Mit fluoreszenzaktivierter Zellsortierung die zelltypspezifische Genexpression im Hirngewebe von Ratten untersuchen

Das allgemeine Ziel dieses Verfahrens besteht darin, einzelne neuronale Zelltypen aus Gehirngewebe für nachfolgende Analysen zu isolieren. Dies wird erreicht, indem das Nervengewebe zunächst in eine Einzelzell-Suspension dissoziiert wird. Im zweiten Schritt wird das Myelin aus der Suspension entfernt und anschließend werden die Zellen mit zelltypspezifischen Antikörpern gefärbt.

Im letzten Schritt werden die einzelnen Zellpopulationen mittels Durchflusszytometrie sortiert. Letztendlich ermöglicht diese methode der zelltypspezifischen Isolierung es den Anwendern, Veränderungen in der Gen- oder Proteinexpression oder epigenetischen Modifikationen auf zelltypspezifische Weise zu analysieren. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Neurowissenschaften zu beantworten, beispielsweise, welche Zelltypen bestimmte Rezeptoren exprimieren, welche bestimmte Proteine exprimieren und welche bestimmte epigenetische Modifikationen aufweisen, um zelltypspezifische Mechanismen im Gehirn besser verstehen zu können.

Beginnen Sie die neuronale Dissoziation, indem Sie sterile Rasierklingen verwenden, um jede aus adulten Hirngeweben gewonnene Probe auf dem Deckel einer sechswelligen Kulturplatte in kleine Stücke von 30 bis 400 Milligramm zerkleinern. Tauchen Sie das Gewebe anschließend in ein Milliliter kalzium- und magnesiumfreies HBSS und überführen Sie die Proben mithilfe einer Pipette in sterile Zentrifugenröhrchen mit einem Volumen von zwei Milliliter, sobald sämtliches Gewebe gesammelt wurde. Zentrifugieren Sie die Proben und aspirieren Sie die Überstände.

Fügen Sie 1.900 Mikroliter warmes Enzym hinzu. Mischen Sie einmal und inkubieren Sie die Proben 15 Minuten lang in einem Wasserbad bei 37 Grad Celsius, wobei Sie das Gefäß alle fünf Minuten mehrmals umdrehen, um die abgesetzten Gewebestücke erneut aufzuschwemmen.

Am Ende der Inkubation 30 Mikroliter frisch zubereiteten Enzyms hinzufügen. Jeweils zwei Proben vermischen und die Röhrchen vorsichtig umstülpen. Anschließend jede Probe mit einer mit „eins“ gekennzeichneten Pasteur-Pipette durch 30 Auf-und-ab-Bewegungen dissociieren.

Darauf achten, dass keine Blasen entstehen. Die Proben weitere 15 Minuten bei 37 Grad Celsius unter Inversion alle fünf Minuten inkubieren, gefolgt von der Dissoziation der Proben mit einer Pasteurpipette. Nummer zwei, wie gerade demonstriert.

Danach wechseln Sie zur Pipette Nummer drei, wiederholen Sie die Dissoziation und inkubieren Sie die Proben weitere 10 Minuten. Im Wasserbad wenden Sie die Proben alle fünf Minuten um. Am Ende der Inkubation filtrieren Sie die Einzelzell-Suspensionen durch 80-Mikron-Zellsiebe in 15-Milliliter-Falcon-Röhrchen. Spülen Sie jedes Sieb nach Filtration der letzten Probe mit 10 Millilitern kalzium- und magnesiumfreiem HBSS, um die enzymatischen Reaktionen zu stoppen, zentrifugieren Sie die Röhrchen und aspirieren Sie die Überstände, um das Myelin aus der Zellfraktion zu entfernen.

Suspensionen lösen die Pellets gründlich in 400 Mikrolitern Myelin-Abtrennungspuffer auf und geben die entsprechende Menge Myelin-Abtrennungsperlen zu jedem Röhrchen hinzu. Pipettieren Sie die Lösungen mehrmals auf und ab, bis die Zellen und Perlen vollständig gemischt sind. Inkubieren Sie danach die Probe bei vier Grad Celsius für 15 Minuten.

