säule, um das Eluat aufzufangen.

Aspirieren Sie dann den Supernamen aus den Proben und resuspendieren Sie die Pellets in 500 Mikrolitern Myelinentfernungspuffer. Tragen Sie die Zellsuspensionen sofort auf die Säulen auf und sammeln Sie die Zellen in den darunter liegenden Röhrchen. Spülen Sie dann jeden Filter und jede Säule viermal mit einem Milliliter Myelinentfernung, Puffer pro Waschgang.

Nach der letzten Wäsche schleudern Sie die Zellen herunter und aspirieren die Überstände, um die Zellen für die Sortierung durch Durchflusszytometrie zu färben. Wirbeln Sie jede Probe etwa zwei Sekunden lang vor, um die Pellets zu dissoziieren und einen Mikroliter Zellen aus jedem Röhrchen in einzelne Röhrchen zu überführen. Für die Färbekontrollen geben Sie sofort fünf Mikroliter FC-Block in jedes Röhrchen, einschließlich der Färbekontrollen.

Anschließend die Proben erneut vortexen und bei vier Grad Celsius inkubieren. Nach fünf Minuten fügen Sie 100 Mikroliter des entsprechenden Primärantikörper-Cocktails hinzu. Decken Sie die Röhrchen ab, um die Antikörper vor Licht zu schützen, und inkubieren Sie die Zellen 20 Minuten lang bei vier Grad Celsius.

Am Ende der Inkubation waschen Sie die Proben in zwei Millilitern Waschpuffer, aspirieren Sie dann die Überstände und markieren Sie jede Probe mit 100 Mikrolitern des entsprechenden Sekundärantikörpers. Decken Sie die Röhrchen ab und stellen Sie sie 15 Minuten lang bei vier Grad Celsius. Waschen Sie dann die Proben in zwei Millilitern Waschpuffer, zentrifugieren Sie die Proben und saugen Sie sie dann ab.

Überstände Resus, suspendieren Sie die Pellets in 250 Mikroliter sterilem PBS und sortieren Sie die Zellen hier repräsentative strömungssortierte Populationen von Nervenzellen aus einem einzigen männlichen Hippocampus sind dargestellt, die Zellen wurden zuerst von allen möglichen Ereignissen auf der Grundlage ihrer Vorwärts- und Seitenstreueigenschaften abgegrenzt. Als nächstes wurden die einzelnen Zellen oder Einzelzellen von Dubletten oder größeren Zellklumpen basierend auf ihrer Größe abgegrenzt, um eine genaue Sortierung der einzelnen Zelltypen zu ermöglichen, die Einzelzellen wurden dann in CD 11, B-positive und CD 11 B-negative Zellpopulationen sortiert, wobei die CD 11 B-negativen Zellen weiter in GT eins und TH eins positive Zellen sortiert wurden. Das Analyseprogramm wurde dann verwendet, um die Gesamtzahl der Ereignisse in jeder Population sowie den Prozentsatz der Elternpopulationen zu bestimmen, um die Reinheit der sortierten Zellen zu bestätigen.

In diesem speziellen Beispiel wurde die relative Genexpression alternativer zelltypspezifischer Gene mittels real-time PCR analysiert. Erwartungsgemäß bestätigten diese Daten die Reinheit der sortierten Zellen und identifizierten einige interessante Unterschiede zwischen den untersuchten Hirnregionen. Nach Bestätigung der Reinheit der Sorte kann die Expression anderer Gene von Interesse gemessen werden, um den spezifischen Zelltyp zu bestimmen, in dem sie exprimiert werden, oder um zu bestimmen, ob ihre Expression nach einer Behandlung in einer zelltypspezifischen Weise verändert ist.

Hier wurde beispielsweise die Expression der Kuhbindung untersucht, einem Kalziumbindungsprotein, das häufig zur Identifizierung von Neuronen im Hippocampus und im Kleinhirn verwendet wird. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie bestimmte neuronale Zelltypen von Interesse isolieren können, wie z. B. die hier gezeigte Nervenzelle mit geeigneten Antikörpern auf der Zelloberfläche.