Nach der Inkubation jedes Proben in fünf Milliliter Myelin-Abtrennungspuffer waschen, während die Zellen zentrifugiert werden; stellen Sie für jede Probe eine Säule im Magnetfeld eines magnetischen Sortiergeräts auf und legen Sie einen sauberen 80-Mikron-Filter auf jede Säule. Spülen Sie jeden Filter und jede Säule dreimal mit je einem Milliliter Myelin-Abtrennungspuffer, wobei Sie den Durchlauf jeweils in einem Abfallbehälter sammeln. Nach dem letzten Spülschritt stellen Sie 5-Milliliter-Polystyrol-Rundbodentuben direkt unter jede Säule, um das Eluat zu sammeln.

Anschießend den Überstand von den Proben abziehen und die Pellets in 500 Mikrolitern Myelin-Abbau-Puffer resuspendieren. Die Zellsuspensionen unverzüglich auf die Säulen auftragen und die Zellen in den darunterstehenden Röhrchen auffangen. Danach jeden Filter und jede Säule viermal mit jeweils einem Milliliter Myelin-Abbau-Puffer spülen.

Nach der letzten Waschung die Zellen abzentrifugieren und die Überstände abpipettieren, um die Zellen zur Sortierung per Durchflusszytometrie anzufärben. Jede Probe etwa zwei Sekunden lang verwirbeln, um die Pellets aufzulösen, und ein Mikroliter Zellen aus jedem Röhrchen in einzelne Röhrchen überführen. Für die Färbekontrollen unverzüglich fünf Mikroliter FC-Block zu jedem Röhrchen hinzufügen, einschließlich der Färbekontrollen.

Anschließend die Proben erneut vortexen und bei vier Grad Celsius inkubieren. Nach fünf Minuten 100 Mikroliter der entsprechenden Primärantikörper-Lösung hinzufügen. Die Röhrchen abdecken, um die Antikörper vor Licht zu schützen, und die Zellen 20 Minuten bei vier Grad Celsius inkubieren.

Am Ende der Inkubation die Proben mit zwei Millilitern Waschpuffer waschen, anschließend die Überstände abpipettieren und jede Probe mit 100 Mikrolitern des entsprechenden sekundären Antikörpers markieren. Die Röhrchen abdecken und 15 Minuten bei vier Grad Celsius inkubieren. Danach die Proben mit zwei Millilitern Waschpuffer waschen, die Proben zentrifugieren und anschließend den Überstand abpipettieren.

Überstände resuspendieren, die Pellets in 250 Mikroliter sterilem PBS und sortieren Sie die Zellen hier; repräsentative, mittels Flusszytometrie sortierte Populationen neuraler Zellen aus einem einzelnen männlichen Hippocampus werden gezeigt. Die Zellen wurden zunächst basierend auf ihren Vorwärts- und Seitwärtsstreuungseigenschaften von allen möglichen Ereignissen ausgewählt. Anschließend wurden Einzelzellen (Singuletts) von Doppelten oder größeren Zellklumpen anhand ihrer Größe abgegrenzt, um eine genaue Sortierung der einzelnen Zelltypen zu ermöglichen. Die Einzelzellen wurden dann in CD11b-positive und CD11b-negative Zellpopulationen sortiert, wobei die CD11b-negativen Zellen weiter in GT1- und TH1-positive Zellen unterteilt wurden. Mit dem Analyseprogramm wurde anschließend die Gesamtanzahl der Ereignisse in jeder Population sowie der Prozentsatz der übergeordneten Populationen bestimmt, um die Reinheit der sortierten Zellen zu überprüfen.

In diesem speziellen Beispiel wurde die relative Genexpression alternativer, zelltypspezifischer Gene mittels Echtzeit-PCR analysiert. Wie erwartet bestätigten diese Daten die Reinheit der sortierten Zellen und identifizierten zudem einige interessante Unterschiede zwischen den untersuchten Hirnregionen. Nach Bestätigung der Reinheit der Sortierung können die Expression anderer Gene von Interesse gemessen werden, um den spezifischen Zelltyp zu bestimmen, in dem sie exprimiert werden, oder um festzustellen, ob ihre Expression nach einer Behandlung auf zelltypspezifische Weise verändert ist.

Zum Beispiel wurde hier die Expression von Cow-Binding, einem Kalzium-bindenden Protein, das häufig zur Identifizierung von Neuronen im Hippocampus und im Kleinhirn verwendet wird, untersucht. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie spezifische neuronale Zelltypen von Interesse, wie der hier gezeigte neuronale Zelltyp, mithilfe geeigneter Antikörper gegen Zelloberflächenmarker isoliert werden können.